Metody chromatograficzne w kontroli składu i jakości żywności

POLITECHNIKA POZNAŃSKA

WYDZIAŁ

TECHNOLOGII

CHEMICZNEJ

PRACA ZALICZENIOWA

Przedmiot: Chromatografia procesowa

Metody chromatograficzne w kontroli składu i jakości żywności

S tud ent :

N ata lia Gun ia ( 952 88)
Da ria Jac ko ws ka ( 9529 2)
Agn ie s zk a Kr zy żko ws ka (95312 )
J oanna L ew andow s ka ( 95320 )
Marta Martyła (95327)

Kierunek studiów:

T e chno logi a Ch emi czn a

Specjalność:

T e chno logi a Organ icz na

Prowadzący:

prof. dr hab. inż. A. Voelkel

Poznań 2014

Spis treści:

Wstęp…………………………………………………………………………………

1. Analiza żywności i jej znaczenie…………………………………………………..

2. Wykorzystanie chromatografii w kontroli podstawowych składników

odżywczych zawartych w pożywieniu………………………………………………..

2.1. Sacharydy (cukry)………………………………………………………

2.2. Białka i aminokwasy……………………………………………………

2.3. Lipidy…………………………………………………………………..

2.3.1. Definicja i podział…………………………………………..

2.3.2. Metody oznaczania lipidów w żywności……………………

2.3.2.1. Oznaczanie tłuszczu surowego…………………..

2.3.2.2. Oznaczanie poszczególnych grup lipidów……….

2.3.2.2.1. Chromatografia kolumnowa………….

2.3.2.2.2. Chromatografia cienkowarstwowa…...

2.3.2.2.3.

Wysokosprawna

chromatografia

cieczowa…………………………………………

2.3.2.3. Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych………

2.3.2.3.1. Chromatografia gazowa……………..

2.3.2.3.2.

Wysokosprawna

chromatografia

cieczowa…………………………………………

2.4. Witaminy………………………………………………………………..

3. Chromatografia a jakość dodatków do żywności…………………………………

3.1. Kontrola jakości przeciwutleniaczy…………………………………….

3.2. Kontrola jakości konserwantów………………………………………..

3.3. Środki słodzące………………………………………………………….

3.4. Związki zapachowe……………………………………………………..

3.4.1. Chromatografia gazowa – olfaktometria…………………….

3.5. Barwniki………………………………………………………………..

3.5.1. Definicja i podział………………………………………….

3.5.2. Metody oznaczania barwników…………………………….

3.5.2.1. Chromatografia cienkowarstwowa………………

3.5.2.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa………

4. Chromatografia w kontroli zanieczyszczeń żywności……………………………..

Podsumowanie………………………………………………………………………..

Literatura……………………………………………………………………………...

Wstęp

Analiza żywności wchodzi w zakres multidyscyplinarnej nauki o żywności i żywieniu

człowieka, która korzysta ze zdobyczy takich dziedzin jak matematyka, chemia, fizyka,

biologia, biochemia, mikrobiologia, fizjologia, inżynieria, informatyka, a także ekonomia,

organizacja produkcji czy marketing. Jakość produktów żywnościowych jest bardzo ważna

dla konsumentów, gdyż wpływa na ich zdrowie, a także decyduje o walorach smakowych. O

jakości żywności decyduje przede wszystkim jej skład chemiczny, uzależniony od warunków

produkcji roślinnej i zwierzęcej, parametrów procesów technologicznych, opakowania oraz

warunków transportu i przechowywania. Podstawowym celem analizy jakościowo-ilościowej

składników żywności jest wyszukiwanie czynników, które obniżają jakość zdrowotną

żywności oraz zapewniają odpowiednie jej bezpieczeństwo. Analiza pozwala stwierdzić, jaka

jest wartość odżywcza produktu spożywczego oraz czy proces technologiczny produkcji

przebiegał prawidłowo. Znajomość metod oznaczania podstawowych składników żywności,

dodatków do żywności, zanieczyszczeń, czy zmian zachodzących podczas przetwarzania i

przechowywania żywności jest niezbędna dla specjalistów zajmujących się produkcją i

kontrolą jakości żywności oraz przydatna wszystkim osobom zainteresowanym zrozumieniem

zależności między spożywaną żywnością, a zdrowiem człowieka.

1. Analiza żywności i jej znaczenie

Już w starożytności zdawano sobie sprawę z ogromnego wpływu spożywanego

pożywienia na zdrowie człowieka. Obecnie wiadomo, że między żywnością, żywieniem a

zdrowiem człowieka istnieją ścisłe zależności (rysunek 1) [1].

Rysunek 1. Żywność, żywienie, a zdrowie – ilustracja zależności [1].

Centralną pozycję zajmują w nim dwie cechy: jakość żywności, na którą wpływ mają głównie

sanitarno-higieniczne warunki produkcji, przetwórstwa i obrotu handlowego oraz wartość

odżywcza żywności, informująca o zawartości niezbędnych dla organizmu składników, ich

wzajemnych proporcjach i biodostępności. Obie cechy są ze sobą powiązane. O jakości

żywności decyduje ponadto zawartość w niej naturalnych związków toksycznych,

zanieczyszczeń środowiskowych, technologicznych i biologicznych.

Podstawowym zadaniem analizy żywności jest dokonanie analizy jakościowej i

ilościowej produktów żywnościowych na każdym etapie ich wytwarzania, począwszy od

etapu surowców, poprzez etap produkcji, obrotu handlowego, aż do etapu konsumpcji.

Analizie, oprócz produktów spożywczych poddane są także materiały i wyroby przeznaczone

do kontaktu z żywnością. Dzięki postępowi w zakresie analizy żywności stało się możliwe [1,

2]:

- poznanie szczegółowego składu większości surowców i produktów żywnościowych;

- ustalenie wartości kalorycznej artykułów spożywczych;

- opracowanie szybkich oznaczeń składników żywności, przy małym nakładzie pracy;

- prowadzenie badań na temat funkcjonalnych właściwości składników żywności;

- oznaczanie zanieczyszczeń żywności na bardzo niskim poziomie stężeń, rzędu kilku pg/g;

- oznaczanie biologicznych zanieczyszczeń żywności oraz badanie jego wpływu na jakość

produktów spożywczych;

- poznanie mechanizmów przemian chemicznych i biochemicznych zachodzących w czasie

przechowywania i przetwarzania surowców i produktów żywnościowych;

- zmniejszenie strat składników odżywczych i zapobieganie tworzenia się związków

szkodliwych w trakcie obróbki technologicznej żywności;

- opracowanie nowych dodatków do żywności, spełniających szereg funkcji technologicznych

i sensorycznych, które są zgodne z obowiązującymi normami;

- monitorowanie procesu produkcji i obrotu produktami żywnościowymi pod kątem

zapewnienia właściwej jakości zdrowotnej żywności i przestrzegania zasad bezpieczeństwa

żywności.

Żywnością nazywamy jadalne części tkanek roślinnych i zwierzęcych w stanie

naturalnym lub przetworzonym, które po zjedzeniu i przyswojeniu przez organizm ludzki

mogą być źródłem różnych składników odżywczych. Zgodnie z terminologią pojęcie

żywności nie obejmuje:

- środków żywienia zwierząt, żywych zwierząt, jeżeli nie są wprowadzone do obrotu jako

żywność przeznaczona bezpośrednio dla konsumenta,

- roślin przed zbiorem,

- produktów leczniczych,

- kosmetyków, tytoniu i wyrobów tytoniowych,

- środków odurzających i substancji psychotropowych,

- pasz,

- pozostałości i zanieczyszczeń.

Składnikiem odżywczym jest natomiast składnik pokarmowy niezbędny do

odżywiania organizmu człowieka. Wyróżnia się obecnie ponad 400 różnych składników

odżywczych, z tym że tylko 60 z nich to tzw. składniki niezbędne. Składniki niezbędne muszą

być dostarczone w pożywieniu, ponieważ organizm nie jest w stanie sam ich wytworzyć, ani

niczym zastąpić. Każdy ze składników odżywczych pełni odrębną rolę, a zapotrzebowanie na

każdego z nich jest różne i zależne od wieku człowieka, płci, okresu wzrostu, wykonywanej

pracy i stopnia aktywności fizycznej. Skład chemiczny żywności obrazuje rysunek 2 [1, 2]:

Rysunek 2. Składniki żywności [2].

Ponieważ zasadniczą cechą żywności jest to, iż posiada składniki odżywcze powstała

klasyfikacja uwzględniająca występowania w niej dominującego składnika odżywczego.

Zgodnie z nią żywość podzielono na cztery zasadnicze grupy:

- produkty białkowe,

- żywność bogatą w sacharydy,

- tłuszcze jadalne,

- owoce i warzywa.

SKŁAD CHEMICZNY ŻYWNOŚCI

PODSTAWOWE SKŁADNIKI

ŻYWNOŚCIOWE

WODA

BIAŁKA

LIPIDY

KWASY TŁUSZCZOWE

WITAMINY

ZWIĄZKI MINERALNE

SACHARYDY

ZANIECZYSZCZENIA

ŻYWNOŚCI

DODATKI DO

ŻYWNOŚCI

ZAPOBIEGAJĄCE ZEPSUCIU

SENSORYCZNE

TEKSTUROTWÓRCZE

POMOCNICZE

2. Wykorzystanie chromatografii w kontroli podstawowych składników odżywczych

zawartych w pożywieniu

2.1. Sacharydy (cukry)

Sacharydy stanowią liczną grupę związków, które ze względu na budowę chemiczną

dzieli się na mono-, oligo- i polisacharydy (rysunek 3). Nazwa sacharydy wywodzi się od

sacharozy, sacharydu powszechnie używanego w celach spożywczych i zwanego potocznie

cukrem. Tradycyjnym wzorem ogólnym cukrów jest C

, choć wiele sacharydów tego

wzoru nie spełnia. W literaturze cukry znane są też pod nazwą węglowodanów. Nazwa cukru

składa się z liczebnika podającego liczbę atomów węgla i charakterystycznej dla cukrów

końcówki – oza. Monosacharydy charakteryzują się obecnością w cząsteczce asymetrycznych

atomów węgla (połączonych z 4 różnymi grupami chemicznymi), zwanych centrami

stereogenicznymi.

Obecność asymetrycznych atomów węgla stwarza możliwość

występowania licznych izomerów optycznych i przestrzennych. Cukrami prostymi nazywane

są sacharydy, które nie ulegają hydrolizie; należy do nich m.in. ryboza, glukoza. Jeżeli

cząsteczka cukru składa się z dwóch lub więcej reszt monosacharydów, to zaliczany jest on

do cukrów złożonych, a ich hydroliza prowadzi do otrzymania cukrów prostych. Cukry

złożone, zawierające od 2 do 10 reszt monosacharydowych, nazywane są oligosacharydami,

natomiast cukry powyżej 10 reszt – polisacharydami [1, 2].

Sacharydy są głównym składnikiem większości roślinnych produktów spożywczych.

Glukoza, fruktoza występują głównie w miodzie, owocach i warzywach. Sacharoza w

największych ilościach znajduje się w buraku cukrowym, trzcinie cukrowej, laktoza to

sacharyd obecny w mleku ssaków. Skrobia natomiast w większych ilościach występuje w

ziarnie zbóż, w przetworach zbożowych oraz ziemniakach.

Monosacharydy i oligosacharydy są słodkie, rozpuszczalne w wodzie, łatwo

krystalizują i mają określoną masę cząsteczkową. W przeciwieństwie do nich polisacharydy

nie mają smaku słodkiego, są mniej lub wcale nierozpuszczalne w wodzie i są zróżnicowane

pod względem masy cząsteczkowej. Wszystkie cukry są nielotne i rozpadają się przed

osiągnięciem temperatury wrzenia. Krystalizują z roztworów opornie (wyjątkiem jest

sacharoza) i mają tendencję do tworzenia gęstych, syropowatych cieczy, zwłaszcza jeśli nie są

czyste. Monosacharydy zawierają synegriczne atomy węgla i dlatego są związkami optycznie

czynnymi; wodne roztwory sacharydów wykazują zdolność skręcania płaszczyzny światła

spolaryzowanego [1].

Rysunek 3. Podział cukrów.

SACHARYDY

CUKRY PROSTE

(monosacharydy)

pentozy

L-arabinoza

D-ksyloza

D-ryboza

heksozy

D-galaktoza

D-glukoza

D-mannoza

D-fruktoza

CUKRY ZŁOŻONE

KILKOCUKRY

(oligosacharydy)

dwucukry

laktoza

maltoza

sacharoza

trójcukry

rafinoza

czterocukry

stachioza

WIELOCUKRY

(polisacharydy)

właściwe

pentozany

arabany

ksylany

heksozany

celuloza

glikogen

inulina

skrobia

kwaśne

gumy

hemicelulozy

pektyny

śluzy

Ze względu na to, że sacharydy stanowią zróżnicowaną grupę związków zarówno pod

względem budowy, jak i właściwości fizykochemicznych, wybór odpowiedniej metody

analitycznej uzależniony jest od celu badania. Do najczęściej wykorzystywanych właściwości

sacharydów w ich analizie zaliczamy:

- właściwości redukujące,

- zachowanie wobec silnych kwasów mineralnych (rozpad do związków o charakterze

aldehydów typu furfural, które dają reakcje barwne),

- zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego,

- zdolność do tworzenia w wodzie roztworów jednorodnych,

- uleganie fermentacji.

Sposoby przygotowania próbek żywności dostosowane są do konkretnego produktu i

podaje się je wraz z procedurą oznaczania ilościowego. W przypadku oznaczania sacharydów

w produktach stałych należy je rozpuścić w wodzie lub wodnych roztworach alkoholi.

Uzyskane w ten sposób roztwory zawierają z reguły wiele substancji przeszkadzających w

metodach analitycznych, stąd należy je oczyścić, np. przez traktowanie octanem ołowiu(II)

ekstraktów roślinnych, syropów, produktów owocowych, warzywnych, napoi czy dodatek

tlenku glinu do miodu. Substancje przeszkadzające (barwniki, białka, lipidy, inne substancje

niesacharydowe o właściwościach redukcyjnych) usuwa się przez klarowanie i odbarwianie

[2].

