Najważniejsze odmiany techniki

PCR

Asymetryczny PCR (an.
asymmetric PCR)

Celem asymetrycznego PCR jest amplifikacja
jednoniciowego DNA o określonej długości.

Taki zsyntetyzowany przez reakcję PCR
produkt może być stosowany jako:

specyficzna sonda molekularna w

hybrydyzacji,

matryca w reakcjach sekwencjonowania

DNA.

Asymetryczny PCR (an.

asymmetric PCR)

Asymetryczny PCR można wykonać w dwojaki sposób

stosując:

jednoetapowa amplifikacja (nierówne stężenie

primerów od początku reakcji)

Produkt amplifikacji otrzymuje się przez

zastosowanie dwóch różnych primerów, z których jeden

całkowicie ulega wyczerpaniu w czasie pierwszych cykli

amplifikacji. W następnych cyklach tylko pozostały w

nadmiarze primer może ulegać elongacji, dając

właściwy produkt asymetrycznego PCR - jednoniciowy

DNA o określonej długości. Amplifikacja od momentu

wyczerpania się jednego z primerów nie zachodzi już w

sposób ekspotencjalny, lecz liniowy. Ta metoda wymaga

dużej liczby cykli, a to jest potencjalnym źródłem

błędów w inkorporacji właściwych nukleotydów.

Asymetryczny PCR (an.

asymmetric PCR)

dwuetapowa amplifikacja (tylko jeden primer

do reamplifikacji jednej nici DNA na matrycy

dwuniciowego produktu PCR występującego w

mieszaninie reakcyjnej)

Jest to metoda o wiele bardziej wydajna,

ponieważ startuje się z wysokokopijnej,

sprawdzonej, o określonej już pod względem

długości matrycy DNA (jest to ważne ze względu

na liniowy charakter amplifikacji). Stosując tą

technikę można zamplifikować kilka pmoli

pojedynczo-niciowego DNA (ssDNA). Taka ilość

ssDNA może już być analizowana w barwionym

bromkiem etydyny żelu agarozowym.

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP,

ARMS)

(ang. allelo-specific amplification)

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA), jest również

nazywana PASA (ang. PCR Amplification of

Specific Alleles), ASP (ang. Allele-Specific PCR) lub

ARMS (ang. Amplification Refractory Mutation

System).

Podstawą tej odmiany techniki PCR jest założenie,

że niekomplementarność nukleotydów przy

końcu 3' jednego lub obu stosowanych primerów

zapobiega elongacji końca 3' primera przez

polimerazę Taq. Oczywistym jest więc, że można

tutaj stosować tylko polimerazy DNA pozbawione

aktywności 3'-5' egzonukleazy.

Wydajna inicjacja syntezy DNA w takim PCR jest

determinowana przez sekwencję ostatniego lub dwóch

ostatnich nukleotydów na końcu 3' primerów.

Jeśli są one komplementarne do matrycy, to badane allele

są wydajnie amplifikowane, a przy braku

komplementarności dla innych alleli, amplifikacja ich jest

zahamowana.

Zaleca się stosowanie krótkich primerów (np. 14 nt). Każdy

allel musi być testowany w oddzielnej probówce reakcyjnej.

Stąd, ASA wymaga bezwzględnie koamplifikacji kontrolnego

DNA dla sprawdzenia możliwego zahamowania reakcji.

Stosowanie takiej kontroli jest kluczowe w tej metodzie,

ponieważ brak produktu w reakcji ma takie same znaczenie

diagnostyczne jak jego obecność.

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP,

ARMS)

(ang. allelo-specific amplification)

ASA jest metodą wykrywania polimorfizmu alleli,

istnienia punktowych mutacji i jest wykorzystywana

do:

wyjaśniania mechanizmu badanej choroby,

wyjaśniania ewolucyjnych powiązań między gatunkami,

badania mechanizmu działania substancji mutagennych,

wykrywania sprzężonych z chorobą genów w diagnostyce

pewnych chorób,

badania zasad powstawania oporności przeciw

chemioterapeutykom u mikroorganizmów,

badania powiązań genetycznych.

