1

Ćwiczenie 1 i 2

Identyfikacja i różnicowanie Staphylococcus

Szczepy:

1. Micrococcus luteus

2. Micrococcus luteus ATCC 4698

3. Staphylococcus aureus ATCC 25923

4. Staphylococcus epidermidis ATCC 14990

5. Staphylococcus epidermidis 136 (izolat kliniczny)

6. Staphylococcus aureus PSK 63 (izolat kliniczny)

7. Staphylococcus warneri

8. Staphylococcus haemolyticus

9. Staphylococcus capitis ATCC 27840

10. Staphylococcus aureus ATCC 43300

11. Staphylococcus aureus ATCC 6538

Podłoża i testy:

1. agar LB – wykrywanie katalazy

2. agar z krwią

3. podłoże Chapman’a

4. Baird Parker Medium

5. podłoże Müller-Hintona

6. podłoże z DNA (wykrywanie DNA-zy)

7. bulion z mannitolem

8. bulion z solą sodową fenoloftaleiny (do wykrywania fosfatazy alkalicznej)

9. agar z dodatkiem 10% mleka

10. surowica królicza (do wykrywania koagulazy)

11. zestaw diagnostyczny do identyfikacji gronkowca złocistego Microgen Staph

12. krążki nowobiocyna, bacytracyna

13. Testy Api Staph

2

Wykonanie ćwiczenia

1. Badania mikroskopowe

Należy wybarwić preparaty metodą Grama

2. Wykonać posiew metodą sektorowo-redukcyjną na agarze LB, podłożu Chapman’a i

Baird-Parker’a. Płytki z agarem z krwią i podłożem na DNA-zę podzielić na sektory (4

lub 6) na każdym z nich wysiać badane szczepy. Posiane płytki inkubować w

temperaturze 37ºC.

3. Wysiać badane szczepy na skosy agaru odżywczego z dodatkiem 10% mleka. Hodować w

temperaturze pokojowej przez kilka dni, obserwować kolor pigmentu produkowanego

przez badane szczepy.

Wytwarzanie barwnika przez Staphylococcus zależy od składu podłoża (stymulują go

takie składniki jak: mleko, glicerol) oraz warunków hodowli (światło i temperatura 27-30

ºC).

4. Do probówek z bulionem zawierającym mannitol wsiać po uszku ezy badanych szczepów

gronkowców, jedną probówkę z pożywką zostawić jako kontrolę. Inkubować w 37 ºC.

Zmiana zabarwienia z zielonego na żółte świadczy o fermentacji mannitolu.

5. Podłoże do wykrywania fosfatazy zawiera bulion z dodatkiem 1% soli sodowej

difosforanu fenoloftaleiny (w 0.066 M buforze fosforanowym). Związek ten jest

hydrolizowany przez fosfatazy i uwalniana jest do podłoża fenoloftaleina (bezbarwna w

pH 8,3; a czerwona w pH 10).

Do probówki należy wsiać ezę badanego szczepu bakterii, inkubować w temp. 37ºC przez

16 h. Na kolejnych ćwiczeniach do probówek dodać 1-2 krople 10% NaOH.

Wynik dodatni: podłoże zabarwia się na kolor amarantowo-czerwony.

6. Oznaczanie wytwarzania koagulazy metodą probówkową.

Zasada testu:

Koagulaza jest zewnątrzkomórkowym białkiem, które wiąże się do protrombiny tworząc

kompleks zwany stafylotrombiną, wtedy fibrynogen jest przekształcany w fibrynę

(powstaje skrzep)

Wykonanie:

Do oznaczeń stosuje się osocze królika rozcieńczone pięciokrotnie płynem

fizjologicznym. Do 0,5 ml osocza dodać za pomocą ezy hodowle gronkowca z podłoża

agarowego. Inkubować w temperaturze 37ºC, wynik testu tzn. wystąpienie wyraźnego

skrzepu odczytać po 4 h.

Uwaga:

3

Ze względu na możliwość rozpuszczenia powstałego skrzepu fibryny przez stafylokinazę

(bakteryjny aktywator plazminogenu o aktywności proteolitycznej), wynik należy

odczytać do 24 h.

