1

Replikacja DNA

Proces enzymatycznej syntezy nici DNA komplementarnych do istniejącej w komórce

cząsteczki DNA - stanowiącej matrycę dla tej reakcji.

W efekcie procesu replikacji ilość DNA w komórce ulega podwojeniu.

MATRYCOWA NIĆ DNA

POLIMERAZA DNA

wolna grupa hydroksylowa 3’

5’

3’

5’

SUBSTRATY

– 5’ TRIFOSFORANY NUKLEOZYDÓW

ELEMENTY NIEZBĘDNE DLA PRZEBIEGU PROCESU REPLIKACJI DNA

OH

OH

O H

O H

O H

O H

2

OH

HO

OH

OH

OH

OH

3’

5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

nić opóźniona

nić wiodąca

fragmenty Okazaki

kierunek przemieszczania
widełek replikacyjnych

Struktura widełek replikacyjnych

Jedna z potomnych nici DNA jest syntetyzowana w sposób ciągły – w kierunku zgodnym
z przemieszczaniem się widełek replikacyjnych. Nazywamy ją nicią wiodącą (leading strand).

Druga z potomnych nici DNA

– zwana nicią opóźnioną (lagging strand) jest syntetyzowana

w postaci krótkich odcinków zwanych fragmentami Okazaki.

1

2

3

3

wg. Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

DNA wyizolowany z komórek kultury Escherichia coli utrzymywanej przez
wiele pokoleń w obecności

[

15

N]

NH4Cl, jako jedynego źródła azotu,

poddano wirowaniu w gradiencie gęstości CsCl

Komórki przeniesiono do pożywki zawierającej wyłącznie

14

N

DNA wyizolowano po czasie odpowiadającym jednemu
podziałowi komórkowemu

.... oraz po czasie odpowiadającym dwom podziałom
komórkowym

[

15

N]

DNA

[

15

N]

/

[

14

N]

DNA

[

14

N]

DNA

[

15

N]

/

[

14

N]

DNA

Doświadczenie Meselsona i Stahla (1957)

Dowód doświadczalny na semikonserwatywność procesu replikacji DNA

wg. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002,

Molecular Biology of the Cell, 4th. Ed. Garland Publishing Inc.

75

100/0

25

50

oriC

miejsce inicjacji
replikacji

sekwencje

terminacyjne

Mapa genetyczna Escherichia coli

Escherichia coli K12

4

Struktura miejsca startu replikacji (oriC) chromosomu Escherichia coli

GATCTNTTNTTTT

TTATCCACA

Trzy tandemowe powtórzenia

sekwencji 13 pz.

Miejsca wiązania białka DnaA cztery sekwencje po 9 pz.

ok. 245 pz.

nazwa grupy genów*

Objaśnienie nazwy - funkcja

mut

mutageneza

dna

replikacja DNA

pol

polimeraza DNA

rpo

polimeraza RNA

uvr

odporność na promieniowanie UV

rec

rekombinacja DNA

ter

miejsce terminacji (zakończenia) replikacji

ori

miejsce startu replikacji

dam

metylacja nukleotydów adeninowych

lig

ligaza DNA

cou

oporność na kumerycynę**

nal

oporność na kwas nalidyksowy**

*

w nazewnictwie genów (i produktów ich ekspresji) przyjęto konwencję, którą ilustruje następujący przykład:

dnaC -

gen (sekwencja DNA) kodujący białko DnaC,

recA -

gen kodujący białko RecA i.t.d.

**

kumerycyna (coumericin) i kwas nalidyksowy (nalidixic acid) są antybiotykami blokującymi replikację DNA

poprzez wiązanie się z podjednostkami gyrazy DNA

Niektóre grupy genów Escherichia coli uczestniczące w procesach

związanych z metabolizmem DNA

5

wg. Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

cztery powtórzenia
sekwencji 9 pz.

Trzy powtórzenia
sekwencji 13 pz.

DnaA

Hu

+

DnaB
DnaC

Synteza starterów i zainicjowanie replikacji

Kompleks

ok. 20 cząsteczek białka DnaA wiąże się z powtarzalnymi

sekwencjami 9 pz. w obrębie ori C.
W obecności ATP, oraz białek HU (a także najprawdopodobniej białek FIS

i IHF

), cząsteczka DNA zagina się oplatając agregat białek DnaA.

Naprężenie powstające w cząsteczce DNA powoduje zrywanie wiązań
wodorowych w obrębie powtarzających się sekwencji 13 pz.

Do kompleksu otwartego przyłącza się helikaza (białko DnaB) występująca
w połączeniu z białkiem DnaC w postaci podwójnego heksameru (DnaB

6

x DnaC

6

)

Białko DnaC reaguje z DnaA uwalniając aktywną formę helikazy(DnaB

6

).

Helikazy rozwijają nici DNA wypierając białko DnaA.
Rozdzielone nici są stabilizowane przez białka SSB.