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP,

ARMS)

(ang. allelo-specific amplification)

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP,

ARMS)

(ang. allelo-specific amplification)

5'

3'

5'

3'

allel 1

G

C

primer 1

primer 3

5'

3'

5'

3'

C

primer 1

primer 3

produkt PCR

5'

3'

5'

3'

allel 1

G

primer 3

A

B

primer 2

G

brak produktu PCR

5'

3'

5'

3'

G

C

primer 3

5'

3'

5'

3'

primer 3

produkt PCR

primer 2

allel 2

5'

3'

5'

3'

primer 3

brak produktu PCR

allel 2

primer 1

C

C

primer 2

G

Wewnętrzny PCR (ang. nested

PCR)

Metoda ta polega na zastosowaniu
wewnętrznej pary primerów w stosunku
do preegzystującego produktu
amplifikacji (

dwuetapowa amplifikacja

).

Produkt tej reakcji może być stosowany
jako:

1.

sonda molekularna w hybrydyzacji,

2.

kontrola specyficzności amplifikacji
matrycy.

Wewnętrzny PCR (ang. nested

PCR)

Dla celów diagnostycznych (aby wyeliminować
możliwość kontaminacji) stosuje się reakcję
wewnętrznego PCR w jednej probówce reakcyjnej
(

jednoetapowa amplifikacja

) z użyciem dwóch par

primerów charakteryzującymi się różnymi
temperaturami topnienia (Tm).

Hybrydyzacja wewnętrznych primerów podczas
pierwszych cykli jest hamowana z powodu ich
niskiej temperatury topnienia (np. Tm dla pary
primerów zewnętrznych wynosi 80C, a dla pary
primerów wewnętrznych - 45C).

Wewnętrzny PCR (ang. nested

PCR)

W pierwszych cyklach takiej reakcji PCR zachodzi

amplifikacja długiego fragmentu DNA z udziałem

primerów zewnętrznych (15-20 cykli, dwutemperaturowy

profil reakcji: denaturacja 95C przez 20 s, dołączanie

primerów i elongacja w 72C przez 30 s).

Następne 16 cykli wykonuje się w następujący sposób:

denaturacja przy 92C przez 20 s, dołączanie primerów

przez 20 s, redukując temperaturę o 2C co 2 cykle

startując od temperatury 66C i elongacja przy 72C

przez 20 s. Na tym etapie wytwarzają się produkty różnej

wielkości (resztkowa amplifikacja z udziałem primerów

zewnętrznych, mieszane produkty powstałe na bazie

primera zewnętrznego i wewnętrznego i produkty

amplifikacji z primerami wewnętrznymi.

Trzeci etap reakcji to wytwarzanie tylko krótkich

fragmentów z wykorzystaniem primerów wewnętrznych

(37-45 cykli, denaturacja 88C przez 20 s, dołączanie

primerów 50C przez 20 s, elongacja przy 72C przez 20

s.

Multipleksowy PCR (ang. multiplex

PCR)

Metoda ta pozwala na równoczesną amplifikację

kilku regionów genomu w jednej probówce przy

zastosowaniu różnych par primerów.

Taka równoczesna amplifikacja więcej niż jednego

regionu DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej

obniża koszty eksperymentów, oszczędza pracę i

czas, a także zmniejsza ryzyko kontaminacji.

Ta odmiana techniki PCR znalazła szerokie

zastosowanie, np. do wykrywania czynników

zakaźnych, diagnostyki chorób genetycznie

uwarunkowanych, wykrywania różnego typu

mutacji.

Różnicowy PCR (ang. differential

PCR)

Podstawą różnicowego PCR jest możliwość
amplifikacji genu targetowego i fragmentu
odnośnikowego w tej samej probówce
reakcyjnej.

Taka równoczesna amplifikacja ilościowo
określonego fragmentu odnośnikowego i
fragmentu o nieznanej liczbie kopii w jednej
probówce może posłużyć do ilościowego
określenia sekwencji targetowej.

