Identyfikacja płci u ptakow metoda PCR

Cz.3_ GENETYKA_Laboratorium_2013/14

Teoria

1. PCR

Reakcja ła

cuchowa polimerazy lub polimerazowa reakcja ła

cuchowa (PCR) - technika amplifikacji

(powielania) in vitro okre

lonych, b

przypadkowych, fragmentów DNA (a w pewnych przypadkach

RNA). Kluczowym momentem w rozwoju tej techniki było wprowadzenie przez Kary’ego Mullisa (Saiki i

wsp. 1985, Mullis i wsp. 1986, Mullis i Faloona 1987) termostabilnej polimerazy umo

liwiaj

cej

przeprowadzenie wielu cykli reakcji (obejmuj

cych denaturacj

DNA w 94-95°C). Reakcja polega na

powielaniu fragmentu DNA na matrycy kwasu nukleinowego z u

yciem starterów i termostabilnej

polimerazy. Starterami s

hybrydyzuj

ce ze specyficznymi sekwencjami w DNA (annealing)

oligonukleotydy wyznaczaj

ce miejsca rozpocz

cia syntezy komplementarnych nici DNA. W zale

od amplifikowanego materiału (DNA lub RNA), oraz celu prowadzonej reakcji, istnieje szereg odmian

polimerazowej reakcji ła

cuchowej takich jak:

Klasyczny PCR - technika umo

liwiaj

ca amplifikacj

specyficznych fragmentów DNA. W metodzie tej

ywa si

jako starterów syntetycznych jednoniciowych fragmentów DNA (o długo

ci od 10 do ok. 30

par zasad - zale

nie od prowadzonej reakcji). Miejsce przył

czenia starterów wyznacza amplifikowany

obszar; konieczne jest aby hybrydyzowały one z komplementarnymi ni

mi, umo

liwiaj

c syntez

komplementarnych do siebie fragmentów DNA. Reakcja PCR składa si

zazwyczaj z 25 do 40 cykli.

Jeden cykl stanowi

nast

puj

ce po sobie reakcje: a) denaturacji DNA (zazwyczaj 20-30 sek. w temp.

94-95°C), b) hybrydyzacji starterów (annealing - w zale

ci od stosowanych starterów 20-90 sek. w

temp. 40-65°C) oraz c) syntezy komplementarnych nici (zazwyczaj 20-90 sek. w temp. 72°C). Warunki

prowadzonej reakcji PCR musz

optymalizowane (temperatura i długo

ść

cykli, ilo

ść

cykli,

stosowana termostabilna polimeraza - np. Taq, Pvu, Tth, Tfl, st

ęż

enie MgCl , ilo

ść

matrycy i st

ęż

enie

starterów oraz szereg innych specyficznych parametrów) dla ka

dego do

wiadczenia.

RT-PCR –(ang. reverse transcription PCR) jest odmian

PCR pozwalaj

na amplifikacj

steczek

(okre

lonych lub przypadkowych) RNA. RT-PCR jako pierwszy opisał P. Seeburg. Reakcja mo

przebiega

w dwóch etapach: 1) synteza jednoniciowego DNA komplementarnego do RNA

(prowadzona przez odwrotn

transkryptaz

) oraz 2) klasyczny PCR - amplifikacja uzyskanego cDNA.

real-time PCR , (ang. real-time polymerase chain reaction) ilo

ciowe PCR DNA (z analiz

ilo

produktu w czasie rzeczywistym,) - jest to czuła metoda analityczna wykorzystuj

ca techniki

fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilo

ci produktu reakcji w ka

dym cyklu prowadzonej reakcji

PCR. Dzi

ki temu cała procedura analizy jest stosunkowo szybka i pozwala wyeliminowa

etap

szacowania produktu po zako

czeniu reakcji. Umo

liwia ona tak

e wgl

d w kinetyk

reakcji, a co za

tym idzie pozwala na oszacowanie ilo

ci produktu na pocz

tku reakcji, co jest niemo

liwe w

konwencjonalnej metodzie PCR. Ponadto dzi

ki temu,

e amplifikacja kwasów nukleinowych i detekcja

produktu odbywa si

w jednym zamkni

tym naczyniu, ryzyko zanieczyszczenia badanej próby jest

minimalne. Metody real-time PCR nie nale

y myli

z metod

reverse transcription PCR (RT-PCR).