W celu analizy sacharydów stosuje się również metody chromatograficzne.

Wykorzystywane są zarówno do oznaczeń jakościowych, jak i ilościowych. Stosowane w tym

celu są [1, 2, 3]:

- chromatografia cienkowarstwowa lub chromatografia bibułowa,

- chromatografia kolumnowa,

- chromatografia gazowa,

- wysokosprawna chromatografia cieczowa.

Rozdział metodą chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym lub

chromatografii bibułowej pozwala między innymi na identyfikację pentoz, heksoz i

disacharydów w mieszaninie cukrów. Identyfikację przeprowadzamy przez porównanie R

oraz na podstawie charakterystycznych dla poszczególnych sacharydów reakcji barwnych z

odpowiednimi odczynnikami. Jako fazę stacjonarną stosuje się najczęściej żel krzemionkowy

(Silica gel), tlenek glinu (Alumina), ziemię okrzemkową oraz krzemian magnezu (Florisil).

Za pomocą chromatografii kolumnowej w zależności od zastosowanej metody

rozdziału można uzyskać jakościowy rozdział sacharydów, a oznaczenie ilościowe wykonuje

się metodami chemicznymi lub enzymatycznymi. Rozdzielenia chromatograficzne prowadzi

się zarówno na złożach jonowymiennych (kationowymiennych i anionowymiennych), fazach

cyklodekstrynowych (możliwość rozróżnienia enancjomerów), związanych fazach

aminowych, impregnowanych in situ aminami żelach krzemionkowych, niepolarnych fazach

, czy na grafityzowanym węglu.

W przypadku zastosowania techniki GC-FID (detektor płomieniowo-jonizacyjny),

sacharydy przed oznaczeniem muszą być poddane procesowi sililacji, w wyniku którego

przekształcone są w lotne pochodne trimetylosililowe. Po rozdziale na odpowiedniej

kolumnie chromatograficznej na podstawie porównania czasów retencji cukrów i

odpowiednich wzorów można zidentyfikować określone sacharydy w próbce, a na podstawie

wielkości piku w oparciu o krzywą kalibracyjną określić ilość badanego sacharydu. I tak np.

do oznaczenia glukozy i galaktozy w chlebie wykorzystano kolumnę zawierającą

zmodyfikowaną fazę stacjonarną 3% SP-2330 na złożu 100/120 mesh Supelcoport, analizę

prowadzono w temp. 215°C, a do detekcji posłużył detektor FID. Innym przykładem jest

analiza zawartości glukozy, fruktozy, sacharozy i maltozy w miodzie, którą wykonano na

kolumnie wypełnionej złożem 100/200 mesh Diatomite CQ zmodyfikowanym 10% E-20;

program temperaturowy 100-230°C, detektor FID.

W przypadku HPLC po rozdziale sacharydów na kolumnie chromatograficznej

dokonuje się ich analizy na podstawie wartości współczynnika załamania światła

poszczególnych sacharydów, który mierzymy detektorem refraktometrycznym (RI).

Identyfikacja dokonywana jest metodą porównania ze wzorcem. Przykładem zastosowania tej

techniki jest oznaczanie glukozy, sacharozy i rafinozy w jogurcie, podczas którego do

ekstrakcji analitów użyto 70% etanolu, a rozdział uzyskanego ekstraktu przeprowadzono z

wykorzystaniem fazy stacjonarnej Spherisorb-NH2, fazę ruchomą stanowiła mieszanina

woda/acetonitryl (36:64, v/v), do detekcji służył detektor refraktometryczny. Z kolei

oznaczanie glukozy w hydrolizacie skrobiowym wykonano poprzez ekstrakcję analitu za

pomocą wody, rozdzielenie chromatograficzne uzyskanej próbki na kolumnie Dextropak

podczas którego do Lucji wykorzystano wodę, a do detekcji detektor RID.

Metody chromatograficzne GC i HPLC charakteryzują się dużą precyzją oraz

łatwością i szybkością wykonania w porównaniu z metodami chemicznymi. Technika HPLC

jest wykorzystywana przede wszystkim do oznaczania średnio- i wysokocząsteczkowych

węglowodanów i w porównaniu z metodą GC charakteryzuje się krótszym czasem analizy (o

50%), wyższymi wartościami odzysku i lepszą dokładnością oznaczeń. Z kolei technika GC

stosowana jest głównie do analizy monosacharydów, do jej zalet zaliczamy wysoką czułość i

doskonałą rozdzielczość (możliwość odróżnienia α i b anomerów); do wad konieczność

derywatyzacji.

2.2. Białka i aminokwasy

Białka to niezbędne składniki pokarmowe. Ich zawartość w produktach spożywczych

pozwala określić wartość odżywczą. Związki te są podstawowym składnikiem budulcowym

tkanek, tworzą też enzymy i hormony, regulują procesy przemiany materii, są elementami

układu odpornościowego (przeciwciała). Białka mogą być zbudowane wyłącznie

z aminokwasów – białka proste lub aminokwasów, części prostetycznych niebiałkowych –

białka złożone. Różnorodność białek wynika ze składu i różnorodności uszeregowania reszt

tych grup. Aminokwasy przedstawiono na rysunku [1].

Białka mogą ulegać denaturacji. Jest to proces nieodwracalny (niszczenie struktury

pod wpływem ogrzewania czy dodatku związków zdolnych do rozerwania wiązań

wodorowych – mocznika, kwasów i zasad) lub odwracalny, co prowadzi do agregacji

czy strącania [1]. W strukturze białek występują grupy zasadowe i kwasowe stąd właściwości

silnie zależą od pH i mogą mieć ładunek dodatni lub ujemny. Charakterystycznym punktem

natomiast jest punt izoelektryczny, czyli taki w którym ładunki + i – się równoważą

i sumaryczny ładunek wynosi zero. Większość białek dobrze rozpuszcza się w wodzie i ulega

hydratacji. Obserwuje się efekt wysolenia, polegający na zmniejszeniu rozpuszczalności

białek w obecności soli nieorganicznych.

Bogatym źródłem białka w żywności są przede wszystkim jajka, mleko i przetwory

mleczne, mięso zwierząt i ryb. Białko w nich zawarte posiada wysoką wartość odżywczą,

tzn., że w ich skład wchodzą wszystkie aminokwasy egzogenne (których organizm ludzki

nie syntezują i trzeba je dostarczać). Produkty pochodzenia roślinnego, szczególnie nasiona

roślin strączkowych i zbóż również mają dużą zawartość białek, ale są one

niepełnowartościowe.

Zawartość białek w różnych produktach i wartość odżywczą przedstawioną jako wskaźnik

aminokwasu ograniczającego – stosunku niezbędnych aminokwasów w badanym białku do

zawartości tego aminokwasu we wzorcu) zestawiono w tabeli poniżej [1].

Tabela 1. Białko w produktach spożywczych [1].

Analiza

Celem analizy ilościowej i jakościowej białka, surowca czy produktu spożywczego

jest ocena wartości odżywczej, czyli zdolności zaspokojenia potrzeb pokarmowych.

Zawartość aminokwasów jest istotna w produktach spożywczych specjalnego przeznaczenia

– suplementach diety, dla sportowców, dla osób starszych czy niemowląt. Aminokwasy

są także prekursorami powstających w czasie obróbki technologicznej związków

aromatycznych. Znając zatem skład można przewidywać jakie zmiany zajdą w czasie

przetwórstwa. Pozwala to także na kontrolę prawidłowości procesów przetwórstwa,

np. mleka. Analiza aminokwasów ponadto stosowana jest przy wykrywaniu zafałszowań

żywności,np. analiza 3-metylohistydyny świadczy o dodatku kolagenu lub białek roślinnych

do przetworów mięsnych. Innym celem jest sprawdzenie zawartości asparaginy, która jest

prekursorem rakotwórczego akrylamidu powstającego w czasie wysokotemperaturowej

obróbki produktów skrobiowych [4].

Celem analizy może być oznaczenie wolnych aminokwasów lub związanych w białkach.

Przed właściwą analizą należy odpowiednio przygotować próbkę, poprzez ekstrakcję,

oczyszczanie, często derywatację przed lub po analizie.

Wykorzystanie metod chromatograficznych

Chromatografia gazowa ma małe zastosowanie ze względu na konieczność przeprowadzenia

analitu w lotne estry. Częściej wykorzystuje się chromatografię cieczową i jej różne odmiany

(scharakteryzowane w tabeli poniżej) głównie do rozdziału białek i analizy,

przy czym najczęściej wykorzystuje się HPLC w odwróconym układzie faz. Do detekcji

najczęściej wykorzystuje się detektory spektrofotometryczne, gdy w strukturze są chromofory

aromatyczne, gdy tylko od wiązania peptydowego często stosuje się derywatację.

Gdy białaka rozdzielane są w śladowych ilościach wykorzystuje się detektory fluorescencyjne

FLD (bardziej czułe) przy zastosowaniu prekolumnowej lub postkolumnowej.

Oznaczanie wolnych aminokwasów przygotowania próbki przez ekstakcję, np. roztworem

1M HCl oraz oczyszczanie z białek, węglowodanów i tłuszczów metodami fizycznymi

(wirowanie i filtracja) i chemicznymi (wytrącanie, denaturacja). Z kolei oznaczanie

aminokwasów związanych w białkach wymaga oprócz etapu oczyszczania jeszcze

przeprowadzenia efektywnej hydrolizy białek – enzymatycznej, kwasowej, zasadowej,

przy czym dominuje kwasowa.

Kolejnym etapem jest derywatacja w celu polepszenia detekcji. Głównie stosuje się:



detektor spektroskopowy UV-VIS – ninhydryna, chlorek dabasylu (w świetle

widzialnym), fenyloizotiocyjanian (UV)



detektor fluorescencyjny – chlorek dansylu, o-ftalaldehyd



detektor fluorescencyjny – fluorescamina



detektor elektrochemiczny – otrzymywanie pochodnych obdarzonych ładunkiem

W analizie najczęściej wykorzystywana jest chromatografia jonowymienna oraz RP-HPLC.

Tabela 2. Metody chromatografii stosowane przy oczyszczaniu i analizie białek [4, 5, 6].

Metoda

Zasada

Stosowane fazy

Zastosowanie

SEC
Chromatografia
żelowa (sączenie
molekularne)

rozdział na podstawie wielkości i kształtu
cząsteczek – małe cząsteczki
zatrzymywane są w porach, co spowalnia
ich wędrówkę duże wypływają z
kolumny jako pierwsze
Cząsteczki nie wiążą się z wypełniaczem

wypełnienie: ziarna nierozpuszczalnego polimeru, np.
poliakryloamidu, ziarna, których podstawowym składnikiem
jest dekstran (SEPHANDEX) lub agaroza (SEPHAROSE)

eluent jest obojętny, spełnia tylko rolę przenośnika, woda lub
alkohole dla polarnych wypełnień, w przypadku niepolarnych
chloroform, dichlorometan, toluen , THF

do oczyszczania białek
wrażliwych na pH czy stężenie
jonów, odpowiednio
skalibrowana metoda może
służyć do wyznaczenia masy
cząsteczkowej białka

IC
Ch.
jonowymienna

rozdział zależny od ładunku
powierzchniowego białka

polega na odwracalnej wymianie jonowej
ze znajdującym się w roztworze
przeciwjonem wymieniacza jonowego

wypełnienie: w przypadku białek o ładunku ujemnym: kolumny
z dodatnio naładowanymi grupami – dietyloaminoetylowe
(DEAE-celuloza, DEAE-Sephadex)
w przypadku białek o ładunku dodatnim:wypełniacze z
ładunkiem ujemnym grypu karboksylwe – CMceluloza i
CMSephandex lub z grupami sulfonowymi

eluent: bufor wymywający o odpowiednim pH i sile jonowej,

ma zastosowanie analityczne i
preparatywne

HIC
Ch.
Oddziaływań
hydrofobowych

polega na hydrofobowym oddziaływaniu
ligandu związanego z fazą stacjonarną, a
niepolarną częścią białka, dodatek soli
powoduje odsłonięcie hydrofobowej
części białka, co zwiększa oddziaływania
hydrofobowe

faza stacjonarna: sorbenty typu C3-C6 wiązane z sieciowaną
agarozą lub kopolimerem syntetycznym

eluent z dodatkiem soli (siarczan sodu, amonu, octany sody,
potasu, wodorofosforany czy chlorek sodu)
Proces przy malejącym gradiencie stężenia soli

głównie do białek o dużej masie
cząsteczkowej, zaletą jest
zachowanie aktywności
biologicznej białek

część białek może nie ulec
rozdziałowi

AC
Chromatografia
powinowactwa

wykorzystuje wzajemne powinowactwo
dwóch substancji, rozdział na podstawie
odwracalnej reakcji, bardzo skuteczną
metodą jest wykorzystywanie
unieruchomionych przeciwciał

faza stacjonarna zawiera ligand o dużym powinowactwie do
analitu, mogą być to przeciwciała
eluent: często roztwór denaturujący (np. mocznik) czy o
skrajnych wartościach pH ze względu na silne oddziaływania

metoda o dużej selektywności
do specyficznych zastosowań
w czasie elucji może dojść do
zmiany struktury

RP-HPLC
Ch. W układzie
faz
odwróconych

mechanizm obejmuje oddziaływania
pomiędzy eluentem fazą stacjonarną a
analitem i polega na współzawodniczeniu
pomiędzy cząsteczkami analitu a fazy
ruchomej o miejsce na adsorbencie, w
przeciwieństwie do narmalnego układu
faz w RP-HPLC stosuje się słabopolarne
lub niepolarne fazy stałe

f. stacjonarna: sorbenty siloksanowe modyfikowane grupami
alkilowymi, fenylowymi i difenylowymi typu C18, C8, C4
(C5, C6), C2,.

elucja gradientowa

faza ruchoma : wodę i acetonitryl z dodatkiem kwasu
trifluorooctowego (TFA), zarówno w eluencie A (niższe
stężenie acetonitrylu 5
– 25 %) jak i w eluencie B (wyższe stężenie acetonitrylu 75 –
95 %).

szerokie zastosowanie w
analizie i rozdziale białek

może dojść do denaturacji, aby
tego uniknąć stosuje się dodatek
do eluentu soli stabilizujących
strukturę białka (np. NaCl,
AcNa, (NH4)2SO4). Trzeba się,
jednak, liczyć się z tym, że taki
dodatek
często modyfikuje retencję
substancji

Elektroforeza
kapilarna

rozdziała w wyniku przepływu
elektroosmotycznego na skutek
przyłożonego napięcia

kapilary kwarcowe wypełnione roztworem buforującym,

duża zdolność rozdzielcza,
krótki czas analizy, bardzo duża
czułość

2.3. Lipidy

2.3.1. Definicja i podział

Lipidy to liczna grupa związków organicznych o złożonej budowie, których cechą

charakterystyczną jest to, że rozpuszczają się w tzw. rozpuszczalnikach tłuszczowych do

których zalicza się np. eter etylowy lub naftowy, chloroform, benzen, aceton, tetrachlorek

węgla, a także alkohole w podwyższonych temperaturach. Zdecydowana większość lipidów

nie rozpuszcza się w wodzie, jako wyjątek od tej reguły można wymienić lecytynę, związek z

grupy fosfolipidów, który wykazuje częściową rozpuszczalność w wodzie [7, 8].

