1/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

Uwagi ogólne:
W roku 2007/08 zadania oceniane były w oparciu o klucz z podanymi frazami, których użycia
oczekiwał sprawdzający. Każda z nich miała określoną wartość punktową. Nie wystarczyło napisać,
że "używamy safraniny", ale koniecznym było nazwanie tej substancji "barwnikiem", a samego
procesu "dobarwianiem komórek na kolor różowy". Prawdopodobnie podany przykład nie jest
najlepszym z możliwych, ale wnioskiem powinno być: wszystkie podstawowe wiadomości powinny
znaleźć się w odpowiedziach.

Te pytania pochodzą z roku 2004/05 i choć forma sprawdziany niejednokrotnie uległa już zmianie, to
wiedza do jego napisania pozostaje ta sama.

Ćwiczenia #1

1. Co to jest podłoże mikrobiologiczne?

Podłoże mikrobiologiczne jest to mieszanina odpowiednio dobranych składników odżywczych,
dostarczających hodowanym na nich organizmom niezbędnych pierwiastków chemicznych oraz źródła
energii.
Każde podłoże musi mieć odpowiednią dla danego gatunku wartość odżywczą, pH, potencjał
oksydoredukcyjny (rH) oraz wartość osmotyczną. Ważne jest również określenie do jakiego celu ma
służyć dane podłoże, czy chodzi nam tylko o namnożenie komórek, czy o wyselekcjonowanie jakiegoś
konkretnego gatunku drobnoustroju, czy też o zróżnicowanie gatunków występujących w mieszaninie.
Zależnie od potrzeby możemy zastosować podłoże minimalne lub pełne, podłoże selekcyjne lub też
różnicujące. Jednym z koniecznych warunków, jaki muszą spełniać wszystkie podłoża jest ich
sterylność, co oznacza, że muszą być pozbawione wszelkich organizmów – zarówno ich form
wegetatywnych jak i przetrwalnych.

2. Opisz podłoża: agar-agar, bulion odżywczy, podłoże Davisa

Agar-agar – (agar) jest wielocukrem zawierającym galaktozę, resztę siarczanową, jony magnezu i
wapnia. Wydobywa się go z krasnorostów. Rozpuszcza się w wodzie przy temp. 95-99oC, tworząc
lekko opalizującą zawiesinę. Krzepnie po ostudzeniu do 45-48oC.
Bulion odżywczy – najszerzej stosowane podłoże (płynne), składa się z peptonu (rozpuszczalne
produkty częściowej hydrolizy białek, otrzymane pod wpływem enzymów proteolitycznych), wodnego
wyciągu mięsnego (wyekstrahowane drobnocząsteczkowe składniki pokarmowe, np. Kreatynina,
zasady organiczne, witaminy...) oraz NaCl, dodawanego w celu zachowania izotoniczności pożywki w
stosunku do wnętrza komórek drobnoustrojów
podłoże Davisa – minimalne, półpłynne, glukoza jest źródłem węgla, zawiera siarczany i sole
mineralne

3. Co to jest podłoże różnicujące i wybiórcze?

Różnicujące – inaczej elekcyjne; podłoże pełne, z łatwo dostępnym węglem [innymi słowy: wszystko
wyrośnie]; to podłoże pozwala na rozróżnianie kolonii bakterii przez kolor [związek zawarty w
podłożu jest rozkładany do związku barwnego przez dany gatunek, np. laktoza dla pałeczek jelitowych
należących do rodziny Enterobacteriaceae]

2/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

Przykładowo:
-podłoże zawierające skrobię pozwala po użyciu jodyny wyróżnić bakterie zdolne do trawienia tego
wielocukru

Info: laktoza dla Enterobacteriaceae
Pałeczki rozkładające laktozę tworzą kolonie o barwie ciemnoróżowej (indykatorem jest czerwień
obojętna).
Pałeczki niefermentujące laktozy tworzą kolonie o barwie białawo – przezroczystej.