Miejsce inicjacji replikacji (ori

C) ulega aktywacji przez transkrypcję

promotora gid

A, w wyniku której następuje zwinięcie odcinka DNA

w dodatkowe ujemne superskręty – niezbędne do otwarcia
dwuniciowej struktury helisy

Ryc. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

oriC

polimeraza DNA

białka DnaA

helikaza (DnaB)

primaza (DnaG)

starter (RNA)

Inicjacja replikacji w miejscu oriC chromosomu E. coli (2)

6

Białka niezbędne dla zainicjowania replikacji w miejscu oriC Escherichia coli

Białko

masa

cząst.

l. podj.

Funkcja

DnaA

50 000

1

Otwiera dupleks DNA w specyficznych miejscach
regionu oriC

DnaB (helikaza)

300 000

6 (ident.)

Rozkręca dupleks DNA

DnaC

29 000

1

Jest wymagane dla wiązania DnaB w miejscu startu
replikacji

HU

19 000

2

Białko podobne do histonu, stymuluje inicjację replikacji

Primaza (DnaG)

60 000

1

Syntetyzuje starter RNA

SSB

75 600

4 (ident.)

Wiąże się z pojedynczą nicią DNA

Polimeraza RNA

454 000

6

Umożliwia pojawienie się aktywności DnaA

Topoizomeraza II
(giraza DNA)

400 000

4

Usuwa naprężenia powstałe po rozkręceniu DNA

z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

primaza

5’

3’

5’

3’

5’

3’

HO

-

HO

-

Przebieg reakcji syntezy starterów dla procesu replikacji DNA

reakcja jest katalizowana przez enzym zwany

primazą DNA

Primaza

Specyficzna polimeraza RNA katalizująca syntezę oligonukleotydów RNA na matrycy DNA
w miejscu startu replikacji i później, w czasie przesuwania się widełek replikacyjnych.
Oligonukleotydy te są starterami rozpoznawanymi przez polimerazę III DNA w czasie replikacji
(zarówno nici wiodącej, jak i fragmentów Okazaki nici opóźnionej).
Primaza (E. coli

) jest enzymem monomerycznym o m. cząst. 60 000Da.

Syntetyzowane przez nią oligonukleotydy RNA (startery) mają in vivo długość 11 ± 1 pz.
Primaza włączona jest w strukturę primosomu.

7

Replikacja może przebiegać dwukierunkowo lub jednokierunkowo

W większości przypadków obserwujemy replikację dwukierunkową:

- replikacja typu

θ chromosomów bakteryjnych,

- replikacja eukariotycznego DNA.

Niektóre replikony ulegają replikacji przebiegającej jednokierunkowo:

- replikacja typu

ζ (forma obracającego się koła) - DNA niektórych bakteriofagów,

-

replikacja typu powiększającej się pętli (D-loop, R-loop) - plazmidowe DNA,

mitochondrialne DNA

Replikacja jednokierunkowa

miejsce startu

replikacji

Replikacja dwukierunkowa

miejsce startu

replikacji

kierunek ruchu

widełek replikacyjnych

kierunek ruchu

widełek replikacyjnych

wg. Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

wg. Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

Replikacja kolistego chromosomu bakteryjnego (E. coli)
powoduje powstanie struktury przypominającej kształtem
grecką literę theta (Θ).

Ruch widełek replikacyjnych jest dwukierunkowy -
poruszają się w przeciwnych kierunkach.

8

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII,

Oxford University Press.

Mikrofotografia elektronowa kompleksu inicjującego

powstającego w miejscu oriC chromosomu E. coli. Kompleks
uwidoczniono stosując przeciwciała specyficzne wobec
białek DnaB (helikaza).

fot. Barbara Furnell

przed rozpoczęciem replikacji

w 1 minutę po inicjacji replikacji

Mikrofotografia elektronowa kompleksu inicjującego

powstającego w miejscu oriC chromosomu E. coli. Kompleks
uwidoczniono stosując przeciwciała specyficzne wobec
białek DnaB (helikaza).

Replikacja typu

θ

(chromosomu Escherichia coli)

Nowe nici DNA („oczko” replikacyjne) można rozpoznać po tym, że są to fragmenty cząsteczki

o identycznej długości – jeżeli zmierzyć odległość pomiędzy widełkami replikacyjnymi

Ryc. z: Lewin B., (2000), Genes VII, Oxford University Press

9

Porównanie polimeraz DNA z Escherichia coli

Polimeraza DNA

I

II

III

Gen strukturalny
(podjednostki o aktywności polimerazowej)

polA

polB (dnaA)

polC (dnaE)

Liczba podjednostek

1

> 4

> 10

Masa cząsteczkowa
(podjednostki o aktywności polimerazowej)

103 000

88 000

~900 000

aktywność 3‘ → 5' egzonukleazowa

Tak

Tak

Tak

Aktywność 5‘ → 3' egzonukleazowa

Tak

Nie

Nie

Szybkość polimeryzacji (nukleot./s)

16 - 20

~ 7

250 - 1 000

Zdolność polimeryzacji
(liczba nukleotydów przyłączanych przed
dysocjacją enzymu i matrycy)

3 - 200

10 000

500 000

Podjednostki polimerazy III DNA z Escherichia coli

Podjednost

ka

Masa

cząst.