Lipidy dzieli się na trzy duże grupy: prostych, złożonych i wtórnych, te z kolei dzielą

się na mniejsze zbiory. Lipidy wtórne to pochodne lipidów prostych i wtórnych, powstałych

w wyniku ich hydrolizy.

Rysunek 4. Podział lipidów [9].

Lipidy stanowią niezbędny element diety człowieka, bowiem powinny dostarczać około 40 %

dziennego zapotrzebowania na energię. Powszechnie używany termin „tłuszcze” oznacza

wieloskładnikowa mieszankę lipidów, których znaczącą część stanowią kwasy tłuszczowe.

2.3.2. Metody oznaczania lipidów w żywności

Oznaczanie lipidów to jedna z podstawowych analiz przeprowadzanych w celu

ustalenia składu produktów spożywczych, a także określenia ich wartości energetycznej. Ze

LIPIDY

proste

lipidy właściwe

estry kwasów tłuszczowych i

glicerolu

woski:

estry wyższych kwasów

tłuszczowych i alkoholi (z

wyjątkiem glicerolu)

złożone

fosfolipidy:

lipidy zawierające kwas

fosforowy jako mono - lub

diester

glikolipidy:

związki zawierające

przynajmniej jedną reszztę

cukrówą połączoną

wiązaniem glikozydowych z

częscią lipidową

wtórne

kwasy tłuszczowe

alkohole lipidowe

węglowodory

względu na to, że związki te posiadają bardzo złożoną budowę, a dodatkowo są niestabilne,

ich analiza nie należy do łatwych. Lipidy są szczególnie wrażliwe na obecność czynników

utleniających, w tym tlenu atmosferycznego, w związku z czym w czasie analizy należy

zachować środki ostrożności i w miarę możliwości przeprowadzać badania w atmosferze gazu

obojętnego lub użyć przeciwutleniaczy. Dodatkowy problem stanowi pobranie, z materiału

biologicznego, reprezentatywnej próbki [8].

2.3.2.1. Oznaczanie tłuszczu surowego

Tłuszczem surowym w analizie żywności nazywa się substancję, która podczas

suszenia w temperaturze 105

C w czasie jednej godziny, nie jest lotna i dodatkowo da się

wyekstrahować rozpuszczalnikiem organicznym. Do oznaczania tego typu tłuszczu stosuje się

metody ekstrakcyjne, objętościowe i instrumentalne [9].

2.3.2.2. Oznaczanie poszczególnych grup lipidów

Oprócz oznaczenia ogólnej zawartości tłuszczu surowego, bardzo ważne jest

zidentyfikowanie konkretnych klas lipidów. Całkowitą analizę lipidów w artykułach

żywnościowych przeprowadza się z użyciem chromatografii kolumnowej (LC),

cienkowarstwowej (TLC) lub wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

2.3.2.2.1. Chromatografia kolumnowa

Chromatografia kolumnowa to najpopularniejsza metoda rozdzielania lipidów.

Wymywanie poszczególnych grup lipidów następuje poprzez zmianę składu eluenta np.

stosując kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym, za pomocą chloroformu wymywa się

lipidy neutralne, aceton wymywa glikolipidy, a metanol fosfolipidy. W ten sposób

rozdzielone grupy lipidów można poddać dalszemu rozdziałowi. Stosując jako eluent heksan

lub heksan z dodatkiem 2% , 5% lub 15% eteru można rozdzielić lipidy neutralne na

węglowodory, estry cholesterolu, cholesterol. Analizę ilościową konkretnych lipidów

przeprowadza się za pomocą chromatografii gazowej z dodatkiem wzorca wewnętrznego [1].

2.3.2.2.2. Chromatografia cienkowarstwowa

Jako fazę stacjonarną w chromatografii cienkowarstwowej stosuję się na ogół płytki z

żelu krzemionkowego, fazę ruchomą stanowi mieszania rozpuszczalników organicznych

(heksan, eter dietylowy i kwas octowy). Taki dobór faz umożliwia rozdział lipidów

neutralnych - acylogliceroli, wolnych steroli, estrów steroli, wolnych kwasów tłuszczowych i

innych. Gdy jako fazę ruchomą użyje się mieszanin chloroform – metanol – woda lub

chloroform – metanol - kwas octowy, możliwy jest rozdział fosfolipidów. Zaletami tego typu

rozdziału lipidów są niskie koszta, szybkość oraz prostota [1].

2.3.2.2.3. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Przed przeprowadzeniem analizy techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej

(HPLC) należy próbkę odpowiednio przygotować, tj. rozdzielić mieszaninę lipidów na

konkretne grupy za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Poszczególne frakcje lipidowe

wymywane są za pomocą mieszaniny rozpuszczalników organicznych (eter dietylowy,

heksan, chloroform, etanol) a fazę stałą stanowią na ogół kolumny krzemionkowe. Zaletą

rozdziału lipidów za pomocą ekstrakcji do fazy stałej jest fakt, że metoda ta wymaga znacznie

mniejszej ilości eluentu. Początkowo do tego celu stosowano chromatografy z detektorem

UV, dlatego metodą tą można była analizować jedynie lipidy nienasycone, bowiem tylko te

absorbowały promieniowanie UV. Aktualnie, przy zastosowaniu detektora laserowego,

możliwa jest analiza ilościowa i jakościowa wszystkich grup lipidów. Zaletami tej

chromatografii jest wysoka zdolność rozdzielcza lipidów oraz to, że do analizy

wykorzystywane są małe ilości próbki [1].

2.3.2.3. Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych

Podstawowym składnikiem tłuszczów są kwasy tłuszczowe. Ze względu na ważną

rolę jaką pełnią w organizmie ludzkim – są głównym materiałem zapasowym, kładziony jest

duży nacisk na oznaczanie ich zawartości w artykułach spożywczych. Kwasy tłuszczowe to

związki o ogólnych wzorze RCOOH, w których R oznacza łańcuch węglowodorowy.

Łańcuch ten, w naturalnych tłuszczach, jest prosty i może zawierać wiązania nienasycone.

Naturalne kwasy tłuszczowe, zawierają parzystą liczbę węgli w łańcuch, która na ogół wynosi

od 12 do 20. Dobór metody , za pomocą której analizuje się kwasy tłuszczowe zależy w

głównej mierze od długości łańcuch, ilości wiązań podwójnych, a także obecności grup

funkcyjnych. Najczęściej w tym celu stosuje się chromatografię gazową (GC) oraz

wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) [9].

2.3.2.3.1. Chromatografia gazowa

Podstawowym problemem przy zastosowaniu chromatografii gazowej w analizie

kwasów tłuszczowych jest ich mała lotność. Ze względu na to, przed analizą należy związki

te przeprowadzić w bardziej lotne pochodne np. estry metylowe, estry butylowe lub

trimetylosililowe (TMS). Pochodne kwasów tłuszczowych analizuję się na kolumnach

kapilarnych o różnej polarności, jednak wykazano, że im kolumna jest bardziej polarna, tym

rozdział jest efektywniejszy. Najlepsze fazy stacjonarne to fazy cyjanoetylosilikonowe oraz

cyjanopropylosilikonowe. Gdy badaniu poddaje się mieszaninę krótko i długołańcuchowych

kwasów tłuszczowych, w celu lepszego rozdziału, należy zastosować analizę w

programowanej temperaturze. Najczęściej stosowanym detektorem w oznaczaniu kwasów

tłuszczowych jest detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID), w przypadku analizy estrów

metylowych kwasów tłuszczowych używa się także detektor wychwytu elektronów (ECD).

Często do analizy wykorzystuję się chromatograf gazowy sprzężony ze spektrometrem

masowym (GC-MS). Zastosowanie takiego układu pozwala na rejestrację widm masowych

oraz parametrów retencji, co umożliwia przeprowadzenie kompleksowej identyfikacji.

Analizę ilościową przeprowadza się za pomocą metody wzorca wewnętrznego [1].

2.3.2.3.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Tak jak w przypadku chromatografii gazowej, aby móc analizować kwasy tłuszczowe

metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, należyte najpierw przeprowadzić w

odpowiednie pochodne. Jeżeli kwasy tłuszczowe podda się działaniu alkoholu lub amidu,

otrzymane estry można identyfikować za pomocą detektora UV. Gdy do procesu estryfikacji

użyje się alkoholu o właściwościach fluorescencyjnych, można zastosować detektor

fluorescencyjny. Często analizę kwasów tłuszczowych prowadzi się w odwróconym układzie

faz. Używanymi do tego celu fazami stacjonarnymi są żele krzemionkowe modyfikowane

grupami oktadecylowymi oraz ortylowymi. Rozdział zachodzi przy wykorzystaniu

rozpuszczalników polarnych i może zachodzić zarówno w warunkach izokratycznych, jak i w

gradiencie temperaturowym. Kolejność wymywania kwasów tłuszczowych zależy od

długości ich łańcucha, a także od stopnia nienasycenia. Wraz ze wzrostem długości łańcucha,

wydłuża się czas retencji, natomiast wraz ze wzrostem ilości wiązań podwójnych w łańcuch

czas ten maleje [1].

2.4. Witaminy

Witaminy należą do grupy niskocząsteczkowych związków organicznych

posiadających różnorodną budowę chemiczną. Pełnią one funkcję katalizatorów reakcji

biochemicznych, wchodzą w skład enzymów i koenzymów, są niezbędne do wzrostu i

podtrzymania funkcji życiowych. Dla wielu organizmów są to związki chemiczne, które nie

mogą być syntetyzowane przez określony organizm, a są niezbędne w procesach

biochemicznych w nim przebiegających (związki egzogenne), dlatego muszą być dostarczane

z pożywieniem. Niektóre z nich okazały się również egzogennym elementem wzrostowym

dla wielu drobnoustrojów. Dwie z witamin pełnią również funkcję niezbędnych

biokatalizatorów dostarczanych za pomocą bakterii glebowych rośliną wyższym (witamina

B12) i niższym (witamina B1). Witaminy rozważa się jako substancje działające w bardzo

małych ilościach w odróżnieniu od innych składników pokarmowych, poza kwasem

askorbinowym, dzienne zapotrzebowanie na pozostałe witaminy nie przekracza 20 mg.

Prowitaminami nazywamy związki chemiczne przekształcające się w organizmie w witaminę,

np. niektóre witaminy są wytwarzane przez zwierzęta z odpowiednich związków

syntetyzowanych przez rośliny (np. β-karoten).

Witaminy i prowitaminy produkowane są przez rośliny oraz bakterie żyjące w przewodzie

pokarmowym, a także tkanki zwierzęce. Ze względu na synergiczne działanie wielu witamin,

ich rzeczywiste zapotrzebowanie ilościowe jest trudne do określenia. Uzależnione jest ono od

cech osobniczych, stanu zdrowia, i okresu życia człowieka. Choroba polegająca na

całkowitym braku lub znacznym niedoborze witamin nazywana jest awitaminozą.

Hipowitaminozą nazywamy niekorzystny stan pośredni pomiędzy awitaminozą a optymalnym

zaspokojeniem zapotrzebowania organizmu na daną witaminę. Nadmiar witamin

w organizmie ludzkim, głównie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach nazywany jest

hiperwitaminozą. Jednym z głównych wskaźników jakości witamin jest ich zawartość

w surowcach i produktach żywnościowych. Większość witamin to substancje mało odporne

na działanie różnych czynników fizycznych i chemicznych, dlatego ich straty są nieraz bardzo

duże [1].

Podstawowy podział witamin:



witaminy rozpuszczalne w tłuszczach (witamina A, D, E, K)



witaminy rozpuszczalne w wodzie (witamina B

, B

, PP, B

, B

H, C).

Oznaczanie witamin

Występowanie witamin w bardzo niewielkich ilościach oraz ich wrażliwość na czynniki

fizykochemiczne, sprawia wiele trudności w ich ilościowym oznaczaniu. Liczna grupa

witamin występuje w produktach spożywczych w postaci związanej, co wymaga

zastosowania np. hydrolizy enzymatycznej lub kwasowej. Do jakościowego i ilościowego

oznaczania witamin i prowitamin stosuje się różne metody (chemiczne, fizykochemiczne).

Coraz częściej do analizy witamin w produktach spożywczych wykorzystuje się

wysokosprawną chromatografię cieczową, najczęściej w odwróconym układzie faz

z zastosowaniem kolumny RP-C18. Fazę ruchomą stanowi mieszanina wody (z dodatkiem

kwasu octowego lub trifluorooctowego) i acetonitrylu lub wody (z dodatkiem kwasu

octowego lub trifluorooctowego) i metanolu. Do wykrywania związków lub ich grup można

stosować różne rodzaje detektorów, jednak najczęściej stosowane są detektory

spektrofotometryczne (UV), spektrofotometryczne z matrycą diod (DAD), a także

spektrometry mas (MS). Detektory te są stosowane zarówno do wykrywania pojedynczych

składników np. witaminy A, a także do mieszanin wieloskładnikowych np. witaminy A

oraz E [1].

