Ćwiczenie 8

Podstawy diagnostyki ziarenkowców Gram-dodatnich

I. Część teoretyczna

Ziarenkowce gram-dodatnie

należą do różnych grup taksonomicznych, są one jednak podobne

fenotypowo.

Wspólną cechą tych bakterii jest kulisty lub owalny kształt komórek i tworzenie układów

podziałowych (dwoinki, tetrady, pakiety, łańcuszki). Większość gatunków to bakterie względnie
beztlenowe, tylko rodzaj Micrococcus

należy do bezwzględnych tlenowców.

Ziarenkowce te są zarówno komensalami wchodzącymi w skład naturalnej flory ludzi i zwierząt,

jak i bezwzględnymi patogenami lub mogą być warunkowo chorobotwórcze. Spośród tlenowych i
względnie beztlenowych ziarniaków Gram-dodatnich, z klinicznego punktu widzenia, największe
znaczenie mają rodzaje: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus. Rodzaj Micrococcus należy do
drobnoustrojów saprofitycznych, jednakże ze względu na powszechne występowanie, często izolowany
jest ze środowiska, a także może stanowić zanieczyszczenie materiału diagnostycznego.

Klasyfikacja rodzajów Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus i Micrococcus wg Bergey’s Manual
of Systematic Bacteriology z roku 2005 roku:

Typ BXIII. Firmicutes

Klasa III. Bacilli

Rząd I. Bacillales

Rząd II. Lactobacillales

Rodzina VIII. Staphylococcaceae

Rodzina IV. Enterococcaceae

- Rodzaj I. Staphylococcus

- Rodzaj I. Enterococcus

Rodzina VI. Streptococcaceae
-

Rodzaj I. Streptococcus

Typ BXIV Actinobacteria

Klasa I. Actinobacteria

Podklasa V. Actinobacteridae

Rząd I. Actinomycetales

Podrząd II. Micrococcineae

Rodzina I. Micrococcaceae

- Rodzaj I. Micrococcus

Rodzaj Staphylococcus

Do rodzaju Staphylococcus nal

eży 41 gatunków lub podgatunków. Większość gatunków

gronkowców stanowi fizjologiczną florę, głównie skóry i przedsionka nosa. Są też przyczyną wielu
infekcji.
Gronkowce można podzielić na dwie podstawowe grupy tj.:

gronkowce koagulazo-dodatnie: S. aureus,

gronkowce koagulazo-ujemne (np.: S. epidermidis, S. saprophiticus, S. haemolyticus).

Należy jednak zaznaczyć, że koagulazę wytwarzają również S. intermedius (jak dotąd chorobotwórczy
tylko dla zwierząt, rzadko spotykany u ludzi) i niektóre szczepy S. hyicus, a niektóre kliniczne szczepy S.
aureus

nie wytwarzają koagulazy. Inny podział uwzględnia wrażliwość gronkowców koagulazoujemnych

na nowobiocynę. Do gatunków nowobiocynowrażliwych należy np.: S. epidermidis, S. hominis, S.
haemolyticus, a do nowobiocynoopornych S. saprophyticus.

Najważniejszy i najbardziej wirulentny gatunek to S. aureus. Gronkowce złociste nie posiadają

jednego wyraźnie zdefiniowanego czynnika zjadliwości. Za ich chorobotwórczość odpowiedzialny jest
zespół cech.

2

Chorobotwórczość S. aureus determinowana jest przez szereg składników powierzchni takich jak:
kwasy tejchojowe (mogą wyzwalać reakcję aktywacji dopełniacza oraz pobudzać makrofagi do
wydzielania cytokin), czynnik skupiania osocza (receptor fibrynogenu osocza -

clumping factor) i białko

wiążące kolagen (uczestniczą w adhezji), białko A (wiąże region Fc immunoglobulin, co utrudnia
fagocytozę), otoczka.
Drobnoustroje te wyt

warzają zewnątrzkomórkowo wiele toksyn i enzymów, które są odpowiedzialne za

patogenezę odpowiednich zakażeń. Najważniejsze z nich to:

- koagulaza – zmienia fibrynogen w fibrynę, która otacza drobnoustroje w tkance, co utrudnia

fagocytozę

- hemolizyny ( , , ) – wywołują lizę erytrocytów; hemolizyna może wywoływać działanie letalne

w OUN, uszkadzać błony oraz powodować martwicę skóry

- leukocydyna – uszkadza makrofagi
- eksfoliatyny (toksyna epidermolityczna) – odpowiedzialne są za forme epidermolizy
- enterotoksyny – superantygeny; zatrucia pokarmowe
- toksyna-1 zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1) – superantygen; wywołuje wstrząs toksyczny
- enzymy takie jak: fibrynolizyna (stafylokinaza), hialuronidaza, nukleazy, proteazy, lipazy

Stałą cechą S. aureus jest wytwarzanie koagulazy, i ciepłostałej DNAzy (co jest wykorzystane w
diagnostyce tych drobnoustrojów).

Pierwotne infekcje wywoływane przez S. aureus to przede wszystkim choroby skóry takie jak

czyraki, czyraki mnogie,

ropnie, pęcherzyce, zespół oparzonej skóry, trądzik oraz zakażenia miejsca

operowanego.

Zakażenia wewnętrznych narządów i tkanek nie są powszechne, jakkolwiek S. aureus

może być przyczyną zapalenia zatok, zapalenie ucha środkowego, połogowe zapalenie sutka. Do innych
rodzajów zakażeń inwazyjnych wywoływanych przez S. aureus należą: zapalenie wsierdzia po zabiegu
kardiochirurgicznym, pooperacyjne lub pourazowe zapalenie kości oraz kości i szpiku, pogrypowe
zapalenie płuc, sepsa, a także zakażenie układu moczowego, przewodu pokarmowego, zatrucia
pokarmowe i inne.
U około 20-40% populacji S. aureus kolonizuje przedsionek nosa (nosicielstwo S. aureus).

