Metoda PCR

Metoda PCR

PCR

PCR

Polymerase Chain

Polymerase Chain

Reaction –

Reaction –

Łańcuchowa reakcja

Łańcuchowa reakcja

polimeryzacji

polimeryzacji

Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:

Do przeprowadzenia PCR potrzebne są:

• wyizolowana, o odpowiedniej czystości matryca

DNA 

• odpowiednie środowisko reakcji- bufor, jony

Mg²+

• startery
• dNTP
• termostabilna polimeraza DNA
• opcjonalnie: substancje stabilizujące

Jak należy dobrać startery do

Jak należy dobrać startery do

reakcji PCR:

reakcji PCR:

•

powinny zawierać około 50% par GC

powinny zawierać około 50% par GC

•

długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad

długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad

•

startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części

startery nie powinny zawierać w 3' końcowej części

fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz

fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz

do drugiego startera

do drugiego startera

•

temperatura ich topnienia powinna występować w

temperatura ich topnienia powinna występować w

przedziale 50-60˚C.

przedziale 50-60˚C.

•

nie mogą tworzyć struktur typu spinki do włosów

nie mogą tworzyć struktur typu spinki do włosów

•

muszą być komplementarne do fragmentów matrycy

muszą być komplementarne do fragmentów matrycy

•

stężenie starterów w mieszaninie powinno być optymalne

stężenie starterów w mieszaninie powinno być optymalne

•

startery powinny być wydłużane w kierunku jeden do

startery powinny być wydłużane w kierunku jeden do

drugiego

drugiego

Temperatura topnienia

• Temperatura topnienia jest to temperatura dysocjacji

dupleksu
primer - matryca. 

• Wartość temperatury topnienia rośnie wraz ze

wzrostem zawartości cytozyny i guaniny w łańcuchu.
Jest to spowodowane tym,
iż pomiędzy tymi zasadami występuje po trzy wiązania
wodorowe, natomiast pomiędzy adenina i tymina tylko
dwa.

•  

Najprostszym modelem do obliczania

temperatury topnienia jest formuła:

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie

powtarzanego cyklu

powtarzanego cyklu

trzech etapów, które

trzech etapów, które

zachodzą w rożnych temperaturach.

zachodzą w rożnych temperaturach.

Trzy etapy PCR :

Trzy etapy PCR :

1) Denaturacja

1) Denaturacja

2) Hybrydyzacja odcinków starterowych

2) Hybrydyzacja odcinków starterowych

3) Elongacja

3) Elongacja

Przebieg

Przebieg

reakcji

reakcji

:

:

Gdyby wydajność reakcji PCR była

Gdyby wydajność reakcji PCR była

stuprocentowa, po n cyklach reakcji z

stuprocentowa, po n cyklach reakcji z

jednej cząsteczki można by uzyskać 2

jednej cząsteczki można by uzyskać 2

do n-tej potęgi cząsteczek DNA.

do n-tej potęgi cząsteczek DNA.

Polimeraza Taq

•enzym z grupy polimeraz DNA wyizolowany z bakterii

Thermus aquaticus

•stabilny termicznie
•nie wykazuje aktywności 3'->5' egzonukleazy
•Do swej aktywności wymaga jonów Mg

Tremocykler 

Jest urządzeniem służącym do sterowania temperaturą.

Zakres zmiany temperatury zależy m.in. od długości
odcinka DNA, który planujemy powielić, od długości
starterów oraz optimów temperaturowych enzymów
(polimeraz).

Sterowanie temperaturą możliwe jest dzięki
wprowadzeniu do pamięci termocyklera określonego
programu,na podstawie której powielamy badany DNA.

Okresowe zmiany temperatury wywołują różnego typu
reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie

Zalety metody PCR:

Zalety metody PCR:

•

Bardzo czuła.

Bardzo czuła.

•

Prosta w wykonaniu

Prosta w wykonaniu

•

Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu

Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu

•

możemy powielać materiał genetyczny pobrany

możemy powielać materiał genetyczny pobrany

zarówno z żywych, jak i martwych tkanek

zarówno z żywych, jak i martwych tkanek

•

metoda specyficzna

metoda specyficzna

Wady metody PCR:

Wady metody PCR:

•

należy utrzymywać sterylne warunki : sterylność

należy utrzymywać sterylne warunki : sterylność

wszystkich używanych urządzeń w reakcji

wszystkich używanych urządzeń w reakcji

•

po reakcji PCR nie ma dowodów, że ta reakcja

po reakcji PCR nie ma dowodów, że ta reakcja

nastąpiła,

nastąpiła,

aby to stwierdzić stosujemy elektroforezę.

aby to stwierdzić stosujemy elektroforezę.