Gen

Funkcja

α (alfa)

132 000

pol

C (

dna

E)

aktywność polimerazowa

podjednostki rdzenia

polimerazy

ε (epsilon)

27 000

dna

Q

(

mut

D)

egzonukleaza 3'→ 5'

(aktywność korekcyjna)

θ (theta)

10 000

hol

E

-

1

τ (tau)

71 000

dna

X

stabilizacja wiązania z matrycą; dimeryzacja rdzenia

enzymu

γ (gamma)

52 000

dna

X

2

podwyższanie zdolności polimweryzacji

δ (delta)

35 000

hol

A

podwyższanie zdolności polimweryzacji

δ'

33 000

hol

B

-

χ (chi)

15 000

hol

C

-

ψ (psi)

12 000

hol

D

-

β (beta)

37 000

dna

N

ATPaza wymagana dla optymalnej zdolności

polimeryzacji

– funkcjonuje, jako „klamra” utrzymująca

holoenzym polimerazy III na matrycy DNA

1

znak "-

" umieszczony w tej rubryce oznacza, że funkcja podjednostki nie została

jednoznacznie zdefiniowana

2

podjednostka γ jest kodowana przez część genu dla podjednostki η na drodze przesunięcia

fazowego w czasie translacji, które prowadzi do przedwczesnej jej terminacji.

10

Ryc. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

polimeraza III DNA na nici opóźnionej
kończy syntezę kolejnego fragmentu Okazaki

polimeraza III DNA na nici wiodącej

białka SSB

matryca dla nici opóźnionej

helikaza

primaza

starter (RNA)

synteza następnego fragmentu Okazaki

rozpocznie się w tym miejscu

fragment Okazaki

nić wiodąca

matryca dla nici wiodącej

gyraza DNA
(topoizomeraza II)

Struktura widełek replikacyjnych Escherichia coli

Zaznaczono główne białka funkcjonujące w ich obrębie

Ryc. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

polimeraza III DNA
na nici wiodącej

matryca dla nici wiodącej

nić wiodąca

matryca dla nici opóźnionej

polimeraza III DNA
na nici opóźnionej

białka SSB

helikaza

primaza

starter (RNA)

fragment Okazaki

gyraza DNA
(topoizomeraza II)

Funkcjonowanie „dimeru” polimerazy III DNA w czasie replikacji

chromosomu bakteryjnego Escherichia coli

11

PAS

n (PriA)

n (PriB)
n’’ (PriC)
i (DnaT)
primaza (DnaG)

primaza

helikaza

primosom

Kompleks białkowy uczestniczący w inicjacji replikacji chromosomu bakteryjnego.
W jego skład (Escherichia coli) wchodzą białka: i (DnaT), n (PriB), n' (PriA), n'' (PriC) rozpoznające
sekwencje PAS (primosome assembly site -

miejsca składania primosomu), do których przyłączają się

pozostale białka kompleksu (primosomu):
DnaC, (DnaB)6 -

główna helikaza replikacyjna i jako ostatnie - DnaG (primaza).

Primosom

Ryz. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

białka SSB

polimeraza DNA

kooperatywne wiązanie białek SSB z łańcuchem DNA

uniemożliwia powstanie struktur dwuniciowych

Funkcja białek SSB (single-strand binding proteins) w replikacji DNA Escherichia coli

12

Ryc. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

polimeraza III DNA na nici wiodącej

nić wiodąca (nowa nić DNA)

matryca dla nici opóźnionej

matryca dla nici wiodącej

5’

5’

3’

5’

3’

3’

Podczas replikacji pojawia się problem
związany ze skęcaniem się rodzicielskiej
cząsteczki DNA

przy szybkości replikacji wynoszącej 500 nt./s, rodzicielski (matrycowy) DNA, przed
widełkami replikacyjnymi, powinien obracać się z szybkością 50 obrotów na sekundę

Kompleks tworzący „klamrę” hydrolizuje ATP

Kompleks

„Klamra”

Przyłącza się rdzeń polimerazy

Rdzeń

Przyłączają się

τ

oraz drugi rdze

ń

synteza nici
wiodącej

synteza nici
opóźnionej

Podjednostki

τ

stabilizują strukturę

„dimeru” polimerazy

Powstawanie holoenzymu polimerazy III DNA

Escherichia coli

w postaci „dimeru” prowadzącego

skoordynowana replikację nici wiodącej

i fragmentu Okazaki

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII,

Oxford University Press.

13

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII,

Oxford University Press.

1.

Inicjacja syntezy fragmentu Okazaki

2.