Wybiórcze – są to podłoża z dodatkiem [lub z brakiem obecności] takich substancji, które
umożliwiają wzrost tylko pewnych określonych gatunków bakterii a jednocześnie hamują wzrost
innych gatunków. Podłoża te pozwalają na wyizolowanie jednego lub kilku gatunków bakteryjnych
czy grzybiczych z materiału, w którym znajduje się cała masa drobnoustrojów.
Przykładowo:
-jeżeli chcemy wyizolować autotrofy to podłoże przygotujemy bez źródeł węgla
-szukając szczepów odpornych na daną substancję [np. antybiotyk] dodamy ją do pożywki

4. Sterylizacja stosowana i poznana na ćwiczeniach

Sterylizacji można przeprowadzać dwiema drogami:
•

przez zabicie drobnoustrojów i ich form przetrwalnych w danym, środowisku (wysoka

temperatura – suszarka do szkła, autoklaw, aparat Kocha; promieniowanie – UV, beta, gama, X;
związki chemiczne – chlorek etylu, propylenu)
•

przez usunięcie drobnoustrojów i ich form przetrwalnych z danego środowiska (filtracja).

Wybór metody sterylizacji zależy od rodzaju sterylizowanego podłoża (środowiska) a także od
wyposażenia laboratorium; należy wybrać metodę nieniszczącą podłoża a skuteczną, możliwie szybką
i tanią. Pamiętać należy, że w pracowni mikrobiologicznej sterylizujemy wszystko, czym moglibyśmy
zakazić badaną hodowlę drobnoustrojów.

5. W jaki sposób wysterylizować: [...]?

szalki Petriego – suszarka do szkła
plastikowe końcówki pipet - autoklaw
fartuch – autoklaw [nie zwykły bawełniany, a np. chirurgiczny]
bulion odżywczy – autoklaw tak jak wszystkie pożywki. Podczas tyndalizacji bakterie zbyt obficie się
rozmnożą niszcząc tym samym podłoże.
sól fizjologiczną – autoklaw
20% roztwór Glc – aparat Kocha
roztwór tyminy – aparat Kocha
roztwór aminokwasów – aparat Kocha
mleko – aparat Kocha
20% roztwór laktozy – aparat Kocha
wodę destylowaną – autoklaw
10M HCl – stężonych kwasów nie jałowimy

Należy umieć uzasadnić dokonany wybór metody, a także określić dlaczego stosowanie podanej
metody jest niemożliwe.
Przykładowo: dlaczego nie jałowimy roztworu fizjologicznego przy pomocy UV?

3/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

6. Jak sprawdzić, czy badany szczep wytwarza endospory?

Barwienie przetrwalników metoda Schaeffer – Fultona:

1) Z hodowli starej [24 lub 48 godzinnej] wykonać rozmaz – w młodej nie ma jeszcze endospor
2) Preparat wysuszyć i utrwalić w płomieniu palnika
3) Barwić na gorąco zielenią malachitową
4) Spłukać wodą
5) Dobarwić na różowo komórki safraniną dla kontrastu otoczenie-komórka-endospora
6) Spłukać wodą i osuszyć
7) Preparat oglądany pod immersją. Otoczenie powinno być pozbawione zabarwienia, wnętrze

komórek różowe, znajdujące się wewnątrz komórek formy przetrwalne powinny być zielone.

Innym sposobem jest umieszczenie próbki na "jedną turę z trzech stosowanych do sterylizacji” [30
minut w 100oC] w aparacie Kocha. Zabite zostaną formy wegetatywne, a przetrwalniki będą
pobudzone do kiełkowania.

Ćwiczenia #2

7. Co to jest: szczep, kolonia? Do czego jest wykorzystywana?

Kolonią to widoczne gołym okiem skupisko drobnoustrojów na podłożu stałym. Na ogół kolonia
powstaje w wyniku podziałów pojedynczej komórki. Kolonie wykorzystywane są do otrzymywania
czystych kultur metodą pośrednią przez posiew redukcyjny, określania liczby komórek żywych w
danej objętości roztworu [CFU/ml] i wiele innych.