Gronkowce koagulazo-ujemne (CNS -

ang. Coagulase Negative Staphylocicci) stanowią

komensalną i fizjologiczną florę skóry i błon śluzowych człowieka. Są to drobnoustroje typowo
oportunistyczne -

mogą być przyczyna zakażeń jeżeli mechanizmy obronne gospodarza ulegną

osłabieniu lub gdy dostaną się do tkanek (uszkodzona skóra i błony śluzowe mogą stanowić wrota
zakażenia dla tych drobnoustrojów). Gatunkiem najczęściej izolowanym z zakażeń jest S. epidermidis.
Jest on

przyczyną zakażeń związanych z obecnością wszczepu (zastawki sercowe, rozruszniki serca,

różne protezy, cewniki śródnaczyniowe i inne tzw. biomateriały), ciągłą ambulatoryjna dializą
otrzewnową. S. epidermidis może być przyczyną zakażeń skóry i endocarditis., S. saprophyticus jest
przyczyną infekcji dróg moczowych (dominuje u młodych kobiet), S. haemolyticus, S. lugdunensis, S.
schleiferi

mogą wywoływać infekcje zbliżone do infekcji wywoływanych przez S. epidermidis.

Diagnostyka Staphylococcus spp.
Podłoża:

agar wzbogacony

bulion wzbogacony

podłoże agarowe z krwią (agar wzbogacony krwią baranią) - krwinki są hemolizowane przez i
hemolizyny (obserwacja hemolizy po 24h inkubacji); gronkowce tworzą kolonie białe, szare lub
złocistopomarańczowe, gładkie, okrągłe, wilgotne, kopulaste

podłoże Chapmana z mannitolem i NaCl (wybiórczo-różnicujące); wysokie stężenie NaCl (7,5%) jest
czynnikiem wybiórczym, który hamuje wzrost większości Gram-ujemnych i Gram-dodatnich; oprócz
gronkowców mogą na tym podłożu wzrastać bakterie wykazujące tolerancję na NaCl takie jak Bacillus
spp., Corynebacterium spp., Micrococcus spp., Enterococcus spp.

, grzyby drożdżopodobne;

różnicująca właściwość tego podłoża jest wynikiem obecności mannitolu, niektóre gatunki

gronkowców np. S. aureus fermentują mannitol tworząc żółte kolonie otoczone żółtą obwódką,

3

drobnoustroje nie fermentujące mannitolu np. S epidermidis w większości przypadków są małe i
otoczone czerwoną lub purpurową obwódką

podłoże Baird-Parkera (wybiórczo-różnicujące) służy do namnażania szczepów Staphylococcus
aureus,

szczególnie izolowanych z produktów żywnościowych i leków. Jest bogate w składniki

odżywcze: trzy peptony, glicynę i pirogronian sodu, który pobudza wzrost szczepów zmienionych
podczas produkcji. Wybiórczość podłoża w stosunku do Staphylococcus aureus zapewnia chlorek
litu. Teluryn potasu (czynnik różnicujący) ulega redukcji, powodując czarne zabarwienie kolonii.
Obecność żółtka jaja kurzego pozwala wykryć lipazę wytwarzaną przez niektóre szczepy
Staphylococcus aureus

, wokół których pojawia się przejaśnienie, a niekiedy drobna precypitacja. Na

tym podłożu mogą się rozwijać również inne niż gronkowce drobnoustroje np. Enterococcus, Listeria,
Proteus, Pseudomonas

, grzyby drożdżopodobne, lecz żaden z tych drobnoustrojów nie wytwarza

jaśniejszej otoczki

Testy różnicujące gronkowce od innych ziarniaków Gram-dodatnich

Test na wytwarzanie katalazy -

dla odróżnienia od enterokoków, które są katalazo-ujemne.

Oznaczanie

w podłożu płynnym. Do 5ml hodowli bulionowej dodajemy 1ml 3% H

2

O

2

. Szczepy

katalazo

(+) powodują uwolnienie tlenu z H

2

O

2

co objawia się burzeniem hodowli. Oznaczanie

kontrolne polega na dodaniu H

2

O

2

do niezaszczepionego podłoża.

Oznaczanie w p

odłożu stałym. Na kolonię nakrapia się 3% H

2

O

2

.

pojawienie sie pęcherzyków

uwalnianego tlenu wskazuje na wytwarzanie katalazy. Oznaczanie kontrolne polega na
nakropieniu 3% H

2

O

2

na czyste podłoże (Uwaga! Testu nie wykonuje się na podłożach z krwią).

Tolerancja tlenu -

posiew na podłoża tlenowe i beztlenowe do odróżnienia od mikrokoków, które są

wyłącznie tlenowe

Test na oznaczanie zdolności do wykorzystania cukrów z wytworzeniem kwasu w warunkach
tlenowych i beztlenowych - odczyn O-F (oxidation-fermentation test)
Wykorzystuje się w tym celu zmodyfikowane podłoże Hugh - Leifsona z glukozą [ inne niż przy Gram
(-

) ]. Do dwóch probówek z podłożem posiewamy oczko hodowli aż do dna probówek. Następnie,

j

edną z probówek pokrywamy warstwą jałowej parafiny (w tym przypadku przed posiewem podłoże

należy zregenerować ). Inkubacja 5 dni, odczyt codziennie.
Jeśli cukier jest wykorzystywany z wytworzeniem kwasu - następuje zmiana zabarwienia z ciemno-
fioletowego na żółty. Brak zmiany zabarwienia świadczy o niewykorzystaniu cukru
Gronkowce cechują się beztlenowym rozkładem glukozy (zmiana zabarwienia podłoża na żółte w
otwartej i pokrytej parafiną probówce) w odróżnieniu od mikrokoków, które utleniają glukozę (zmiana
zabarwienia podłoża na żółte w „otwartej” probówce) lub są asacharolityczne (brak zmiany
zabarwienia w obu probówkach).

Oznaczenie wrażliwości na furazolidon - odróżnienie wrażliwych na furazolidon gronkowców od
opornych mikrokoków.

Test wykonuje

się metodą dyfuzyjno-krążkową. Zawiesinę drobnoustrojów o gęstości 0,5 wg skali

MacFarlanda posiewa się wymazówką na podłoże Mueller-Hintona (grubość 3,5 - 4 mm), Następnie
nakłada się krążek wysycony furazolidonem. Próbę inkubuje się w 35-37

o

C 18-24h.