Oznaczanie witamin rozpuszczalnych w wodzie

Cyjanokobalaminę (witamina B

) ekstrahuje się 50 mM buforu octanu sodu o pH równym

4,0 i temperaturze 100

°C przez 35 min, w obecności cyjanku sodu. Powstały ekstrakt należy

poddać oczyszczeniu w kolumnie powinowactwa immunologicznego. Odseparowaną

witaminę B

oznacza cię metodą HPLC z detektorem UV przy 361 nm w odwróconym

układzie faz. Eluent stanowi mieszanina wody z dodatkiem kwasu trifluorooctowego 0,025%

i acetonitrylu.

Chcąc równocześnie oznaczyć witaminę PP (nikotynamid), B

(tiaminę), B

(ryboflawina),

(cyjanokobalaminę), B

(kwas foliowy) i formy witaminy B

(pirydoksyna, pirydoksal,

pirydoksamin) w mleku dla niemowląt stosuje się wysokosprawną chromatografię cieczową.

Do rozdziału witamin stosuje się kolumnę C18. Mieszanina metanolu, wody (15:85, v/v),

5 mM kwasu oktanosulfonowego, 0,5% trietyloaminy, pH 3,6 stanowią fazę ruchomą. Przed

rozpoczęciem analizy chromatograficznej próbki należy poddać zakwaszeniu, strąceniu białek

oraz odwirowaniu strąconego osadu. Otrzymany supernatant filtruje się przez filtr

membranowy i analizuje według opisu przedstawionego powyżej. Podczas analizy

chromatograficznej witamin rozpuszczalnych w wodzie warunki procesu mogą być

następujące: kolumna C18, detektor spektrofotometryczny z matrycą diodową (DAD)

rejestrujący przy dwóch długościach fali: λ= 210 nm dla witamin B

(inozytol) i B

oraz

λ= 275 nm dla witamin B

, B

, C, PP, B

, B

Jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę

rozpuszczalników: acetonitryl (faza A), 0,025% wodny roztwór kwasy trifluorooctowego

o pH równym 2,6 (faza B).

Jedną z metod oznaczania witaminy C (zwanej też kwasem L-askorbinowym oraz kwasem

askorbowym) w produktach spożywczych jest wysokosprawna chromatografia cieczowa. Do

ekstrakcji witaminy C z próbek stałych oraz do rozcieńczania stosuje się rozcieńczone

roztwory kwasów z uwagi na to, że witamina C jest najbardziej stabilna w tym środowisku.

W tym celu używa się 2% kwasu szczawiowego, 3% kwasu metafosforowego (V), 8% kwasu

octowego lub 2% kwasu solnego. Metoda ta polega na oznaczeniu łącznej zawartości kwasu

L-askorbinowego

dehydroaskorbinowego.

wyniku

redukcji

kwasu

dehydroaskorbinowego za pomocą ditiotreitolu (DTT) otrzymywany jest kwas

L-askorbinowy. Witamina C oznaczana jest techniką wysokosprawnej chromatografii

cieczowej z użyciem kolumny RP-C18 i detektora spektrofotometrycznego UV przy długości

fali

λ= 254 nm.

Do jakościowego oznaczenia zawartości witaminy C wykorzystuje się technikę

chromatografii cienkowarstwowej. Roztwór kwasu L-askorbinowego będącego wskaźnikiem

i badaną próbkę (witamina C zawarta np. w owocach) należy nanieść na płytkę

chromatograficzną. Jako eluent można zastosować octan etylu. Chromatogram TLC należy

umieścić pod lampą UV, gdzie na tej samej wysokości będą widoczne dwie plamki, jedna

pochodząca od wzorca a druga od badanej próbki. Do analizy jakościowej wykorzystuje się

wartość współczynnika opóźnienia R

, który jest charakterystyczny dla danej substancji

w danych warunkach chromatograficznych, dlatego może służyć do jej identyfikacji [1].

W celu oznaczenia zawartości β-karotenu w surowcach spożywczych stosuje się techniki

chromatografii kolumnowej (metodą adsorpcyjną). Polega ona na wyodrębnieniu z badanego

materiału (np. marchew, szpinak, szczaw, pomidory) barwników karotenoidowych i rozdziale

ich aktywnych form metodą chromatografii adsorpcyjnej na kolumnie. Przed przystąpieniem

do rozdziału należy przygotować badaną próbkę przeprowadzając jej homogenizację z wodą

do konsystencji papki. Następnie ekstrahuje się ją acetonem i poddaje rozdzieleniu faz.

Ekstrakt eterowy poddaje się sączeniu przez warstwę bezwodnego Na

i nanosi na

kolumnę chromatograficzną. Uzyskane pasmo karotenów eluuje się roztworem acetonu

w eterze do momentu uzyskania bezbarwnego eluatu [10].

Oznaczanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach

Oznaczanie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach przeprowadza się techniką

wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją spektrofotometryczną lub

fluorymetryczną. Proces rozdziału witamin rozpuszczalnych w tłuszczach realizuje się

zarówno w normalnym, jak i odwróconym układzie faz. Warunki panujące podczas rozdziału

mieszanin witamin rozpuszczalnych w tłuszczach mogą być następujące (Tabela 3, 4):

Tabela 3. Przykłady układów NP-HPLC do oznaczania witamin rozpuszczalnych w

tłuszczach [1].

Kolumna

Wymiary [mm]

Faza ruchoma [v:v]

Długość fali [nm]

Polygosil

250 x 8

izooktan/butanol (99:1)

265

LiChrospher

250 x 4

n-heksan:propan-2-ol (99:1)

265

LiChrospher

250 x 4

n-heksan:propan-2-ol (98:2)

265

μPorasil

krzemionka

300 x 3,9

n-heksan:tetrahydrofuran:

propan-2-ol (98/1:1)

265

Tabela 4. Przykłady układów RP-HPLC do oznaczania witamin rozpuszczalnych w

tłuszczach [1].

Kolumna

Wymiary [mm]

Faza ruchoma [v:v]

Długość fali [nm]

Hypersil ODS, 5 μm

250 x 4,6

Metanol

265

LiChrospher 100 RP18,

5 μm

250 x 4,0

Metanol:woda (95:5)

265

Vydac 20TP 54

250 x 4,6

Metanol:woda (93:7)

265

Nucleosil C18, 5 μm

250 x 4,0

Acetonitryl:metanol

(70:30)

265

Zorbax ODS

250 x 4,6

Acetonitryl:metanol (95:5)

265

Dla większości przypadków proces chromatograficzny musi być poprzedzony zmydlaniem

badanego materiału, a następnie wyekstrahowaniem badanej witaminy za pomocą właściwej

ekstrakcji (Tabela 5).

Tabela 5. Przykłady odpowiednich warunków ekstrakcji i zmydlania stosowanych przy

oznaczaniu witamin rozpuszczalnych w tłuszczach [1].

Zmydlanie

Ekstrakcja

8 g tłuszczu, 100 cm

etanolu, 1 g

askorbinianu sodu, 0,04 g siarczku sodu,

12 g KOH, 50 cm

wody, 80°C przez 30 min.

n-heksan 3 x 100 cm

, przemywanie wodą

4 x100 cm

12 g tłuszczu, 30 cm

etanolu, 30 cm

metanolu, 0,1 g kwasu askorbinowego,

30 cm

50% KOH, 100°C przez 30 min.

eter dietylowy 2 x 100 cm

, przemywanie

wodą 4 x 50 cm

8 g tłuszczu, 100 cm

etanolu, 1 g kwasu

askorbinowego, 50 cm

50% KOH, 20°C

przez 2 h

mieszanina eteru naftowego i dietylowego

(1:1), 2 x 200 cm3, przemywanie wodą

4 x 50 cm

24 g tłuszczu, 90 cm

etanolu, 0,5 g

askorbinianu sodu, 30 cm

60% KOH, 100°C

przez 45 min pod chłodnicą zwrotną

eter dietylowy 1 x 150 cm

, 3 x 75 cm

przemywanie wodą 4 x 200 cm

Oznaczanie tokoferoli (formy witaminy E) w oleju słonecznikowym

Oznaczenie tokoferoli polega na wprowadzeniu do badanej próbki zawierającej olej

słonecznikowy, kwasu askorbinowego oraz roztworu KOH w etanolu. Proces zmydlania

prowadzi się w łaźni wodnej w temperaturze ok. 95°C. W kolejnym etapie witaminę E

ekstrahuje się eterem naftowym. Następnie połączone ekstrakty przemywa się wodą, a ślady

wody usuwa stosując bezwodny siarczan sodu. Przygotowany ekstrakt eterowy poddaje się

odparowaniu do sucha na odparowywaczu obrotowym. Otrzymaną próbkę należy rozpuścić

w fazie ruchomej, a następnie poddać analizie chromatograficznej metodą HPLC. Do

przeprowadzenia analizy można użyć układu HPLC z detektorem spektrofotometrycznym UV

(

λ= 292) oraz kolumnę C18 (250 x 4,6 mm). Fazę ruchomą stanowi mieszanina

rozpuszczalników: acetonitryl (faza A) i metanol (faza B). Rozdział przebiega z

zastosowaniem elucji izokratycznej: 80% fazy A i 20% fazy B [1].

Oznaczanie tokoferoli w nasionach roślin oleistych można oznaczyć również metodą

adsorpcyjną z zastosowaniem techniki cienkowarstwowej (TLC). Polega ono na

odseparowaniu tokoferoli od innych składników badanego materiału stosując zmydlanie

i ekstrakcję, a następnie naniesieniu odpowiedniej ilości ekstraktu na płytkę

chromatograficzną pokrytą adsorbentem i rozwijaniu w komorze chromatograficznej. Po

rozdziale prowadza się identyfikację składników w świetle UV. Przed naniesieniem ekstraktu

na płytkę chromatograficzną należy ją uprzednio przygotować. W tym celu przygotowuje się

mieszaninę żelu krzemionkowego G, wody oraz 0,004% wodnego roztworu soli sodowej

fluoresceiny i energicznie wstrząsa, a następnie powleka płytkę warstwą o grubości 0,25 mm.

Płytki powierzchniowo suche aktywuje się w temperaturze 130°C przez 1,5h. Przed

przystąpieniem do analizy chromatograficznej należy zmielić nasiona roślin oleistych

i przeprowadzić proces zmydlania w obecności pirogalolu, etanolu absolutnego oraz 60%

KOH. Zawartość próby poddaje się ekstrakcji mieszaniną eterów dietylowego i naftowego.

Następnie nanosi się próby na płytki chromatograficzne i rozwija chromatogram [10].

3. Chromatografia a jakość dodatków do żywności

Rozwój przemysłu spożywczego i stosowanie nowoczesnych technologii

spowodowały konieczność używania wielu dotychczas nie wykorzystywanych składników,

których dodatek do tradycyjnych surowców powoduje uzyskanie nowych cech produktu oraz

poprawienie jego jakości. Dodatki tego typu wprowadzone w procesie technologicznym do

podstawowych surowców roślinnych lub zwierzęcych, są określane jako substancje

dodatkowe, dodatki do żywności oraz dodatki funkcjonalne do żywności. Celem stosowania

dodatków do żywności jest [1]:

- wydłużenie okresu trwałości produktów przez ograniczenie i zapobieganie niekorzystnym

zmianom, wywołanym procesami biochemicznymi oraz zapewnienie bezpieczeństwa

produktu,

- zapobieganie zmianom jakości (barwy, smaku, zapachu, tekstury),

- ochrona składników decydujących o wartości odżywczej i dietetycznej produktów,

- zwiększenie atrakcyjności i dyspozycyjności produktów dla konsumentów,

- zwiększenie wydajności produkcji przez ograniczenie ubytków oraz przez substytucję,

- otrzymanie produktów nowego rodzaju, szczególnie dietetycznych oraz dla diabetyków.

Technologiczną klasyfikację dodatków do żywności można uszeregować w czterech

zasadniczych grupach, a w nich poszczególne kategorie zgodnie z określeniem funkcji

przyjętych przez Unię Europejską (Tabela 6).

Tabela 6. Kategorie dodatków do żywności [14].

Zapobiegające

zepsuciu

- konserwanty, kwasy, bufory,

- przeciwutleniacze, sekwestranty,

- stabilizatory, gazy (atmosfera kontrolowana)

Sensoryczne

- barwniki, nabłyszczające, kwaszące,

- słodziki, wzmacniające smakowitość, aromaty

Teksturotwórcze

emulgatory, przeciwzbrylające, skrobia modyfikowana,

spulchniające, stabilizatory, zagęszczające, zwiększające masę,

zwilżające, żelujące

Pomocnicze

enzymy, gazy wypierające, polepszacze mąki, pianotwórcze,

przeciwpieniące, rozpuszczalniki

3.1.

Kontrola jakości przeciwutleniaczy

Przeciwutleniacze, to substancje, które przedłużają trwałość żywności dzięki

zabezpieczeniu jej przed rozkładem (jełczenie, zmiana barwy) spowodowanym utlenianiem

pod wpływem tlenu z powietrza. Stosuje się je we względu na podatność niektórych

produktów żywnościowych na utlenianie [1, 11].

Zjawisko utleniania w produktach nietłuszczowych obserwujemy przy udziale

enzymów (oksydaz), które znajdują się w surowcu. Zapobiegamy temu zjawisku stosując

dezaktywację enzymów [11].

Jełczenie tłuszczów pogarsza cechy sensoryczne oraz wartość odżywczą żywności.