Szczepy to różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczególnych
czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie. W obrębie gatunku mogą więc występować
szczepy różniące się pewnymi cechami.

8. Jak uzyskać czystą kulturę? Metody izolacji czystych kultur.

Czystą kulturą nazywamy hodowlę, w której bakterie stanowią potomstwo jednej, pierwotnie
wyosobnionej komórki bakteryjnej.
Wyróżniamy dwie drogi izolowania czystych kultur – pośrednia i bezpośrednia.

Metoda bezpośrednia polega na pobraniu pojedynczej komórki i przeniesieniu jej na sterylne podłoże
o składzie zapewniającym rozwój.

Na ćwiczeniach stosowaliśmy jedynie metody pośrednie.

-

posiew redukcyjny [wykonujemy wzorek ezą]

-

metoda kolejnych rozcieńczeń w roztworze fizjologicznym [rozcieńczamy jeżeli potrzeba i

wysiewamy 0,1ml]

-

posiew wgłębny [do sterylnej szalki wlewamy 1ml hodowli o odpowiednim rozcieńczeniu i

dodajemy 9ml jałowej pożywki o temperaturze umożliwiającej przeżycie bakteriom]

9. Do czego służy sól fizjologiczna (RF)?

Roztwór soli fizjologicznej służy do rozcieńczania pożywek, kultur bakteryjnych i wszystkiego, co
może mieć styczność z bakteriami. Jest to roztwór czystego NaCl o ciśnieniu osmotycznym
identycznym jak w cytoplazmie komórce bakteryjnej.

4/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

10. Metoda rozcieńczeń – obliczenia

Chcąc rozcieńczyć hodowlę bakteryjną posługujemy się RF. Pobieramy pipetą z badanej próbki 0,5ml
roztworu. Dbając o zachowanie sterylności przenosimy go do probówki i rozcieńczamy 4,5ml RF. W
ten sposób otrzymamy rozcieńczenie dziesiętne (10-1). Możemy rozcieńczyć naszą hodowlę ile razy
jest to potrzebne w analogicznych krokach. Aby wysiać rozcieńczoną hodowlę na podłoże stałe/szalkę
Petriego, pobieramy pipetą 0,1ml roztworu i rozprowadzamy ją głaszczką. Po kilkudniowej inkubacji
możemy policzyć ile koloni wyrosło.

Przy odpowiadaniu na pytanie koniecznie podajemy wzór wyjaśniając też jego składowe.

X = a*b*10
X – CFU/ml; a – średnia liczba bakterii na płytkach; b – odwrotność wysiewanego rozcieńczenia;
10 – odwrotność wysiewanej objętości [0,1ml]

Czasem hodowlę wystarczy rozcieńczyć dwukrotnie, czyli do 1ml hodowli dodajemy 1ml RF. W
innych zadaniach zdarza się, że wręcz wystarczy od razu wysiać 0,1ml na płytkę, bo komórek na
starcie jest już odpowiednio mało.

Jeszcze jedna uwaga techniczna – nie liczymy "ile było bakterii w 1ml badanej hodowli", lecz "ile
bakterii w 1ml badanej hodowli było w stanie dzielić się i utworzyć kolonię". Innymi słowy, nie
sprawdzamy całkowitej liczby bakterii, a CFU [colony-forming unit], czyli zliczamy żywe.

Ćwiczenia #3

11. W jaki sposób określić procent żywych komórek w hodowli bakterii?

Założenie 1: żywe komórki to takie, które mogą się dzielić, zatem są zdolne do wytworzenia kolonii
Liczymy żywe komórki stosując posiew na odpowiednie stałe podłoże pełne z rozcieńczenia naszej
hodowli. Przyjmę dla wyniku końcowych wyliczeń CFU literkę 'Ż' jak 'żywe'. Jednostka to 'komórek
tworzących kolonie na 1 ml'.

