ODWROTNA TRANSKRYPCJA RT-PCR

RT-PCR

• RT-PCR (ang. reverse transcription polymerase chain reaction) – to modyfikacja metody PCR, skłdajaca się z dwóch etapów:

• Odwrotnej transkrypcji

• Amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą klasycznej reakcji PCR.

• Dodatkowym etapem badania ekspresji genu jest elektroforeza produktów (amplifikatów) reakcji PCR wykonywana najczęściej w żelu agarozowym

≠ Real-time PCR

Odwrotna transkrypcja

• Enzymatyczna synteza duniciowego DNA na matrycy jednoniciowego RNA

• Enzymem używanym w tym procecie jest odwrotna transkryptaza

• P roces ten naturalnie występuje u wirusów np. HIV gdy włączają one swój materiał genetyczny do materiału gospodarza i replikują go.

Reakcję odwrotnej transkrypcji można przeprowadzać na całym RNA, bądź jedynie na mRNA. Ważnym elementem jest usunięcie genomowego DNA, które mogłoby być matrycą w standardowej reakcji PCR. W celu powielenia RNA często stosuje się oligo-T startery, które są komplementarne do końca 3’ poli-A mRNA.

Startery

Do reakcji odwrotnej transkrypcji można użyć trzech rodzajów starterów:

• specyficznych do danej sekwencji;

• o przypadkowej sekwencji;

• starterów zawierających końcach dużą liczbę tymin

 

• Startery oligo(dT)15 - z dodatkowym nukleotydem (kotwicą) pozwalają syntezować pierwszą nić cDNA od 3’ końca mRNA - poli(A). Bardzo wygodne w zastosowaniu umożliwiają syntezę cDNA na matrycy mRNA, którego długość nie przekracza 5 000 pz. Otrzymany cDNA można przeznaczyć do dalszego zastosowania w reakcji PCR, Real-time PCR lub do hybrydyzacji typu Northern blot.

• Random primers (startery losowe) - 6-nukleotydowe krótkie i niespecyficznie, wiążą się z mRNA na całej jego długości. Idealne w zastosowaniu w przypadku trudnych matryc, w których struktury drugorzędowe utrudniają proces przepisania mRNA na cDNA. 64 możliwych 6-nukleotydowych kombinacji starterów powoduje przepisanie do komplementarnego DNA dowolnej matrycy RNA.

cDNA

complementary DNA jest komplementarne do określonego mRNA i systezyowane enzymatycznie-z udziałem odwrotnej transkryptazy

Wykorzystanie odwrotnej transkryptazy

• RT-PCR

• Proces odtwarzania telomerów przez telomerazę

• Towarzyszy przemieszczaniu retrotranspozonów w genomie gospodarza

S kład mieszaniny RT-PCR

• Wyizolowane RNA (mRNA)

• Odwrotna transkryptaza

• dNTP-mieszanina deoksynukleotydów (dATP, dTTP, dGTP oraz dCTP -adenina, tymina, guanina, cytozyna)

• Startery (oligo-T , losowe)

• DTT (ditiotreitol) -stabilizator

• Bufor z jonami Mg++ i Mn++

• Woda wolna od Rnaz

• Polimera DNA (Taq)

Odwrotna transkryptaza

• Inaczej nazywana rewertazą- jest to enzym umożliwiający przepisanie nici RNA na DNA

• Wykazuje aktywność polimerazy DNA zależnej od RNA oraz aktywność rybonukleazową

• Występuje u retrowirusów,a podczas syntezy DNA robi dużo błędów, ponieważ nie ma aktywności korekcyjnej. Pozwala to na szybką akumulację mutacji w wirusach takich jak HIV, które wykorzystują ją do replikacji. Inhibitorami rewertazy są m.in. azytotymidyna i tenofowir.

Stosuje się dwa rodzaje odwrotnych transkryptaz:

• pochodzącą z wirusa AMV (z ang. avian myeloblastosis virus)

• lub z wirusa MMLV (z ang. Moloney murine leukaemia virus).