Amplifikacja nieznanych sekwencji

Możliwość specyficznej amplifikacji DNA zależy od tego

czy znamy jego sekwencję nukleotydową. Często

jednak dysponujemy matrycowym DNA, którego

sekwencja nukleotydowa jest całkowicie nieznana, a

dysponujemy tylko znajomością sekwencji

nukleotydowej pokrewnych genów pochodzących z

innych gatunków. W takich sytuacjach jednak

amplifikacja PCR jest również możliwa przy

zastosowaniu zdegenerowanych primerów

oligonukleotydowych (tzw.

primery uniwersalne

).

Inną strategią jest zaprojektowanie primerów na

podstawie znajomości sekwencji aminokwasowej

peptydów lub białek. To podejście napotyka trudności

ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego

(większość aminokwasów jest kodowana przez więcej

niż jeden kodon). Stąd, primery projektowane na

podstawie sekwencji aminokwasowej powinny być w

pełni redundentne. Z tego też względu na ogół stosuje

się krótkie primery, np. stosunkowo krótki primer

złożony z 15 nukleotydów ma już 512 różnych

permutacji.

Sekwencja nukleotydowa primera ustalona na

podstawie sekwencji aminokwasowej peptydu

Sekwenc

ja

peptydu

L

A

T

N

N

Odpowia

dające

kodony

C T G

C T A

C T T

C T C

T T A

T T G

GC A

GC T

GC C

GC G

AC T

AC A
AC C

AC G

AA T

AA C

AA T

AA C

Sekwenc

ja

primera

[C,T] T

[N]

GC [N]

AC [N]

AA [T,C]

AA [T,C]

Amplifikacja nieznanych sekwencji

Pewnym rozwiązaniem w amplifikacji nieznanych

sekwencji jest zastosowanie uniwersalnej zasady jaką

jest inozyna, którą można podstawić w miejscach

okupowanych przez 3 lub 4 różne zasady. Inozyna jest

zasadą purynową, naturalnie występującą w rzadko

występującym nukleotydzie pewnych rodzaji tRNA i ma

zdolność parowania z wszystkimi czteroma

podstawowymi zasadami (A, C, G, T). Nie zaleca się

stosowania inozynowych nukleotydów przy końcu 3'

primera.

Zastosowanie wysoce zdegenerowanych primerów do

reakcji PCR nie wymaga żadnych specyficznych

warunków reakcji, chociaż obniżenie temperatury

dołączania primerów może być konieczne w niektórych

przypadkach.

Czynniki wpływające na efektywność

PCR

Wiele różnych czynników może wpływać na

efektywność amplifikacji DNA metodą PCR.

Oczywistym jest, że w zoptymalizowanym

systemie niewielka zmiana jednego lub kilku

zasadniczych czynników reakcji będzie miała duży

wpływ na efektywność procesu.

Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji

PCR są:

1.

stężenie jonów Mg,

2.

dNTP,

3.

aktywność polimerazy Taq,

4.

zmiana profilu temperaturowego cyklu, a

szczególnie zmiana temperatury dołączania

primerów.

Czynniki wpływające na efektywność

PCR

Stwierdzono na przykład, że:

10 mM MgCl

2

hamuje aktywność polimerazy Taq

w 40-50%,

gdy stężenie jonów jednowartościowych

przekroczy 75 mM KCl obserwowany jest wyraźny

efekt hamujący.

Nawet w przypadku zoptymalizowania parametrów

reakcji PCR, wyniki mogą być

niesatysfakcjonujące i wtedy należy rozważyć

wpływ innych cznników mogących obniżać

efektywność.

Do nich należą między innymi:

natura natywnego materiału matrycy,

stosowana metoda do izolacji matrycowego DNA,

związki chemiczne użyte do izolacji DNA i w

śladowych ilościach wprowadzone do próbki

reakcyjnej PCR.