Rozrywanie łańcuchów węglowych prowadzi do powstawania niskocząsteczkowych

produktów: węglowodorów, aldehydów, ketonów, kwasów, estrów, lak tonów, alkoholi

i estrów. Przy długim utlenianiu tłuszczów mogą powstać również substancje toksyczne, jak

również wolne rodniki. Produkty utleniania lipidów mogą niszczyć biologicznie czynne

białka, działać mutagennie na kwasy tłuszczowe oraz destrukcyjnie na karotenoidy

i witaminę A. Jełczeniu podlegać może również żywność o stosunkowo niskiej zawartości

tłuszczów, ale dobrze rozwiniętej powierzchni (mąka) [11].

Główną przyczyną stosowania przeciwutleniaczy jest zapobieganie przemiany

nienasyconych substancji tłuszczowych. Przemiany te zachodzą z lub bez udziału enzymów

[11].

Aby zahamować proces utleniania podejmuje się różne działania np.: pakuje się

produkty pod próżnią w atmosferze gazu obojętnego (azotu). Jednak dla niektórych

produktów jest to niewystarczające, więc wtedy stosuje się przeciwutleniacze naturalne,

syntetyczne lub synergenty [1, 12].

Przeciwutleniacze naturalne występują w olejach roślinnych: tokoferole, z których

największe działanie przeciewutleniające posiada δ-tokoferol (zapobiega jełczeniu

nienasyconych kwasów tłuszczowych oraz związków aromatycznych). Naturalnymi

przeciwutleniaczami są również: flawonoidy i fenylokwasy, występujące w owocach,

liściach, nasionach, przyprawach [1, 12].

Przeciwutleniacze syntetyczne wśród nich wyróżniamy estry: propylowy, ortylowy

i dodecylowy kwasu galusowego oraz butylohydroksyanizol i butylohydroksy toluen. Używa

się je do utrwalania tłuszczów smażalniczych oraz utrwalenia smażonego produktu (np.

chipsy, frytki, pączki) [1, 12].

Synergenty, ich rolą jest wspomaganie i przedłużanie działania przeciwutleniaczy,

aktywują funkcje przeciwutleniacza i kompleksują jony metali ciężkich, które katalizują

procesy utleniania. Tworzą one trwałe kompleksy z jonami metali. Wyróżniamy wśród nich:

wersenian wapniowo-sodowy EDTA, kwasy: cytrynowy, winowy, jabłkowy oraz difosforany

(V), aminokwasy i peptydy [1, 12].

Do analizy substancji przeciwutleniających używa się metody chromatograficzne.

Wykorzystuje się chromatografię bibułową oraz cienkowarstwową. Zaletami tych metodą są:

niskie koszty wyposażenia oraz prostota analizy. Szybsza jest chromatografia

cienkowarstwowa, jednak obserwuje się gorszą powtarzalność. Chromatografia bibułowa

w odwróconym układzie faz jest często stosowana ze względu na różną polarność

syntetycznych

przeciwutleniaczy.

chromatografii

bibułowej

wykorzystywane

są rozpuszczalniki: roztwory metanolu, etanolu, dioksanu, octanu etylu i metylu, aceton,

tetrachlorek węgla oraz ich mieszaniny. Za to reagentami, które wywołują chromatografy są:

kwas molibdenofosforowy lub azotan (VI) sodu w obecności amoniaku [11].

W chromatografii cienkowarstwowej stosuje się modyfikowane żele krzemionkowe,

acetylowaną celulozę, tlenek glinu lub poliamidy jako fazę stacjonarną. Jako rozpuszczalniki

stosuje się wcześniej wymienione przy chromatografii bibułowej oraz benzen, ksylen,

chloroform, propanol, glikol polietylenowy oraz ich mieszaniny. Substancjami wywołującymi

są: kwas fosforomolibdenowy, kwas sulfanilowy, azotan (V) srebra, siarczan (VI) żelaza (III),

odczynnik Folin-Ciocalteau oraz odczynnik Gibba [11].

Z analizie przeciwutleniaczy wykorzystuje się również chromatografię gazową, która

jest metodą z dużą selektywnością, czułością i małą czasochłonnością. W tym rodzaju

chromatografii wykorzystuje się kolumny nisko polarne oraz polarne, które termostatowane

są w szerokim zakresie temperatur. Gazami nośnymi mogą być: azot, argon i hel.

Wykorzystuje się detektory płomieniowo-jonizacyjne, cieplno-przewodnościowe oraz

wychwytu elektronów. Literatura donosi również o wykorzystaniu technik sprzężonych GC-

IR i GC-MS [11].

Wysokosprawna chromatografia cieczowa posiada szerokie zastosowanie w analizie

przeciwutleniaczy. Pozwala na szybki rozdział i analizę ilościową nielotnych i termicznie

labilnych związków. Metodą tą można oznaczać pojedyncze oraz mieszaniny

przeciwutleniaczy. Analizę można przeprowadzać w normalnym lub odwróconym układzie

faz, a także z zastosowaniem chromatografii par jonowych, jonowymiennej lub micelarnej.

Wykorzystuje się szeroką gamę faz stacjonarnych: BondaPak 18, z wypełnieniem Corasil II,

LiChrosrb RP18, NovaPak C19, Spherisorb i Ultraphere ODS, LiChrosrb NH

i inne,

zarówno w elucji izokratycznej, jak i gradientowej. Najczęściej wykorzystuje się fazy, gdzie

kolumna wypełniona jest złożem C18. Jako eluaty przy elucji gradientowej stosuje się:

cykloheksan, tetrahydrofuran, n-heptan, dichlorometan, metanol, acetonitryl, dioksan, octan

amonu, propanol oraz różne bufory i ich mieszaniny, m.in. mieszanina metanolu i wody

(70:30, v/v) lub acetonitrylu i wody (68:32, v/v). Detekcja odbywa się w ultrafiolecie

w zakresie od około 235 nm do 360 nm. Jednak można również wykorzystać detektory:

fluorymetrycznego, amperometrycznego, z matrycą diodową oraz elektrochemiczny [1, 11].

Do oznaczania przeciwutleniaczy w gumie do żucia m.in. galusanu propylu,

trihydroksybutyrofenonu, butylohydroksyanizolu, palmitynianu askorbylu, stosuje się metodę

HPLC z detektorem DAD. Ekstrakcję acetonitrylem z zastosowaniem ultradźwięków stosuje

się przed właściwą analizą. W analizie wykorzystuje się kolumnę wypełnioną C18. Fazą

ruchomą zazwyczaj stosuje się wodę z dodatkiem kwasu siarkowego – faza A oraz acetonitryl

– faza B, przepływ fazy ruchomej 0,5 ml/min. Proces rozdzielania wykonuje się stosując

elucję gradientową [1].

Przeciwutleniacze fenolowe oznacza się za pomocą chromatografii cieczową

z detekcją UV. Przed właściwą analizą próbkę (oleju) rozcieńcza się mieszaniną izopropanolu

i heksanu (4:1, v/v). Do analizy wykorzystuje się kolumnę C18 w odwróconym układzie faz,

wykorzystując mieszaninę wody/acetonitrylu/metanolu/izopropanolu jako fazy ruchomej.

Oznaczenie wykorzystuje się z zastosowaniem elucji gradientowej [1].

Przeciwutleniacze fenolowe można również oznaczać za pomocą chromatografii

gazowej z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym. Do około 30-60 mg próbek handlowych,

czyli np. masła, oleju, margaryny, sera, majonezu dodaje się 1 ml eteru dietylowego.

Do w ten przygotowany sposób próbek dodaje się wzorca wewnętrznego (8-chinolinol)

i następnie analizuje próbki [1].

3.2. Kontrola jakości konserwantów

Konserwanty, czyli substancje konserwujące, związki mające na celu zmniejszanie,

względnie całkowite zahamowanie procesów biologicznych powodowaniem mikroflory lub

enzymów tkankowych, które są odpowiedzialne za psucie się lub obniżanie jakości żywności.

Charakterystyczną cechą jest hamowanie rozwoju mikroorganizmów albo ich niszczenie przy

niskich dawkach, najczęściej ok. 0,1% [1, 12, 13].

Podczas przechowywania żywności zachodzą w niej zmiany, na ogół niepożądane,

są to zmiany:



fizjologiczne – na skutek działania enzymów tkankowych związanych

z procesami dojrzewania, oddychania i transpiracji, takie zmiany zachodzą

w surowcach roślinnych,



chemiczne – spowodowane reakcjami chemicznymi składników żywności

między sobą lub ze składnikami środowiska,



fizyczne – zmiany struktur fizycznych samego produktu lub z oddziaływania

czynników fizycznych otoczenia,



mikrobiologiczne – powodowane przez działalność drobnoustrojów [13].

Mechanizm działania substancji konserwujących na drobnoustroje jest złożony.

Zależny jest od wielu czynników, m.in. rodzaj i liczba drobnoustrojów, skład i właściwości

żywności. Najważniejszą rolę w tym mechanizmie odgrywa hamowanie lub blokowanie

procesów biochemicznych w komórce drobnoustroju Dzieje się to przez:



zmianę przepuszczalności ścian komórkowych lub błon cytoplazmatycznych,

ingerencję w mechanizm genetyczny,



hamowanie aktywności lub inaktywację niektórych enzymów biorących udział

w metabolizmie wewnątrzkomórkowym,



hamowanie syntezy DNA, białka i innych niezbędnych składników

odżywczych komórki,



inaktywowanie składników niezbędnych do rozwoju drobnoustrojów,



gwałtowne

aktywowanie

enzymów

powodujących

rozkład

wysokoenergetycznych nukleotydów [1, 12, 13].

Wyróżniamy dwie grupy konserwantów: antyseptyki – związki syntetyczne o prostej

budowie pochodzenia pozamikrobiologicznego, mogą posiadać swoje odpowiedniki

w przyrodzie, stosuje się je w ilościach poniżej 0,2%, antybiotyki – posiadają skomplikowaną

budowę oraz działają w bardzo małych dawkach (od kilku do kilkuset ppm), wytwarzane są

przez drobnoustroje [1, 12, 13].

Efektywność działania konserwantów zależy od ich aktywności w stosunku do rodzaju

drobnoustrojów, warunków środowiska, stężenia jonów wodorowych, temperatury, składu

chemicznego produktów, obecności substancji zmniejszających aktywność wody oraz pH

środowiska. Największe znaczenie ma oddziaływanie pH. Im niższe pH, tym dodatki

konserwujące o charakterze słabych kwasów lub ich soli wykazują silniejsze działanie, gdyż

najsilniej działają w stanie niezdysocjowanym, a wraz ze wzrostem pH wzrasta stopień ich

dysocjacji. Bardzo często wykorzystuje się dwa lub nawet kilka konserwantów, które

wykazują efekt synergistyczny, dzięki czemu przy mniejszych dawkach konserwantów

uzyskuje się podobny efekt [1, 12, 13].

Związek do utrwalania żywności powinien: być nietoksyczny; łatwo ulegać

metabolizmowi w organizmie człowieka i nie odkładać w tkance tłuszczowej; być

niezawodny w szerokim spektrum hamowania bakterii, drożdży i pleśni; być rozpuszczalny

w wodzie; być obojętny chemicznie wobec składników żywności; być trwały na procesy

technologiczne, którymi jest poddawany produkt; być tani [1, 12].

Chemiczne konserwanty powinny mieć charakter pomocniczy i stosowane powinny

być w najniższych uzasadnionych stężeniach. Należy dążyć do stosowania metod fizycznych,

takich jak: pasteryzacja, sterylizacja, mrożenie czy suszenie, oraz metod biologicznych

np. ukwaszanie [13].

Najważniejsze konserwanty: kwas benzoesowy, kwas sorbowy, ditlenek siarki,

niazyna, azotan (III) sodu i potasu, azotan (V) sodu i potasu, estry kwasu

p-hydroksybenzoesowego oraz ich sole sodowe (parabeny) [1, 12, 13].

Do jakościowej i ilościowej analizy konserwantów (kwas sorbowy, kwas benzoesowy)

stosuje się wysokosprawną chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz (RP, C18).

Fazami ruchomymi, które stosujemy w analizie to mieszaniny: woda/metanol/kwas octowy

(69:28:3, v/v/v), metanol/bufor octanu amonu pH 4,6 (50:50, v/v) [1, 12].

W oznaczaniu kwasu benzoesowego i sorbowego metodą HPLC w dżemie, przed

wykonaniem właściwej analizy należy usunąć białka i tłuszcze, w tym celu dodaje się

metanol. Po strąceniu, osad usuwa się przez odwirowanie, a supernatant analizuje się metodą

HPLC. Rozdzielanie wykonuje się w warunkach izokratycznych z kolumną C18 i eluatem:

mieszanina buforu octowego i metanolu. Faza ruchoma jest monitorowana przy 235 nm [1].

Próbki mięsa ekstrahuje się etanolem, następnie analizuje się chromatografię cieczową

z detektorem UV przy długości fali 254 lub 280 nm. Fazą stacjonarną jest kolumna

wypełniona złożem C18, faza ruchoma: mieszanina buforu octanu amonu i metanolu.

Do rozdzielania kwasu benzoesowego i sorbowego stosowana jest elucja gradientowa [1].

W metodzie chromatografii gazowej kwasy tj.: sorbowy, benzoesowy i salicylowy,

uprzednio się metyluje, ponieważ estry metylowe tych kwasów są bardziej lotne niż wolne

kwasy [12].

Przy analizie kwasu benzoesowego i sorbowego metodą GC, próbkę łączy się z wodą,

kwasem siarkowym (VI) i eterem, następnie wytrząsa się mieszaninę. Potem odwirowuje się

próbkę, a warstwę eteru przenosi się do kolby i ekstrahuje dwukrotnie NaOH i NaCl.

Ekstraktu zakwasza się roztworem HCl do pH<1, dodaje się dichlorometanu i bezwodnego

, następnie odparowuje się do sucha. Taką próbkę poddaje się reakcji derywatyzacji,

a następnie poddaje się analizie metodą GC-FID [1].

Estry kwasu p-hydroksybenzoesowego oraz ich sole sodowe oznaczamy

wykorzystując wysokosprawną chromatografię cieczową w odwróconym układzie faz.

