1

WICZENIE

7

SDS-PAGE L

AEMMLI ELEKTROFOREZA

Wyci g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych

• Akrylamid/bisakrylamid – T

• Temed – C, F

• SDS – Xn

• APS – O, Xn

• EDTA – Xi

• Merkaptoetanol – T, N

Wylewanie eli

Odczynniki:
- AA: 30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid
- bufor do elu rozdzielaj cego: 1 M Tris-HCl, pH 8,8
- bufor do elu zag szczaj cego: 1 M Tris-HCl, pH 6,8
- 20% siarczan dodecylu sodu (SDS)
- 1% SDS
- 10% nadsiarczan amonu (APS)
- N,N,N’,N’- tetrametyloetylenodiamina (Temed)
- bufor do próbek (2x st ony):

625

µl 1 M Tris-HCl pH 6.8

1000

µl glicerol

500

µl 2-merkaptoetanol

1000

µl 20 % SDS

3,78 mg EDTA
1675

µl H

2

O dejonizowana

- bufor do naczy elektrodowych 5 mM Tris, 384 mM glicyna, 0,1 % SDS, pH 8,3
- 0,02% bł kit bromofenolowy
- zestaw wysokomasowych białek wzorcowych do elektroforezy (HMW) zawieraj cy:

miozyna (205 kDa),

α-galaktozydaza (116 kDa), fosforylaza b (97,4 kDa), albumina

surowicy wołu (66 kDa), albumina jaja kurzego (45 kDa), anhydraza w glanowa (29 kDa)

W celu przygotowania 12 ml

8 % elu rozdzielaj cego odpipetowa :

• roztwór AA

3,20 ml

• 1 M Tris-HCl, pH 8,8

4,50 ml

• 20 % SDS

60

µl

• H

2

O dejonizowana

4,25 ml

2

po odgazowaniu na pompce wodnej doda :

• Temed

24

µl

• 10 % APS

60

µl

W celu przygotowania 4 ml

4,5 % elu zag szczaj cego odpipetowa :

• roztwór AA

0,60 ml

• 1 M Tris-HCl, pH 6,8

0,49 ml

• 20 % SDS

20

µl

• H

2

O dejonizowana

2,88 ml

po odgazowaniu na pompce wodnej

• Temed

4

µl

• 10 % APS

16

µl

Przygotowanie próbek

Oznaczy st enia białka w próbkach metod Bradforda. Z ka dej próbki odpipetowa po
15

µg białka do osobnych eppendorfów. Próbki zag ci do obj. 5 µl na wirówce pró niowej,

doda 5

µl 2x st onego buforu do próbek oraz 0,5 µl roztworu bł kitu bromofenolowego,

zwirowa i gotowa 5-10 min w temperaturze 100

°C. Do próbki zawieraj cej białka o znanej

masie cz steczkowej (zestaw białek wzorcowych do elektroforezy, 3

µl) doda 0,5 µl

roztworu bł kitu bromofenolowego, zwirowa i gotowa 1 min w temperaturze 100

°C. Po

gotowaniu wszystkie próbki zwirowa i nakłada do kolejnych studzienek elu za pomoc
ko cówek kapilarnych.

Warunki pr dowe: 60 V na wej cie próbki w el zag szczaj cy (ok. 20 min)

120 V na rozdział (ok. 100 min)

Elektroforez prowadzi do wyj cia bł kitu bromofenolowego z elu.

Barwienie elu po elektroforezie

el zanurzy w wybarwiaczu (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x dest. 0,1%

CBBG-250) i pozostawi na 30 min na wytrz sarce kołyskowej. Nast pnie usun
wybarwiacz i el zala odbarwiaczem (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x
dest.). Cało pozostawi na wytrz sarce, a do uzyskania bezbarwnego tła.

3

Opracowanie wyników

Oznaczanie wzgl dnych mas cz steczkowych białek:
- wykre li krzyw kalibracyjn zale no ci log m.cz. białek standardowych od współczynnika

R

f

tj. wzgl dnej ruchliwo ci elektroforetycznej wyznaczonej ze stosunku drogi przebytej

przez dane białko do drogi przebytej przez bł kit bromofenolowy.

- obliczy warto ci

R

f

dla białek badanych i z wykresu kalibracyjnego odczyta wzgl dne

masy cz steczkowe tych białek.

Literatura:

1. „Techniki bada fizjologicznych” (red. A. Lity ska, M.H. Lewandowski), str. 102 - 106

Białka standardowe:

M.cz. (kDa)

log M.cz.

R

f

miozyna

205

α

-galaktozydaza

116

fosforylaza b

97,4

albumina surowicy wołu

66

albumina jaja kurzego

45

anhydraza w glanowa

29

Białko badane:

1.

2.

3.

4.

5.

6.