Biosynteza witamin

B

2

, B

12

, A (karotenów), D

2

Witamina B

2

ryboflawina

1. szczepy produkujące do

100

mg witaminy na 1L

pożywki

2.

szczepy produkujące od

500

do

1000

mg/1L

3. szczepy wytwarzające do

10

g/1L

•

Do pierwszej grupy należą między innymi bakterie z rodzaju

Clostridium, Pseudomonas i Azotobacter.

•

Drugą grupę reprezentują głównie drożdże, na przykład

Candida

flareri

,

•

Trzecią - grzyby workowe

Eremothecium ashbyii

i

Ashbya

gossypii

oraz mutant

Bacillus subtilis

.

Do drobnoustrojów syntetyzujących

znaczące ilości ryboflawiny (mg/dm

3

)

należą

•

Clostridium acetobutylicum

97

•

Escherichia coli

505

•

Candida flareri

567

•

Eremothecium ashbyii

2480

•

Ashbya gossipii

6420

Do produkcji witaminy B

2

od dawna używa się

drożdży

Saccharomyces cerevisiae

które

zawierają

39-80

m

g B

2

/g suchej substancji.

Proces produkcji :

Drożdże rozdrabnia się i poddaje autolizie w

temp. 45-50°C, utrzymując pH w przedziale 6-

6,5. Ekstrakcję witaminy prowadzi się

alkoholem, a wyciąg alkoholowy zagęszcza do

60% s.s.

W Japonii w 1985 r. doniesiono o użyciu

S.

cerevisiae

do syntezy ryboflawiny na pożywce

zawierającej octan wapnia. Po 250 godz.

hodowli otrzymywano

5,8

g B

2

/dm

3

pożywki.

Przykład ulepszania zdolności

produkcji szczepu drogą mutagenezy

Do produkcji ryboflawiny z powodzeniem

używa się drożdży

Candida flareri

(Candida famata).

Według amerykańskiego patentu (1988)

można otrzymać

21 g

ryboflawiny/dm

3

pożywki po 200 godz. hodowli

mutagenizowanych drożdży

Candida

flareri

zdolnych do nadprodukcji witaminy

B

2

Przykład optymalizacji składu podłoża

hodowlanego

• Stwierdzono, że wykorzystanie węgla z

tłuszczu kukurydzianego

do biosyntezy

ryboflawiny jest prawie dwukrotnie

intensywniejsze od węgla z

glukozy

.

• Do pożywki dodaje się również

tiaminę

,

biotynę

,

inozyto

l oraz

mikroelementy

.

• Duże znaczenie ma dodatek do pożywki

glicyny

.

Izolacja i oczyszczanie ryboflawiny

• Po zakończeniu hodowli płyn zakwasza się kwasem

siarkowym do pH 4,5 i po zagęszczeniu suszy metodą

walcową lub rozpryskową, uzyskując paszowy

koncentrat witaminy B

2

.

• W przypadku otrzymywania oczyszczonej witaminy z

płynu pohodowlanego, stosuje się metody ekstrakcji,

adsorbcji, frakcjonowanego strącania.

• We wszystkich tych metodach pierwszym etapem jest

usunięcie pozostałości tłuszczu przy użyciu eteru, w

którym ryboflawina jest nierozpuszczalna

Witamina B

12

kobalamina

Wiele drobnoustrojów jest

zdolnych do biosyntezy

wewnątrzkomórkowej

witaminy

B

12

,

między innymi z rodzaju

Aerobacter, Azotobacter,

Bacillus, Clostridium,

Propionibacteriun,

Pseudomonas

Zastosowanie promieniowców do

biosyntezy witaminy B

12

Szczególnie dużo witaminy B

12

- do 6 mg/dm

3

- syntetyzują drobnoustroje z gatunku

Nocardia rugosa, N. gardneri,

Streptomyces griseus, S. olivaceus

.