Wystąpienie

strefy zahamowania wzrostu wskazuje na wrażliwość na furozolidon. Gronkowce, w odróżnienie od
mikrokoków są wrażliwe na ten antybiotyk.

Oznaczanie wytwarzania

oksydazy cytochromowej. Oksydaza cytochromowa katalizuje w obecności

tlenu utlenianie zreduko

wanych cytochromów. Enzym ten występuje u drobnoustrojów bezwzględnie

tlenowych np. Micrococcus spp.
W wykrywaniu oksydazy cytochromowej stosuje się odczynniki, które są bezbarwne ale po utlenieniu
zabarwiają się. W badaniu tym można zastosować dichlorowodorek tetrametylo-p-fenylenodiaminy
lub dichlorowodorek dimetylo-p-

fenylenodiaminy. Po utlenieniu odczynniki te przyjmują barwę

fioletowa lub granatową. Test można wykonać poprzez nakropienie odczynnika na hodowle lub do
zawiesiny bądź poprzez roztarcie masy bakteryjnej na bibule wysyconej odczynnikiem. W obecności

4

oksydazy z dodawanych odczynników powstaje błękit indofenolu, co objawia się wystąpieniem
intensywnie niebieskiego zabarwienia w ciągu 30s - 2 min. (obecność oksydazy cytochromowej)

Testy różnicujące gronkowce wewnątrzrodzajowo

Oznaczanie wytwarzania koagulazy -

test ten służy do różnicowania S. aureus od innych gronkowców

(poza S. aureus

koagulazę wytwarza kilka innych gatunków lecz występują one głównie u zwierząt).

Koagulaza jest to czynnik

, który ścina osocze. Występuje ona w dwóch formach. Pierwsza,

koagulaza związana (clumping factor), związana ze ścianą komórkową, wykrywana jest testem
szkiełkowym. Koagulaza związana działa bezpośrednio na fibrynogen tworząc nierozpuszczalny
skrzep fibryny (grudki). Druga forma to wolna koagulaza, która jest wydzielana przez komórki i
wykrywana jest w teście probówkowym. Koagulaza zewnątrzkomórkowa reaguje z „coagulase-
reacting factor (CRF) tworząc coagulase-CRF complex, substancje, która jest klinicznie nie do
odróżnienia od trombiny. Ten kompleks następnie działa na fibrynogen i powstaje nierozpuszczalny
skrzep fibryny.

Test szkiełkowy. Test ten przeprowadza się z zastosowaniem osocza króliczego (odpowiednio
przygotowane z cytrynianem sodu lub preparat gotowy w formie liofilizowanej). Na szkiełku
podstaw

owym umieścić obok siebie dwie krople roztworu soli fizjologicznej, w obu kroplach

zawiesić badane bakterie (gęstość homogennej zawiesiny powinna w przybliżeniu odpowiadać
wyglądowi mleka - gęsta zawiesina). Do jednej kropli dodać oczko ezy osocza i delikatnie
wymieszać. W ciągu kilkunastu sekund powinny pojawić się wyraźne kłaczki - wynik dodatni.
Zawiesina bakterii bez dodanego osocza powinna pozostać homogenna. Pojawienie się kłaczków
w zawiesinie bez osocza świadczy o autoaglutynacji bakterii i nie może być podstawą do przyjęcia
wyniku ani dodatniego ani ujemnego.

Test probówkowy. Stosuje się osocze królicze (odpowiednio przygotowane z cytrynianem sodu lub
preparat gotowy w formie liofilizowanej). Do 0,5 ml zawiesiny badanych gronkowców dodać 0,5 ml
osoc

za. W identyczny sposób przygotować kontrole ze szczepami koagulazo-ujemnym i

koagulazo-

dodatnim. Inkubować w temp. 37

o

C. Wynik testu należy odczytywać po 1, 3 , 6, 24 h.

Wynik dodatni -

wyraźny skrzep.

Slidex Staph Kit -

zestaw do diagnostyki gronkowców in vitro (szybka identyfikacja S. aureus). Test ten

jest połączeniem testu lateksowego z testem hemaglutynacji i służy do wykrywania obecności
czynnika zlepnego (clumping factor), białka A i innych antygenów swoistych dla S. aureus.

Odczynniki: R1 - odczynnik przeciw S. aureus (anti S. aureus reagent) - krwinki czerwone uczulone
fibrynogenem i lateks uczulony IgG (Anti-S. aureus, monoklonalna), mertiolat sodu, azydek sodu.
Odczynnik R2 - odczynnik kontrolny - nieuczulone krwinki czerwone i nieuczulony lateks, mertiolat
sodu, azydek sodu.

Wymieszać odczynnik testowy R1 i kontrolny R2. Na czyste szkiełko podstawowe nanieść kroplę

odczynnika R1 i R2, do każdej kropli dodać po kilka kolonii bakterii, wymieszać każdą kroplę (ok. 10
s), porusza

jąc delikatnie ruchem kolistym (ok. 20 s). Wynik dodatni - aglutynacja w ciągu 30 s

wykazująca widoczny zlep uczulonych krwinek czerwonych i/lub lateksu przy ujemnej kontroli (z
odczynnikiem R2). Wynik ujemny -

jednorodna zawiesina zarówno w kropli z odczynnikiem R1, jak i z

R2

Oznaczenie wrażliwości na nowobiocynę. Badanie wykonuje się w celu odróżnienia gatunków CNS
wrażliwych na nowobiocynę (np.: S. epidermidis) od opornych na ten antybiotyk (np.; S.
saprophyticus).

Badanie wykonuje się identycznie jak oznaczanie wrażliwości na furazolidon. Stosuje się krążki

zawierające 5 g nowobiocyny. Strefa zahamowania wzrostu o średnicy 16 mm wskazuje na
drobnoustrój oporny na nowobiocynę, natomiast większa niż 16 mm na wrażliwy.