Założenie 2: jeżeli komórka jest widoczna po zabarwieniu np. safraniną to niechaj będzie komórką
bakteryjną
Barwimy safraniną próbkę w odpowiednim rozcieńczeniu, żeby nasze bakterie były lepiej widoczne w
stosunku do otoczenia. Można też wspomóc się wybarwianiem tła. Następnie nanosimy próbkę na
komorę Thoma i pod mikroskopem zliczamy komórki. Można wspomagać się kreskowaniem. Po
dokonaniu obliczeń otrzymujemy całkowitą liczbę bakterii ['C'].

Obliczenia do komory Thoma:
-liczymy średnią arytmetyczną liczby bakterii w kratce

-jedna kratka to objętość
-obliczamy liczbę komórek na 1ml [średnia * odwrotność objętości]

Ostatecznie prowadzi to do wzoru:

5/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

12. Jak wyznaczyć krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej?

Co określony czas powinniśmy pobierać 0,1ml z badanej hodowli i po ewentualnym rozcieńczeniu
wysiewać na płytkę [dalsza procedura jak do obliczania CFU]. Na podstawie zmian CFU rysujemy
wykres. Oś pionowa to liczba bakterii żywych, a na osi poziomej zaznaczamy upływ czasu w
dobranych jednostkach.

Może przydać się na kolokwium linijka i ołówek do rysowania takiego wykresu.

Nie jest poprawna metoda pokazywana na ćwiczeniach związana z pomiarami absorbancji. Dr Baj
wielokrotnie podkreślała, że ma to jedynie na celu zaobserwowanie zależności szybkości wzrostu od
warunków otoczenia i stosowanej pożywki.

13. Faza logarytmiczna wzrostu

Charakterystyczne w tej fazie jest zmniejszenie się rozmiarów bakterii w porównaniu z fazą
poprzednią. Przez cały okres logarytmiczny wielkość komórek utrzymuje się mniej więcej na tym
samym poziomie, nie zmienia się też ich wiek osobniczy i częstość podziału. Faza logarytmiczna jest
głównym okresem wzrostu hodowli. Jej długość zależy od czynników środowiskowych i od cech
danej bakterii. Skrócić je mogą: brak pokarmu, nadmierne nagromadzenie toksycznych metabolitów,
nieodpowiednie pH, rH. Na ogół w podłożach ubogich, w których bakteria musi syntetyzować
wszystkie składniki, szybkość wzrostu jest mniejsza, a faza logarytmiczna dłuższa.

Ćwiczenia #4

14. Co wiesz o ziarniakach?

-

kształt pojedynczej komórki bakteryjnej: kulisty

-

zdolne do tworzenia różnych układów:

-

ważny patogen ludzki, szczególnie zakażenia gronkowcami

-

np. zapalenie płuc wywołuje Diplococcus pneumoniae

-

gatunki zarówno Gram dodatnie jak i Gram ujemne [należy znać po jednym przykładzie każdej]

-

swoje właściwości [tworzenie układów, patogenność] zawdzięczają obecności otoczek śluzowych

6/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

15. Porównaj laseczki i pałeczki oraz podaj przykłady.

Cecha

Laseczki [bacillum]

Pałeczki [bacterium]

forma morfologiczna

cylindryczna, regularna

wielkość

większe od pałeczek

mniejsze od laseczek

końce

zakończone tępo

zaokrąglone końce

tworzone układy

łańcuszki

brak

endospory

tak

nie

barwienie Grama

dodatnie (+)

ujemne (–)

tlenowe

tak - bacillus, nie - clostridium

tlenowce lub względnie tlenowe

nazwa angielska

rod - pręt, drąg, pałka

Przykłady laseczek: Basillus megaterium, B. subtilis, Clostridium pasteurianum
Przykłady pałeczek: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens

16. Podaj po 5 gatunków laseczek i pałeczek.

Kilkukrotnie informowano nas, że musimy znać tylko i wyłącznie bakterie, które pojawiły się na
ćwiczeniach. W tym roku nie objawiło się takie mrowie gatunków, a podobnego pytania próżno było
szukać na kolokwium. Niemniej jednak warto znać rozróżnienie taksonomiczne oraz wyniki barwienia
metodą Grama na poszczególnych gatunkach.