Czynniki wpływające na efektywność

PCR

Hamowanie przez analizowany materiał

Typowymi źródłami matrycowego DNA dla
reakcji PCR w diagnostyce są między
innymi:
mocz,
krew obwodowa,
wymazy komórkowe,
ślina,
płyn mózgowo rdzeniowy,
materiały biopsji.

Czynniki wpływające na efektywność

PCR

Mocz zawiera wiele inhibitorów reakcji PCR.

Izolacja matrycowego DNA z moczu jest prosta.

Polega na 10 min gotowaniu próbki moczu, co

wystarcza do uwolnienia DNA z materiału

komórkowego i cząstek zakaźnych (np. wirusów)

przez hydrolizę struktur białkowych. Takie próbki

DNA muszą zostać rozcieńczone, aby nie

hamowały reakcji PCR. Z drugiej jednak strony

rozcieńczenie obniża ilość czynników zakaźnych w

jednostce objętości, co oczywiście utrudnia nieraz

wykrywalność patogenów (trudna interpretacja

wyników negatywnych). Trudno dokładnie określić

naturę tych inhibitorów, stąd reakcje PCR z takimi

nieznanymi substancjami inhibitorowymi

wymagają bezwzględnie dobrych próbek

kontrolnych, które określą aktualną wrażliwość na

inhibicję.

Czynniki wpływające na efektywność

PCR

Stosowanie krwi obwodowej jako źródło matrycowego DNA

czasami czyni pewne problemy.

Próbki krwi powinny być pobierane do probówek zawierających

EDTA (1 mg/ml) jako antykoagulenta.

Próbki pobierane na heparynę (14.3 U/ml krwi) nie nadają się do

celów PCR. Heparyna całkowicie hamuje amplifikację matrycowego

DNA podczas PCR. Taki efekt działania heparyny nie może być

zniesiony przez żadną ze znanych metod izolacji i oczyszczania

DNA. Jedyną możliwością jest inkubowanie DNA z heparynazą I lub

II.

Ekstrakcja DNA z krwi powinna wyeliminować zanieczyszczenia

związkami porfirynowymi pochodzącymi z hemu (dobre

oddzielenie erytrocytów od leukocytów). Są one substancjami

najsilniej hamującymi reakcje PCR wykonywanych z matrycowym

DNA otrzymywanym z krwi. Pozbawione porfiryn próbki DNA z krwi

najwydajniej otrzymuje się poddając najpierw wybiórczej lizie

erytrocyty, a następnie leukocyty selektywnie osadza się przez

wirowanie i przemywa buforem. Z oczyszczonych od erytrocytów

komórek leukocytów izoluje się DNA, który jest pozbawiony

porfiryn.

Hamowanie przez związki chemiczne

stosowane do izolacji DNA

Powszechnie do izolacji DNA używa się detergentów

potrzebnych do lizy komórek i denaturacji białek

związanych z kwasami nukleinowymi.

Detergenty ogólnie można podzielić na niejonowe i

jonowe. Nonidet P-40, Tween 20, Triton X-1000 i N-

oktyloglikozyd należą do grupy detergentów

niejonowych. Natomiast dezoksycholan sodu, sarkozyl i

sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) należą do grupy

detergentów jonowych.

Zastosowanie detergentów niejonowych zamiast

detergentów jonowych w izolacji DNA dla celów PCR

jest korzystniejsze.

Hamowanie przez związki chemiczne

stosowane do izolacji DNA

Wykazano, że detergenty niejonowe nie hamują aktywności

polimerazy Taq w stężeniach <5%, za wyjątkiem N-

oktyloglikozydu, który hamuje reakcję PCR w stężeniach

powyżej 0.4%. Stąd, niekonieczna staje się ekstrakcja

fenolowa lizatów komórkowych poddanych działaniu

proteinazy K z detergentem niejonowym przed nastawieniem

reakcji PCR (proteinazę K inaktywuje się termicznie).

Zaoszczędza to znacznie czas przygotowania próbki DNA do

PCR i redukuje możliwość zaistnienia kontaminacji.

