Biotechnologia Leków – instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

1

Biosynteza, wykrywanie oraz oznaczanie aktywności przeciwgrzybowej makrolidów

polienowych.

Opracowanie: dr inż. Roland Wakieć

Wprowadzenie.

Promieniowce są bakteriami Gram-dodatnimi. Obficie występują w glebie lub na

rozkładającej się masie roślinnej. Większość z nich prowadzi saprofityczny tryb życia,

niektóre są chorobotwórcze dla roślin i zwierząt. Degradują sterydy, ligninę, chityny,

węglowodory, długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, kwasy huminowe, a więc związki z

trudem rozkładane przez inne bakterie. W trakcie rozkładu tych substancji wytwarzają m.in.

związki zapachowe. Substancje produkowane i wydzielane na zewnątrz komórek na zasadzie

sekrecji odpowiedzialne są m.in. za „ziemisty” zapach gleby, powodowany przez substancję

zwaną geosminą (1,10-dimetylo-9-dekalol), którą wytwarza Streptomyces griseus.

Promieniowce są bakteriami chemoorganotroficznymi, które rosnąc, tworzą kolonie o

kształcie wydłużonych rozgałęziających się nitek, (przypominających grzybnię). Organizmy

te zajmują wśród bakterii miejsce szczególne, ich komórki maja budowę prokariotyczną, ale

morfologią, cyklem rozwojowym i sposobem rozmnażania przypominają grzyby strzępkowe.

Strzępki promieniowców mają jednak znacznie mniejszą średnicę (szerokość nitek od 1-5

mm) i są mniej zróżnicowane morfologicznie niż w przypadku grzybów. W hodowli wgłębnej

(płynnej) promieniowce rosną w sposób charakterystyczny – w postaci grzybni nitkowatej,

kłaczków lub kuleczek nieco analogicznie do przemysłowych grzybów strzępkowych (po 2-3

dniach wzrostu, hodowla przypomina nieco namoczoną w wodzie watę).

Rysunek 1. Cykl życiowy promieniowców z rodzaju Sterptomyces.

(źródło:

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Streptomyces

)

PDF stworzony przez wersj

ę demonstracyjną pdfFactory Pro

www.pdffactory.pl/

Biotechnologia Leków – instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

2

Wzrost kolonii promieniowców z rodziny Streptomyces polega na rozwoju w pierwszej

fazie delikatnej, luźnej siatki strzępek wnikających w głąb podłoża, skąd pobierane są

składniki odżywcze – jest to tak zwana grzybnia substratowa (inaczej podstawowa lub

wegetatywna). W drugiej kolejności powstaje grzybnia generatywna, zwana inaczej wtórną

bądź powietrzną. Tworzy ona wypiętrzoną bardzo zwartą część kolonii. Tworzenie grzybni

powietrznej zakończone jest procesem sporulacji – zarodnikowania. Soronośne nitki grzybni

powietrznej – sporofory tworzą tzw. artrospory określane również jako konidia. Konidia

promieniowców mogą przetrwać w stanie uśpienia nawet do kilkunastu lat. Procesowi

kiełkowania zarodników sprzyja obecność w podłożu takich składników jak: L-alanina, L-

tyrozyna, zasady purynowe i pirymidynowe, dwutlenek węgla, jony magnezowe i wapniowe.

Po wykiełkowaniu zarodników następuje okres rozwoju grzybni, która w początkowej fazie

wzrostu rzadko podzielona jest przegrodami.

Spośród promieniowców największe znaczenie biotechnologiczne mają gatunki

tlenowe, saprofityczne, bytujące w glebie lub kompoście. Najważniejsze z tej grupy są

organizmy należące do rodzaju Sterptomyces. Wytwarzają one

2

/

3

wszystkich znanych

dotychczas antybiotyków i aż 90% antybiotyków stosowanych w lecznictwie. Poniższa tabela

przedstawia przykłady antybiotyków o różnym zastosowaniu, produkowanych przez

promieniowce, w znaczącej przewadze należące do rodzaju Streptomyces.

Promieniowce

Antybiotyki

Aktywność przeciwbakteryjna

Micromonospora purpurea

gentamycyny

Nocardia mediterrana

ryfamycyny

Streptomyces aureofaciens

tetracykliny

S. canamyceticus

kanamycyny

S. erythreus

erytromycyna

S. fradiae

neomycyna

S. griseus

streptomycyna

S. lincolnensis

linkomycyna

S. orientalis

wankomycyna

S. tenebrarius

tobramycyna

Aktywność przeciwgrzybowa

S. nodosus

amfoterycyna

S. noursei

nystatyna

Aktywność przeciwnowotworowa

S. antibioticus

aktynomycyna

S. caespitosus

mitomycyna

S. peuceticus

daunorubicyna

S. verticillus

bleomycyna

Tabela 1. Antybiotyki stosowane w lecznictwie produkowane przez promieniowce.