17. Opisz kolejne etapy barwienia metodą Grama.

1) Z hodowli świeżej/nocnej/18h przygotować rozmaz bakterii na szkiełku podstawowym – w starych

bakteriach zachodzić mogą zmiany w ścianie i stają
się gramchwiejne

2)

Preparat wysuszyć i utrwalić w płomieniu palnika

3)

Pierwszy barwnik: fiolet krystaliczny

4)

Po odpowiednim czasie przemyć, a następnie zalać
płynem Lugola [I2/KI] – tworzy kompleks z fioletem
krystalicznym, czyli pełni rolę bejcy/zaprawy

5)

Spłukać wodą, osuszyć bibułą, zalać stężonym
etanolem [95%] – odbarwianie oraz uszkodzenie
zewnętrznej błony u Gram-ujemnych, która mogłaby
fałszować wynik

6)

Spłukać wodą, osuszyć bibułą i dobarwić wszystkie
komórki różową safraniną

7) Spłukać wodą, osuszyć

7/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

Bakterie Gram-dodatnie mają fioletowe zabarwienie, natomiast Gram-ujemne kolor różowy.
Tło nie zostaje w tym procesie zmienione, więc jest to metoda barwienie pozytywnego. Ze względu na
użycie dwóch barwników i bejcy jest to barwienie złożone.

Barwienie metodą Grama nie polega na mieszaniu bakterii, jak to jest robione na ćwiczeniach. Zabieg
ten ma jedynie pozwolić na rozróżnienie efektu końcowego przy Gram(+) i Gram(-).

Uwaga, na tegorocznym kolokwium pojawiło się pytanie o stosowane na ćwiczeniach sposoby
utrwalania preparatów i celowość tych zabiegów. Poza płomieniem palnika zastosowanie miało też
utrwalanie chemiczne [tu: metanol].

18. Podaj po 5 gatunków bakterii gramdodatnich i gramujemnych.

Może być dodatkowa restrykcja w postaci różnych taksonów. Nie możemy tym samym wpisać do
gramdodatnich samych laseczek, a do gramujemnych tylko pałeczek.

Ćwiczenia #5

19. Opisz schemat budowy błony zewnętrznej bakterii.

Błona zewnętrzna jest zbudowana z fosfolipidów, białek i lipopolisacharydu. Fosfolipidy tworzą
wewnętrzną warstwę błony zewnętrznej, natomiast lipopolisacharyd (LPS) – warstwę zewnętrzną.
LPS składa się on z najgłębiej leżącego lipidu A, polisacharydu rdzeniowego i najbardziej na zewnątrz
położonego polisacharydowego łańcucha O-swoistego, zwanego antygenem O. LPS jest endotoksyną.
powodującą różne schorzenia u ssaków. Czynnikiem w głównym stopniu odpowiedzialnym za jego
toksyczność jest lipid A.
W błonie zewnętrznej poryny tworzą wypełnione wodą kanały umożliwiające bierny transport jonów i
niskocząsteczkowych związków hydrofilowych, np. glukozy, aminokwasów, kationów. Kanały te
mogą być niespecyficzne (np. białka OmpF czy OmpC u E. coli), bądź specyficzne (wyposażone w
swoiste miejsce wiążące), np. białko LamB, (pobieranie maltozy i maltodekstryn). Błona zewnętrzna
jest zakotwiczona w peptydoglikanie poprzez lipoproteinę Brauna. Przestrzeń między błoną
zewnętrzną i błoną cytoplazmatyczną to przestrzeń peryplazmatyczna (peryplazma). Występują tam:
a) enzymy hydrolityczne biorące udział w rozkładzie substancji pokarmowych;
b) białka wiążące, biorące udział w procesie transportu;
c) białka ochronne, inaktywujące egzogenne substancje toksyczne, np. beta-laktamazy;
d) receptory uczestniczące w chemotaksji;
e) pewne enzymy chemolitotrofów uczestniczące w utlenianiu niektórych związków
nieorganicznych.
Bakterie gramdodatnie wrażliwe na działanie lizozymu (hydroliza wiązań β-1,4-glikozydowych w
mureinie), gramujemne wrażliwe po usunięciu błony zewnętrznej, która je chroni przed różnymi
związkami szkodliwymi.