Detergenty jonowe hamują aktywność polimerazy Taq już

przy bardzo niskich stężeniach. Jonowe detergenty

stosowane do lizy komórek i denaturacji białek muszą być

usunięte przez ekstrakcję fenolową i precypitację etanolową

przed nastawieniem reakcji PCR. Jest to spowodowane tym,

że większość detergentów stosuje się w stężeniach wyższych

niż te które są kompatibilne z PCR (np. SDS bardzo często

stosuje się w 2% stężeniu końcowym).

Hamowanie przez związki chemiczne

stosowane do izolacji DNA

Stwierdzono, że 0.001% SDS ma niewielki efekt

stymulacyjny na PCR.

Natomiast, 0.01% SDS obniża aktywność polimerazy

Taq do 10%, a 0.1% SDS hamuje prawie całkowicie

reakcję PCR (aktywność polimerazy Taq <0.1% w

stosunku do pełnej aktywności).

Hamujący efekt niskich stężeń SDS może być

kompensowany przez pewne niejonowe detergenty

(np. 0.5% Tween 20 przeciwdziała hamowaniu reakcji

PCR przez 0.1% SDS). Jednak bardziej zalecane jest

całkowite usuwanie SDS z próbki DNA.

Wydajną eliminację SDS z próbki DNA uzyskuje się

przez ekstrakcję fenolową i następnie precypitację

etanolową stosując 0.2 M chlorek sodu zamiast octanu

amonu przed dodaniem etanolu, co pozostawia SDS w

stanie rozpuszczonym, zapobiegając koprecypitacji

SDS z kwasami nukleinowymi.

Hamowanie przez związki chemiczne

stosowane do izolacji DNA

Proteinaza K jest proteazą często stosowaną w

metodach lizy komórek i izolacji DNA. Pozostawienie

nawet resztkowej aktywności tego enzymu w

mieszaninie reakcyjnej może bardzo szybko

zdegradować proteolitycznie polimerazę Taq. Stąd,

należy bezwzględnie dobrze zinaktywować proteinazę

K przez ogrzanie lizatu komórkowego lub

oczyszczonych próbek DNA w temperaturze 95C

przez 10 min.

Ślady fenolu w próbce DNA do PCR hamują aktywność

polimerazy DNA. Problem ten można wyeliminować

usuwając ślady fenolu pochodzącego z ekstrakcji

fenolowej przez końcową ekstrakcję DNA mieszaniną

chloroform-alkohol izoamylowy (49:1). Następnie DNA

precypituje się z etanolem i solą, a resztki soli usuwa

się przez przemywanie sprecypitowanego DNA 70-80%

etanolem.

Hamowanie przez związki chemiczne

stosowane do izolacji DNA

Stężenie soli w mieszaninie reakcyjnej w znaczny

sposób wpływa na aktywność polimerazy Taq.
50 mM chlorek amonu daje niewielką inhibicję,
50 mM octan amonu jest bez wpływu na efektywność

reakcji,
50 mM chlorek sodu stymuluje reakcję o 25-30%.
Powyższe dane trzeba brać pod uwagę, ponieważ

koprecypitowane z matrycowym DNA sole mogą

wpływać na aktywność polimerazy Taq.
Inne jony wprowadzane do mieszaniny reakcyjnej PCR,

np. jony potasu, wpływają na Tm primera. Tę

zależność wyraża wzór:

Tm = 81.5 + 16.6(log10 [J+]) + 0.41 (%G+C) - (600/l) - 0.63

(%FA).

Hamowanie przez związki chemiczne

stosowane do izolacji DNA

Badano także wpływ sperminy, spermidyny i

poliamin na efektywność reakcji PCR. Wykazano, że:

spermina i spermidyna w stężeniach od 0.5 do 3 mM

nie ma wpływu na amplifikację PCR,

według innych autorów obserwuje się wyraźną

stymulację amplifikacji PCR przez sperminę lub

spermidynę w stężeniach od 0.4 do 0.6 mM,

spermidyna działa skuteczniej od sperminy.