Oznaczanie DNAzy. Badanie przeprowadza się z użyciem podłóż zawierających kwas
de

zoksyrybonukleinowy (DNA). Jeżeli drobnoustrój wytwarza DNAzę z obecnego w podłożu kwasu

powstają oligonukleotydy. Aktywności DNAzy może być wykrywana za pomocą kwasu solnego lub
błękitu toluidyny lub zieleni metylowej. W metodzie z HCl wykorzystuje się fakt, że DNA nie jest w nim

5

rozpuszczalne, natomiast ol

igonukleotydy są rozpuszczalne. Hodowlę bakterii na podłożu z DNA

zalewa się HCI, jeżeli DNA nie zostało rozłożone powstaje opalizująca strefa precypitacji, jeżeli DNA
zostało rozłożone wokół kolonii widoczna jest strefa przejaśnienia. Z kolei błęki toluidyny i zieleń
metylowa są to barwniki metachromatyczne. Błękit toluidyny po połączeniu z DNA tworzy niebieskie
zabarwienie, jeżeli natomiast DNA zostało rozłożone powstaje różowe zabarwienie podłoża w miejscu
gdzie nastąpiła degradacja. Podobnie, w obecności DNA zieleń metylowa pozostaje zielona,
natomiast przy braku DNA zieleń zostaje uwolniona i jest bezbarwna.

Poniżej przedstawiono przykłady manualnych, półautomatycznych i automatycznych komercyjnych
biochemicznych systemów identyfikacyjnych dla gronkowców
Systemy nieautomatyczne:
API Staph; bioMerieux
Micro-ID; Organon Teknika
Minitek; BBL
Systemy półautomatyczne:
ATB Expression; bioMerieux - ID 32 Staph
RAPID ATB STAPH
Sceptor; BBL
MicroScan; Baxter Diagnostics
Systemy automatyczne:
Vitek; bioMerieux
Vitek 2; bioMerieux
Vitek 2 compact; bioMerieux
Phoenix; BD Biosciences
Walk Away; Baxter Diagnostics

API STAPH jest biochemicznym systemem

, w którym identyfikacja gronkowców i mikrokoków oparta jest

o 19 testów różnicujących (wytwarzanie kwasu z 14 węglowodanów, redukcja azotanów do azotynów,
wytwarzanie fosfatazy zasadowej, wytwarzanie acety-metylo-karbinolu, dihydrolaza argininy, ureaza).
API STAPH składa się z pasków zawierających odwodnione substraty testowe w pojedynczych
probówkach. Substraty rozpuszcza się przez dodanie do każdej mikrobrobówki zawiesiny testowanego
szczepu. Następnie, test inkubuje się 18 h (w niektórych przypadkach 48h) w temperaturze 30-37

O

C.

Odczytu i interpretacji dokonuje

się zgodnie z informacjami podanymi przez producenta.

ATB -

ID 32 STAPH jest systemem umożliwiającym identyfikację rodzajów Staphylococcus,

Micrococcus, Stomatococcus, Aerococcus.

Szereg biochemiczny ID 32 STAPH składa się z 32 testów.

Po 24 h inkubacji za

chodzące reakcje odczytuje się w automacie ATB lub wizualnie. Identyfikację

przeprowadza się przy pomocy tabeli identyfikacyjnej, Książki Kodów lub odpowiedniego
oprogramowania.

Diagnostyka Streptococcus spp. i Enterococcus spp.

Drobnoustroje z rodzaju Streptococcus spp. i Enterococcus spp.

należą do ziarniaków

Gram-dodatnich,

katalazo-ujemnych.

Ziarniaki

Gram-dodatnie

katalazo-

ujemne występują

powszechnie w środowisku naturalnym (gleba, woda, rośliny, powietrze), w produktach żywnościowych
pochodzenia r

oślinnego i zwierzęcego. Mogą kolonizować skórę i/lub błony śluzowe człowieka i

uczestniczyć w zakażeniach z różną lokalizacją.
Rosną na podłożach stosowanych w diagnostyce laboratoryjnej. Należą do drobnoustrojów mezofilnych,
optymalna temperatura wzrostu - 30 - 44

o

C. Rosną w obecności tlenu, w warunkach mikroaerofilnych ,

6

jak i beztlenowych. Nie wytwarzają przetrwalników, wiele jest opornych na wysychanie i przeżywają w
powietrzu, glebie i innych składnikach środowiska.
W

preparatach barwionych układają się w dwoinki, tetrady, łańcuszki, mogą występować także

pojedyńczo lub tworzyć nieregularne skupiska.
Do ziarniaków Gram-dodatnich katalazo-ujemnych należą m.inn. następujące rodzaje:

Streptococcus -

mikroflora górnych dróg oddechowych; duże znaczenie kliniczne

Enterococcus -

mikroflora przewodu pokarmowego; duże znaczenie kliniczne

Gemella -

mikroflora górnych dróg oddechowych; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

Aerococcus -

środowisko naturalne, produkty zwierzęce; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

Leuconostoc -

środowisko naturalne, znaczenie w przemyśle mleczarskim, przy produkcji marynat,

win; rzadko izolowane z materiałów klinicznych

Pediococcus -

środowisko naturalne, wykorzystywane w przemyśle browarniczym i spożywczym

(piwo, wino, ser

y, kiełbasy, produkty warzywne); bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z

materiałów klinicznych

Lactococcus -

występują w żywności, przewodzie pokarmowym u ludzi, wykorzystywane w przemyśle

spożywczym; bakterie kwasu mlekowego; rzadko izolowane z materiałów klinicznych
Drobnoustroje te charakteryzują się zróżnicowaną wrażliwością na antybiotyki. Wszystkie są

naturalnie oporne na amidynopenicyliny, monobaktamy i stare chinolony. Bakterie z rodzaju
Streptococcus

są naturalnie oporne na aminoglikozydy, z rodzaju Enterococcus są naturalnie oporne na

aminoglikozydy, penicyliny, cefalosporyny, polimyksyny, linkozamidy. Pediococcus i Leuconostoc
wykazują naturalną oporność wysokiego stopnia na wankomycynę. Naturalna zmniejszona wrażliwość
na penicyliny występuje wśród ziarniaków z rodzajów Lactococcus, Leuconostoc i Aerococcus.
W diagnostyce Gram-

