KWASY NUKLEINOWE, IZOLACJA, ANALIZA, ROZDZIAŁ.

ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY PRODUKTÓW PCR.

• ELEKTROFOREZA – technika stosowana przy rozdziale, analizie, i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.

• DNA i RNA mają ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem, nadawanym przez grupy fosforanowe, migrują w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.

ELEKTROFOREZA – schemat postępowania jest następujący: żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. Saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem, który następnie wyciąga się. W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków do których wprowadzone są próbki DNA oraz z reguły tzw. standard, czyli mieszanina cząsteczek o znanych masach dzięki czemu będzie możliwa później kalibracja żelu. Przed naniesieniem próbki na że muszą być odpowiednio przygotowane: dodawany jest barwnik, który informuje nas jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki (co jest niezbędne, ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz związek interkalujący – bromek etydyny który fluoryzuje w UV co pozwoli nam na zlokalizowanie prążków. Minimalna ilość DNA którą widać na prążku to 20ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodzącym prąd o stałym i określonym napięciu i natężeniu. Jakość rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jakości stosuję się napięcie nie wyższe niż 5V na 1cm długości żelu.

TECHNIKA PCR

PCR pozwala na powielenie In vitro i analizę wybranego fragmentu genomu, polegająca na sekwencji wielokrotnego ogrzewania oziębiania próbki. Umożliwia zwielokrotnienie (amplifikację) w ciągu kilku godzin określonego fragmentu DNA lub RNA w milionowych liczbach jego kopii. Gdyby wydajność procesu była 100%, po n cyklach reakcji z jednej molekuły otrzymalibyśmy 2n molekuł.

OPTYMALIZACJA REAKCJI PCR

• Nie przebiega w 100% wydajności

• W celu zwiększenia wydajności należy odpowiednio zmieniać warunki reakcji

• Optymalizacja jest bardzo ważna w przypadku amplifikowania docelowej sekwencji występującej w populacji z innymi sekwencjami

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA EFEKTYWNOŚĆ REAKCJI PCR:

• Wyposażenie: typ próbówki, typ termocyklera

• Ilość cykli, temperatura i czas termicznego cyklu

• Objętość próbówki reakcyjnej

• Próbka DNA (ilość, czystość)

PRAMETRY ULEGAJĄCE ZMIANĄ W REAKCJI PCR:

• Stężenie matrycy

• ilość matrycowego DNA powinna mieścić się w zakresie: plazmidowy DNA 0,01-1ng oraz genomowy DNA 0,1-1ng

• większa ilość matrycowego DNA zwiększa zawartość niespecyficznych produktów PCR

• Temperatura przyłączania starterów

• punkt wyjścia: temperatura dysocjacji dupleksu starter – matryca oznaczona jako temperatura topnienia

• najlepsze rezultaty: startery których Tm jest równe lub wyższe 54 stopnie

• starter krótszy niż 25 nukleotydów : Tm oblicza się ze wzoru Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

• długość startera większa niż 25 nukleotydów: Tm oblicza specjalistycznym programem komputerowym

• im dłuższe startery tym większa temperatura topnienia (łatwiejsza praca)

• wraz z obniżeniem temperatury maleje specyficzność

• Stężenie MgCl₂

• waha się od 1-1,4mM

• podwyższając stężenie nukleotydów należy zwiększać stężenie jonów Mg

• nukleotydy redukują pulę wolnych jonów Mg wpływając w ten sposób na aktywność polimerazy i hybrydyzację starterów

• za dużo jonów Mg – zwiększona ilość niespecyficznych produktów PCR i obniża zgodność syntezy

• jeżeli próbka DNA zawiera EDTA to zawartość Mg powinna wzrosnąć

• Stężenie dNTP

• W mieszaninie reakcyjnej każdego dNTP zwykle po 2,5mM

• Nierówna ilość dNTP redukuje wydajność amplifikacji

• Stężenie polimerazy Tag

• W 25mikro litrach mieszaniny reakcyjnej zwykle używa się 0,1-1U

• Wyższe stężenie – synteza niespecyficznych produktów

• jeżeli w mieszaninie reakcyjnej obecne są inhibitory większa ilość polimerazy jest pomocna w otrzymaniu lepszej zawartości produktów amplifikacji

BUFOR – mieszanina poza buforem Tris o pH 8, często zawiera różne dodatki takie jak: BSA, siarczan amonu, Triton. Te dodatki mogą stabilizować polimerazę oraz modyfikować oddziaływania między matrycą i starterami.

Jeżeli przebieg reakcji nie jest optymalny to podczas badania produktów, często zamiast zdefiniowanego prążka w żelu pojawia się raczej rozciągnięta plama (smear) mieszaniny rozmaitych produktów.

JAK ZAPOBIEC NIESPECYFICZNEJ AMPLIFIKACJI:

• użycie dobrze oczyszczonej matrycy w odpowiednim stężeniu

• stosować startery o wysokim Tm

• Tm powinny być takie same albo bardzo zbliżone dla obu starterów

• Dobrze dobrać stężenie Mg

• Nie stosować nadmiaru Tag polimerazy

• Unikać dużych stężeń EDTA w buforze w którym jest zawieszona matryca

• Unikać pracy z termocyklerem różnych firm w tym samym laboratorium

• Dobrze dobrać temperaturę przyłączenia starterów

STARTERY – krótkie fragmenty oligonukleotydów, specyficznie rozpoznającą określoną sekwencje DNA. W reakcji PCR startery rozpoznają sekwencje i ją zaznaczają.

POLIMERAZA – enzym mający zdolność syntezy nici komplementarnej na matrycy pojedynczej nici kwasu nukleinowego. Polimerazy występują u wszystkich organizmów żywych. W zależności od syntetyzowanej nici wyróżnia się polimerazy DNA syntetyzujące nić DNA (np. w procesie replikacji) i polimerazy RNA syntetyzujące nić RNA (np. w procesie transkrypcji).

POLIMERAZA DNA – enzym katalizujący syntezę DNA w czasie replikacji lub naprawy DNA. Synteza ta polega na polimeryzacji deoksyrybonukleotydów przez wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych między nimi. Substratami do tej reakcji są nukleotydy trój fosforanowe, a jej produktem ubocznym jest pirofosforan, złożony z dwóch reszt fosforanowych. Dlatego składnikami DNA są nukleotydy jedno fosforanowe. Większość polimeraz DNA wymaga matrycy, w formie jedno niciowego DNA lub RNA, z krótkim obszarem dwu niciowym. Odcinek dwu niciowy powstaje przez przyłączenie się do jedno niciowej matrycy krótkiego komplementarnego do matrycy odcinka DNA lub RNA, zwanego primerem lub starterem (zwykle ma długość od kilku do 20 nukleotydów)

DZIAŁANIE POLIMERAZY DNA – polega na wydłużeniu primera przez dobudowywanie nukleotydów komplementarnych do matrycy na końcu 3 primera, a później na końcu 3 wydłużonego primera. Polimerazy DNA dostarczają jako produktu DNA, natomiast jako matrycę mogą stosować DNA lub RNA. Wyjątkowo, odwrotne transkryptazy są przedstawicielami polimeraz DNA, które bardzo wydajnie przepisują RNA na DNA (odwrotna transkrypcja cDNA)

ETAPY REAKCJI PCR

• Denaturacja dwu niciowego DNA

• Przyłączenie (hybrydyzacja) primerów do miejsc komplementarnych w matrycowym DNA

• Wydłużenie (elongacja) primerów przez syntezę wolnych nukleotydów

W 30 cyklach PCR z 1 kopii DNA uzyskujemy 1 061 109 567 kopii DNA !!!