1

Cz.3_ GENETYKA_Laboratorium_2013/14

Teoria

1. PCR

Reakcja ła

ń

cuchowa polimerazy lub polimerazowa reakcja ła

ń

cuchowa (PCR) - technika amplifikacji

(powielania) in vitro okre

ś

lonych, b

ą

d

ź

przypadkowych, fragmentów DNA (a w pewnych przypadkach

RNA). Kluczowym momentem w rozwoju tej techniki było wprowadzenie przez Kary’ego Mullisa (Saiki i

wsp. 1985, Mullis i wsp. 1986, Mullis i Faloona 1987) termostabilnej polimerazy umo

ż

liwiaj

ą

cej

przeprowadzenie wielu cykli reakcji (obejmuj

ą

cych denaturacj

ę

DNA w 94-95°C). Reakcja polega na

powielaniu fragmentu DNA na matrycy kwasu nukleinowego z u

ż

yciem starterów i termostabilnej

polimerazy. Starterami s

ą

hybrydyzuj

ą

ce ze specyficznymi sekwencjami w DNA (annealing)

oligonukleotydy wyznaczaj

ą

ce miejsca rozpocz

ę

cia syntezy komplementarnych nici DNA. W zale

ż

no

ś

ci

od amplifikowanego materiału (DNA lub RNA), oraz celu prowadzonej reakcji, istnieje szereg odmian

polimerazowej reakcji ła

ń

cuchowej takich jak:

Klasyczny PCR - technika umo

ż

liwiaj

ą

ca amplifikacj

ę

specyficznych fragmentów DNA. W metodzie tej

u

ż

ywa si

ę

jako starterów syntetycznych jednoniciowych fragmentów DNA (o długo

ś

ci od 10 do ok. 30

par zasad - zale

ż

nie od prowadzonej reakcji). Miejsce przył

ą

czenia starterów wyznacza amplifikowany

obszar; konieczne jest aby hybrydyzowały one z komplementarnymi ni

ć

mi, umo

ż

liwiaj

ą

c syntez

ę

komplementarnych do siebie fragmentów DNA. Reakcja PCR składa si

ę

zazwyczaj z 25 do 40 cykli.

Jeden cykl stanowi

ą

nast

ę

puj

ą

ce po sobie reakcje: a) denaturacji DNA (zazwyczaj 20-30 sek. w temp.

94-95°C), b) hybrydyzacji starterów (annealing - w zale

ż

no

ś

ci od stosowanych starterów 20-90 sek. w

temp. 40-65°C) oraz c) syntezy komplementarnych nici (zazwyczaj 20-90 sek. w temp. 72°C). Warunki

prowadzonej reakcji PCR musz

ą

by

ć

optymalizowane (temperatura i długo

ść

cykli, ilo

ść

cykli,

stosowana termostabilna polimeraza - np. Taq, Pvu, Tth, Tfl, st

ęż

enie MgCl , ilo

ść

matrycy i st

ęż

enie

starterów oraz szereg innych specyficznych parametrów) dla ka

ż

dego do

ś

wiadczenia.

RT-PCR –(ang. reverse transcription PCR) jest odmian

ą

PCR pozwalaj

ą

c

ą

na amplifikacj

ę

cz

ą

steczek

(okre

ś

lonych lub przypadkowych) RNA. RT-PCR jako pierwszy opisał P. Seeburg. Reakcja mo

ż

e

przebiega

ć

w dwóch etapach: 1) synteza jednoniciowego DNA komplementarnego do RNA

(prowadzona przez odwrotn

ą

transkryptaz

ę

) oraz 2) klasyczny PCR - amplifikacja uzyskanego cDNA.

real-time PCR , (ang. real-time polymerase chain reaction) ilo

ś

ciowe PCR DNA (z analiz

ą

ilo

ś

ci

produktu w czasie rzeczywistym,) - jest to czuła metoda analityczna wykorzystuj

ą

ca techniki

fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilo

ś

ci produktu reakcji w ka

ż

dym cyklu prowadzonej reakcji

PCR. Dzi

ę

ki temu cała procedura analizy jest stosunkowo szybka i pozwala wyeliminowa

ć

etap

szacowania produktu po zako

ń

czeniu reakcji. Umo

ż

liwia ona tak

ż

e wgl

ą

d w kinetyk

ę

reakcji, a co za

tym idzie pozwala na oszacowanie ilo

ś

ci produktu na pocz

ą

tku reakcji, co jest niemo

ż

liwe w

konwencjonalnej metodzie PCR. Ponadto dzi

ę

ki temu,

ż

e amplifikacja kwasów nukleinowych i detekcja

produktu odbywa si

ę

w jednym zamkni

ę

tym naczyniu, ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest

minimalne. Metody real-time PCR nie nale

ż

y myli

ć

z metod

ą

reverse transcription PCR (RT-PCR).