dodatnich ziarniaków, katalazo-ujemnych wykorzystuje się następujące cechy:

zdolność do wytwarzania hemolizy na podłożu agarowym z dodatkiem 5% krwi baraniej; hemoliza
beta -

całkowita - całkowity rozkład krwinek czerwonych, strefa hemolozy wyraźnie odgraniczona od

reszty niezhemolizowanego podłoża, wielkośc strefy często przekracza parokrotnie średnicę kolonii,
alfa -

częściowa - częściowe rozpuszczenie krwinek, zazielenienie podłoża, niewielka przejrzystość,

wielkość strefy hemolizy alfa jest zwykle mniejsza niż hemolizy beta, gamma - brak hemolizy

wzrost w 45

o

C

wzrost w bulionie z 6,5% NaCl

wzrost w bulionie o pH 9,6

hydroliza L-pirrolidonyl - beta- naftylamidu prz

ez aminopeptydazę pyrolidonylową (PYR) w wyniku

czego powstaje naftylamid czerwonego koloru po dodaniu 0,01% odczynnika cinnamaldehydu

hydroliza eskuliny -

w wyniku rozkładu powstaje dekstroza i eskuletina, która reaguje z cytrynianem

żelaza dając brązowo-brunatny produkt

rozpuszczalność w żółci (identyfikacja S. pneumoniae) - sole żółci uczynniają enzymy autolityczne
poprzez działanie na powierzchnię komórki w wyniku czego następuje liza komórki

zdolność wzrostu w obecności żółci

test CAMP (identyfikacja Streptococcus gr. B) - czynnik CAMP (Co-

cytolizyna B) jest ciepłostałą

wydzielaną zewnątrzkomórkowo proteiną, która działa synergistycznie z toksyną beta gronkowców.
Po posiewie na podłożu z krwią S. agalactiae i prostopadle do niego S. aureus wytwarzającego beta-
hemolizynę wystąpi charakterystyczny trójkąt hemolizy

wrażliwość na bacytracynę (identyfikacja S. pyogenes) - krążeë wysycony bacytracyną (substancja o
działaniu przeciwdrobnoustrojowym produkowana przez bakterie Gram-dodatnie) w stężeniu 0,04 j

wr

ażliwość na optochinę (identyfikacją S. pneumoniae) - krążek wysycony optochiną w stężeniu 5 ug

obecność antygenu grupowego (wielocukru C) - po ekstrakcji enzymatycznej antygeny
polisacharydowe znajdujące się w ścianie komórkowej paciorkowca uwidaczniają się w reakcji
aglutynacji cząsteczek lateksu uczulonych swoistymi, grupowymi immunoglobulinami króliczymi

7

Rodzaj Sreptococcus

Rodzaj Streptococcus

skupia liczne gatunki charakteryzujące się odmiennymi właściwościami

fenotypowymi i genotypowymi oraz różną chorobotwórczością.
Według ostatniej klasyfikacji dzielony jest na sześć grup filogenetycznych (I-VI) na podstawie różnic w
sekwencji podjednostki 16S rRNA.

Grupę siódmą stanowią gatunki o nieustalonej przynależności.

Przynależność gatunków o największym znaczeniu klinicznym
I

– paciorkowce ropotwórcze:

S. pyogenes

S. agalactiae

S. dysgalactiae

II

– Grupa Streptococcus bovis:

S. bovis

III

– Grupa Streptococcus mitis:

S. mitis

S. pneumoniae

S. oralis

S. sanguis

IV - Grupa Streptococcus mutans:

S. mutans

S. sobrinus

V - Grupa Streptococcus salivarius

S. salivarius subsp. Salivarius

VI - Grupa Streptococcus milleri

S. anginosus

(lub Grupa Streptococcus anginosus)

S. intermedius

VII

– Inne gatunki o nieustalonej przynależności

S. pleomorphus

Na przestrzeni lat wprowadzano różne schematy klasyfikacyjne streptokoków.
Pierwszy podział uwzględnia typy hemolizy na podłożu agarowym z 5% krwią baranią:

paciorkowce beta-

hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które całkowicie rozkładają krwinki

czerwone

paciorkowce alfa-

hemolizujące - wytwarzające hemolizyny, które częściowo rozkładają krwinki

czerwone

paciorkowce niehemolizujące (gamma-hemolizujące) - nie wytwarzające hemolizyn

Drugi, k

lasyczny podział na grupy serologiczne wg Rebeki Lancefield (1933), uwzględnia różnice w

budowie antygenowej składników ściany komórkowej (immunologicznie czynnego wielocukru C lub
kwasu lipotejchojowego

). Grupy serologiczne oznaczone są dużymi literami alfabetu od A do W. Jest to

podział szczególnie przydatny w identyfikacji paciorkowców.
Grupy serologiczne paciorkowców o znaczeniu klinicznym:

grupa serologiczna A

– S. pyogenes

grupa serologiczna B

– S. agalactiae

grupa serologiczna C

– S. dysgalactiae

grupa serologiczna D

– S. bovis

grupa serologiczna F

– niektóre paciorkowce grupy S. milleri

grupa serologiczna G

– S. canis

Kolejny p

odział praktyczny obejmuje:

paciorkowce ropotwórcze

Streptococcus pyogenes (grupa serologiczna A , na

podłożu z krwią wywołują hemolizę typu

beta)

Streptococcus agalactiae (grupa serologiczna B, n

a podłożu z krwią wywołują hemolizę typu

beta, mogą też występować szczepy o typie hemolizy alfa lub gamma)

S. equi ssp. equi (grupa serologiczna C - hemoliza beta), S. equi ssp zooepidermicus (grupa

serologiczna C, hemoliza beta), S. equisimilis (grupa serologiczna C, hemoliza beta). S.
dysgalactiae (grupa serologiczna C, hemoliza alfa).

