WYDZIAŁ CHEMICZNY POLITECHNIKI ŚLĄSKIEJ

W GLIWICACH

KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ

I BIOTECHNOLOGII

ĆWICZENIE 8

ENZYMATYCZNA REDUKCJA

ZWIĄZKÓW KARBONYLOWYCH ORAZ WIĄZAŃ

C=C

OPRACOWAŁ: mgr inż. Tadeusz Gorewoda
PROWADZĄCY: mgr inż. Tadeusz Gorewoda

Gliwice 2006

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

1. Wstęp;

Już od prawie wieku

drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae) są obecne

w syntezie organicznej. Przez ten czas stały się one jednymi z najbardziej popularnych
biokatalizatorów komórkowych, stosowanych w różnych typach reakcji. Jednym z szerszych
zastosowań tych organizmów są reakcje redukcji. pośród tych reakcji można wymienić:
redukcje

β

-ketoestrów, diketonów i ketokwasów; redukcje

α

-hydroksyaldehydów

i

α

-hydroksyketonów do

α,β

-dioli; redukcję związków zawierających wiązanie C=C;

redukcję aromatycznych i nienasyconych ketonów; redukcję związków nitrowych.

1

Wyżej

wymienione reakcje mogą zachodzić dzięki obecności w komórkach drożdży enzymów
z grupy reduktaz.
Podczas ćwiczenia zostaną przeprowadzone reakcje:

a) Redukcji

β

-ketoestru do

β

-hydroksyestru;

b) Redukcji wiązania podwójnego węgiel – węgiel;

1.1 Redukcja

ββββ

-ketoestru do

ββββ

-hydroksyestru

Spośród reakcji redukcji przebiegających z udziałem drożdży piekarskich najszerzej

opisywaną grupą są redukcje

β

-ketoestrów do

β

-hydroksyestrów. Badania genomu

S. cerevisiae wykazały 49 sekwencji kodujących białka zdolne do aktywności redukcyjnej.
Wykazano różnice pomiędzy działaniem poszczególnych enzymów, ich aktywnością
stereoselektywnością. Używając do reakcji wydzielone enzymy uzyskiwano doskonałe
selektywności (>90% ee, >90% de). Użycie całych komórek drożdżowych dało w niektórych
przypadkach nieco gorsze rezultaty.

2

Wiąże się to z faktem działania całej gamy enzymów.

Dodatkowo taka metoda charakteryzuje się większą objętością mieszaniny reakcyjnej
i większym balastem, niż użycie pojedyńczych enzymów. Jednakże za użyciem całych
komórek drożdżowych przemawia istotny fakt, iż opisywane procesy zachodzą z udziałem
koezymu

jakim

jest

NADPH

(zredukowany

fosforan

dinukleotydu

nikotyno-

amidoadeninowego). Aby koenzym ten mógł się regenerować, wymagane jest dostarczenie
drożdżom węglowodanów (np. glukozy).

R

R

1

O

R

R

1

OH

R

2

R

3

O

R

2

R

3

OH

H

węglowodan

reduktaza

NADPH

NADP

+

1

Servi S.; Synthesis 1990, 1-25

2

Kaluzna I., Matsuda T., Sewell A. K., Stewart J. D.; J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12827-12832.

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Największą zaletą redukcji ketoestrów z użyciem drożdży jest selektywność reakcji.

W przypadku

α

-niepodstawionych ketoestrów stwierdzono, iż wielkość podstawnika przy

węglu C3 oraz podstawnika przy grupie estrowej wywiera istotny wpływ na enancjo-
selektywność reakcji. Wybierając odpowiednie podstawniki można więc uzyskać produkt
o pożądanej konfiguracji z wysokim nadmiarem enancjomerycznym. Poniżej przedstawiono
kilka przykładów:

R

1

OR

2

O

O

R

1

OR

2

OH

O

R

1

R

2

produkt

wydajność (%)

ee(%)

CH

2

Cl

n-C

8

H

17

(3R)

67

100

CH

2

Cl

CH

2

CH

3

(3S)

-

do 90

OBu-t

CH

2

CH

3

(3R)

75

97

Ph

CH

2

CH

3

(3S)

-

100

Redukcja

α

-podstawionych ketoestrów wiąże się dodatkowo z diastereoselekty-

wnością (powstają dwa centra chiralne). Także w tym wypadku udało się uzyskać wysokie
nadmiary enancjomeryczne i diastereomeryczne dzięki użyciu różnych podstawników
w pozycjach 2, 3 oraz przy grupie estrowej.