7. Wykrywanie czynnika skupiania (CF-clumping factor) i białka A

MICROGEN® Staph jest szybkim testem lateksowym do potwierdzenia identyfikacji

Staphylococcus aureus, działającym na zasadzie aglutynacji szkiełkowej.

Zasada testu:

Cząsteczki lateksowe są pokryte fibrynogenem (do którego wiąże się czynnik skupiania

CF) i IgG (które wiążą się z białkiem A). Po zmieszaniu z zawiesiną S. aureus cząsteczki

lateksowe błyskawicznie reagują tworząc zauważalne agregaty. Brak zauważalnej

aglutynacji świadczy o wyniku ujemnym.

Wybrać 1 - 2 izolowane kolonie rosnące przez 18 - 24 godz. w temp. 35 - 37°C na

podłożu do izolacji wstępnej, takim jak agar z 5% krwi.

Wykonanie:

A. Wymieszać lateks MICROGEN® Staph przez delikatne odwracanie buteleczki i dodać

1 kroplę do kółka na czystej, suchej karcie reakcyjnej.

B. Pobrać jałową ezą jedną kolonię badanego szczepu i zawiesić w kropli odczynnika

lateksowego na karcie. Rozprowadzić na powierzchni kółka pałeczką do mieszania.

C. Delikatnie obracać kartę przez 2 minuty i obserwować, czy pojawia się aglutynacja.

D. Po odczycie wrzucić zużyte karty i pałeczki do roztworu odpowiedniego środka

dezynfekcyjnego.

Uwagi:

 Badać tylko czyste, pojedyncze kolonie, ponieważ mieszane kolonie mogą dawać

błędne wyniki.

 Hodowle starsze od 30-godzinnych mogą dawać autoaglutynację.

 Podłoża o wysokiej zawartości soli, takie jak Mannitol Salt Agar (Chapman),

hamują wytwarzanie białka A, co może prowadzić do fałszywie ujemnych

wyników.

 Pozytywną wynik uzyskuje się dla innych niż S. aureus koagulazo-dodatnich

gronkowców np. S. intermedius i S. hyicus (te dwa ostatnie gatunki rzadko izoluje

się z materiałów od ludzi, częściej od zwierząt)

4

8. Wytwarzanie katalazy przez gronkowce sprawdzić na płytkach LB

odżywczym przez nakroplenie 3% wody utlenionej, pojawienie się bąbelków gazu

świadczy o obecności enzymu.

Katalaza jest enzymem wytwarzanym przez większość bakterii tlenowych.

Unieszkodliwia ona nadtlenek wodoru powstający w czasie metabolizmu tlenowego,

katalizując jego rozkład do wody i tlenu.

9. Oznaczyć wrażliwość na wybrane antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową wg przepisu

producenta.

10. Dla wybranych szczepów wykonać testy Api Staph według przepisu producenta.

Podłoże Baird-Parker

Skład podłoża (g/l):

Pepton K

10,00

Ekstrakt drożdżowy

1,00

Ekstrakt wołowy

5,00

L-glicyna

12,00

Pirogronian sodu

10,00

Chlorek litu

5,00

Agar

15,00

Końcowe pH 7.2 ± 0.2

Sposób przygotowania:

58,0 g podłoża zawiesić w 1000 ml wody destylowanej. Sterylizować w 121ºC przez 15

minut. Po ochłodzeniu podłoża do 45 ± 1ºC, dodać na każde 100 ml podłoża 1 ml 1%

roztworu tellurynu potasu + 5 ml gotowej emulsji żółtka, lub 5 ml gotowej emulsji żółtka z

tellurynem potasu.

Opis:

Podłoże Baird-Parkera służącym do izolacji i różnicowania gronkowców, szczególnie

Staphylococcus aureus w produktach spożywczych i innych materiałach. Jest ono podłożem

wybiórczym ze względu na obecności w podłożu chlorku litu i tellurynu potasu, który hamuje

wzrost mikroflory towarzyszącej. Obecność pirogronianu sodu i glicyny selektywnie

stymuluje wzrost S. aureus. Telluryn hamuje wzrost większości koliform i jest również

redukowany przez S. aureus do metalicznego tellurynu - stąd czarne zabarwienie kolonii.