2. Identyfikacja płci u ptaków metod

PCR

Niektóre gatunki ptaków nie wykazuj

dymorfizmu płciowego, pozwalaj

cego na oznaczenie płci

dorosłych osobników na podstawie cech morfologicznych. Podobna sytuacja wyst

puje cz

sto u

młodych osobników. Dlatego do oznaczania płci ptaków wykorzystuje si

analizy genetyczne oparte na

metodzie PCR (ła

cuchowa reakcja polimerazy, ang. Polymerase Chain Reaction). W tym celu

wykorzystuje si

geny CHD1 zlokalizowane na chromosomach płci. Nale

y pami

e u ptaków płci

heterogametyczna s

samice, gdy

posiadaj

dwa ró

ne chromosomy płci (ZW), a samce s

płci

homogametyczn

(ZZ). Gen CHD1-W zlokalizowany jest w chromosomie W i jest charakterystyczny dla

samicy. Gen CHD1-Z znajduje si

w chromosomie Z i wyst

puje zarówno u samca jak i u samicy.

W przypadku oznaczania płci ptaków najcz

ęś

ciej wykorzystuje si

startery zaprojektowane

przez Griffithsa i in. (1998), które namna

fragmenty genów CHD1-W i CHD1-Z (po jednym

fragmencie z ka

dego genu, Z i W) wyra

nie ró

ce si

długo

, co umo

liwia łatwy rozdział

uzyskanego produktu na

elach agarozowych. W efekcie ko

cowym, na obrazie elektroforetycznym

widoczne s

dwa pr

ąż

ki, gdy testowany osobnik jest samic

(ZW) lub jeden pr

ąż

ek, gdy osobnik jest

samcem (ZZ).

1. Izolacja DNA

Analizowane próbki pochodz

od sikory modrej (Cyanistes caeruleus) z populacji

cej na

Gotlandii (Szwecja). DNA zostało wyizolowane z krwi ptaków przy u

yciu metody Chelex-100. Jest to

prosta i szybka metoda wykorzystuj

ca polarne kuleczki

ywicy (chelex), które wi

ążą

polarne składniki

komórkowe powstaj

ce po homogenizacji tkanek. W wyniku czego niepolarne j

drowe DNA i RNA

pozostaje w roztworze wody powy

ej Chelexu.

Protokół izolacji DNA z krwi (przygotowane wcze

niej)

Grudk

krwi umie

na bibułce filtracyjnej i pozostawi

na kilka minut w celu

odparowania etanolu (pobierane próbki krwi s

przechowywane w 96% etanolu)

Wysuszon

krew przenie

ść

do uprzednio opisanej probówki 1,5ml

Doda

200

l 5% roztworu Chelexu

Próbki worteksowa

przez około 1 min

inkubowa

w 56°C przez 20 min, a nast

pnie inkubowa

w 94°C przez 9 min

próbki wirowa

przez 3-5 min przy obrotach 10 000-15 000 rpm

przenie

ść

supernatant (górna, płynna warstwa (faza)) do nowej, opisanej probówki

przechowywa

w temp. -20°C

PYTANIA

1. Jakie znasz rodzaje PCR? Do czego słu

y ka

dy z nich?

2. Wymie

czynniki odpowiedzialne za sukces reakcji PCR?

3. Dlaczego w reakcji PCR u

ywa si

termostabilnej polimerazy DNA?

4. Czy jeden protokół (dokładny skład mieszaniny, temperatury reakcji itp.) mo

e by

stosowany do namna

ania ró

nych fragmentów DNA? Uzasadnij odpowied

Cz.3_ GENETYKA_Laboratorium_2012

wiczenie praktyczne – oznaczanie płci ptaków metod

PCR

Dbaj o swoje miejsce pracy. Pozostaw go tak czystym jak go zastałe

. Jednorazowe zu

yte

materiały wyrzu

, a materiały wielokrotnego u

ytku umyj.