(za: Chmiel i Stefański, Biotechnologia i Chemia Antybiotyków, 1998).

PDF stworzony przez wersj

ę demonstracyjną pdfFactory Pro

www.pdffactory.pl/

Biotechnologia Leków – instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

3

Przedstawicielem promieniowców z rodziny Sterptomyces jest Stereptomyces

coelicolor. W chwili obecnej jest to pierwszy organizm z tej grupy, którego genom (jego

sekwencja) została całkowicie poznana. Składa on się z 8 667 507 par zasad. Genom

przypuszczalnie zawiera 7 825 genów, w skład których wchodzi ponad 20 klasterów

kodujących poznane lub przypuszczalne metabolity wtórne, wśród których są substancje o

różnorakiej aktywności biologicznej. Większość rozpoznanych genów tego organizmu jest

podobna do opisanych już wcześniej genów innych bakterii oraz genów regulatorowych.

Niezwykłe i unikalne posród organizmów bakteryjnych są geny odpowiedzialne za

różnicowanie faz rozwoju kolonii Streptomyces. Spośród metabolitów wtórnych

produkowanych przez Streptomyces coelicolor na szczególną uwagę zasługują: aktynorodyna,

undecylodigiosyna, metylenomycyna, CDA (calcium-dependent peptide antibiotic) oraz

przeciwgrzybowy antybiotyk polienowy będący pochodną amfoterycyny B. Związki te mogą

być wytwarzane przez kolonie S. coelicolor w różnych ilościach w zależności od

zmieniających się warunków bytowania. Obecność tych związków w zawiesinie

fermentacyjnej można wykrywać na różne sposoby. Jednym z najprostszych jest wykrycie

actinorodyny – niebieskiego (w pH powyżej 8,5) barwnika o właściwościach

przeciwdrobnoustrojowych. Związek ten jest produkowany przez kolonie S. coelicolor i

wydzielany z komórek na zasadzie sekrecji.

Zdjęcie 1. Sekrecja aktynorodyny przez kolonię Sterptomyces

(źródło:

http://www.hero.ac.uk/sites/hero/uk/research/archives/2002/genome_keys_unlock_nature1588.cfm)

Wygodnym i prostym sposobem na identyfikację związków w mieszaninie

pofermentacyjnej jest zastosowanie metod spektroskopowych w zakresie światła widzialnego

i UV, jeżeli oczywiście poszukiwane związki posiadają w tym przedziale długości fal

charakterystyczne maksima absorpcji. Maksimum absorpcji w przypadku aktynorodyny w pH

PDF stworzony przez wersj

ę demonstracyjną pdfFactory Pro

www.pdffactory.pl/

Biotechnologia Leków – instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

4

zasadowym występuje przy długości fali 615nm dla undecylprodigiosyny w zależności od pH

wynosi 533nm lub 468nm (odpowiednie pH kwaśne i zasadowe). W przypadku związków

polienowych, do których zalicza się m.in. amfoterycyna B, w zakresie niskich stężeń (c<10

-7

M) w obszarze 420-320 nm obserwuje się 4 pasma absorpcji przy 409, 385, 365, 347 nm

(charakterystyczne widmo tzw. oscylacyjne). Intensywność tych pasm wzrasta wraz z

długością fali.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

300

320

340

360

380

400

420

D

ługość fali [nm]

A

b

s

o

rp

c

ja

AMB
AMA
Orn-AMA
Orn-AME

Wykres 1. Charakterystyczne widma metanolowych roztworów amfoterycyny B i jej

syntetycznych pochodnych.

Makrolidy polienowe (tzw. polieny) należą do związków przeciwgrzybowych

pochodzenia naturalnego. Najskuteczniejszym chemoterapeutykiem z tej grupy jest

amfoterycyna B. Mechanizm jej działania związany jest z obecnością ergosterolu w błonie

cytoplazmatycznej grzybów. Wykazując nieco większe powinowactwo do ergosterolu niż do

występującego w komórkach ssaków cholesterolu amfoterycyna B (AMB) wiąże się

preferencyjnie z tym pierwszym, tworząc transbłonowy kanał, przez który dochodzi do

niekontrolowanego wypływu jonów jedno i dwuwartościowych (m.in. K

+

, Mg

2+

) co leży u

podstaw działania przeciwgrzybowego.

Cel ćwiczenia.

Biosynteza oraz stwierdzenie obecności w zawiesinie pofermentacyjnej Streptomyces

coelicolor antybiotybiotyków polienowych. Zapoznanie z technikami spektroskopowymi

PDF stworzony przez wersj

ę demonstracyjną pdfFactory Pro

www.pdffactory.pl/

Biotechnologia Leków – instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

5

(UV-Vis). Zapoznanie ze sposobami wzrostu promieniowców z rodzaju Streptomyces w

podłożu płynnym oraz stałym a także z morfologią ich komórek i kolonii.