20. Opisz otoczki bakteryjne. Jaką rolę pełnią? Jak je wykryć?

Budowa otoczek:
1) wielocukrowe (najczęstsze) np. Streptococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc); Leuconostoc
mesenteroides;

8/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

2) polipeptydowe, a więc złożone z aminokwasów, np. Bacillus anthracis - kwas D- glutaminowy, B.
subtilis – D- i L- izomery tego aminokwasu.
3) glikoproteinowe, np. Neisseria meningitidis (dwoinka zapalenia opon mózgowych).

Rola otoczek:
1) ochrona przed wysychaniem (95% wody);
2) ochrona bakterii pasożytniczych przed fagocytozą;
3) ochrona przed bakteriofagami;
4) mogą one wpływać na dyfuzję różnych cząsteczek do i z komórki; np. pewnych antybiotyków,
jonów metali (Mg2+, Hg2+)
5) materiał zapasowy
6) adhezja bakterii do podłoży stałych; co jest ważne dla kolonizacji danego środowiska. Śluzy mogą
brać udział w przyczepianiu się pewnych patogenów do swojego gospodarza, np. powstawanie płytki
nazębnej. Streptococcus mutans i S. sobrinus (bakterie gramdodatnie o niskiej zawartości GC)
syntetyzują polisacharydy glukany (wykorzystując do tego celu sacharozę), które działają jak cement,
wiążący bakterie w płytkę nazębną. Bakterie znajdujące się w płytce fermentują cukry, uwalniają do
środowiska kwasy organiczne (a przede wszystkim kwas mlekowy), które są bezpośrednią przyczyną
próchnicy.

Wykrywanie otoczek bakteryjnych metodą Burriego-Ginsa:
1) Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynnej hodowli
2) Dodać kroplę tuszu chińskiego i zmieszać z hodowlą
3) Drugim szkiełkiem podstawowym rozprowadzić zawiesinę po powierzchni tak, aby powstałą

jednorodna, brązowa warstwa

4) Rozmaz wysuszyć na powietrzu, ostrożnie utrwalić w płomieniu palnika
5) Dobarwić wnętrza komórek safraniną
6) Spłukać barwnik, preparat osuszyć
Obserwacja pod mikroskopem: Tło powinno być ciemne, wnętrza bakterii zabarwione na różowo,
natomiast otoczki pozostają niewybarwione.

Jest to barwienie złożone [bo dwa barwniki] oraz pozytywno-negatywne [barwimy komórki jak i tło].

21. Opisz endospory.

Endospory - tworzone przez bakterie należące do prawie 20 różnych rodzajów taksonomicznych.,
zaliczanych do typu Gram-positive low GC: Bacillus, Paenibacillus, Clostridium, Sporolactobacillus,
Desulfotomaculum, Sporosarcina, Thermoanerobacter, Sporohalobacter, Anaerobacter,
Syntrophospora, Heliobacterium, Heliophilum, Sporomusa, Alicyclobacillus, Amphibacillus,
Desulfitobacterium. Żaden ze znanych archeonów nie jest zdolny do wytwarzania endospor Najlepiej
poznane endospory Bacillus i Clostridium. Kształt spory, ułożenie w komórce macierzystej, jej
wielkość w stosunku do średnicy komórki macierzystej są charakterystyczne dla danego gatunku i
dlatego mają znaczenie taksonomiczne.