• M-MLV odwrotna transkryptaza jest jedną z polimeraz DNA zależną od RNA, która w reakcji wymaga starterów w postaci oligonukleotydów DNA oraz matrycy w postaci sekwencji RNA, aby mogła zajść synteza cDNA. Prezentowany enzym jest produktem genu pol wirusa białaczki szczurów i występuje w postaci podjednostki białkowej o masie 71 kD. M-MLV wykazuje niższą aktywność RNazy H, i jest zdolna syntezować dłuższe łańcuchy cDNA. Optimum działania 37 ͦC, pH=7,6

• AMV odwrotna transkryptaza to enzym wirusa ptasiej mieloblastomy, zaletą transkryptazy AMV jest aktywność 3’-->5’ RNazy H, która degraduje kompleksy RNA:DNA powstające podczas odwrotnej transkrypcji. Optimum działania 42-55 ͦC, pH=8,3

[dodatkowe informacje o RNazach bo na to zwróciła uwagę w mojej prezentacji]

Rybonukleazy (RNazy) są enzymami, których główną funkcją jest rozkładanie wiązań fosfodiestrowych w kwasach rybonukleinowych (RNA). Obecność tych specyficznych enzymów stwierdzono u wszystkich organizmów, przy czym w zależności od gatunku różnią się one specyficznością oraz mechanizmem działania enzymatycznego [1]. Rybonukleazy występują także w skórze ludzkiej, gdzie niektóre RNazy z ludzkiego naskórka wykazują tylko aktywność hydrolityczną, podczas gdy inne uważane są za istotne w procesie przyczepności i złuszczania keratynocytów [6].

Scharakteryzowano dwie główne klasy rybonukleaz, a mianowicie:

1. Endorybonukleazy  tj. enzymy rozkładające wiązania wewnątrz łańcucha RNA

2. Egzonukleazy, których zadaniem jesy uwalnianie nukleotydówz kwasu rybonukleinowego (RNA) na jego zakończeniach.

Jako enzymy rybonukleazy pełnią w komórce różnorodne funkcje. I tak przypisuje się im udział w procesie dojrzewania prekursorów kwasów nukleinowych oraz w rozkładzie RNA. Ponadto, Rnaza I uczestniczy w układzie obronnym organizmu.  Choć specyficzność Rnaz wiąże się z jednoniciowymi fragmentami kwasu rybonukleinowego, znana jest też tzw. Rnaza H, która atakuje hybrydy RNA-DNA. 

RNaza H –odpowiedzialna jest za uwuwanie primerów RNA,pozwalając na połaczenie nowo zsyntezowanego DNA

[Fragment po angielsku-bardzo ciezko jest coś znaleźć po polsu,a nie chce popełnić żadnych błędów merytorycznych przy tłumaczeniu]

Because RNase H specifically degrades only the RNA in RNA:DNA hybrids, it is commonly used in molecular biology to destroy the RNA template after first-strand complementary DNA (cDNA) synthesis by reverse transcription, as well as in procedures such as nuclease protection assays. RNase H can also be used to degrade specific RNA strands when the cDNA oligonucleotide is hybridized, such as the removal of the polyadenine tail from mRNA hybridized to oligo(dT), or the destruction of a chosen non-coding RNA inside or outside the living cell. To terminate the reaction, a chelator, such as EDTA, is often added to sequester the required metal ions in the reaction mixture.

Reakcję RT-PCR można przeprowadzić w dwojaki sposób :

• 1. One step RT-PCR

• 2. Two-step RT-PCR

• W pierwszym wariancie całość reakcji zachodzi w jednej probówce co zapobiega kontaminacji próbki oraz ułatwia proces.

• T wo-step RT-PCR wymaga zastosowania dwóch probówek dla każdego z dwóch etapów. W pierwszym kroku przeprowadzana jest odwrotna transkrypcja całego RNA bądź poli(A)RNA na cDNA. W kolejnym etapie stosowane są już specyficzne primery, które pozwalają na amplifikację danej sekwencji cDNA. Ten rodzaj reakcji jest bardziej specyficzny.

W technice ‘one-step’ :

• reakcje RT i PCR przeprowadzone są w jednej probówce, dlatego wymagane jest zastosowanie starterów specyficznych dla badanych sekwencji,

• metoda wygodna, szybka i czuła,

• zminimalizowana liczba etapów zwiększa powtarzalność i zmniejsza ryzyko kontaminacji,

• Zmniejszone szanse na zanieczyszczenia,

• ograniczeniem techniki jest możliwość uzyskania tylko określonego rodzaju produktu, co uniemożliwia wykorzystanie otrzymanego cDNA do innych aplikacji,

• dodatkowym problemem jest ujemny wpływ odczynników reakcji odwrotnej transkrypcji na wydajność reakcji PCR.

• Idealna do analizowania dużej ilości próbek

W technice ‘two-step’

• etap przepisania RNA na cDNA oraz amplifikacja badanych sekwencji są rozdzielone.