2

2. Identyfikacja płci u ptaków metod

ą

PCR

Niektóre gatunki ptaków nie wykazuj

ą

dymorfizmu płciowego, pozwalaj

ą

cego na oznaczenie płci

dorosłych osobników na podstawie cech morfologicznych. Podobna sytuacja wyst

ę

puje cz

ę

sto u

młodych osobników. Dlatego do oznaczania płci ptaków wykorzystuje si

ę

analizy genetyczne oparte na

metodzie PCR (ła

ń

cuchowa reakcja polimerazy, ang. Polymerase Chain Reaction). W tym celu

wykorzystuje si

ę

geny CHD1 zlokalizowane na chromosomach płci. Nale

ż

y pami

ę

ta

ć

,

ż

e u ptaków płci

ą

heterogametyczna s

ą

samice, gdy

ż

posiadaj

ą

dwa ró

ż

ne chromosomy płci (ZW), a samce s

ą

płci

ą

homogametyczn

ą

(ZZ). Gen CHD1-W zlokalizowany jest w chromosomie W i jest charakterystyczny dla

samicy. Gen CHD1-Z znajduje si

ę

w chromosomie Z i wyst

ę

puje zarówno u samca jak i u samicy.

W przypadku oznaczania płci ptaków najcz

ęś

ciej wykorzystuje si

ę

startery zaprojektowane

przez Griffithsa i in. (1998), które namna

ż

aj

ą

fragmenty genów CHD1-W i CHD1-Z (po jednym

fragmencie z ka

ż

dego genu, Z i W) wyra

ź

nie ró

ż

ni

ą

ce si

ę

długo

ś

ci

ą

, co umo

ż

liwia łatwy rozdział

uzyskanego produktu na

ż

elach agarozowych. W efekcie ko

ń

cowym, na obrazie elektroforetycznym

widoczne s

ą

dwa pr

ąż

ki, gdy testowany osobnik jest samic

ą

(ZW) lub jeden pr

ąż

ek, gdy osobnik jest

samcem (ZZ).

1. Izolacja DNA

Analizowane próbki pochodz

ą

od sikory modrej (Cyanistes caeruleus) z populacji

ż

yj

ą

cej na

Gotlandii (Szwecja). DNA zostało wyizolowane z krwi ptaków przy u

ż

yciu metody Chelex-100. Jest to

prosta i szybka metoda wykorzystuj

ą

ca polarne kuleczki

ż

ywicy (chelex), które wi

ążą

polarne składniki

komórkowe powstaj

ą

ce po homogenizacji tkanek. W wyniku czego niepolarne j

ą

drowe DNA i RNA

pozostaje w roztworze wody powy

ż

ej Chelexu.

Protokół izolacji DNA z krwi (przygotowane wcze

ś

niej)

1.

Grudk

ę

krwi umie

ś

ci

ć

na bibułce filtracyjnej i pozostawi

ć

na kilka minut w celu

odparowania etanolu (pobierane próbki krwi s

ą

przechowywane w 96% etanolu)

2.

Wysuszon

ą

krew przenie

ść

do uprzednio opisanej probówki 1,5ml

3.

Doda

ć

200

µ

l 5% roztworu Chelexu

4.

Próbki worteksowa

ć

przez około 1 min

5.

inkubowa

ć

w 56°C przez 20 min, a nast

ę

pnie inkubowa

ć

w 94°C przez 9 min

6.

próbki wirowa

ć

przez 3-5 min przy obrotach 10 000-15 000 rpm

7.

przenie

ść

supernatant (górna, płynna warstwa (faza)) do nowej, opisanej probówki

8.

przechowywa

ć

w temp. -20°C

PYTANIA

1. Jakie znasz rodzaje PCR? Do czego słu

ż

y ka

ż

dy z nich?

2. Wymie

ń

czynniki odpowiedzialne za sukces reakcji PCR?

3. Dlaczego w reakcji PCR u

ż

ywa si

ę

termostabilnej polimerazy DNA?

4. Czy jeden protokół (dokładny skład mieszaniny, temperatury reakcji itp.) mo

ż

e by

ć

stosowany do namna

ż

ania ró

ż

nych fragmentów DNA? Uzasadnij odpowied

ź

.

3

Cz.3_ GENETYKA_Laboratorium_2012

1.

Ć

wiczenie praktyczne – oznaczanie płci ptaków metod

ą

PCR

Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałe

ś

. Jednorazowe zu

ż

yte

materiały wyrzu

ć

, a materiały wielokrotnego u

ż

ytku umyj.

Przed przyst

ą

pieniem do

ć

wicze

ń

przeczytaj ze zrozumieniem cał

ą

instrukcj

ę

.

