1

Transformacja bakterii E. coli

metodą elektroporacji

Materiał: elektrokompetentne komórki E. coli (szczep DH5α) przechowywane w postaci stocków glicerolowych (-

80°C).

1.

Zawiesinę elektrokompetentnych komórek rozmrozić na lodzie. Umieścić w lodzie kuwetę do

e

lektroporacji (szczelina grubości 1 mm) w celu jej schłodzenia.

2.

Przenieść 40 μl zawiesiny bakterii do kuwety elektroporacyjnej tak, aby cała zawiesina

znajdowała się na dnie kuwety. Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Trzymać w lodzie.

3.

Dodać 100 ng plazmidowego DNA.

4.

Ustawić parametry elektroporacji wg poniższej tabeli:

grupa 1

grupa 2

grupa 3

grupa 4

grupa 5

grupa 6

napi

ęcie

[kV]

0.9 kV

1.1 kV

1.3 kV

1.6 kV

1.7 kV

Kontrola

(-)

Warunki

wspólne (dla wszystkich grup):

Mode: 2.5kV/RESISTANCE High Voltage

Resistance: R5 (129 ohm)

5.

Wytrzeć kuwetę elektroporacyjną do sucha (!!!), umieścić w komorze elektroporatora i

zabezpieczyć przez dokręcenie.

6.

Przyłożyć impuls (przycisk ‘PULSE).

7.

Odczytać i zapisać wartość czasu trwania impulsu oraz faktyczną wartość napięcia. (UWAGA:

przed następną elektroporacją należy nacisnąć ‘RESET’)

8.

Niezwłocznie dodać 1 ml pożywki LB (bez ampicyliny!) ogrzanej do temp. 37° C.

9.

Przenieść bakterie do probówek 1.5 lub 2.0 ml.

10.

Inkubować w temperaturze 37° C z wytrząsaniem przez 1 godz.

11. Dla

kontroli

do

świadczenia należy użyć jednej porcji (40 μl) bakterii

elektrokompetentnych bez podawania impulsu elektrycznego. Post

ępować identycznie

jak z bakteriami poddawanymi elektroporacji.

12.

Wysiać bakterie na płytki z zestaloną pożywką LB z dodatkiem czynnika selekcyjnego

(ampicyliny)

– do posiewu pobrać po 1 i/lub 10 μl hodowli rozcieńczonej 1:100 i natychmiast

rozprowadzić równomiernie po całej płytce Petriego za pomocą głaszczki.

13.

Szalki inkubować w cieplarce 37° C przez 24 h do uzyskania wzrostu transformantów.

Protokół przygotowania komórek elektrokompetentnych:

1.

Przygotować 1 litr hodowli E.coli na podłożu LB (inkubować z wytrząsaniem przez noc do OD

600

=0,5-1,0,

co odpowiada ~10

10

komórek/ml).

2.

Schłodzić hodowlę w lodzie. Zwirować (4000 g, 15’, 4°C), osad komórek rozbić i zawiesić w 1 objętości

(1 litr) zimnej sterylnej wody.

3.

Ponownie zwirować hodowlę i zawiesić w 0,5 objętości zimnej wody. Powtórzyć płukanie.

4.

Zwirować hodowlę i zawiesić w 0,02 objętości zimnej wody.

5.

Zwirować hodowlę i zawiesić w 0,002-0,003 objętości zimnej wody z dodatkiem 10% glicerolu.

Rozporcjować zawiesinę po 40 µl do jałowych probówek i przechowywać w temp. -80°C.