Przed przyst

pieniem do

wicze

przeczytaj ze zrozumieniem cał

instrukcj

Odczynniki i aparatura:

- pipety automatyczne i jednorazowe ko

cówki

- odczynniki do PCR: próbki DNA, polimeraza,
bufor do PCR, MgCl

startery, woda

- probówki Eppendorfa,

- mikrowirówka,
- pisaki do probówek/ r

czniki papierowe/stojaki,

pojemniki z lodem/alkohol do sterylizacji miejsca
pracy, r

kawiczki

Przygotowanie reakcji PCR

1. Sprawd

ustawienia termocyklera

2. Na lodzie przygotuj w probówce Eppendorfa 1,5 ml mieszanin

do reakcji PCR (na 5 reakcji

PCR, 8

l na reakcj

Skład mieszaniny

1 próbka (

5 próbek (

woda dejonizowana

3,3

16,5

10 x bufor PCR

2,0

10,0

25mM MgCl

0,6

3,0

2 mM dNTP mix (A, G, C i T)

1,0

5,0

starter P2

0,5

2,5

starter P8

0,5

2,5

polimeraza Taq (5U/

0.1

0,5

Razem

8,0

40,0

Uwaga! Ka

dy odczynnik (z wyj

tkiem polimerazy Taq) przed dodaniem do mieszaniny musi by

rozmro

ony, wymieszany i odwirowany!

3. Umie

ść

probówki do PCR w statywie na lodzie, podpisz numerem grupy i zespołu (np. „1.1”).

Mieszanin

do PCR dokładnie wymieszaj przez pipetowanie i rozdziel po 8

l do 4 probówek do

PCR;

4. Do trzech pierwszych probówek dodaj po 2

l DNA (próbki 1-3), natomiast do ostatniej probówki

dodaj 2

l wody dejonizowanej (kontrola negatywna). Wstaw próby do termocyklera i uruchom

program:

5. Wybierz wła

ciwy program PCR (BIRDSEX) w termocyklerze i sprawd

jego poprawno

ść

1. Wst

pna denaturacja: 94˚C, 2 minuty

2. Wła

ciwy PCR – 30 cykli składaj

cych si

1. Denaturacja: 94˚C, 30 sek
2. Przył

czanie starterów: 50˚C, 30 sek

3. Elongacja: 72˚C, 60 sek

3. Post-PCR:

1. Ko

cowe wydłu

anie: 72˚C, 10 minuty

2. Przechowywanie produktu: 8˚C

4. Po zako

czeniu reakcji wyjmij próbki z bloku termocyklera

wiczenie praktyczne – ci

cie DNA plazmidowego za pomoc

enzymów

restrykcyjnych (skrypt cz. II)

wiczenie praktyczne –

Elektroforeza w

elu agarozowym (b

dziemy j

przeprowadza

lab.4) (opis

wicze

znajduje si

równie

w Cz. 2 skryptu (Izolacja plazmidowego DNA)

Jeden 2%

el agarozowy na grup

został przygotowany wcze

niej.

el zawiera barwnik Gel

Red.

Bufor który został u

yty do PCR zawierał barwnik i i gliceryne dlatego w tym przypadku ni

mieszamy prób z barwnikim (obci

ąż

nikiem) do elektroforezy.

Do ka

dej studzienki w

elu nałó

l produktu reakcji PCR z odpowiednich probówek. Do

pierwszej studzienki w rz

dzie nałó

5 ul standardu wielko

ci.

Wł

cz zasilacz (napi

cie ok. 100 V). Po ok. 15-20 minutach wył

cz aparat. Zrób zdj

cie

elu

na transiluminatorze UV.

Zinterpretuj uzyskane wyniki.

Literatura:

Griffiths, R., Double, M. C., Orr, K., & Dawson, R. J. G. (1998). A DNA test to sex most birds. Molecular Ecology, 7(8), 1071-
1075.

Walsh, P. S., Metzger, D. A., & Higuchi, R. (1991). Chelex® 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based
typing from forensic material. BioTechniques, 10(4), 506-513.

Opracowały: mgr Edyta Podmokła, dr Dominika Włoch-Salamon (na podstawie skryptu http://www.igib.uw.edu.pl)

RAPORT

1. Zinterpretuj obraz na

elu poni

ej – oznacz płe

osobników z których pochodz

próby

analizowane i pokazane na zdj

ciu. Odpowied

uzasadnij?

2. Zastanów si

i wyja

nij dlaczego w PCR stosuje si

kontrol

negatywn

3. Czy w przeprowadzonym eksperymencie mo

na stosowa

równie

kontrol

pozytywn

Uzasadnij odpowied

Dlaczego reakcj

PCR przeprowadza si

„na lodzie”