W skali przemysłowej można otrzymać

witaminę B

12

z grzybni po produkcji

antybiotyków, np. streptomycyny, gryzeiny.

Zastosowanie bakterii do biosyntezy

witaminy B

12

Obecnie ekonomiczną i często stosowaną metodą
otrzymywania witaminy B

12

w skali przemysłowej jest

użycie bakterii z rodzaju

Propionibacterium shermani i

P.freudenreichii

, które są zdolne do biosyntezy tej

witaminy w ilości ponad

20 mg/dm

3

pożywki.

Zaletą tych drobnoustrojów jest szybki wzrost w
stosunkowo prostych podłożach z melasą jako źródłem
węgla oraz wysoka wydajność w produkcji witaminy B

12

w podłożach z dodatkiem węglowodorów i alkoholi jako
źródła węgla

.

Optymalizacja szczepów drogą fuzji

protoplastów

W ostatnich latach, w wyniku fuzji
komórek wyselekcjonowanego szczepu

Rhodopseudomonas

ze szczepem

Protominobacter

,

uzyskano organizm

zdolny do biosyntezy 135 mg/dm

3

witaminy B

12

w ciągu beztlenowej 2-7

dniowej hodowli na pożywce z glukozą

Optymalizacja składników podłoża

• W procesie biosyntezy witaminy B

12

bardzo ważny jest

dodatek do pożywki

soli kobaltowych

, niezbędnych dla

syntezy witaminy.

Niemniej jednak stężenie kobaltu w pożywce

przekraczające

50 p.p.m

. hamuje biosyntezę witaminy.

• Również dodatek do pożywki

betainy, choliny

stymuluje

syntezę witaminy. Przykładowo, podczas hodowli

P.

denitrificans

dodatek betainy i choliny w ilości

5 mg/ml

powodował 10-20-krotny wzrost ilości witaminy B

12

.

• W hodowli niektórych drobnoustrojów stosuje

się dodatek

5,5-dimetylobenzoimidazolu

,

który odgrywa znaczącą rolę w syntezie

witaminy B

12

jako jeden z prekursorów tej

witaminy.

Izolacja kobalaminy

• W procesie technologicznym izolacji witaminy B

12

hodowla szczepu produkcyjnego lub jego biomasa jest

w pierwszym etapie gotowana w temperaturze

80-120°C przez 10-30 minut, a następnie komórki są

rozbijane w celu uwolnienia witaminy.

• Związek ten i jego pochodne traktowane są cyjankiem

potasu w celu włączenia do ich cząstek grupy CN~.

• Otrzymane w ten sposób tzw. cyjankobalaminy są dalej

oczyszczane za pomocą chromatografii absorpcyjnej lub

ekstrahowane roztworami fenolu i krezolu.

Biostnteza karotenów

Karoteny są wytwarzane przez bakterie i grzyby.

Szczególnie interesującym szczepem jest grzyb

Blakeslea trispora

który wydziela do pożywki

barwnik karotenowy. W pewnych warunkach grzyb

ten może syntetyzować do kilkudziesięciu

miligramów

b

-karotenu w litrze pożywki

hodowlanej.

b

-karoten

a

-karoten

Optymalizacja procesu biosyntezy

karotenów (prekursorów witaminy A)

• Na pożywce zawierającej mieloną kukurydzę, mąkę z

nasion bawełny, oleje roślinne, melasę owoców

cytrusowych, tiaminę, oczyszczoną naftę, uzyskano

około 1 grama

b

-karotenu, w przeliczeniu na dm

3

pożywki.

• Dodatek octanu, aminokwasów, a szczególnie

b

-

jononu w ilości do 1,8 g/dm

3

, znacznie intensyfikuje

biosyntezę

b

-karotenu.