• Elastyczność,

• możliwość wyboru startera,

• Zdolność do optymalizacji dla trudnej RT -PCR ( np. w połączeniu z enzymami Platinum® dla większej specyficzności),

Zalety metody RT-PCR

Zaletą jest bardzo duża specyficzność oraz czułość.

-Pozwala na określenie obecności ekspresji danego genu w komórce oraz poziomu jego ekspresji.

-Ułatwia pracę z RNA, które jest stosunkowo niestabilne i łatwo ulega degradacji.

ZASTOSOWANIE

Technika ta używana jest m.in. do:

• studiowania transkryptu sklonowanego genu,

• testowania RNA pochodzącego z różnych tkanek na obecność danych transkryptów w celu określenia wzoru ekspresji genu.

• Badania molekularnego podłoża chorób (nowotwory)

• Przykłady zastosowania RT-PCR: (szczegółowe-nie mówiłam o tym na prezentacji)

1.RT-PCR przeprowadzono na całym mitochondrialnym (mt)RNA pochodzącym z sadzonek pszenicy i kultur tkankowych. Badano obecność genu rps13, który koduje rybosomalne białko S13, oraz genu atp6, który koduje podjednostkę 6 kompleksu syntazy ATP. Wyniki: kultury in vitro mogą utrudniać potranskrypcyjną regulację ekspresji genów. Produkty amplifikacji wklonowano w plazmidowy wektor pUC19.
2. Analiza ekspresji białka - gluteniny w rozwijającym się ziarnie pszenicy (cecha: najczęściej analizowane są zboża we wczesnych etapach rozwoju tj.ziarna, sadzonki). RT-PCR został użyty ponieważ jest bardzo wrażliwą metodą pozwalającą na badanie bardzo blisko spokrewnionych genów – należących do tej samej rodziny, których odróżnienie poprzez hybrydyzację mogłoby okazać się niemożliwe (bardzo bliskie podobieństwo sekwencji uniemożliwia prawidłową hybrydyzację)
3. Badanie ekspresji genu związanego z kiełkowaniem, kodującego karboksypeptydazę serynową podczas różnicowania tkanki naczyniowej w ziarnach pszenicy i jej sadzonkach. RT-PCR było przeprowadzone na całym RNA wyizolowanym z wyselekcjonowanych ziaren aleuronowych, tarczek rosnących ziaren pszenicy oraz kiełków i korzeni z rozwijających się sadzonek.
4.Transaktywacja kukurydzianego transpozonu (Ds) w transgenicznej pszenicy, w której ekspresji ulegał gen transpozazy (Ac). Całe RNA uzyskano z 0,5g liści (Ac transformants – czyli transgeniczna z transpozazą). Ekspresję tego genu określono za pomocą metody Northern-blot i RTPCR. Przeprowadzono 25 cykli PCR.
5. Przeprowadzono analizę wzorów ekspresji dwóch genów ekspansyn pomidora: LeExp1 i LeExp18 w korzeniach porażonych mątwikiem ziemniaczanym (G. rostochiensis). Analiza obejmowała badania ich ekspresji na poziomie mRNA metodami in vitro i in situ. Metodą RTPCR in vitro stwierdzono obecność transkryptów obu genów zarówno w roślinach nie porażonych jak i porażonych larwami nicienia. W nie porażonych roślinach pomidora metodą RTPCR in vitro wykryto silną ekspresję LeExp1 w czerwonym owocu, a słabą ekspresję tego genu w kwiatach, korzeniu i zielonym owocu oraz liściu. Tą samą metodą wykryto ekspresję genu LeExp18 w liściu, kwiatach, korzeniu oraz zielonym i czerwonym owocu.
6. Badania paleoepidemiologiczne - zastosowano reakcję RT-PCR - polegającą na amplifikacji (PCR) cząsteczek cDNA (komplementarny DNA) zsyntetyzowanych (odwrotna transkrypcja - RT) na matrycy RNA. Powielano RNA odzyskany z komórek zachowanych w parafinie oraz pochodzących z pochowanych w wiecznej zmarzlinie zwłok osób, których śmierć spowodowała druga fala grypy hiszpanki. Okazało się, że śmiertelna dla człowieka odmiana grypy powstała w ptakach, a jej rezerwuarem było przypuszczalnie ptactwo wodne. Niestety śladowe ilości zachowanego RNA nie pozwoliły ustalić, dlaczego była ona tak niebezpieczna dla człowieka i kiedy powstała.