Terminacja syntezy fragmentu Okazaki

3.

Dysocjacja jednego z rdzeni Polimerazy III i klamry

β

4.

Reasocjacja klamry

β

„Klamra” utworzona przez podjednostki β

polimerazy III DNA utrzymująca holoenzym na cząsteczce DNA

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII,

Oxford University Press.

14

Białka Escherichia coli funkcjonujące w regionie widełek replikacyjnych

Białko

masa

cząst.

l. podj.

Funkcja

SSB

75 600

4 (ident.)

Wiąże się z pojedyńczą nicią DNA

białko i (DnaT)

66 000

3

Składnik primosomu

białko n

28 000

2

Tworzenie i funkcja primosomu

białko n'

76 000

1

Składnik primosomu

białko n''

17 000

1

Składnik primosomu

DnaC

29 000

1

Składnik primosomu

DnaB (helikaza)

300 000

6 (ident.)

Rozkręca dupleks DNA, Składnik primosomu

Primaza (DnaG)

60 000

1

Synteza startera RNA, składnik primosomu

polimeraza III DNA

900 000

2x10

Synteza łańcucha DNA

polimeraza I DNA

103 000

1

Wypełnianie przerw w łańcuchu DNA, wycinanie starterów RNA

Ligaza DNA

74 000

1

Ligacja DNA

Topoizomeraza II (giraza DNA)

400 000

4

Superskręcanie DNA

Rep (helikaza)

65 000

1

Rozkręcanie dupleksu DNA

Helikaza II DNA

75 000

1

Rozkręcanie dupleksu DNA

Topoizomeraza I DNA

100 000

4

Usuwa negatywne superskręty

Włączenie niewłaściwego nukleotydu – błąd w Escherichia coli zdarza się z częstością:

1 raz na 10

9

- 10

10

nukleotydów

Wielkość chromosomu E. coli 4.7 x 10

6

pz.

↓

Błąd występuje

1 raz na 1 000 - 10 000 replikacji

Dokładność procesu replikacji

15

Polimeraza I DNA

starter (RNA)

przerwa

(nick)

5’

3’

starter (RNA)

dATP, dGTP, dCTP, dTTP

AMP, UMP, CMP, GMP

ligaza DNA

fragment Okazaki

ATP lub NAD+

AMP + PPi lub NMN

ligaza DNA

Polimeraza I DNA

Polimeraza I DNA

ligaza DNA

Zakończenie syntezy nici opóźnionej DNA

Usuwanie odcinków starterowych RNA (polimeraza I DNA)
oraz tworzenie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy
fragmentami Okazaki (ligaza DNA)

Ryc. z: Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

domena o aktywności
polimerazowej (5’→3’)

domena o aktywości
3’→5’ egzonukleazowej

5’

3’

– symbol oznacza rzadką tautomeryczną formę cytozyny (C*),

która może zastąpić T. Zdarza się jej włączenie w nową nić DNA

Zanim polimeraza przesunie się wzdłuż nici matrycowej, zwykle następuje
tautomeryczne przekształcenie C*→C. Parowanie C – A nie jest możliwe.

Niesparowany koniec 3’-OH nowej nici DNA uniemożliwia elongację
łańcucha DNA. Polimeraza przesuwa się wstecz. Niesparowany nukleotyd
znajduje się teraz w obszarze domeny 3’→5’ egzonukleazowej.

Niesparowany nukleotyd zostaje usunięty

Polimeraza I DNA może kontynuować polimeryzację
(syntezę uzupełniającą)

Nie zaznaczono domeny o aktywności
5’ → 3’ egzonukleazowej

wg. Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

16

Domeny strukturalne i funkcjonalne polimerazy I DNA Escherichia coli

domena N-

końcowa

odpowiada za aktywność
egzonukleazową 5’→3’

dwie domeny strukturalne tworzące
łącznie tzw.

duży fragment

lub

–

fragment Klenowa

odpowiadają za aktywność
polimerazową 5’ → 3’
egzonukleazową 3’ → 5’

68 000 Da

ok. 35 000 Da

Cały enzym - 103 000 Da

Ryc. z: Lewin B., (2000), Genes VII, Oxford University Press

Mechanizm działania ligazy DNA

Enzym +

ATP

lub enzym +

NAD

Enzym-

AMP

Adenina-Ryboza-

+ AMP

17

oriC

widełki

replikacyjne

2

widełki

replikacyjne

1

terE,D,A

zatrzymują widełki

1

terC,B

zatrzymują widełki

2

Ryc. z: Lewin B., (2000), Genes VII, Oxford University Press

miejsce spotkania widełek

białka

Tus

wiążą się asymetrycznie

z sekwencjami

ter

ter

ter

widełki replikacyjne mogą przechodzić poprzez
cząsteczkę białka Tus w jednej z orientacji...