• Stwierdzono, że wspólna hodowla szczepów

Blakeslea

trispora

,

o zróżnicowanej płci, w porównaniu z

hodowlą pojedynczego szczepu, umożliwia uzyskanie

ponad 5-15-krotnego wzrostu biosyntezy

b

-karotenu

Biosynteza prowitaminy D

2

(ergosterolu)

Znacznie większe ilości steroli stwierdza się w
komórkach pleśni z rodzaju

Aspergillus, Penicillium,

Fusarium, Cephalosporium

(

0,1-0,8

suchej masy).

Potencjalnym źródłem steroli, w tym prowitaminy D

2

,

są jednak drożdże w rodzaju

Candida

i

Saccharomyces

zawierające ponad 2% ergosterolu w suchej masie.

Komórki bakterii i

promieniowców zawierają

stosunkowo niewielkie ilości

steroli (

0,001 do 0,01%

suchej masy).

Szczepami wykorzystywanymi do produkcji

ergosterolu są

Saccharomyces cerevisiae

,

Saccharomyces fragilis, Candida utilis

i

Candida tropicans

.

W zależności od wieku i warunków hodowli
organizmy te gromadzą ergosterol w
ilościach od

1

do

3%

suchej masy.

Biosynteza SCP

Korzyści wynikające z zastosowania mikroorganizmów

do syntezy białka

• mikroorganizmy w optymalnych warunkach wykazują

bardzo szybki wzrost, a niektóre z nich podwajają

swoją masę co 0,5-1 godz;

• mikroorganizmy łatwiej podlegają modyfikacji

genetycznej dla nadania ich biomasie cech

wymaganych przez człowieka (np. szybkości wzrostu,

poprawy składu aminokwasowego) aniżeli rośliny i

zwierzęta;

• efektywność biosyntezy białka przez zwierzęta (bydło),

rośliny (soja) i drobnoustroje (drożdże) wyraża się

stosunkiem 1:81:100 000;

• mikroorganizmy zawierają dużą ilość białka

odpowiedniej jakości;

• mikroorganizmy można namnażać w sposób ciągły, co

zapewnia dużą wydajność biosyntezy niezależnie od

warunków klimatycznych;

• mikroorganizmy mogą przetwarzać produkty uboczne,

surowce odpadowe i ścieki;

• poprzez zmianę składu pożywki i parametrów hodowli

można zmieniać skład aminokwasowy białka.

Drobnoustroje używane do biosyntezy białka
powinny m.in. odznaczać się

• zdolnością do wszechstronnego i maksymalnego

wykorzystania odżywczych składników
(węglowodanów, związków azotowych, kwasów
organicznych, alkoholi, aldehydów, substancji
mineralnych);

• odpowiednim składem chemicznym biomasy,

odpowiadającym wysokoodżywczym produktom
spożywczym i paszowym (wysoką zawartością białka,
tłuszczu, węglowodanów i witamin, brakiem
substancji antyżywieniowych, niską zawartością
kwasów nukleinowych);

• dobrze rozbudowanym kompleksem enzymów

oddechowych, warunkujących szybki wzrost biomasy

• właściwościami syntetyzowania korzystnych i

wymaganych w środkach odżywczych, substancji o
działaniu oligodynamicznym (witamin i specyficznych
organicznych połączeń związków mineralnych);

• odpornością na niekorzystne zmiany składu podłoża i

warunków hodowli;

• korzystnymi cechami technologicznymi, ułatwiającymi

dalszą obróbkę technologiczną biomasy (wydzielanie,
dezintegrację itp.);

• brakiem zdolności syntezy substancji toksycznych;

• brakiem zdolności adsorpcji substancji toksycznych lub

rakotwórczych z pożywki.

Zestawienie substratów i mikroorganizmów w procesie produkcji białka

mikrobiologicznego

Enzymatyczna

synteza tlenków

alkenów

Wg S. Russel

Biotechnologia

Zarys beztlenowego rozkładu związków organicznych

w procesie fermentacji metanowej

Wg S. Russel
Biotechnologia