Eluentem w tym wypadku jest acetonitryl z wodą i kwasem octowym lub acetonitryl

z octanem amonu oraz metanol z wodą. Wykorzystuje się detektor UV [13].

Azotany (III) i (V) oznacza się metodą HPLC z zastosowaniem kolumny

jonowymiennej lub w odwróconym układzie faz (kolumna RP8) z detekcją przy długości fali

205 nm [13].

3.3. Środki słodzące

Zastępowanie sacharozy niskoenergetycznymi związkami syntetycznymi o dużej sile

słodzącej jest spowodowane względami dietetycznymi. Pojęcie słodzik obejmuje zarówno

substancje słodzące pochodzenia naturalnego, jak i syntetyczne związki, charakteryzujące się

intensywnym słodkim smakiem. Słodziki zapewniają słodki smak bez dostarczania energii

(kalorii) lub z bardzo małą ich ilością. Większość z nich nie jest trawiona przez organizm i

dlatego nie dostarczają kalorii. Słodkość substancji słodzących określa się jako stosunek

intensywności słodkości jednostki wagowej danej substancji do słodkości sacharozy, którą

przyjmuje się za 1. Substancje słodzące dzielą się na dwie grupy: półsyntetyczne, o niezbyt

dużej intensywności słodkości (lakitol, izomalt, mannitol, sorbitol) oraz syntetyczne, silnie

słodzące (cyklaminiany, aspartam, sacharyna). Półsyntetyczne słodziki to alkohole cukrowe

otrzymywane przez redukcję odpowiednich cukrów, dlatego posiadają pewną wartość

odżywczą [15]. W tabeli 7 zebrano zalety i wady stosowania słodzików w żywnieniu:

Tabela 7.

Słodziki, a żywienie.

ZALETY

WADY

Niska lub żadna wartość kaloryczna

Odczuwanie metalicznego posmaku

Większa siła słodząca słodzików

syntetycznych w porównaniu do cukru –

mniejszy ich dodatek pozwala uzyskać taką

samą słodkość (względy finansowe)

Zakaz spożywania niektórych słodzików

przez dzieci i kobiety ciężarne

Brak wpływu na zęby w postaci próchnicy

Zakaz spożywania produktów bogatych w

aspartam przez chorych na fenyloketonurię

Niskokaloryczne słodziki pozwalają uzyskać

słodki smak bez obniżania poziomu cukru we

krwi

Możliwość wywołania biegunek po

nadmiernym ich spożyciu

Łatwa kontrola diety cukrzyków

Rakotwórcze właściwości niektórych

substancji słodzących (dane sprzeczne)

Technika HPLC jest najczęściej stosowana do oznaczania syntetycznych substancji

sładzących. Za jej pomocą można oznaczyć kilka substancji podczas jednej analizy.

Rozdzielenie wykonuje się w układzie faz odwróconych z detekcją spektrofotometryczną

(długość fali 220 nm). Przed wykonaniem analizy właściwej próbkę należy odpowiednio

przygotować. W przypadku produktów klarownych (Tonic) badaną próbkę odgazowuje się w

łaźni ultradźwiękowej i rozcieńcza 10-krotnie wodą dejonizowaną. Uzyskany roztwór

przesącza sie przez filtr membranowy o wielkości porów 0,45 μm i poddaje analizie metodą

HPLC. Gdy badany napój zawiera barwniki, czy też substancje smakowo-zapachowe, próbkę

po odgazowaniu w łaźni ultradźwiękowej oczyszcza się metodą ekstrakcji do fazy stałej.

Kolumienkę ze złożem C18, przemywa się metanolem, a następnie buforem octan sodu/kwas

octowy (pH 4,5). Na tak przygotowaną kolumienkę wprowadza się około 10 ml próbki. Po

usunięciu zanieczyszczeń syntetyczne substancje słodzące eluuje się metanolem. Eluat

odparowuje się do sucha, a następnie rozpuszcza w fazie ruchomej. Przed analizą próbkę

przesącza się przez filtr membranowy i analizuje metodą HPLC. W przypadku produktu,

który zawiera naturalne wyciągi owocowe i warzywne, oczyszczanie wykonuje się za pomocą

roztworów Carreza I (K

[Fe(CN)

] · 3 H

O) i Carreza II (ZnSO

· 7 H

O). Następnie napój

sączy się dwukrotnie: przez sączek bibułowy i sączek membranowy (wielkość porów 0,45

μm) [1, 2].

Do analiz wykorzystuje się zestaw HPLC-UV (λ = 220 nm) wyposażony w kolumnę

C18 (150 x 4,6 mm). Jako fazę ruchomą stosuje się układ rozpuszczalników: acetonitryl (faza

A) i bufor octan sodu/kwas octowy (faza B). Rozdzielenie prowadzi się z zastosowaniem

elucji gradientowej, przepływ fazy ruchomej - 0,8 cm

/min. Do rozdzielenia syntetycznych

substancji słodzących można zastosować również kolumnę typu RP i mieszaninę buforu

fosforanowego (0,0125 mol/dm

, pH 3,5) i acetonitrylu w stosunku 90:10 (v/v) [5].

Przebieg procesu oznaczania słodzików metodą HPLC-MS obrazuje rysunek 5.

Rysunek 5. Przebieg procesu HPLC-MS oznaczania substancji słodzących [15].

odważenie

próbki i jej

homogenizacja

rozpuszczenie

próbki /

ekstarkcja

analitów

oczyszczenie

ekstraktu

rozdzielanie

analitów

detekcja

analitów

3.4. Związki zapachowe

Substancje zapachowe żywności to grupa kilku tysięcy związków, należących do

wielu klas. Związki te są obecne w produktach i surowcach w bardzo zróżnicowanych

stężeniach i liczbie. Liczba związków zapachowych identyfikowanych w żywności na

przestrzeni ostatnich 40 lat zwiększyła się 10-krotnie od ok. 600 na rok 1960 do ok. 6000 na

rok 1995 [16]. Zawdzięczamy to głównie postępowi technik chromatograficznych.

Kształtowanie zapachu jest procesem dynamicznym. W wyniku działania enzymów

powstaje aromat określany jako pierwotny. W rezultacie przemian termicznych i działalności

mikroorganizmów powstają związki tworzące aromat wtórny. Drogi tworzenia związków

lotnych żywności obejmują zarówno reakcje chemiczne, jak i enzymatyczne. Obok

pożądanych zmian w aromacie produktu mogą pojawiać się także zmiany niepożądane – jako

wynik procesów oksydacyjnych, hydrolitycznych, degradacji termicznej i wielu innych

przemian. Z punktu widzenia konsumenta związki odpowiedzialne za obcy zapach żywności

odgrywają niebagatelne znaczenie. Próg wyczuwalności sensorycznej, czyli najniższe

stężenie, w którym można wyczuć dany związek, decyduje o jego wpływie na aromat danego

surowca lub produktu. Zarówno więc bezwzględna zawartość związku, jak i jego próg

wyczuwalności sensorycznej są istotne w charakterystyce zapachu produktu. W celu

powiązania tych wartości wprowadzono pojęcie wartości aktywności aromatu OAV (ang.

Odor Activity Value), będące ilorazem stężenia substancji do progu jej wyczuwalności

sensorycznej. Zapach związku zależy od budowy przestrzennej cząsteczki i bardzo często

nieznaczne różnice w budowie sferycznej związków powodują ich zupełnie odmienną

percepcję. Na rodzaj i intensywność zapachu wpływa też stężenie danego związku. Często

związki występujące w śladowych ilościach (nawet na poziomie ng/l) wywierają większy

wpływ na właściwości sensoryczne produktów spożywczych niż te, które występuję w

wysokich stężeniach (rzędu setek mg/l) [16].

3.4.1. Chromatografia gazowa - olfaktometria

Bardzo istotną techniką, która znajduje zastosowanie tylko w analizie związków

zapachowych, jest połączenie chromatografii gazowej z olfaktometrią (GC-O) [17, 18, 19].

Identyfikacja najważniejszych związków zapachowych w żywności polega na

wyselekcjonowaniu spośród wielu związków lotnych tych, które decydują o zapachu.

Narzędziem do identyfikacji tych związków musi być ludzki nos, dlatego też rolę detektora w

GC-O pełni przeszkolona grupa osób lub zespół osób oceniających. Wąchanie analitów jest

możliwe dzięki obecności specjalnie skonstruowanej przystawki (portu olfaktometrycznego)

zamontowanej równolegle z konwencjonalnymi detektorami, np. płomieniowo-jonizacyjnym

FID (rysunek 6).

Rysunek 6. Schemat chromatografu gazowego z detektorem olfaktometrycznym [18].

Strumień eluatu z kolumny po przejściu przez odpowiednio skonstruowaną linię przesyłową

jest wąchany w szklanym lub teflonowym stożkowym porcie dopasowanym do kształtu nosa.

Linia przesyłowa jest ogrzewana, aby zapobiec kondensacji trudno lotnych analitów na

ściankach kapilary. Jednocześnie, aby uniknąć wysuszenia śluzówki nosa osoby oceniającej,

co mogłoby powodować dyskomfort, zwłaszcza w czasie długich

analiz, do eluatu doprowadzany jest gaz pomocniczy w postaci

wilgotnego powietrza. Linia transferowa musi być na tyle długa, by

zapewnić wygodną siedzącą pozycję oceniającego w czasie detekcji

i uniknąć dyskomfortu związanego z bliskim sąsiedztwem gorących

elementów chromatografu. Jeżeli analizowany ekstrakt jest wystarczająco skoncentrowany,

niekiedy możliwy jest podział eluatu na kilka strumieni i jednoczesna detekcja w kilku

równolegle podłączonych portach olfaktometrycznych dokonywana przez kilka osób

jednocześnie. Uzyskane wyniki są bardziej zgodne [17, 18].

Oznaczanie substancji zapachowych z wykorzystaniem technik instrumentalnych

składa się z dwóch etapów. Szczególnie ważna jest pierwsza faza analizy, czyli izolacja

analitów z matrycy. Kluczowym krokiem jest dobór odpowiedniej metody przygotowywania

próbki. Najkorzystniejsze jest stosowanie takich metod ekstrakcji, które obrazują raczej

uwalnianie lotnych składników z matrycy, niż pozwalają na oznaczenie całkowitej zawartości

tych składników i które mogą być dzięki temu łatwiej skorelowane z wynikami analizy

sensorycznej. Do metod tego typu należą metody wykorzystujące analizę fazy

nadpowierzchniowej, w tym zarówno metody statyczne, jak i dynamiczne, przy czym ze

względu na możliwość wzbogacenia analitów, znacznie częściej stosowane są metody

dynamiczne [18].

Wygląd olfaktogramów ściśle zależy od procedury izolacji analitów oraz od

stosowanej metody ilościowej. Istnieje kilka metod ilościowego oznaczania intensywności

zapachu i względnego wpływu poszczególnych analitów na zapach próbki. Metody te można

podzielić na trzy grupy, różniące się zasadą oznaczania (rysunek 7).

Rysunek 7. Metody ilościowej analizy w GC-O [19].

Krótka charakterystyka przedstawionych na rysunku metod [17, 19]:

- metody częstości detekcji, zespół oceniający analizuje tę samą próbkę i obliczany jest

procent osób, które wyczuły związek zapachowy w określonym czasie retencji; związki, które

wyczuwane są częściej od innych, uznawane są za mające najistotniejszy wpływ na zapach

danej próbki,

GC-O

metody

częstości

detekcji

metody rozcieńczania

do progu

wyczuwalności

CHARM

AEDA

metody bezpośredniej

intensywności

metody

późniejszej

oceny

intensywności

metody

jednoczesnej

oceny

intensywności

metoda

rozpiętości

palców

- metody rozcieńczenia do progu wyczuwalności, ilościowy opis potencjału zapachowego

danego związku (bazą jest stosunek jego stężenia w próbce do progu jego wyczuwalności

sensorycznej w powietrzu), przygotowana zostaje seria różnych rozcieńczeń ekstraktu

związków zapachowych i następuje ocena każdej próbki z wykorzystaniem detektora

zapachowego; AEDA pozwala zmierzyć największe rozcieńczenie próbki, przy którym

zapach badanego związku jest jeszcze wyczuwalny, obliczamy współczynnik rozcieńczenia

zapachu (FD); CHARM wymaga ponadto określenia czasu trwania wrażenia zapachowego w

eluacie z kolumny i pozwala na stworzenie swego rodzaju piku chromatograficznego,

- metody bezpośredniej intensywności, pomiar intensywności bodźca węchowego oraz czas

jego trwania, stosując różnego rodzaju skale do ilościowego pomiaru natężenia zapachu

eluującego związku; może być to pomiar pojedynczy uśredniony czasowo, rejestrowany po

elucji analitu (metody późniejszej oceny intensywności), bądź pomiar dynamiczny, w którym

pojawienie się zapachu, maksimum jego intensywności i zanik rejestrowany jest w sposób

ciągły (metoda rozpiętości palców); uzyskany olfaktogram przedstawia zależność

intensywności zapachu w funkcji czasu retencji (wysokość piku – maksymalne natężenie

zapachu analitu, szerokość piku – długość bodźca zapachowego).

Poniżej znajdują się przykłady zastosowań chromatografii gazowej z detekcją

olfaktometryczną w analizie żywności [19]:

- tworzenie profili zapachowych wędlin, serów, napojów alkoholowych, charakterystycznych

dla danego kraju i regionu,

- poznanie procesu powstawania i kształtowania aromatu produktów spożywczych (np.

wędliny) oraz wpływ czynników takich jak np. rodzaj użytych przypraw na zapach,

- kontrola procesu technologicznego produkcji żywności,

- identyfikacja związków odpowiedzialnych za niepożądane zapachy i wykrycie przyczyny

ich pojawiania się w końcowym produkcie (kontrola jakości żywności),

- ocena dojrzałości owoców i warzyw, sposobu ich pakowania i przechowywania,

- analiza porównawcza aromatu owocu, jego soku i olejku aromatycznego.