Streptococcus pneumoniae (hemoliza alfa, s

zczepy tego rodzaju nie mają antygenu grupowego)

paciorkowce jamy ustnej (do nie

dawna nazywane „grupa viridans” - zieleniące)

8

Grupa S. mutans (hemoliza gamma)
Grupa S. salivarius (hemoliza gamma)

Streptococcus bovis (hemoliza gamma; grupa serologiczna D)

Grupa S. milleri (lub S. anginosus); (hemoliza gamma, alfa, beta; grupa serologiczna A, C, F, G)
Grupa S. sanguis (lub S. oralis); (hemoliza alfa; grupa serologiczna H, W)

Streptococcus mitis (hemoliza alfa; grupa serologiczna O - biotyp 1 oraz K - biotyp 2)

inne - S. acidominimus, S. uberis

paciorkowce wybredne (wymagają do wzrostu witaminy B6 lub innych związków np.: L-cysteiny,
glutationu, tioglikolanu) - S. defektivus, S. adjacens

W

patologii człowieka istotne znaczenie odgrywa kilkanaście gatunków. Od ludzi z materiałów

klinicznych najczęściej izolowane są: S. pyogenes, S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. pneumoniae.
S. pyogenes

to najczęstszy i najważniejszy spośród paciorkowców czynnik etiologiczny zakażeń. Za ich

chorobotwórczość odpowiedzialnych jest wiele czynników. Niektóre szczepy wytwarzają otoczkę
zbudowaną z kwasu hialuronowego. Białko powierzchniowe M zakotwiczone w mureinie ma własności
antyfagocytarne.
Najważniejsze pozakomórkowe czynniki zjadliwości to:

streptolizyny O i S (hemolizyny)

– niszczą błony komórkowe erytrocytów i innych komórek

(streptolizyno O jest silny

m immunogenem, w następstwie zakażenia można wykryć podwyższone

miano przeciwciał przeciwko tej toksynie – miano antystreptolizyny O – ASO)

toksyny pirogenne

– superantygeny, odpowiedzialne za gorączkę, wysypkę płoniczą, sepsę i

wstrząs toksyczny
- toksyny erytrogenne – wywołują wysypkę charakterystyczna dla płonicy
- egzotoksyna A – jest superantygenem odpowiedzialnym za objawy ogólne zakażeń

paciorkowcami grupy A

(sepsa, zespół wstrząsu toksycznego)

- egzotoksyna B (proteaza cysteinowa) – jest odpowiedzialna za niszczenie tkanek u pacjentów z

martwiczym zapaleniem powięzi

czynniki ułatwiające rozprzestrzenianie (enzymy)
- streptokinaza – rozpuszcza fibrynę
- hialuronidaza – rozkłada substancję spajającą tkanki
- DNaza (streptodornaza) – rozkłada DNA, upłynnia ropę.
- proteinazy – ułatwiają rozprzestrzenianie w tkankach

S. pyogenes

wywołuje:

zapalenie gardła i anginę

ropne zapalenie skóry

liszajec

różę – rozlane zakażenie skóry lub błon śluzowych (zwykle wystepuje na kończynach i na twarzy)

celulitis

– zakażenie skóry i przylegającej tkanki łącznej

gorączkę połogową

martwicze zapalenie powięzi

ropne zapalenie węzłów chłonnych i ucha środkowego, zapalenie wyrostka sutkowego, zapalenie
zatok

płonicę (szkarlatynę)

paciorkowcowy zespół wstrząsu toksycznego

posocznica (możliwe równoczesne występowanie zapalenia wsierdzia)

rumień guzowaty (powikłanie infekcji paciorkowcowej)

odległe następstwa przebytych zakażeń paciorkowcowych – gorączka reumatyczna (gościec
stawowy), ostre kłębuszkowe zapalenie nerek, zapalenie mięśnia sercowego, reumatyczne zapalenie
stawów

S. pyogenes może stanowić część flory bakteryjnej błon śluzowych dróg oddechowych u nosicieli

9

Streptococcus pneumoniae

tworzy owalne lub lancetowato zakończone komórki układające się w

pary lub krótkie łańcuszki, otoczone grubą otoczką polisacharydową, która ma własności
antyfagocytarne. Zewnątrzkomórkowe czynniki zjadliwości wytwarzane przez pneumokoki to proteaza
IgA, która inaktywuje wydzielnicze IgA.
Drobnoustrój ten jest czynnikiem etiologicznym płatowego zapalenie płuc, odoskrzelowego zapalenia
płuc, zapalenia oskrzeli, zapalenia ucha środkowego, zapalenia zatok, zapalenia opon mózgowo-
rdzeniowych, owrzodzenia rogówki, sepsy.
Pneumokoki często występują na śluzówka dróg oddechowych. Około 40-70% dorosłych ludzi jest
nosicielami tego drobnoustroju.
Streptococcus agalactiae

są często izolowane z jamy nosowo-gardłowej, przewodu pokarmowego i

pochwy zdrowych ludzi. Drobnoustrój ten może wywoływać zakażenia skóry i tkanki łącznej, sepsę,
zakażenie układu moczowego, zapalenie płuc oraz zapalenie otrzewnej u osób z immunosupresją. Jest
znaczącym czynnikiem zakażeń noworodków nabywanych podczas przechodzenia przez kanał rodny
(kolonizacja pochwy matki)

– sepsy i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.

Paciorkowce jamy ustnej (S. mutans, S. sanguis, S. mitis)

są odpowiedzialne za zapalenie wsierdzia

oraz próchnice zębów.

