1

LAB IV_ GENETYKA_Laboratorium_2013_14

Teoria

Elektroforeza DNA w

ż

elach

Elektroforeza w

ż

elach jest technik

ą

stosowan

ą

standardowo przy rozdziale, analizie i

oczyszczaniu kwasów nukleinowych. Po umieszczeniu w polu elektrycznym cz

ą

steczki

te migruj

ą

w

ż

elu zgodnie ze swym ładunkiem, przy czym szybko

ść

migracji zale

ż

y od

wielko

ś

ci i kształtu cz

ą

steczki. Elektroforeza w

ż

elach jest poł

ą

czeniem techniki rozdziału w

polu elektrycznym z metod

ą

s

ą

czenia molekularnego. Powszechnie stosuje si

ę

dwa rodzaje

ż

eli: agarozowe i akryloamidowe. Elektroforez

ę

mo

ż

emy prowadzi

ć

w warunkach

natywnych b

ą

d

ź

denaturuj

ą

cych.

Elektroforeza w

ż

elach agarozowych.

Elektroforeza w

ż

elach agarozowych, jako metoda szybka i prosta, znalazła

powszechne zastosowanie. Zdolno

ść

rozdzielcza

ż

elu zale

ż

y od st

ęż

enia agarozy,

determinuj

ą

cego wielko

ść

porów w

ż

elu. Standardowo stosuje si

ę

ż

ele 1 %. Do rozdziału

cz

ą

steczek mniejszych (0.5-2.0 kb) u

ż

ywa si

ę

ż

eli bardziej st

ęż

onych 1,4-2%, a do

rozdziału cz

ą

steczek wi

ę

kszych (10-20 kb i wi

ę

kszych)

ż

eli o st

ęż

eniu mniejszym, 0,5-

0,7%. Podczas elektroforezy w

ż

elach agarozowych nast

ę

puje równie

ż

rozdział cz

ą

steczek o

tej samej wielko

ś

ci, lecz ró

ż

ni

ą

cych si

ę

kształtem np. rozdział trzech ró

ż

nych form

plazmidu: CCC (ang. covalently closed circle), liniowej i OC (ang. open circle).

Elektroforeza musi by

ć

przeprowadzana w odpowiednim buforze. Najcz

ęś

ciej

stosowanym buforem jest TAE ( Tris-octan, EDTA) lub TBE ( Tris-boran, EDTA). Przed

naniesieniem na

ż

el próbki zawiesza si

ę

w buforze zawieraj

ą

cym „obci

ąż

nik” (glicerol,

Ficoll lub sacharoza) oraz barwnik umo

ż

liwiaj

ą

cy

ś

ledzenie przebiegu elektroforezy w

ż

elu (Xylene cyanol niebieski, fioletowy Bromophenol blue lub pomara

ń

czowy Orange

G). DNA w

ż

elu mo

ż

na uwidoczni

ć

dzi

ę

ki barwieniu zwi

ą

zkiem interkaluj

ą

cym - bromkiem

etydyny, lub specyficznymi barwinkami (w naszym przypadku GelRed) który fluoryzuje w

ś

wietle UV.

Elektroforeza w

ż

elach poliakryloamidowych

Ż

el poliakryloamidowy powstaje przez polimeryzacj

ę

monomerów akryloamidu w

długie ła

ń

cuchy z wytworzeniem wi

ą

za

ń

poprzecznych przez bisakryloamid. W reakcji tej

konieczna jest obecno

ść

odpowiedniego katalizatora (PERS) i zwi

ą

zku inicjuj

ą

cego

reakcj

ę

(TEMED). Wielko

ść

porów w

ż

elu zale

ż

y od stosunku st

ęż

enia akryloamidu do

bisakryloamidu.