3.5. Barwniki

3.5.1. Definicja i podział

Wśród licznej grupy dodatków do żywności wymienić można różnego rodzaju

barwniki. Nie stanowią one żadnej wartości odżywczej, a wpływają jedynie na poprawę

walorów estetycznych produktu. Barwniki mogą być pochodzenia naturalnego lub mogą być

syntezowane, te dzieli się na organiczne i nieorganiczne. Barwniki naturalne to najczęściej

barwniki pochodzenia roślinego, pozyskiwane z roślin tropikalnych, glonów, owoców,

warzyw. Najbardziej znane z tej grupy barwników to karoteny (E160), chlorofil (E140),

antocyjany, kurkumina. Syntetyczne barwniki organiczne to głównie związki azowe,

występujące w postaci proszku, granulatu, pasty, roztworu wodnego. W Polsce,

dopuszczonych do barwienia żywności jest 8 związków chemicznych, są to : żółcień

chinolinowa (E104), azorubina (E122), żółcień pomarańczowa (E 110), czerwień koszenilowa

(E124), błękit patentowy (E 131), indygotyna (E 132), czerń brylantowa (E 151), fiolet

metylowy. Barwniki te są tanie, trwałe i odporne na warunki środowiska. Aby uniknąć

maskowania wad żywności za pomocą syntetycznych barwników, wprowadzono ograniczenia

w wykorzystywaniu ich w przemyśle żywności [20].

3.5.2. Metody oznaczania barwników

Zawartość barwników w produktach żywnościowych można określić na wiele różnych

sposobów. Najczęściej strukturę nowych zsyntezowanych barwników, a także do ustalenia ich

zanieczyszczeń wykorzystuję się magnetyczny rezonans jądrowy (NMR). Popularnymi

metodami oznaczania barwników są także metody chromatograficzne : chromatografia

cienkowarstwowa oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa [1].

3.5.2.1. Chromatografia cienkowarstwowa

W tej metodzie fazę stacjonarną na ogół stanowi celuloza oraz żel krzemionkowy. W

przypadku tej pierwszej, jako układ rozdzielający należy zastosować mieszaninę cytrynianu

sodu, amoniaku oraz metanolu. Gdy stosuję się żel krzemionkowy, wymagany jest inny układ

: octan etylu, etanol, dietyloamina, woda [1].

3.5.2.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Wykazano, że najlepszy rozdział barwników z zastosowaniem wysokosprawnej

chromatografii cieczowej, uzyskuje się z zastosowaniem odwróconego układu faz. Fazę

stacjonarną powinno stanowić złoże C18 , a fazę ruchoma mieszanina izopropanolu i wody

[1].

4. Chromatografia w kontroli zanieczyszczeń żywności

W żywności mogą być obecne zanieczyszczenia toksyczne dla człowieka - szkodliwe

produkty metabolizmu, substancje wchłonięte ze środowiska przez rośliny czy zwierzęta,

pozostałości nawozów, pestycydów, związki stosowane w leczeniu zwierząt, substancje

powstające w skutek obróbki i wprowadzane w procesie technologicznym. Szczególnie

niebezpieczne dla zdrowia są metale ciężkie, pestycydy, wielopierścieniowe węglowodory

aromatyczne, dioksyny, mykotoksyny. [21]. Innym źródłem zanieczyszczeń są substancje

migrujące z opakowań do żywności. Najczęściej stosowane są opakowania szklane

(najbezpieczniejsze), papierowe i z tektury oraz z tworzyw sztucznych (największe ryzyko).

W opakowaniach z tworzyw sztucznych polimery są uznawane za nietoksyczne

nie migrują ze względu na duże rozmiary cząsteczek. Zagrożenie jednak wynika

z obecności monomerów i środków pomocniczych takich jak antyutleniacze i stabilizatory

UV (pochodne fenoli, tioestry, związki trójwartościowego fosforu), środki antystatyczne

(pochodne amin, alifatyczne sulfoniany), plastyfikatory (poliestry, PVC, estry kwasu

ftalowego), środki poślizgowe (amidy nienasyconych kwasów tłuszczowych, alkiloaminy)

oraz rozpuszczalniki z farb i lakierów. Niezbędne jest zatem monitorowanie zanieczyszczeń

w surowcach i gotowych produktach, co wymaga odpowiednich metod analitycznych.

Opakowania przeznaczone do kontaktu z żywnością muszą spełniać określone wymagania

sanitarno- higieniczne. Istotne jest określenie migracji globalnej, czyli sumy wszystkich

substancji przenoszonych do żywności z opakowania oraz migracji specyficznej (SML)

określającej przeniesienie konkretnego składnika [22, 23].

Analiza zanieczyszczeń metodami chromatograficznymi

Techniki

wykorzystywane

muszą

charakteryzować

się

dużą

czułością

i selektywnością, a przy tym ekonomicznością i dobrą szybkością oznaczeń. Metodą szeroko

wykorzystywaną jest chromatografia często stosowana w połączeniu z innymi technikami.

Ze względu na złożoność matrycy i niewielkie stężenia oznaczanych zanieczyszczeń

przed przystąpieniem do właściwej analizy niezbędne jest odpowiednie przygotowanie

próbki.

Tabela 8. Przykłady zanieczyszczeń żywności [1, 22, 24, 25, 26, 27].

Budowa

Przykłady

Występowanie

Właściwości

Metoda

chromatograf.

toksyny

Aflatoksyny

Ochratoksyna

Patulina

Fumonizyny

Deoksyniwalenol

Zearalenon

- głównie w zbożu i jego przetworach, orzechach,

przyprawach, kukurydzy, kawie, kakao, herbacie,

suszonych owocach, winie, mleku

- powstają jako produkty wtórnego metabolizmu grzybów
(pleśni)

- tworzą się w czasie wegetacji, zbioru lub
nieprawidłowego magazynowania

- silnie toksyczne, efekt toksyczny zależy

od rodzaju mikotoksyny i dawki

- długotrwałe narażenie: przewlekłe

choroby w tym nowotwory nerek i
wątroby

- jednorazowa duża dawka: ostre zatrucie

- zapobieganie: należy chronić produkty
przed wilgocią, zapewnić odpowiednie
warunki przechowywania i produkcji,
można stosować dodatek środków
grzybobójczych

TLC

HPLC

GC-MS

LC-MS

HPLC-RP (FLD)

ioksyny

Grupa 75 związków z
różnym podstawieniem
chloru

- największe stężenie dioksyn jest w przetworach

mlecznych, mleku i rybach

- mogą dostawać się do pożywienia z papierowych
produktów takich jak talerzyki papierowe czy filtry do
kawy

- toksyczność zależy od podstawienia,
najbardziej niebezpieczne są pochodne
podstawione w pozycji 2,3,7,8.

- szkodliwe działanie: zmiany
trądzikowe, zwyrodnienie nerwów oraz
uszkodzenie wątroby

GC-MS/MS

GC-SIM

GCxGC

Polichlorowane bifenyle

-szczególnie dużo jest w organizmach wodnych, głównie
w wątrobie i tkance tłuszczowej ryb, ale także w mięsie i
produktach mleczarskich

- powstają w czasie chlorowania wody pitnej

- bardzo dobrze rozpuszczają się w tłuszczach

- wykazują działanie rakotwórcze ponadto
mają zdolność do bioakumulacji

GC-MS/MS

opi

ści

eni

e w

ęgl

odory

arom

tyc

zne W

Dibenzo(a,h)antracen
Benzo(a)piren
Benzo(a)fluoranten
Antracen

- powstają w czasie przetwórstwa (suszenie zbóż, prażenie
kawy), obróbki termicznej (pieczenie, smażenie,
grillowanie) przy czym ich zawartość rośnie ze wzrostem
temperatury i czasu, utrwalania przez wędzenie

- WWA mogą także przenikać do żywności bezpośrednio
ze środowiska – powietrza, gleby, wody

- wysoce niebezpieczne, mają
właściwości kancerogenne i mutagenne,

GC (FID)

GC-MS

HPLC (DAD,FLD,
UV)

cykl

icz

e a

iny

arom

tyc

zne

- powstają w czasie obróbki cieplnej produktów o dużej
zawartości białka, występują głównie w smażonym mięsie
i rybach

>300°C powstają produkty piroliy białek i aminokwasów

150-200°C pochodne chinoliny i chinoksaliny, pirydyny

- działają mutagennie i rakotwórczo

- ich liczba zależy od obecności
prekursorów, inhibitorów, temperatury,
czasu procesu, odczynu środowiska

HPLC (DAD)

HPLC-ESI-MS

LC-MS

zoa

iny

- w peklowanym mięsie, wędzonych rybach, piwie, sosie
sojowym i innych produktach spożywczych

- ok. 90% z nich wykazuje działanie
rakotwórcze, przy czym najsilniejsze
N-nitrozodimetyloamina

- aby ograniczyć ich powstawanie w

czasie obróbki dodaje się

przeciwutleniacze

GC-MS/MS

GC-TFA

HPLC-TFA

Pest

cydy

Bakteriocydy
Herbicydy
Fungicydy
Zoocydy

(fenoksykwasy, pochodne
sulfonylomocznika,
zw. fosforoorganiczne,
karbaminiany,
fenyloaminy, azole)

- produkty spożywcze pochodzenia roślinnego

- źródłem zanieczyszczeń jest nadmierne stosowanie
środków ochrony roślin w nieodpowiednich terminach
wegetacji

- mają zdolność do biokumulacji

- jednorazowe dawki nie są szkodliwe, ale
w przypadku stałego przyjmowania mogą
być niebezpieczne

GC

GCxGC

HPLC

TLC

ntybi

tyki

podstawowa jednostka
budowy tetracyklin

Β-laktamy, tetracykliny,
sulfonamidy, makrolidy,
azalidy, chinolony

- pozostałości antybiotyków w mięsie i produktach
pochodzenia zwierzęcego – jajka, mleko, tłuszcz, miód

- powodem zanieczyszczenia jest głównie
nieprzestrzeganie okresu karencji i nadużywanie
antybiotyków

- przyjmowanie długotrwałe nawet w
małych ilościach może powodować
powstawanie w organizmie
lekoodpornych szczepów bakterii, reakcje
alergiczne czy zaburzenia w
funkcjonowaniu tkanek i narządów

LC (DAD lub FLD)

LC-MS

LC-MS/MS

TLC

ler

gen

Alergeny się pochodzić z różnych źródeł, to złożona mieszanina różnych substancji
chemicznych obejmująca białka z gryki, jaja, orzeszki ziemne, zboża zawierające
gluten, orzechy, skorupiaków, ryb, soi, sezamu, gorczycy i selera, oraz substancje
chemiczne, takie jak siarczyny

- powodują różnego typu reakcje
alergiczne

LC-MS

HPLC

zot

any

, NO

- azotany w wodzie, warzywach liściastych: burak,
szpinak, seler, sałata, kapusta, mogą występować także w
produktach pochodzenia zwierzęcego, a źródłem ich jest
pasza

- azotany (III) występują w mniejszych ilościach, ale na
skutek redukcji azotanów (V) ich ilość rośnie

- azotany (V) są mało toksyczne, mogą
jednak powodować podrażnienia
przewodu pokarmowego, azotany (III)
mogą powodować bóle brzucha, zawroty
głowy, a nawet doprowadzić do zapaści,
azotany mogą być źródłem
N-nitrozoamin

IC

HPLC (UV)

anie

ysz

ruj

ące

z opak

ań

Opakowania papierowe i z tektury

heksanal

benzofenon, metylobenzofenon (SML <0,6 mg/kg)

4,4”-bis(dimetyloamino)benzofenon (keton Michlera),

ftalan diizobutylu (DIBP) QM 1mg/kg, ortofenylofenol,

pentachlorofenol (PCP)SML 0,15mg/kg zw.chloroorganiczne

Opakowania z tworzyw sztucznych

4,4-diizocyjanian difenylometylu (1mg/kg wyrobu)

2,4-diizocyjanian toluilu (1mg/kg wyrobu)

1,3-butadien (SML 0,02mg/kg)

Chlorek winylidenu (SML 0,05 mg/kg)

- szkodliwe działania na zdrowie
człowieka

- niektóre z nich mają potwierdzone
działanie rakotwórcze

- mają wpływ na jakość produktu poprzez
pogorszenie właściwości
organolepycznych,

GC (FID lub ECD)

GC-MS

HPLC

Przygotowanie próbek

Celem jest wyodrębnienie analitu, wzbogacenie próbki, usunięcie przeszkadzających

składników oraz nadanie odpowiednich właściwości pozwalających na analizę substancji.

Stosuje się filtrację, ultrafiltrację, dializę, destylację, przepuszczanie przez kolumny żelowe,

rozpuszczanie, stapianie z odpowiednio dobranymi topikami oraz ekstrakcję [1, 24].

a) ekstrakcja

jest jedną z najpowszechniej używanych metod przygotowania próbek, może być realizowana

w różnych wariantach: ciecz-ciecz, ciecz-ciało stałe w aparacie Soxhleta, ekstrakcja do fazy

stałej (SPE), dyspersyjna ekstrakcja do fazy stałej (dSPE) mikroekstrakcja do fazy stałej

(SPME), ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym, metoda przyspieszonej ekstrakcji

rozpuszczalnikiem.