Diagnostyka paciorkowców

Paciorkowce to Gram-

dodatnie bakterie kształtu kulistego lub owalnego, w preparacie układają

się w pary lub tworzą łańcuszki. Nie wytwarzają przetrwalników i poza nielicznymi wyjątkami nie
wykazują ruchu. Fermentują glukozę do kwasu mlekowego. Są tlenowcami lub względnymi
beztlenowcami. Na podłożu agarowym z krwią tworzą kolonie małe (0,5 - 1 mm), najczęściej wypukłe,
gładkie, błyszczące, matowe lub śluzowe, często otoczone strefą hemolizy. Jednakże morfologia kolonii
paciorkowców jest różnorodna. S. pyogenes tworzy kolonie małe, przeźroczyste, otoczone relatywnie
dużą strefą beta-hemolizy. Kolonie S. agalactiae są większe, bardziej płaskie, kremowe, śluzowe i
otoczone mniejszą strefą hemolizy, często możliwą do zaobserwowania po usunięciu kolonii. Kolonie S.
pneumoniae

są początkowo wypukłe, starsze kolonie mają wklęsły środek powstający na skutek

działania enzymów autolitycznych, strefa hemolizy alfa przybiera zabarwienie brązowo-zielone.
Paciorkowce grupy „viridans” tworzą kolonie małe, opalizujące, otoczone wyraźną strefą hemolizy alfa o
zabarwieniu zielonym.
Podłoża
Paciorkowce należą do drobnoustrojów wybrednych. Rosną słabo lub nie rosną na podłożach zwykłych.
Rosną dobrze na podłożach wzbogaconych takich jak: podłoże tryptozowo sojowe (TSA), wyciąg
mózgowo sercowy (BHI), bulion Todd-Hewitt’a, Columbia agar/bulion z dodatkiem krwi lub surowicy,
agar wzbogacony z dodatkiem krwi, bulion cukrowy.
Podłoża wybiórcze

agar z krwią i z fioletem krystalicznym; fiolet krystaliczny powoduje zahamowanie wzrostu innych niż
paciorkowce drobnoustrojów

podłoża wybiórcze dla S. pyogenes - z dodatkiem neomycyny, trimetoprimu i sulfametoksazolu (STX),
kolistyny -

dodanie antybiotyków hamuje wzrost innych niż S. pyogenes drobnoustrojów

występujących w górnych drogach oddechowych

Diagnostyka paciorkowców oparta jest na ustaleniu typu hemolizy. Identyfikacja paciorkowców beta-
hemolizujących polega na przeprowadzeniu testów serologicznych i klasyfikacji do grup A, B, C, D, F, G.
Paciorkowce alfa lub gamma-

hemolizujące identyfikuje się surowicami anty D i anty B. W celu dalszej

identyfikacji przeprowadza się testy fizjologiczne i biochemiczne. Najczęściej wykonywane testy
przedstawiono w poniższych tabelach.
W diagnostyce paciorkowców wykorzystywane są również zestawy komercyjne oparte na testach
biochemicznych np.: test API 20S (test 24 godzinny), Rapid STR (test 4 godzinny).

10

Do wykazania obecności paciorkowców (ich antygenów) bezpośrednio w materiale badanym
wykorzystuje się lateksowe testy aglutynacyjne ( S. pyogenes, S. agalactiae, Grupa C paciorkowców, S.
pneumoniae), test koaglutynacji (S. pyogenes) oraz testy immunoenzymatyczne (S. pyogenes, S.
agalactiae).

Różnicowanie paciorkowców beta-hemolizujących

Drobnoustrój

Wrażliwość

na

bacytracynę

Wrażliwość

na STX

Antygen

grupowy

Test CAMP

PYR

S. pyogenes

wrażliwy

oporny

A

-

+

S. agalactiae

oporny

oporny

B

+

-

Różnicowanie S. pneumoniae i grupy „viridans”

Drobnoustrój

Wrażliwość na optochinę

Rozpuszczalność w żółci

S. pneumoniae

wrażliwy

+

Grupa „viridans”

oporne

-

Rodzaj Enterococcus

Do lat osiemdziesiątych enterokoki zaliczano do grupy D paciorkowców. Inne paciorkowce należące do
grupy D określano jako „nonenterococci” (S. bovis, S. equinus). Przyczyną podziału paciorkowców grupy
D na dwie kategorie była przede wszystkim ich różnica we wrażliwości na antybiotyki betalaktamowe
(enterokoki wykazują wyższe wartości MIC). W połowie lat osiemdziesiątych na podstawie badań
genetycznych utworzono nowy rodzaj Enterococcus.
Aktualnie do rodzaju Enterococcus należy ponad 20 gatunków, z których u ludzi wykazano co najmniej
10. Najczęściej izolowanym gatunkiem jest E. faecalis (>95% izolatów), drugim co do częstości
występowania jest E. faecium. Do rzadko izolowanych od ludzi należą następujące gatunki: E. avium, E.
durans, E. gallinarum, E. hirae, E. raffinosus, E. casseliflavus, E. flavescens, E. dispar. Jako klasyczne
bakterie oportunistyczne wykazują niski poziom chorobotwórczości. Jednak są one coraz częściej
izolowane z zakażeń szpitalnych. Najpoważniejszym zakażeniem enterokokowym jest zapalenie
wsierdzia.

Wywołują one u ludzi również zakażenia przewodu moczowego, szczególnie dotyczy to

pacjentów hospitalizowanych, zakażenia ran i tkanek miękkich, zakażenia wewnątrzbrzuszne, zakażenia
w obrębie miednicy, opon mózgowo-rdzeniowych, zakażenia wszczepów i protez.

Charakterystyka
Do rodzaju Enterococcus

należą ziarniaki Gram-dodatnie, katalazo-ujemne. W preparatach barwionych

komórki układają się w pary lub łańcuszki. Są względnymi beztlenowcami. Rosną na podłożach
zwykłych. Na podłożu agarowym z krwią powoduję hemolizę alfa, niektóre szczepy mogą wytwarzać
hemolizę gamma lub beta.
Podłoża
Do hodowli drobnoust

rojów z rodzaju Enterococcus stosowane są podłoża:

agar wzbogacony z dodatkiem 5% krwi baraniej

podłoże tryptozowo sojowe

wyciąg mózgowo sercowy

D-Coccosel agar -

podłoże wybiórcze dla mikroorganizmów rosnących w obecności żółci (czynnik

wybiórczy). Na tym podłożu może rosnąć większość pałeczek Gram-ujemnych, Staphylococcus spp,
grupa D Streptococcus i Enterococcus sp. lecz jedynie grupa D Streptococcus i Enterococcus sp
hydrolizują eskulinę (czynnik różnicujący) do eskuletiny, która reaguje z zawartym w podłożu
cytrynianem żelazowo-amonowym dając brązowo-czarny produkt