Odczynniki i aparatura:

- pipety automatyczne i jednorazowe ko

ń

cówki

- odczynniki do PCR: próbki DNA, polimeraza,
bufor do PCR, MgCl

2,

startery, woda

- probówki Eppendorfa,

- mikrowirówka,
- pisaki do probówek/ r

ę

czniki papierowe/stojaki,

pojemniki z lodem/alkohol do sterylizacji miejsca
pracy, r

ę

kawiczki

Przygotowanie reakcji PCR

1. Sprawd

ź

ustawienia termocyklera

2. Na lodzie przygotuj w probówce Eppendorfa 1,5 ml mieszanin

ę

do reakcji PCR (na 5 reakcji

PCR, 8

µ

l na reakcj

ę

):

Skład mieszaniny

1 próbka (

µ

l)

5 próbek (

µ

l)

woda dejonizowana

3,3

16,5

10 x bufor PCR

2,0

10,0

25mM MgCl

2

0,6

3,0

2 mM dNTP mix (A, G, C i T)

1,0

5,0

starter P2

0,5

2,5

starter P8

0,5

2,5

polimeraza Taq (5U/

µ

l)

0.1

0,5

Razem

8,0

40,0

Uwaga! Ka

ż

dy odczynnik (z wyj

ą

tkiem polimerazy Taq) przed dodaniem do mieszaniny musi by

ć

rozmro

ż

ony, wymieszany i odwirowany!

3. Umie

ść

probówki do PCR w statywie na lodzie, podpisz numerem grupy i zespołu (np. „1.1”).

Mieszanin

ę

do PCR dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i rozdziel po 8

µ

l do 4 probówek do

PCR;

4. Do trzech pierwszych probówek dodaj po 2

µ

l DNA (próbki 1-3), natomiast do ostatniej probówki

dodaj 2

µ

l wody dejonizowanej (kontrola negatywna). Wstaw próby do termocyklera i uruchom

program:

5. Wybierz wła

ś

ciwy program PCR (BIRDSEX) w termocyklerze i sprawd

ź

jego poprawno

ść

:

1. Wst

ę

pna denaturacja: 94˚C, 2 minuty

2. Wła

ś

ciwy PCR – 30 cykli składaj

ą

cych si

ę

z:

1. Denaturacja: 94˚C, 30 sek
2. Przył

ą

czanie starterów: 50˚C, 30 sek

3. Elongacja: 72˚C, 60 sek

3. Post-PCR:

1. Ko

ń

cowe wydłu

ż

anie: 72˚C, 10 minuty

2. Przechowywanie produktu: 8˚C

4. Po zako

ń

czeniu reakcji wyjmij próbki z bloku termocyklera

4

2

.

Ć

wiczenie praktyczne – ci

ę

cie DNA plazmidowego za pomoc

ę

enzymów

restrykcyjnych (skrypt cz. II)

3.

Ć

wiczenie praktyczne –

Elektroforeza w

ż

elu agarozowym (b

ę

dziemy j

ą

przeprowadza

ć

na

lab.4) (opis

ć

wicze

ń

znajduje si

ę

równie

ż

w Cz. 2 skryptu (Izolacja plazmidowego DNA)

1.

Jeden 2%

ż

el agarozowy na grup

ę

został przygotowany wcze

ś

niej.

Ż

el zawiera barwnik Gel

Red.

2.

Bufor który został u

ż

yty do PCR zawierał barwnik i i gliceryne dlatego w tym przypadku ni

mieszamy prób z barwnikim (obci

ąż

nikiem) do elektroforezy.

3.

Do ka

ż

dej studzienki w

ż

elu nałó

ż

5

µ

l produktu reakcji PCR z odpowiednich probówek. Do

pierwszej studzienki w rz

ę

dzie nałó

ż

5 ul standardu wielko

ś

ci.

4.

Wł

ą

cz zasilacz (napi

ę

cie ok. 100 V). Po ok. 15-20 minutach wył

ą

cz aparat. Zrób zdj

ę

cie

ż

elu

na transiluminatorze UV.

5.

Zinterpretuj uzyskane wyniki.

Literatura:

1.

Griffiths, R., Double, M. C., Orr, K., & Dawson, R. J. G. (1998). A DNA test to sex most birds. Molecular Ecology, 7(8), 1071-
1075.

2.

Walsh, P. S., Metzger, D. A., & Higuchi, R. (1991). Chelex® 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based
typing from forensic material. BioTechniques, 10(4), 506-513.

Opracowały: mgr Edyta Podmokła, dr Dominika Włoch-Salamon (na podstawie skryptu http://www.igib.uw.edu.pl)

RAPORT

1. Zinterpretuj obraz na

ż

elu poni

ż

ej – oznacz płe

ć

osobników z których pochodz

ą

próby

analizowane i pokazane na zdj

ę

ciu. Odpowied

ź

uzasadnij?

2. Zastanów si

ę

i wyja

ś

nij dlaczego w PCR stosuje si

ę

kontrol

ę

negatywn

ą

?

3. Czy w przeprowadzonym eksperymencie mo

ż

na stosowa

ć

równie

ż

kontrol

ę

pozytywn

ą

?

Uzasadnij odpowied

ź

.

4.

Dlaczego reakcj

ę

PCR przeprowadza si

ę

„na lodzie”