R

1

OR

3

O

O

R

2

R

1

OR

3

OH

O

R

2

R

1

R

2

R

3

wydajność (%)

ee(%)

de(%)/konformer

CH

3

CH

3

CH

2

CH

3

75

100

66 syn

CH

3

CH

2

CH=CH

2

CH

2

CH

3

84

100

90 anti

CH

3

CH

3

n-C

8

H

17

82

98

90 syn

CH2CH3

OH

CH

2

CH

3

72

>90

80 anti

Dla porównania redukcja ketonów do alkoholi w klasycznej preparatyce organicznej może
odbywać się na kilka sposobów. Główne z nich to:

a) Reakcje z wodorkami metali. Najczęściej używanymi związkami są LiAlH

4

(glinowodorek litu) oraz NaBH

4

(borowodorek sodu). Reakcja z użyciem LiAlH

4

jest

dość ogólna - poza grupą karbonylową redukowane są także inne grupy obecne w
substracie np. NO

2

, CN, COOR itd. Borowodorek sodu jest bardziej selektywny i nie

redukuje grup takich jak NO

2

czy halogenowych. Dodatkową jego zaletą jest

możliwość stosowania go w roztworach wodnych. Wodorki metali nie uwadarniają
podwójnych ani potrójnych wiązań węgiel – węgiel (za wyjątkiem wiązań C=C
sprzężonych z grupą COOR).

b) Redukcja z zastosowaniem wodoru gazowego i katalizatora (platyna, ruten, pallad,

nikiel itp.). To rozwiązanie obciążone jest najmniejszą selektywnością – w tych
warunkach zredukowane zostają także wiązania wielokrotne.

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

c) Reakcja z etanolanem sodu w alkoholu etylowym. Stosowana zanim odkryto LiAlH

4

,

częściej stosowana do redukcji estrów niż ketonów.

d) Reakcja z diborowodorem B

2

H

6.

Opisane układy przez lata zyskały wiele modyfikacji. Ich najczęstszym celem było
uzyskanie chemoslektywności reakcji. Uzyskuje się ją dzieki stosowaniu różnych
warunków reakcji: kombinacji metal- jon wodorkowy, różnym katalizatorom
i rozpuszczalnikom

3

. Jednakże stosowane wodorki metali, jak i katalizatory metaliczne są

drogim i nie raz niewygodnym w pracy surowcem. Także praca z wodorem niesie za sobą
nibezpieczeństwo. Z tego względu drożdże piekarnicze w ostatnich latach nabierają
znaczenia na tym polu syntezy. Ich atrybutami są niska cena, niskie temperatury reakcji
(30-40

o

C), zastosowanie wody jako rozpuszczalnika, aspekt ekologiczny.

Daje to podstawy do zastosowania S. cerevisiae na poziomie przemysłowym. Jednym
z zastosowań drożdży jest chemo, regio i wysoce stereospecyficzna redukcja triketonu do
trimegestonu – leku podawanego w terapii chorób pomenopauzalnych.

4

O

.

O

O

.

.

.

O

.

OH

O

.

.

.

(S)

S.cerevisiae

sacharoza, EtOH, H

2

O

trimegeston

Ćwiczenie:

Eksperyment obejmuje redukcję 2-metyloacetooctanu etylu prowadzącą do mieszaniny
(2R,2S) i (2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu w stosunku izomerów 3:1

5

.

.

O

O

OEt

CH

3

.

OH

O

OEt

CH

3

.

OH

O

OEt

CH

3

+

S.cerevisiae

30 st.C, 48 h, 65%, > 95% ee

3 : 1

Oczynniki:

2-metyloacetooctanu etylu 1.0g (7.7mmol)

drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 30g

sacharoza 15g

woda destylowana 200ml

Celite®

Etanol

Octan etylu

MgSO

4

3

March J.; Chemia Organiczna 1975 WNT Warszawa

4

Crocq V., Masson Ch., Winter J.,Richard Ch., Lemaitre G., Lenay J., Vivat M., Buendia J., Prat D.;Organic

Process Research & Development 1997, 1, 2-13

5

Fràter G., Müller U., Günter W, Roberts S.M.(ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated

enzymes in Organic Synthesis, 1992, 2:1.1, Wiley, London.

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Opis ćwiczenia:

Umieścić drożdże oraz wodę w kolbie stożkowej (500ml), a następnie zatkać

wylot kolby watą i umieścić w wytrząsarce (30

o

C) na około 20 minut w celu

zapoczątkowania fermentacji.