Dodatek żółtka jaja umożliwia wykrycie dwóch reakcji typowych dla S. aureus tj. produkcję

lecytynazy – opalizująca strefa wokół kolonii i produkcja lipazy – przezroczysta strefa na

5

zewnątrz strefy opalizującej (wymienione właściwości lityczne nie muszą występować

jednocześnie).

Na tym podłożu kolonie S. aureus są średnicy 1-3 mm, czarne, z wąskim opalizującym

brzegiem otoczone 2-5 mm strefą przejaśnienia. S. saprophyticus i inne koagulazo-ujemne

gronkowce tworzą mniejsze (0,5 - 2 mm) czarne kolonie, ich wzrost jest słaby

Micrococcus sp. – małe kolonie, brązowe do czarnego zabarwienia, bez strefy przejaśnienia.

Podłoże Chapman’a - agar z mannitolem

Skład podłoża (g/l):

Pepton

10,00

Ekstrakt wołowy

1,00

Chlorek sodu

75,00

D-Mannitol

10,00

Czerwień fenolowa

0,025

Agar

15,00

Końcowe pH 7.4 ± 0.2 w 25ºC

Sposób przygotowania:

111,0 g podłoża zawiesić w 1000 ml wody destylowanej . Sterylizować w temperaturze 121ºC

przez 15 minut.

Opis:

Agar z mannitolem wg Chapmana służy do izolowania i wykrywania gronkowców

chorobotwórczych w artykułach spożywczych i innych materiałach. Jest to podłoże

wybiórcze, ze względu na wysoki dodatek soli (7,5% NaCl) w podłożu, są w stanie rosnąć na

nim organizmy halofilne, w tym gronkowce. Podłoże pełni również funkcje różnicującą,

pozwalając na stwierdzenie zdolności wykorzystania mannitolu przez mikroorganizmy.

Bakterie mające zdolność wykorzystywania mannitolu z wytworzeniem kwasów, powodują

spadek pH środowiska hodowli, co stwierdza się dzięki obecności indykatora pH - czerwieni

fenolowej.

Mikroorganizmy tworzące zazwyczaj duże, kremowe do pomarańczowej barwy kolonie,

otoczone wyraźną żółtą strefą to mannitolo-dodatnie gronkowce.

Mikroorganizmy tworzące drobne, białe do różowej barwy kolonie, przy braku zmiany koloru

podłoża to mannitolo-ujemne gronkowce np. (S. epidermidis).

6

DNase Test Agar (Agar z DNA)

Skład podłoża (g/l)

Bacto Trypton

20,0

Chlorek sodu

5,0

Kwas dezoksyrybonukleinowy

2,0

Agar

15,0

pH 7,3 ±0,2

Opis:

Kwas dezoksyrybonukleinowy o dużej masie cząsteczkowej umożliwia wykrycie

dezoksyrybonukleazy (DNAzy), która powoduje depolimeryzację DNA. Podłoże jest

stosowane głównie do identyfikacji gronkowców, jednak może być także wykorzystane do

wykrywania aktywności DNA-zy u innych bakterii (np. Serratia marcescens).

Po okresie inkubacji badanych szczepów na podłożu płytkę zalewa się

1 N

HCl, który strąca

spolimeryzowany DNA, podłoże staje się mętne. Jeśli drobnoustroje wytwarzają DNA-zę

widoczna jest przejrzystą strefę wokół wzrostu bakterii.

Agar z krwią (Agar Columbia + 5% krwi baraniej)

Skład podłoża (g/l)

Pepton K

10,00

Enzymatyczny hydrolizat mięsny 5,00

Trzustkowy hydrolizat serc

3,00

Ekstrakt drożdżowy

5,00

Skrobia kukurydziana

1,00

Chlorek sodu

5,00

Agar

12,00

Końcowe pH 7.3 ± 0.2 w 25ºC

Do 95 ml schłodzonego do około 45–50ºC podłoża dodać 5 ml krewi baraniej.

Opis:

Agar Columbia zawiera dużą ilość składników odżywczych gwarantujących wzrost

mikroorganizmów o podwyższonych wymaganiach pokarmowych. Obecność krwi w podłożu

niesie z sobą dodatkowo czynniki wzrostowe i jest podstawą do określania typu hemolizy

charakterystycznej dla gronkowców, streptokoków i innych mikroorganizmów.