Zastosowanie PCR:

Zastosowanie PCR:

•

wykrywanie bardzo małych ilości bakterii w

wykrywanie bardzo małych ilości bakterii w

tkankach

tkankach

•

diagnostyka chorób dziedzicznych

diagnostyka chorób dziedzicznych

•

ustalanie ojcostwa

ustalanie ojcostwa

•

przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi

przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi

• uzyskiwanie dużych ilości DNA np. do klonowania
• znakowanie fragmentów DNA
• cykliczne sekwencjonowanie
• identyfikacja organizmów – genotypowanie

Multipleks PCR

Multipleks PCR

Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w
czasie jednej reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia
kilku par starterów
o podobnej temperaturze topnienia tak by można było
użyć jeden profil temperaturowy reakcji.

Schemat obrazujący zasadę działania

Schemat obrazujący zasadę działania

multipleks PCR

multipleks PCR

 

 

ZALETY MULTIPLEKS PCR :

ZALETY MULTIPLEKS PCR :

•

system wewnętrznej kontroli 

system wewnętrznej kontroli 

•

kontrola jakości matrycy

kontrola jakości matrycy

•

ocena ilości docelowej sekwencji w

ocena ilości docelowej sekwencji w

badanej próbie

badanej próbie

•

wysoka wydajność

wysoka wydajność

Z

ZASTOSOWANIE MULTIPEKS PCR :

ZASTOSOWANIE MULTIPEKS PCR :



wykrywanie delecji i innych zmian w sekwencji docelowej

wykrywanie delecji i innych zmian w sekwencji docelowej



polymorphic Repetitive DNA (polimorficzne

polymorphic Repetitive DNA (polimorficzne

powtarzalne sekwencje DNA) 

powtarzalne sekwencje DNA) 



wykrywanie i charakteryzacja mikroorganizmów

wykrywanie i charakteryzacja mikroorganizmów

grzybów, bakterii , wirusów oraz pasożytów. 

grzybów, bakterii , wirusów oraz pasożytów. 

Modyfikacje reakcji PCR

Modyfikacje reakcji PCR

PCR-RFLP 

PCR-RFLP 

RAPD-PCR 

RAPD-PCR 

PCR-CCM

PCR-CCM

PCR-PTT

PCR-PTT

RT-PCR

RT-PCR

ACRS-PCR

ACRS-PCR

ARMS-PCR

ARMS-PCR

ASA-PCR

ASA-PCR

PCR-ASO

PCR-ASO

PCR-HD

PCR-HD

PCR-SSCP

PCR-SSCP

PCR-DGGE

PCR-DGGE

PCR-TGGE

PCR-TGGE

inversed PCR

inversed PCR

PCR-OLA

PCR-OLA

REP-PCR

REP-PCR

Real-Time PCR 

Real-Time PCR 

ODWROTNA

ODWROTNA

TRANSKRYPCJA

TRANSKRYPCJA

Schemat od DNA do Białka

Odwrotna transkrypcja

Odwrotna transkrypcja

W reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystuje się
właściwości niektórych polimeraz DNA zależnych od
RNA do syntezy nici cDNA na RNA jako matrycy.

Odwrotna transkrypcja odbywa się w kierunku 3'→5'.

Schemat odwrotnej transkrypcji

Schemat odwrotnej transkrypcji

RT-PCR

RT-PCR

transcription polymerase chain reaction

 Jedna z modyfikacji metody PCR, w którym pierwszy

etap jest przeprowadzony przez odwrotną

transkryptazę, a jako matryca służy cząsteczka mRNA.

Podstawowe cechy i zalety RT PCR:

- umożliwia utworzenie cDNA na matrycy
RNA
- cDNA jest znacznie stabilniejszy niż RNA
- cDNA może być amplifikowany za pomocą
PCR

Zastosowania RT-PCR

Zastosowania RT-PCR

• Wykrywanie nawet minimalnej obecności RNA w

próbie.

• Diagnozowanie chorób genetycznych.
• Wprowadzanie informacji genetycznej komórki

eukariotycznej do komórki prokariotycznej.
(Inżynieria genetyczna)

• Wykrywanie nowotworów. (wykrywanie cząsteczek

mRNA –biomarkerów typowych dla danego typu
komórki nowotworowej.)

Dwa warianty RT-PCR

Dwa warianty RT-PCR

• Wariant I – reakcja w jednym kroku.
• Wariant II- reakcja w dwóch krokach.

Korzyści prowadzenia reakcji

Korzyści prowadzenia reakcji

w Wariancie I i II

w Wariancie I i II

• Wariant I :
1) Reakcja mniej czasochłonna.
2) Małe ryzyko zanieczyszczenia środowiska rekacji

wszechobecnymi enzymami bądź kwasami nukleinowymi.

• Wariant II :
1) Możliwość zastosowania optymalizacji reakcji np. Poprzez

dobór warunków reakcji.

2) Szerokie pole możliwych zastosowań zależne od użytego

specyficznego primera ( startera).

3) Możliwość otrzymywania bardzo długich

komplementarnych łańcuchów DNA (cDNA)