Budowa endospory: najbardziej na zewnątrz znajduje się egzosporium, (okrywa zbudowana z białka),
pod nią - płaszcz (złożony z warstw białek swoistych dla endospory), następnie korteks (luźno
usieciowany peptydoglikan), otaczający rdzeń spory (zwany też protoplastem spory). Rdzeń zawiera
ścianę, błonę cytoplazmatyczną, nukleoid itd.
Kwas dipikolinowy (DPA) i połączone z nim jony wapnia mogą stanowić do 10% suchej masy spory.
Rdzeń jest silnie odwodniony. W dojrzałej endosporze rdzeń zawiera 10-30% wody zawartej w

9/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

komórce wegetatywnej. Występują w nim wytwarzane w czasie sporulacji swoiste białka rdzenia
zwane małymi białkami sporowymi rozpuszczalnymi w kwasach (ang. small acid-soluble spore
proteins, SASPs). Pełnią one co najmniej dwie funkcje. Wiążą się ściśle z DNA i chronią go przed
uszkodzeniami przez UV, wysychaniem i wysoką temperaturą. W czasie kiełkowania służą jako
źródło węgla i energii nowej wegetatywnej komórce, powstającej z endospory.

Sporulacja obejmuje kilka złożonych etapów różnicowania komórki. Bakterie z rodzaju Bacillus są
potencjalnie zdolne do tworzenia przetrwalników pod koniec logarytmicznej fazy wzrostu, (gdy
zaczyna brakować substancji odżywczych lub gdy nagromadzone zostają produkty przemiany materii)
lub gdy przeniesie się je z podłoża bogatego do ubogiego. Proces sporulacji został najlepiej poznany u
B. subtilis. Biorą w nim udział produkty aż 200 genów i trwa on u tej bakterii aż 8 godzin. Endospora
może w stanie suchym przetrwać w stanie uśpienia przez bardzo długi okres czasu.

Proces kiełkowania obejmuje trzy etapy:
1) aktywacja np. poprzez 10 - 30 min ogrzewanie w temperaturze subletalnej (różnej w zależności od
gatunku);
2) kiełkowanie, które może być zainicjowane przez niektóre aminokwasy, rybozydy i cukry, jest
procesem krótkotrwałym (kilka minut); endospora traci odporność na wysoką temperaturę i zw.
chemiczne, zaczyna pobierać wodę. Dochodzi do utraty kwasu dipikolinowego i wapnia, rozkładane
są białka SASP;
3) wzrost i przekształcenie w komórkę wegetatywną.

Cechy charakterystyczne endospor:
1) mają grube osłony
2) silnie załamują światło, więc można je zobaczyć w mikroskopie świetlnym;
3) nie barwią się w czasie zwykłego barwienia komórki barwnikami zasadowymi, można je więc
zobaczyć w wybarwionych komórkach jako ich niewybarwione części; endospory barwi się
specjalnymi barwnikami na gorąco;
4) w większości przypadków są wytwarzane jedna na komórkę, więc na ogół tworzenie endospory nie
jest sposobem rozmnażania; jednak niektóre bakterie tworzą kilka endospor w komórce macierzystej,
np. Anaerobacter sp.;
5) są odporne na wysoką temperaturę, wysychanie, promieniowanie i czynniki chemiczne.