Pokazano również pozytywny wpływ poliamin na

amplifikację PCR z optimum przy stężeniu 0.6 mM.

Formamid (3%) w kombinacji z poliaminą (0.6 mM)

częściowo hamował stymulacyjny efekt poliamin.

Taki sam efekt wykazywał także glicerol.

Dodatkowe składniki wpływające na

efektywność PCR

Dodanie pewnych dodatkowych
składników do mieszaniny reakcyjnej PCR
może wpływać na:

temperaturę topnienia primerów,
termiczny profil aktywności polimerazy
Taq,
stopień denaturacji,
ułatwienie dołączania primerów
(hamowanie tworzenia struktur
drugorzędo-wych primerów).

Dodatkowe składniki wpływające

na efektywność PCR

Każda specyficzna reakcja PCR pozostaje unikalną.

Stąd, działanie dodatkowych składników mieszaniny

reakcyjnej PCR jest nierównocenne. Pewne próby

reakcyjne mogą być wzmaciane, natomiast na inne ten

sam składnik, przy zastosowaniu tych samych stężeń,

może nie mieć żadnego wpływu.

Jednym z tych czynników jest DMSO (dwumetylo-

sulfotlenek). Jest on silnym denaturantem

powodującym lepszą denaturację matrycowego DNA.

Stwierdzono, że:

1.

dodanie DMSO do reakcji PCR może eliminować

tworzenie struktur drugorzędowych przez primery,

2.

DMSO obniża Tm o 5-6C,

3.

gdy stężenie DMSO przekracza w próbce reakcyjnej

10% obserwuje się 50% zahamowanie aktywności

polimerazy Taq.

Dodatkowe składniki wpływające

na efektywność PCR

Innym czynnikiem jest glicerol, poprawiający efektywność

niektórych reakcji PCR przy stężeniu 10-15%.

Najprawdopodobniej jego pozytywne działanie polega na:

1.

lepszej denaturacji DNA matrycy i

2.

eliminacji tworzenia się struktur drugorzędowych primerów i

matrycy.

Glicerol poprzez swoją zdolność stabilizowania struktury białka

ma również wpływ na stabilność polimerazy Taq. Glicerol w

stężeniu powyżej 20% powoduje zahamowanie reakcji PCR.

Opublikowano szereg prac wskazujących na dużą użyteczność

formamidu w polepszaniu efektywności reakcji PCR.

Stwierdzono, że formamid poprawia:

1.

wierność,

2.

powtarzalność wyników,

3.

czułość i

4.

specyficzność amplifikacji, szczególnie gdy targetem jest

sekwencja DNA bogata w pary G+C.

Stężenie formamidu poniżej 10% ma na ogół efekt pozytywny na

aktywność polimerazy Taq.

Dodatkowe składniki wpływające

na efektywność PCR

Glikol poletylenowy (PEG) został także skutecznie

zastosowany dla efektywniejszej amplifikacji DNA.

Najbardziej skuteczne stężenie określono w

zakresie 5 do 15%. Efektywność maleje przy

wysokich stężeniach przekraczających 20%.

Niejonowy detergent Tween 20 stosuje się często

w przypadku gdy istnieją podejrzenia

zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej przez

jonowy detergent SDS (np. pochodzący z izolacji

DNA metodą stosującą do lizy SDS). Tween 20

znosi hamujący efekt pewnych jonowych

detergentów.

Dodatkowe składniki wpływające

na efektywność PCR

Podsumowując:

składniki dodatkowe dodane racjonalnie do

mieszaniny reakcyjnej mogą znacznie polepszyć

efektywność, czułość i specyficzność reakcji PCR,

wpływając na różne parametry reakcji;

trudno jest jednoznacznie określić jaki jest

dokładnie mechanizm polepszania efektywności

reakcji PCR przez te czynniki (przypuszczalnie jest

on sumą efektów zachodzących w każdym cyklu

reakcji poprzez wpływ na denaturację matryc,

hybrydyzację primerów i aktywność polimerazy

Taq).