... lecz są zatrzymywane przez białko Tus dołączone
w orientacji przeciwnej

W terminacji replikacji u Escherichia coli uczestniczą białka Tus

Ryc. z: Brown T.A., 2002, Genomes, 2nd ed. , BIOS Scientific Publishers Ltd.

18

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

topoizomeraza IV

widełki replikacyjne 1

widełki replikacyjne 2

zakończenie procesu replikacji

rozdzielone chromosomy potomne

połączone chromosomy potomne

Zakończenie procesu replikacji
chromosomu bakteryjnego

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

oriC

terminator

replikacji

(ter)

chromosom

komórka bakterii

podział komórki

początek replikacji

replisom

rozdzielenie
miejsc oriC

komórka wydłuża się wraz

z postępem replikacji

rozdział

chromosomów

potomnych

Replikacja DNA i podział komórki E. coli

19

1. Kluczową rolę w regulacji procesu inicjacji replikacji odgrywa transkrypcja RNA – a zatem pośrednio

mechanizmy regulujące ten proces.
a. Zdarzeniem zawsze poprzedzającym replikacj jest transkrypcja sekwencji DNA rozpoczynająca się

na promotorze gidA

. Proces ten wywołuje powstanie dodatkowych negatywnych superskrętów

umożliwiających rozplecenie dwuniciowej cząsteczki DNA.

b. Poziom transkrypcji

genów kodujących białka uczestniczące w procesie inicjacji replikacji decyduje

o powstaniu warunków dla zajścia tego zdarzenia.

2. Sygnałem dla startu procesu replikacji jest nagromadzenie się "inicjatora". Rolę tę najprawdopodobniej

spełnia białko DnaA. Białko DnaA musi wystąpić w formie zaktywowanej (w postaci kompleksu z ATP).
Kompleks DnaA-

ADP jest nieaktywny w inicjacji replikacji. Aktywacja DnaA (zastąpienie ADP przez ATP)

jest blokowane przez wiążące się z kompleksem DnaA-ADP białko IciA (inhibitor of chromosomal initiation).

3. Bezpośrednie sterowanie procesem replikacji następuje na drodze metylacji specyficznych

sekwencji sygnałowych DNA występujących w obrębie oriC.

Regulacja procesu inicjacji replikacji w komórkach Escherichia coli

Ryc. z: Lewin B., (2000), Genes VII,

Oxford University Press.

metylaza Dam

replikacja DNA

zmetylowany DNA

miejsca oriC

Hemi-

metylowany DNA

nowych oriC

Replikacja DNA

Metylaza Dam

Aktywne miejsce oriC

Aktywne miejsce oriC

Nieaktywne miejsca oriC

Metylacja DNA w miejscu ori

C może wpływać na jego aktywność

Aktywne w procesie inicjacji replikacji jest tylko w pełni zmetylowane miejsce oriC

20

Replikacja może przebiegać dwukierunkowo lub jednokierunkowo

W większości przypadków obserwujemy replikację dwukierunkową:

- replikacja typu

θ chromosomów bakteryjnych,

- replikacja eukariotycznego DNA.

Niektóre replikony ulegają replikacji przebiegającej jednokierunkowo:

- replikacja typu

ζ (forma obracającego się koła) - DNA niektórych bakteriofagów,

-

replikacja typu powiększającej się pętli (D-loop, R-loop) - plazmidowe DNA,

mitochondrialne DNA

Replikacja jednokierunkowa

miejsce startu

replikacji

Replikacja dwukierunkowa

miejsce startu

replikacji

kierunek ruchu

widełek replikacyjnych

kierunek ruchu

widełek replikacyjnych

wg. Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

Ryc. z: Lewin B., (2000), Genes VII, Oxford University Press

Matrycą jest kolista dwuniciowa cząsteczka DNA

Inicjacja replikacji polega na przecięciu jednej nici w miejscu ori

Elongacja nowej nici DNA zastępuje (wypiera)
jedną ze „starych” nici

w wyniku trwającej elongacji wypierana nić daje
początek multimerycznej, potomnej cząsteczce DNA

Replikacja przebiegająca wg. modelu „obracającego się koła” (rolling circle replication)

zwana również replikacją typu

ζ

kolista dwuniciowa

matryca

fot. David Dressler

liniowy „ogon”

21

nić

-

nić +

białko A przecina nić + w miejscu ori
i wiąże sie z końcem 5’

replikacja typu „obracającego się koła”(ζ)

na matrycy nici

-

po pelnej rundzie replikacyjnej białko A rozpoznaje ponownie
miejsce ori

przecina powstającą nić + i wiąże się z nowym końcem 5’

Jednocześnie przenosi uwolniony 5’-P na powstającą 3’-OH

uwolniona nić + (kompletna kopia komplementarna nici

-

)

tworzy kolistą cząsteczkę formy infekcyjnej DNA bakteriofaga

nić

-

nić +

nić +

Replikacja typu

ζ, jako mechanizm syntezy jednoniciowych, kolistych cząsteczek DNA

formy infekcyjnej bakteriofaga

ΦX 174

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII, Oxford University Press

PRZYKŁAD:

nić +

np. bakteriofagi:

M13

G4

ΦX 174

genom formy infekcyjnej (

IF

)

jednoniciowa, kolista

cząsteczka DNA

nić –

nić +

nić –

nić +

forma replikacyjna (

RF

)

dwuniciowa, kolista
cząsteczka DNA

M13

G4

ΦX 174

nić –

nić +

SSB

polimeraza RNA

SSB

primaza

SSB

primosom

Przekształcenie jednoniciowej formy infekcyjnej bakteriofagów w dwuniciową formę replikacyjną

może być inicjowane przez różne elementy bakteryjnego systemu replikacyjnego

22

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII, Oxford University Press

odcinanie monomerów

odcinanie multimerów

kolista cząsteczka jednoniciowa

jednoniciowy multimer

dwuniciowy multimer

kolista cząsteczka dwuniciowa

jednoniciowy monomer

Replikacja typu

ζ może być kończona na różne sposoby właściwe danej cząsteczce DNA

(w sposób charakterystyczny dla danego bakteriofaga lub wirusa)

Synteza nici komplementarnej może rozpoczynać się jeszcze przed odcięciem

monomeru lub multimeru

Replikacja wg. modelu przemieszczającej się pętli (D-loop replication)

Przerwy w nowych niciach

zostają zamknięte przez ligazę

nić L

nić H

inicjowanie syntezy RNA w miejscu ori
dla replikacji nici L na nici H

cięcie RNA generuje 3’OH startera

synteza DNA

synteza nowej nici L tworzy pętlę przez
wypieranie rodzicielskiej nici L

pętla D (D loop – displacement loop)
poszerza się

ori dla replikacji nici H

na nici L

Gdy pętla D przechodzi przez ori na nici L
rozpoczyna się replikacja nowej nici H

Zakończenie replikacji

nowej nici L

uwalnia genomy

potomne

po zakończeniu replikacji powstaje dwuniciowa

kolista cząsteczka potomna DNA

wg. Lewin B., (2000), Genes VII, Oxford University Press

23

inicjacja transkrypcji RNA startera

Polimeraza RNA przechodzi poza miejsce ori

RNAza H przecina RNA generując wolną grupę 3’ OH

Rozpoczyna się synteza DNA

utrzymuje się trwały hybryd DNA-RNA

Starterowy RNA (555 nt.)

RNA I
108 nt.

Sekwencja RNA I jest Komplementarna do końca 5’ RNA starterowego

wg. Lewin B., (2000), GenesVII, Oxford University Press

Replikacja DNA replikonów ColE1 jest inicjowana
przez cięcie starterowego RNA
RNA I pełni funkcję regulacyjną

RNA I nieobecny

RNA I obecny

tworzy oddziałuje
z komplementarną sekwencją
starterowego RNA

RNAza H przecina starterowy RNA
pojawia się 3’-OH

→

inicjacja replikacji

RNAza H nie może przeciąć startera
transkrypcja jest kontynuowana,
replikacja nie może zostać zainicjowana

RNA I reguluje replikację replikonu ColE1

24

Inicjacja replikacji zwierzęcego DNA mitochondrialnego

promotor

nici L

sekwencje CSB

III

II

I

nić L

nić H

nić L

nić H

nić L

nić H

specyficzna nukleaza
mitochondrialna

RNA (136 nt.)

Działanie specyficznej nukleazy generuje powstanie
startera komplementarnego do nici H

wg. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

1

μm

Obraz ultramikroskopowy cząsteczki zwierzęcego mitochondrialnego DNA

Kolorem żółtem zaznaczono zreplikowany DNA

Replikacja przebiega zgodnie z modelem przemieszczającej się pętli,

katalizuje ją polimeraza

γ

DNA

Fot. D. Clayton

25

Średnia wielkość chromosomu ludzkiego - ok 1,5 x 10

8

pz.

Szybkość replikacji DNA eukariotycznego -

50 pz./s

czas potrzebny dla replikacji DNA jednego chromosomu ludzkiego:

1,5 x 10

8

pz. / 50 nt/s = 3,0 x 10

6

s (ok. 800 godzin)

Szybkość replikacji DNA

Escherichia coli - ok. 500-800 pz./s

Eukaryota - ok. 50 pz./s

Czy cząsteczka eukariotycznego DNA zawiera więcej niż jedno miejsce startu replikacji?

Wniosek:

Cząsteczka DNA w komórce eukariotycznej musi zawierć wiele miejsc startu replikacji (origins)

Cząsteczka DNA w komórce eukariotycznej obejmuje wiele

replikonów

.

Replikonem

nazywamy odcinek DNA ulegający replikacji zainicjowanej w jednym miejscu startu (origin)

i przebiegającej jako ciągły proces aż do momentu zakończenia syntezy nici DNA komplementarnych
do tego odcinka.
Dany replikon zawsze zawiera jedno miejsce startu replikacji (origin). Może także (Prokaryota) zawierać
sygnały kończące replikację (sekwencje decydujące o terminacji replikacji).