11

Identyfikacja enterokoków do rodzaju uwzględnia następujące cechy:

wygląd kolonii i rodzaj hemolizy na podłożu agarowym z krwią baranią

wygląd drobnoustrojów w preparacie barwionym metodą Grama

wytwarzanie katalazy

wzrost w bulionie z 6,5% NaCl

wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6

wzrost w 45

o

C

wzrost na podłożu z żółcią

hydroliza eskuliny
hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)

przynależność do grupy serelogicznej D

W celu identyfikacj

i enterokoków do gatunku wykorzystuje się następujące cechy:

fermentacja cukrów i alkoholi (mannitol, sorbitol, sorboza, arabinoza, rafinoza, sacharoza, laktoza)

hydroliza argininy

tolerancja tellurynu potasu (0,04% w podłożu stałym)

wykorzystanie pirogronianu

ruch

wytwarzanie barwnika
wzrost w 10

o

C

Do identyfikacji bakterii z rodzaju Enterococcus

stosowane są biochemiczne testy komercyjne

wykorzystywane w diagnostyce paciorkowców.

Różnicowanie Enterococcus spp. i paciorkowców grupy D

Testy

Enterococcus spp.

Paciorkowce grupy D

Wzrost w bulionie z 6,5% NaCl

+

-

Wzrost w podłożu płynnym o pH 9,6

+

-

Hydroliza eskuliny

+

+

Wzrost na podłożu z żółcią

+

+

Hydroliza L-pyrrolidonyl-beta-naftylamidu (PYR)

+

-

Antygen grupowy

D

D

Typ hemolizy

alfa, beta, gamma

alfa, gamma

12

II. Część praktyczna

1. Test na wytwarzanie katalazy

Test ten pozwala na odróżnienie drobnoustrojów z rodzajów Staphylococcus i Micrococcus od Streptococcus sp. i
Enterococcus sp..

Stosowany w teście nadtlenek wodoru (3% H

2

O

2

) jest rozkładany przez katalazę do wody i tlenu,

co objawia się powstawaniem pęcherzyków powietrza.
Uwaga!

Nie przeprowadza się tego testu na podłożach z krwią (krwinki zawierają katalazę)

Nanieś na hodowle drobnoustrojów kroplę . Wynik testu wpisz do tabeli

Drobnoustrój

Staphylococcus spp. Micrococcus spp.

Enterococcus spp.

Streptococcus spp.

Wynik

„+” - rozkład H

2

O

2

„-” - brak rozkładu H

2

O

2

2. Wrażliwość na furazolidon

Wrażliwość / oporność na niektóre substancje wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe jest szeroko
wykorzystywana w diagnostyce. W teście tym odróżniamy gronkowce od mikrokoków. Stosuje się krążki bibułowe
wysycone furazolidonem (100 g).

Odczytaj wynik badania wrażliwości na furazolidon. Wynik testu wpisz do tabeli

S. aureus

S. epidermidis

M. luteus

Wynik

W -

wrażliwość, O - oporność

3. Test utlenianie-fermentacja glukozy (OF - oxidation-fermentation)

Do różnicowania drobnoustrojów wykorzystuje się ich wybrane cechy metaboliczne. W identyfikacji wielu z nich,
także i gronkowców, określa się zdolność do fermentacji glukozy
W teście tym odróżniamy gronkowce (fermentacja) od mikrokoków (utlenianie lub brak reakcji).

Odczytaj wynik badania i wpisz do tabeli

Podłoże

Interpretacja

pokryte parafiną

bez parafiny

S. aureus

M. luteus

„+” - zmiana barwy z fioletowej na żółtą;

„-” - brak zmiany barwy

4. Slidex Staph Kit

Jest to test służący do szybkiej identyfikacji S. aureus. Pozwala on na wykrycie obecności clumping factor
(koagulazy związanej), białka A i innych antygenów swoistych dla S. aureus

Wykonaj test wg instrukcji. Wynik wpisz do tabeli

S. aureus

S. epidermidis

Wynik

„+” - aglutynacja; „-” - zawiesina jednorodna

13

5. Wykrywanie koagulazy wolnej

Do wykrywania wolnej koagulazy wytwarzanej przez S.

aureus stosowany jest test probówkowy

Odczytaj wynik testu i wpisz do tabeli

S. aureus

S. epidermidis

Wynik

„+” - skrzep;

„-” - zawiesina jednorodna

6. Różnicowanie paciorkowców - typy hemolizy

W diagnostyce wielu drobnoustrojów, przede wszystkim paciorkowców wykorzystuje się ich zdolność do
hemolizowania krwinek czerwonych

Obejrzyj hodowle paciorkowców i enterokoków na agarze krwawym.
Wpisz do tabeli jaki typ hemolizy jest charakterystyczny dla poszczególnych bakterii.

Typy hemolizy

-

częściowa

-

całkowita

- brak hemolizy

7. Wrażliwość na optochinę i bacytracynę

Podobnie jak w przypadku gronkowców, także i w diagnostyce paciorkowców wykorzystywana jest wrażliwość tych
drobnoustrojów na niektóre substancje wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe. Do identyfikacji
paciorkowców -hemolizujących stosuje się optochinę (5 g), natomiast -hemolizujących bacytracynę (0,04j.).

Odczytaj testy wrażliwości na optochinę i bacytracynę, wyniki wpisz do tabeli drobnoustroje oporne i wrażliwe na
te substancje.

Optochina

Bacytracyna

Wrażliwość

Oporność

Wrażliwość

Oporność

8. Różnicowanie Enterococcus spp.

Zdolność enterokoków do wzrostu w niekorzystnych warunkach wykorzystuje się w różnicowaniu tych bakterii od
innych ziarniaków Gram-dodatnich katalazo-ujemnych.

Oceń wzrost enterokoków i paciorkowców w hodowlach w bulionie z 6,5% NaCl, o pH 9,6 oraz wzrost w
temperaturze 45

o

C. Wyniki wpisz do tabeli

Bulion z 6,5% NaCl

Bulion o pH 9,6

Wzrost w temp. 45

o

C

Enterococcus faecalis

Streptococcus pyogenes

„+” - wzrost

„-” - brak wzrostu