Szczególne

znaczenie

metoda

SPE,

która

opiera

się na chromatograficznym rozdziale analitu od pozostałości, przy zastosowaniu kolumn

z odpowiednim wypełnieniem – modyfikowanymi materiałami krzemionkowymi

i polimerowymi. Możliwe jest także stosowanie kolumn powinowactwa immunologicznego,

szczególnie przydatne w przegotowaniu próbek toksyn, alergenów. Ekstrakcja

wykorzystywana jest także w analizie migracji związków z opakowań. Badane tworzywo

zanurza się w odpowiednich płynach modelowych (woda destylowana, 3% kwas octowy,

10% etanol oraz oliwę z oliwek lub olej słonecznikowy) w ściśle określonych warunkach

czasu i temperatury zgodnie z normami.

b) analiza nadpowierzchniowa headspace

polega na badaniu fazy gazowej znajdującej się w równowadze z fazą ciekłą lub stałą

umieszczoną w szczelnej fiolce. Zaletą tej metody jest fakt, że na kolumnę wprowadza

się tylko lotne składniki, a nielotne pozostają w roztworze, poza tym pozwala na oznaczenie

bardzo małych stężeń bez wprowadzania dodatkowych substancji. Metoda wykorzystywana

m.in. do oznaczenia lotnych związków organicznych z opakowań.

c) kompleksowa analiza QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe) [28, 29]

jest to metoda szybka, prosta, tania, efektywna i bezpieczna. Pozwala na niewielkie zużycie

odcznników i próbki, wysoki odzysk analitu oraz efektywne usuwanie matrycy. Szczególne

zastosowanie ma do oznaczania pestycydów będących grupą związków o zróżnicowanych

właściwościach. Metodę postępowania przedstawiono na rysunku. Stosuje się także

modyfikacje procesu przez dodatek C8 lub C18 jako sorbentów, w celu usunięcia

przeszkadzających steroli, tłuszczu czy pigmentów lub dodatek kwasu octowego, co poprawia

ekstrakcję polarnych fosforoorganicznych pestycydów.

Rysunek 8. Kompleksowa analiza QuEChERS.

d) oczyszczanie metodą chromatografii żelowej

umożliwia rozdział małocząsteczkowych związków od wielkocząsteczkowych. Najczęściej

stosuje się żywice – kopolimery styrenu i diwinylobenzenu. Eluentem jest zazwyczaj octan

etylu, cykloheksan, eter dietylowy i mieszaniny. Wadą tego typu rozwiązań jest konieczność

użycia dużych ilości rozpuszczalnika i długi czas rozdziału.

e) dodatek izotopów

stosuje się dodatek wzorców – analogów badanej substancji ze znaczonymi izotopami węgla

C o ściśle określonym składzie i stężeniu, celem takiego zabiegu jest określenie stopnia

odzysku, gdy straty substancji są duże w czasie przygotowania próbki, np. w przypadku

dioksyn czy PCD.

Właściwa analiza

Podstawowymi technikami wykorzystywanymi są GC Chromatografia gazowa

oraz Chromatografia cieczowa LC, HPLC. Wykorzystanie tych technik w zależności od

właściwości przedstawiono na rysunku.

Rysunek 9. Zależność doboru metody od właściwości analitu.

Stosowanymi fazami stacjonarnymi są głównie żele krzemionkowe, żele ze związanymi

grupami aminowymi, cyjanowymi. Jako eluent stosuje się wtedy heksan, chloroform,

izopropanol. W odwróconym układzie faz fazę stacjonarną stanowią wypełnienia z grupami

metylowymi, oktylowymi, oktadecylowymi, fazę ruchomą natomiast woda, metanol

i acetonitryl. Stosuje się detektory FID czy wychwytu elektronów ECD lub spektrometr

masowy, co pozwala na potwierdzenie struktury i określenie jakościowe i ilościowe

związków w mieszaninie

TLC

Może być wykorzystywana, np. w analizie mikotoksyn, które umieszcza się na płytce

pokrytej silikonowym żelem, przy zastosowaniu odpowiednich rozpuszczalników.

Po wysuszeniu obserwuje się fluorescencję plam [22]. Można też przeprowadzić mikotoksyny

w pochodne z kwasem trifluorooctowym, co znacznie poprawia wykrywalność (0,25-9 ng.g).

Może być stosowany także w przypadku anliz pozostałości antybiotyków.

Sprzężenie ze spektrometrem mas GC-MS lub LC-MS

Połączenie ze spektrometrem mas pozwala na jednoczesne oznaczanie związków różnych

grup, przy czym spektrometr może pracować w dwóch opcjach – full scan – tryb całkowitego

skaningu widma masowego oraz selected ion monitoring (SIM) – tryb monitorowania

konkretnych jonów. Istnieje także możliwość zwiększenia czułości stosując tandemową

spektrometrię masową MS/MS. Jony rozdzielone w pierwszym analizatorze są następnie

fragmentowane w kolejnym. Metoda ta pozwala na rozdzielanie, identyfikację i analizę

ilościową. Charakteryzuje się wysoką czułością 10

-9

-10

-12

g. Schemat takiego połączenia

przedstawiono na rysunku [1].

Chromatografia wielowymiarowa GCxGC, LCxLC

Pozwala na uzyskanie lepszej czułości, rozdziału pików, a przede wszystkim zmniejszenie

wpływu matrycy. Nie trzeba w tym przypadku stosować tak wielu operacji oczyszczania

próbek. Metoda ta zapewnia oddzielenie sygnałów analitu od matrycy. wykorzystuje dwie

kolumny chromatograficzne różniące się polarnością, które łączy modulator. Jego zadaniem

jest zatężenie analitów elujących z pierwszej kolumny i uwolnienie ich do drugiej kolumny,

dzięki czemu uzyskuje się polepszenie rozdzielenia substancji i wykrywalności. Schemat

takiego połączenia przedstawiono na rysunku.

Chromatogramy liniowe otrzymane są trudne do interpretacji stąd odpowiednie

oprogramowanie przetwarza je na chromatogram konturowy poziomy, w którym

intensywność zabarwienia odpowiada stężeniu.

Piki wychodzące z drugiej kolumny są bardzo wąskie, dlatego istotne jest częste

próbkowanie, co wyklucza część detektorów. Przydatne okazują się FID i ECD. MS

w większości przypadków słabo się sprawdza lepiej zaś spektrometr czasu przelotu (TOF

MS), który jest jednak bardzo kosztowny. Takie wykorzystanie chromatografii jest

szczególnie przydatna w analizie pestycydów. Przeprowadzono badania, w których udało się

oddzielić i oznaczyć 58 analitów z możliwością oznaczenia ilościowego.

Podsumowanie

Metody analizy sacharydów za pomocą chromatografii gazowej i wysokosprawnej

chromatografii cieczowej charakteryzują się dużą precyzją, łatwością i szybkością wykonania

w porównaniu z metodami chemicznymi.

Lipidy jako związki o złożonej budowie stanowią trudny materiał do analizy.

Często lipidy przeprowadza się w różnego rodzaju pochodne, które są zdecydowanie

łatwiejsze do oznaczenia. Wykorzystywanymi metodami do identyfikacji klas lipidów są:

chromatografia cieczowa, cienkowarstwowa, wysokosprawna chromatografia cieczowa,

chromatografia gazowa.

Występowanie witamin w bardzo niewielkich ilościach oraz ich wrażliwość na

czynniki fizykochemiczne, sprawia wiele trudności w ich ilościowym oznaczaniu. Do

jakościowego i ilościowego oznaczania witamin i prowitamin stosuje się różne metody

(chemiczne, fizykochemiczne). Coraz częściej do analizy witamin w produktach

spożywczych wykorzystuje się wysokosprawną chromatografię cieczową, najczęściej w

odwróconym układzie faz z zastosowaniem kolumny RP-C18.

Przeciwutleniacze to substancje, które przedłużają trwałość żywności dzięki

zabezpieczeniu jej przed rozkładem (jełczenie, zmiana barwy) spowodowanym utlenianiem

pod wpływem tlenu z powietrza. Stosuje się je ze względu na podatność niektórych

produktów żywnościowych na utlenianie. Do analizy przeciwutleniaczy wykorzystuje się

chromatografię bibułową, cienkowarstwową, gazową i wysokosprawną chromatografię

cieczową. Można również wykorzystywać techniki sprzężone GC-IR i GC-MS.

Konserwanty, czyli substancje konserwujące, związki mające na celu zmniejszanie,

względnie całkowite zahamowanie procesów biologicznych powodowaniem mikroflory lub

enzymów tkankowych, które są odpowiedzialne za psucie się lub obniżanie jakości żywności.

Substancje te oznaczane są metodą HPLC oraz chromatografii gazowej.

Oznaczanie syntetycznych substancji słodzących metodą HPLC jest sposobem

zalecanym przez normy europejskie, gdyż dzięki niej można oznaczać jednocześnie kilka

substancji słodzących.

Do analizy związków zapachowych wykorzystano technikę GC-O, w której strumień

gazu nośnego z kolumny chromatograficznej rozdziela się między klasyczny detektor FID lub

MS, a port olfaktometryczny, jakim jest nos ludzki. Pozwala określić czy dany związek jest

aktywny sensorycznie przy danym stężeniu, jaki ma zapach i jaka jest jego intensywność oraz

czas aktywności sensorycznej.

Literatura

[1] Kumirska J., Gołębiowski M., Paszkiewicz M., Bychowska A., Analiza żywności,

Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, Gdańsk 2010.

[2] Małecka M., Wybrane metody analizy żywności: Oznaczanie podstawowych składników,

substancji dodatkowych i zanieczyszczeń, Wydawnictwo Akademii Ekonomicznej, Poznań

2006.

[3] Florowska A., Krygier K., Zastosowanie nietrawionych oligosacharydów w produktach

spożywczych, Przemysł Spożywczy, 2004, 58 (5), 44-46.

[4] Gałkowska D., Gałkowska-Pachota M., Oznaczanie aminokwasów w żywności i

suplementach diety, Laboratorium, 9-10 (2010) 44-47.

[5] Rosiński M., Piasecka-Kwaitkowska D., Warchalewski J., Przegląd metod separacji i

oznaczania

białek

przydatnych

badaniach

analizie

żywności,

ŻYWNOŚĆ.Nauka.Technologia.Jakość, 3 (2005) 5-22.

[6] Jastrzębski D., Romanik G., Kolumnowa chromatografia cieczowa w rozdziale peptydów i

białek, 26 Konferencja chromatograficzna w Szczyrku 2005.

[7] Derlacz R., Girstun A., Kowalska-Loth B., Kozłowski P., Piekiełko-Witkowska A.,

Szakiel A., Trzcińska-Danielewicz J.: Podstawy biochemii dla ochrony środowiska,

Warszawa 2009, 23-27.

[8] Drozdowski B. : Lipidy [w:] Sikorski. Z.E. : Chemia żywności T.2, WNT, Warszawa

2007, 73-142.

[9] Analiza kwasów tłuszczowych w smalcu metoda chromatografii gazowej, Instrukcja do

ćwiczeń laboratoryjnych, Gdańsk 2008.

[10] Nogala-Kałucka M., „Analiza żywności, Wybrane metody jakościowych i ilościowych

oznaczeń składników żywności”, Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu,

Poznań 2010.

[11] L.Juszczak, Laboratorium, 2007, 4, 28-32.

[12] Uniwersytet Gdański – Wydział Chemii, Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych.

Ćwiczenie 6, Gdańsk 2008.

[13] Sobolewska-Zielińska, Laboratorium, 2006, 10, 36-41.

[14] Dyrektywa Unii Europejskiej nr 89/10/EEC.

[15] Juszczak L., Substancje słodzące i metody ich oznaczania, Laboratorium, 2006, 12, 30-

34.

[16] Jeleń H. H., Związki zapachowe żywności – wyzwanie dla analityka, Przemysł

Spożywczy, 2004, 58 (5), 18-24.

[17] Jeleń H., Zawirska-Wojtasiak R., Chromatografia gazowa – olfaktometria do

identyfikacji związków zapachowych żywności, Przemysł Spożywczy, 2010, 64 (11), 21-23.

[18] Plutowska B., Wardencki W., Chromatografia gazowa z detekcją olfaktometryczną (GC-

O) w analizie żywności: Charakterystka metody, Analityka: nauka i praktyka, 2008, 1, 55-57.

[19] Plutowska B., Gromadzka J., Wardencki W., Chromatografia gazowa z detekcją

olfaktometryczną (GC-O) w analizie żywności: Metody i zastosowania, Analityka: nauka i

praktyka, 2008, 3, 24-28.

[20] Wielska-Jeszka J.: Barwniki, [w:] Sikorski. Z.E. : Chemia żywności T.1, WNT,

Warszawa 2007, 142-170.

[21] Juszczak L., Chemiczne zanieczyszczenia żywności, Laboratorium – Przegląd

Ogólnopolski, 3 (2009) 38-42.

[22] Bal K., Mielniczuk Z., Metody badań migracji szkodliwych substancji z opakowań do

żywności, Przegląd papierniczy, 66 (2010) 459-462.

[23] Leks-Stępień J., Metody analityczne wskaźnikiem przydatności opakowań do kontaktu z

produktami spożywczymi, Przegląd papierniczy, 67 (2011) 102-104.

[24] Herrero M., Ibanez E., Cifuentes A., Berneal J., Multidimensional chromatography in

food analysis, Journal of Chromatography A, 1216 (2009) 7110–7129.

[25] Posyniak A., Występowanie antybiotyków w żywności – aspekty prawne i analityczne

kontroli pozostałości, Życie weterynaryjne 9 (2011) 717-721.

[26] Czeczko R., Zastosowanie metod chromatograficznych do oznaczania pozostałości

pestycydów w owocach i warzywach, Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych, 48 (2011)

462-465.

[27] Stufka-Olczyk J., Michniewicz M., Milczarek A., Badania zawartości związków

szkodliwych w materiałach opakowaniowych z materiału i tektury, Przegląd papierniczy, 68

(2012) 149-155.

[28] Kujawski M. W., Nowe metodyki badań składników obcych w miodach pszczelich,

Rozprawa doktorska, Gdańsk 2011.

[29] Sadowska-Rociek A., Cieślik E., Stosowane techniki i najnowsze trendy w oznaczaniu

pozostałości pestycydów w żywności metodą chromatografii gazowej, Metrologia, 1-2 (2008)

33-38.

[30]

Romanik

G.,

Opracowanie

nowych

procedur

rozdzielania

oznaczania

wieloskładnikowych mieszanin z zastosowaniem kolumnowej chromatografii z przepływem

zwrotnym, Rozprawa doktorska, Gdańsk 2009.

[31] Targoński Z., Stój A., Zafałszowania żywności i metody ich wykrywania, Żywność.

Nauka. Technologia. Jakość, 4 (2005) 30-40.

[32] Witkiewicz Z., Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2000.