Replikon

Organizm

Liczba

replikonów

średnia długość

replikonu [kpz.]

Szybkość ruchu widełek

replikacyjnych [pz./min]

Bakterie (Escherichia coli)

1

4 200

50 000

Drożdże (Saccharomyces cerevisiae)

500

40

3600

Owady (Drosophila melanogaster)

3 500

40

2 600

Płazy (Xenopus laevis)

15 000

200

500

Ssaki (Mus musculus)

25 000

150

2 200

Rośliny(Vicia faba)

35 000

300

Liczba i szybkość replikacji replikonów różnych organizmów

26

Mikrofotografia elektronowa fragmentu chromosomu Drosophila

ulegającego replikacji

(z: Kreigstein H.J., Hogness D.S., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71:136.)

Mikrofotografia elektronowa fragmentu chromatyny
ulegającego replikacji w jądrze komórki zarodka Drosophila melanogaster

z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994, Molecular Biology of the Cell,
3rd Ed. Garland Publishing Inc.

Strzałki wskazują położenie pęcherzyków replikacyjnych.

W tkankach embrionalnych miejsca startu replikacji położone są bardzo blisko siebie.
W przedstawionym przykładzie potrzeba tylko ok. 1 minuty aby zakończyć replikację
fragmentu DNA widocznego na zdjęciu. Podziały komórkowe w tkance tego typu mogą
zachodzić nawet co 10 minut.

27

ori

ori

ori

inicjacja replikacji

Cząsteczki eukariotycznych DNA zawierają wiele miejsc inicjacji replikacji

ARS

(

A

utonomously

R

eplicating

S

equences) 100

– 200 pz. – wystepują w obszarach międzygenowych

Inicjacja replikacji w komórkach drożdży

Rolę sekwencji inicjacyjnych replikacji (ori) pełnią sekwencje ARS występujące w liczbie 400 -500
w 12 chromosomach Saccharomycesw cerevisiae.

Ich liczba jest zgodna z liczbą replikonów

drożdżowych, która została określona metodami autoradiograficznymi.

(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)

ACS

ORC

B1

DNA

B3

B2

11 pz.

12 pz.

miejsce rozdzielania się

nici DNA

do elementu B3

przyłącza się czynnik

transkrypcyjny

w niektórych ARS

czynniki transkrypcyjne

przyłączają się również

po przeciwnej stronie

elementu ACS

Dołączenie ORC do sekwencji ACS i B1 powoduje owijanie się helisy wokół ORC
połączone z jej silnym zaginaniem co wywołuje w cząsteczce DNA naprężenia
powodujące z kolei rozdzielanie się nici w obszarze B2

TF

ACS

(

A

RS

C

onsensus

S

equence) 11 pz.

ORC

(

O

rigin

R

eplication

C

omplex

) 6 (8) polipeptydów

28

W komórkach wyższych eukariontów nie udało się, jak dotąd wykryć sekwencji
odpowiadających ARS (miejsc inicjacji replikacji – ori)

Wiadome już, że określenie: miejsce inicjacji replikacji, w chromosomie eukariotycznym
należy zastąpić określeniem strefa inicjacyjna.

Strefa inicjacyjna

jest to odcinek DNA o długości do 10 000 pz., zlokalizowany w obszarze

międzygenowym, zawierający wiele sekwencji, w obrębie których może być inicjowana replikacja.

Replikacja w obrębie danej strefy inicjacyjnej rozpoczyna się zawsze w jednym miejscu obejmującym
odcinek DNA o długości 200 - 500 pz., choć odcinki te mogą być różne w czasie różnych rund
replikacyjnych.

Strefa inicjacyjna pozostaje pod kontrolą białek strukturalnych chromatyny działających jak represory
replikacji.
Rolę aktywatorów replikacji spelniają najprawdopodobniej białka struktur jądrowych (matriks),
wspomagane przez czynniki transkrypcyjne.
Wiadomo również, że istotną rolę w regulacji cyklu komórkowego (w tym również inicjacji replikacji
spełniają kinazy białkowe i współdziałające z nimi białka zwane cyklinami. Centralną rolę pełni
najprawdopodobniej 34 kDa kinaza cdc2

– produkt genu cdc2 (cell-division-cycle gene).

Pojawienie się specyficznych kinaz – zjawisko promujące fosforylacje różnorodnych białek może
mieć wielorakie i ważkie konsekwencje np.:

-

Fosforylacja lamin → rozpad otoczki jądrowej,

-

Fosforylacja histonu H1 → kondensacja chromatyny.