Mechanizm ciepłooporności endospor i ich brak wrażliwości na szkodliwe czynniki środowiskowe nie
jest w pełni wyjaśniony. Niewątpliwie największe znaczenie mają następujące czynniki: 1) mała
zawartość wody; 2) białka SASP, które wiążą się ściśle z DNA i chronią go przed uszkodzeniami UV,
chemicznymi i cieplnymi i wysychaniem, 3) duża zawartość kwasu dipikolinowego (niewystępującego
w komórkach wegetatywnych), występującego w połączeniu z wapniem.
W wyniku dehydratacji i nagromadzenia w cytoplazmie białek SASP, i kompleksów Ca2+ z
dipikolonianem cytoplazma przybiera postać gęstego żelu, co jak się wydaje, odgrywa dużą rolę w
ciepłooporność endospor.

Wykrywanie endospor:
1) przy zastosowaniu barwienia zielenią malachitową na gorąco
2) w mikroskopie kontrastowo-fazowym silnie załamują światło;
3) jeśli hodowla jest zdolna przeżyć 10-min. ogrzewanie w 70 - 80oC i 45 min. traktowanie etanolem
w 20oC, to znaczy, że wytwarza endospory.

10/10

MIKROBIOLOGIA – kolokwium I

Pytania przekrojowe

22. Charakterystyka gatunków Escherichia coli, Bacillus megaterium.

Escherichia coli (pałeczka okrężnicy)
(nazwa rodzajowa pochodzi od nazwiska Teodora Eschericha, który wyizolował tę bakterię; gr. colon
= jelito grube/okrężnica - miejsce występowania tej bakterii)
Pałeczka gramujemna należąca do rodziny Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe). Względny
beztlenowiec. Chemoorganotrof, prototrof. Temp. optymalna 37°C. Występuje w jelicie grubym
człowieka i licznych zwierząt Szeroko rozpowszechniona w środowisku życia człowieka. Jest to
bakteria najlepiej poznana pod względem fizjologicznym i genetycznym.

B. megaterium (laseczka olbrzymia)
(gr. mega = wielki, teras = potwór, bestia, megaterium = wielka bestia)
Tworzy łańcuszki. Endospory są położone centralnie i nie powodują rozdęcia komórki macierzystej.
Prototrof. Temp. optymalna 30°C. Tlenowce lub względne tlenowce. Chemoorganotrofy - prototrofy i
auksotrofy. Tworzą endospory. Ich pierwotnym siedliskiem jest gleba, ale dzięki wytwarzanym przez
nie endosporom można je izolować z najróżniejszych środowisk.

23. Jak w hodowli mieszanej E. coli (lub Staphylococus aureus), B. megaterium i Micrococcus

luteus rozróżnić każdy z gatunków? (Najpierw trzeba otrzymać czyste kultury.)

Krok pierwszy: rozcieńczenie hodowli

Krok drugi: posiew wg. jednej z opcji
a) wspólne podłoże pełne [oceniamy potem morfologię kolonii]
b) trzy odpowiednio dobrane podłoża selekcyjne [każde podłoże specyficzne dla danego gatunku]
c) wspólne podłoże różnicujące [jak w 'a' ale nie oceniamy morfologii, lecz np. kolor metabolitu]

Krok trzeci: posiew redukcyjny i otrzymanie czystych kultur

Krok czwarty: z czystych kultur rozróżniamy stosując kolejno obserwację kolonii, barwienie proste i
obserwację morfologii komórek pod immersją, barwienie Grama.

24. Pożywka zanieczyszczona laseczkami. Jak odzyskać czystą kulturę pałeczki?

1) rozcieńczenie hodowli
2) posiew na stałe podłoże pełne [tym razem lepiej się upewnić, czy jest sterylne, bo jeszcze jakieś

maczugowce się pojawią i co wtedy?]

3) wybrane kolonie posiać redukcyjnie na osobne płytki z podłożem pełnym
4) dla pewności i ustalenia gdzie-co-jest materiał z każdej z płytek wybarwić metodą Grama, bo

pałeczki są Gram-ujemne a laseczki Gram-dodatnie

/Q