Wykonanie ćwiczenia.

1. Na uprzednio przygotowane szalki Petiego (bądź skosy) z podłożem Streptomyces

Medium wysiać Streptomyces coelicolor z pożywki płynnej (lub wytwarzających

spory kolonii na podłożu stałym). Inkubować w temperaturze 26-28

0

C przez 7-10 dni

do momentu uzyskania kolonii wytwarzających spory.

(Koniec pierwszych zajęć)

2. Przy pomocy pipety nanieść na szalkę Petriego około 1 ml pożywki płynnej

Streptomyces

medium,

zmywając

powierzchnię

sporujących

kolonii

promieniowców. Po zmyciu powierzchni pobrać pipetą powstałą zawiesinę sporów w

pożywce i przenieść do kolby z pożywką płynną (ok. 100ml pożywki Sterptomyces

medium w kolbie o objętości 300-500ml) – zachować sterylne warunki pracy!!!

3. Zaszczepione kolby z pożywką płynną przenieść do wytrząsarki i prowadzić hodowlę

Streptomyces przez okres 7 dni w 26-28

0

C z intensywnym wytrząsaniem (180-200

obr/min – rpm).

4. Obejrzeć pod mikroskopem (w powiększeniu 5x i 10x) płytki z koloniami

Sterptomyces coelicolor. Zwrócić uwagę na budowę grzybni powietrznej i konidia.

Płytki oglądać uprzednio zdejmując pokrywkę, dopiero po zmyciu spor i

zaszczepieniu podłoża płynnego!!! W miarę możliwości sporządzić dokumentację

zdjęciową lub rysunki.

(Koniec drugich zajęć)

5. Przeprowadzić analizę mieszaniny pofermentacyjnej Sterptomyces coelicolor:

• Odwirować (10min, 10000 RPM) około 2 ml zawiesiny pofermentacyjnej, uzyskując

w ten sposób pozbawiony komórek supernatant.

• Pobrać do probówki typu „Falcon” około 5ml zawiesiny pofermentacyjnej oraz około

3ml n-butanolu. Wytrząsać całość przez około 15 minut. Po wytrząsaniu odwirować

(3000 RPM, 5 min.), doprowadzając do rozdzielenia faz. Zebrać fazę butanolową

(zwrócić uwagę na zmianę koloru – nie jest ona spowodowana kolorem pożywki!).

• Przeprowadzić skaningowe badanie spektroskopowe w przedziale 300-700 nm w

poszukiwaniu maksimów absorpcji charakterystycznych dla poszukiwanych

metabolitów wtórnych (na zebranej fazie butanolowej i pozbawionym komórek

supernatancie).

PDF stworzony przez wersj

ę demonstracyjną pdfFactory Pro

www.pdffactory.pl/

Biotechnologia Leków – instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

6

• Po przeprowadzeniu badań spektroskopowych, odparować na odparowywaczu

mieszaninę azeotropową butanolu z wodą (pochodzącą z pożywki), ewentualny

pozostały na ściankach w postaci filmu związek rozpuścić w niewielkiej ilości DMSO

i nanieść na krążki bibułowe (max. 20μl/krążek) na uprzednio przygotowanych

szalkach Petriego z wysianymi powierzchniowo szczepami testowymi Candida

albicans (podłoże YEPG), Bacillus cereus i E. coli (podłoże TSB). Po 24 godzinach

inkubacji (w 30

0

C w przypadku szczepu grzybowego i 37

0

C w przypadku szczepów

bakteryjnych) odczytać ewentualne strefy zahamowania wzrostu.

(Koniec trzecich zajęć – ostatnich)

Sprawozdanie

Opisać wygląd kolonii promieniowca, obserwacje mikroskopowe zilustrować zdjęciami lub

rysunkami. Opisać wygląd hodowli płynnej po 7 dniowej inkubacji. Załączyć do

sprawozdania uzyskane podczas pomiarów spektroskopowych wykresy. Opisać i

przeanalizować ewentualną zmianę koloru fazy butanolowej po ekstrakcji. Opisać ewentualne

wyniki badań aktywności biologicznej. Obecność jakich metabolitów wtórnych udało się

potwierdzić?

Sprawozdanie powstało na podstawie/literatura uzupełniająca:

1. Biotechnologia i chemia antybiotyków, A. Chmiel, S. Grudziński Wydawnictwo

Naukowe PWN, 1998

2.

Bentley, S.D. et al. Complete genome sequence of the model actinomycete
Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417, 141-147 (May 9, 2002).

3.

http://www.hero.ac.uk/sites/hero/uk/research/archives/2002/genome_keys_unlock_nat
ure1588.cfm

4.

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Streptomyces

PDF stworzony przez wersj

ę demonstracyjną pdfFactory Pro

www.pdffactory.pl/