2-Metyloacetooctan etylu rozpuścić w 1ml etanolu i dodać jednorazowo do kolby

z fermentującymi drożdżami. Kontynuować mieszanie w wytrząsarce w temp.
30

0

C przez 48h.

Po tym czasie sprawdza się przebieg reakcji metodą TLC. W tym celu należy

pobrać próbkę mieszaniny reakcyjnej (ok. 25 – 30 cm

3

) i zmieszać ją z celitem (2

– 3 g). Otrzymaną mieszaninę przesączyć przez złoże mokrego celitu i przemyć
oddzielone drożdże octanem etylu (25 cm

3

). Uzyskane roztwory połączyć.

Doprowadzić odczyn przesączu do pH = 7 przy użyciu 2 molowego roztworu
NaOH i nasycić fazę wodna NaCl. Całość dokładnie wymieszać. Oddzielić fazę
organiczną na wirówce i zatężyć do objętości ok. 4 – 5 cm

3

. Jako układ

rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - -eter dietylowy 3:1. Płytki
wywołuje się poprzez rozpylenie na ich powierzchni anisaldehydu.

 R

f

substratu = 0.83

 R

f

produktu = 0.37

Jeżeli stopień przereagowania jest odpowiedni, reakcję należy przerywać

wyciągając kolbę z wytrząsarki i dodając 2 łyżki celitu. Tak przygotowaną
mieszaninę pozostawić na ok. 30min od czasu do czasu mieszając.

Nastepnie odsącza się zawiesinę drożdży na lejku Büchnera poprzez złoże celitu,

a żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x150ml). Zlane ekstrakty
suszy się bezwodnym siarczanem magnezu, przsącza na lejku z sączkiem
karbowanym, a przesącz odparowuje na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej
pozostałości produktu.

Surowy produkt oczyszczać metodą chromatografii kolumnowej. Jako

wypełnienie kolumny należy stosowac żel silikonowy a jako eluent układ benzyna
-eter dietylowy (3:1). Literaturowa wydajność wynosi 70% mieszaniny (2R,3S)- i
(2S,3S)-2-metylo-3-hydroksymaślanu etylu. Dla rozdziału tych diastereomerów
używane są techniki HPLC.

1.2 Redukcja podwójnego wiązania węgiel- węgiel

Redukcja wiązań typu C=C z użyciem drożdży jest istotną metodą syntezy chiralnych

wielofunkcyjnych syntonów. Po raz pierwszy drożdże do tego celu uzyto już w latach 30
zeszłego stulecia. Istotny wpływ w takim uwodornieniu ma otoczenie wiązania C=C – istotny
wpływ ma sąsiedztwo grupy karbonylowej lub wiązania podwójnego bez których to reakcja
nie zachodzi lub zachodzi ze słabymi wydajnościami. Badania przeprowadzone w latach 70
dowiodły stereoselektywności redukcji z użyciem S. cerevisiae. Także chemoselektywność
enzymów drożdżowych została niejednokrotnie potwierdzona. Poniżej przytoczono kilka
przykładów

6

7

:

6

Fuganti C., Griselli S.,Servi S., Hőgberg, Roberts S.M. (ed.); Preparative Biotransformations. Whole Cells and

Isolated enzymes in Organic Synthesis, 1992, 2:7.1, Wiley, London.

7

Dumanski P.G., Florey P., Knetting M., Smallridge A.J.; J.Molec.Catal. B: Enzymatic 2001, 11, 905-908.

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

.

.

O

S.cerevisiae

eter naftowy

.

.

O

(R)

76%

Me(CH

2

)

4

O

(CH

2

)

7

CO

2

Me

S.cerevisiae

Me(CH

2

)

4

O

(CH

2

)

7

CO

2

Me

74%

C

H

3

H

NO

2

R

S.cerevisiae

H

NO

2

R

CH

3

50% 89-98% ee

R=H, Cl, Br, NO

2

Redukcję wiązań C=C można rónież osiągnąć poprzez redukcję katalizowaną

np. metalami grup przejściowych lub ich tlenkami (Ni Raneya, Pt

2

O, Pd, itd.) z użyciem

gazowego wodoru. Istnieją także metody stosujące np. układy cynk i kwas, sód w etanolu,
hydrazynę lub lit i aminę alifatyczną. Zwykle można przeprowadzić tymi metodami
selektywną redukcję wiązań C=C (bez naruszenia innych obecnych w substratach grup
(np. COOH, CHO, CN, itp.) jednakże wymaga to zastosowania warunków i substratów
redukujących charakterystycznych dla danego związku

3

.