Ż

ele poliakryloamidowe stosuje si

ę

przy rozdziale fragmentów o

wielko

ś

ci od 6 bp (20% poliakryloamid) do 1000 bp (1kbp) (3% poliakryloamid) oraz

przy rozdziale jednoniciowych cz

ą

steczek DNA (np. podczas sekwencjonowania). Do

2

elektroforezy stosuje si

ę

bufor TEB (Tris, EDTA, boran). DNA w

ż

elu uwidacznia si

ę

poprzez

barwienie bromkiem etydyny,

Elektroforeza w

ż

elach denaturuj

ą

cych

Szybko

ść

migracji w

ż

elu jednoniciowych cz

ą

steczek DNA zale

ż

y nie tylko od ich

wielko

ś

ci i ładunku, ale równie

ż

w du

ż

ym stopniu od ich struktury drugorz

ę

dowej. Aby

dokładnie okre

ś

li

ć

wielko

ść

takich cz

ą

steczek, nale

ż

y wyeliminowa

ć

ró

ż

nice w szybko

ś

ci

migracji wywołane ró

ż

n

ą

konformacj

ą

cz

ą

steczki. Mo

ż

na to osi

ą

gn

ąć

stosuj

ą

c

elektroforez

ę

w

ż

elach denaturuj

ą

cych. S

ą

to najcz

ęś

ciej

ż

ele akryloamidowe, w których

czynnikiem denaturuj

ą

cym jest mocznik. Takie

ż

ele stosuje si

ę

mi

ę

dzy innymi przy

analizie jednoniciowych fragmentów DNA podczas sekwencjonowania.

Przed naniesieniem próbki na

ż

el denaturuj

ą

cy konieczne jest odpowiednie jej

zdenaturowanie. Najcz

ęś

ciej osi

ą

ga si

ę

to przez dodanie formamidu i odpowiednie

podgrzanie.

Markery wielko

ś

ci:

Powszechnie u

ż

ywanymi standardami s

ą

preparaty DNA bakteriofaga

λ

strawione

odpowiednimi kombinacjami endonukleaz restrykcyjnych lub mieszanina fragmentów o

znanej długo

ś

ci (np. DNA Ladder Mix i 100bp DNA Ladder Plus z firmy Fermentas).

10kb gene ruler

Opracowała dr Dominika Włoch-Salamon na podstawie

(na podstawie skryptu http://www.igib.uw.edu.pl)

PYTANIA:

1. Od czego zale

ż

y szybko

ść

migracji cz

ą

stek w elektroforezie?

2. Czy te same fragmenty DNA mo

ż

na analizowa

ć

w

ż

elach agarozowych i

poliakryloamidowych?

3. W jaki sposób „uwidaczniamy próbk

ę

DNA w

ż

elu po elektroforezie?

4. Do czego słu

ż

y marker wielko

ś

ci oraz „obci

ąż

nik”?

3

Ć

wiczenia praktyczne

Wykonaj

ć

wiczenie zgodnie z opisem z lab.2 i 3

1. Próbki z lab.2. sprawdzenie ci

ę

cia restrykcyjnego. (str.9. skrypt lab.2.).

Dodatkowo (je

ś

li jest mo

ż

liwo

ść

nałó

ż

prób

ę

zawieraj

ą

c

ą

DNA nie poci

ę

tego plazmidu)

Drabina

λ

EcoRI/HindIII

2. Próbki z lab.3. - Identyfikacja płci u ptaków metod

ą

PCR.(str. 4. skryp lab.3.)

RAPORT:

(ka

ż

dy przygotowuje indywidualnie!)

Imi

ę

Nazwisko………………

1. Lab.2. Ci

ę

cie plazmidu pRS416. W przygotowanej poni

ż

ej ramce, naszkicuj wynik

elektroforezy agarozowej swoich prób.

a) Podpisz wyniki analizowanych prób. Sprawd

ź

czy wynik elektroforezy zgadza si

ę

z

twoimi przewidywaniami (zad. „planowanie ci

ę

cia restrykcyjnego”)

b) Jak w

ę

drował plazmid nie poci

ę

ty? Poci

ę

ty enzymami pojedynczo i oboma na raz?

UWAGI:

Marker wielkości

4

2. Lab.3 – wynik reakcji PCR. W przygotowanej poni

ż

ej ramce, naszkicuj wynik

elektroforezy agarozowej swoich prób.

Drabina Euro Perfect 100-1000

a) Na podstawie wyników okre

ś

l płe

ć

ptaków których próby badałe

ś

/ła

ś

?

b)Jaki jest wynik kontroli negatywnej?

c) Je

ś

li nie otrzymałe

ś

/ła

ś

wyników zastanów si

ę

gdzie mogłe

ś

/ła

ś

popełni

ć

bł

ą

d?

UWAGI:

Marker wielkości