Ćwiczenie:

Celem ćwiczenia jest redukcja

α

-metylo-

β

-(2-furylo)akroleiny . Jako produkt otrzymuje się

nasycony alkohol. Mechanizm tej reakcji jest trójetapowy : redukcja – utlenianie – redukcja.
Wyjściowy aldehyd pozostaje w równowadze z pochodną alkoholu allilowego, przy czym
równowaga jest przesunięta w stronę alkoholu. Jednakże już małe (równowagowe) ilości

α

-metylo-

β

-(2-furylo)akroleiny ulegają powolnej trans-addycji wodoru w poprzek wiązania

podwójnego, do nasyconego aldehydu. Nasycony aldehyd jest wówczas szybko redukowany
do nasyconego alkoholu.

.

CHO

O

[H

+

]

[Ox]

.

OH

O

szybko

powoli

.

CHO

O

szybko

.

OH

O

72%, > 98% ee

poprzez utlenianie

in situ

do nienasyconego aldehydu.

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Odczynniki:

α

-metylo-

β

-(2-furylo)akroleina 1.36g, (0.01mola)

drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae 25g

glukoza 10.4g

woda destylowana 200ml

Celite®

Etanol

Octan etylu

MgSO

4 bezw.

nasycony r-r węglanu sodu

2M kwas solny

Opis ćwiczenia:

Umieścić drożdże, glukozę i wodę w zlewce (1000ml). Delikatnie mieszać

w ciepłej łaźni wodnej (25-30

o

C) przez ok. 1 godzinę.

pH fermentującej mieszaniny powinno być następnie podniesione z 4 do ok. 5.5

poprzez dodanie nasyconego r-ru węglanu sodu (ok.3-6 ml).

Do tak przygotowanej mieszaniny należy dodać roztwór wyjściowego aldehydu

w etanolu (2ml) i delikatnie mieszać w temperaturze pokojowej. Operację należy
wykonywać pod wyciągiem.

Co 12 – 15 godzin należy sprawdzać pH mieszaniny. Ewentualnie w celu

obniżenia pH do wartości ok. 5 posłużyć się roztworem kwasu solnego.

Po tym czasie należy skontrolować skład mieszaniny metodą TLC. Próbkę

przygotować wg procedury z poprzedniej syntezy. Jako układ rozwijający stosuje
się chlorek metylenu. Płytki wywołuje się pod lampą UV przy długości fali
254nm. Ponieważ aldehyd szybko przechodzi w nienasycony alkohol, na płytce
przy R

f

=0.38 mogą być widoczne 2 plamy w kształcie ósemki (nasycony i

nienasycony alkohol). Świadczy to o niecałkowitym przereagowaniu substratu.
Jeżeli obecna jest tylko 1 plamka przy R

f

=0.34 – pochodząca od produktu, można

uznać całkowite przereagowanie.

Jeżeli stopień przereagowania jest zadowalający, należy przerwać reakcję

dodając dwie łyżki celitu. Mieszaninę pozostawić na ok. 30 min od czasu do czasu
mieszając. Następnie odsączyć zawiesinę na lejku ze spiekiem, poprzez złoże
celitu, pod zmniejszonym ciśnieniem. Klarowny, żółty filtrat poddaje się ekstrakcji
octanem etylu (4 x 200ml). Zlane ekstrakty octanowe suszy się bezwodnym
siarczanem magnezu a następnie przesącza na lejku z sączkiem karbowanym.
Przesącz odparowuje się na wyparce rotacyjnej (T = 30

o

C), do uzyskania żółtego

oleistego produktu. Produkt można oczyszczać metodą chromatografii
kolumnowej, używając jako eluenta chlorku metylenu. Uzyskuje się (S)-3-(2-
furylo)-2-metylo-1-propanol z literaturową wydajnością 49%.

Enzymatyczna redukcja związków karbonylowych i wiązań C=C

Przygotowanie do zajęć:

1.Dokładne przeczytanie instrukcji, zapoznanie się z technikami laboratoryjnymi używanymi
podczas opisanych ćwiczeń.
2.Przypomnienie pojęć związanych z katalizą enzymatyczną, redukcją związków
zawierających grupy karbonylowe i wiąznia C=C, selektywnością tych reakcji.
3.Porównanie metod enzymatycznych z klasycznymi. Wady i zalety.

Warunki zaliczenia:

1.Pozytywny wynik kartkówki;
2.Przeprowadzenie eksperymentalnej części ćwiczenia
3.Oddanie sprawozdania (wg. wskazówek prowadzącego) w terminie do 2 tygodni.