Polimerazy DNA

α

δ

ε

β

γ

Miejsce działania:

jądro

jądro

jądro

jądro

mitochondria

Funkcja:

replikacja,

synteza

starterów

replikacja

replikacja

naprawa DNA

replikacja

mitochondrial-

nego DNA

Wielkość [kDa]:

>250

170

265

40

125

Podjednostki

katalityczne:

165-180

125

215

40

125

towarzyszące: 70, 58, 48

48

55

-

35, 47

Aktywność egzonukleazy
3’→5’

brak

obecna

obecna

brak

obecna

Procesywność

niska

zależna od

PCNA

wysoka

niska

wysoka

Aktywność primazy

obecna

brak

brak

brak

brak

Wierność replikacji

wysoka

wysoka

wysoka

niska

wysoka

Polarność helikazy lub
ATPazy stymulującej
aktywność

3’→5’

5’→ 3’

3’→5’

-

-

Polimerazy DNA występujące w komórce eukariotycznej

29

Struktura domeny katalitycznej polimerazy DNA

β szczura

na podstawie analizy dyfrakcji rtg

Z. Hostomsky, La Jolla, Ca (www.mun.ca)

Ryc. z: Stryer L., Biochemia, Przekład IV wyd., PWN Warszawa 1997.

Struktura eukariotycznej polimerazy DNA

β

Struktura trzeciorzędowa enzymu przypomina polimerazę I DNA z Escherichia coli

domena 8 kDa

30

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed., Sunderland (MA)

PCNA

Polimeraza

Rola białek wspomagających replikację w komórkach ssaków

Białko RCF jest ATPazą wiążącą się w miejscu połączenia startera (RNA)
z nicią matrycy DNA. Podjednostki PCNA wiążą się z tak powstałym kompleksem.
Polimeraza DNA

δ

(

ε

?) wiąże się z kompleksem PCNA-DNA

Struktura PCNA

PCNA

(Proliferating Cell Nuclear Antigen

) jest odpowiednikiem „klamry” tworzonej

w czasie replikacji DNA Escherichia coli przez podjednostki

β jej polimerazy III DNA

Ryc. Z: Krishna T.S., Kong X.P., Gary S.,Burgers P.M., Kuriyan J., 1994,

Cell 79: 1233

31

5’

3’

5’

3’

Synteza nici wiodącej

pol. DNA

δ

(

ε

?)

Synteza nici opóźnionej

pol. DNA

ε

(

δ

?) + pol.

α

RPA

RNAza H

Ligaza I DNA

helikaza

Primaza

PCNA

RFC

Struktura replisomu w komórce eukariotycznej

Ryc. z: www.mun.ca

-

Funkcje bakteryjnych białek SSB pełnią białka RPA

-

Rolę primosomu spełnia polimeraza DNA α, z którą związane są podjednostki primazy,

-

Funkcję bakteryjnej polimerazy I DNA pełni RNAza H (wycinanie starterów),

oraz najprawdopodobniej polimeraza DNA

β (synteza uzupełniająca) – nie umieszczone

jej na rycinie,

-

Nie jest znany eukariotyczny czynnik odpowiadający z „dimeryzację” holoenzymu

(odpowiednik podjednostek

η polimerazy III DNA z E. coli.

rdzeń nukleosomu
(oktamer histonowy)

widełki replikacyjne

widełki replikacyjne

nukleosom rozwija się, tetramery histonowe
(połówki rdzenia) oddzielają się od siebie

odtwarza się struktura nukleosomu

obie połówki rdzenia pozostają związane z potomną
cząsteczką DNA, w której skład wchodzi nić wiodaca

do potomnej cząsteczki DNA zawierającej nić opóźnioną
zostaną dołączone rdzenie nukleosomów utworzone
przez histony syntetyzowane de novo

wg. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

Nukleosomy w czasie replikacji

jakkolwiek przebieg mechanizmu dysocjacji i reasocjacji nukleosomów nie został ostatecznie ustalony,

to jednak wiadomo już, że „stare” histony znajduje się po replikacji na tej potomnej cząsteczce DNA,

w której nowa nić była syntetyzowana, jako nić wiodąca.

32

5’
3’

5’

3’

5’
3’

5’

3’

5’
3’

5’

3’

5’
3’

5’

3’

Koniec liniowej cząsteczki DNA tworzącej indywidualny chromosom

REPLIKACJA

w tym końcu chromosomu, jedna z potomnych cząsteczek DNA ma krótszą nić o orientacji 5’→3’

RNA

RNA

RNA

RNA

RNA

Problem replikacji końców liniowych cząsteczek DNA

1. Przekształcenie liniowego replikonu w kolistą cząsteczkę DNA, lub w multimeryczną sekwencję

liniową (bakteriofagi T4, λ).

2. Najprostszym rozwiązaniem jest wykorzystanie grupy OH seryny białka związanego z 5' końcową

cytozyną końca liniowej cząsteczki DNA, jako miejsca dołączenia pierwszego nukleotydu w syntezie
5' → 3' nowej nici (adenowirus, bakteriofag θ29, RNA wirusa polio).

3. Wytworzenie niezwykłej struktury przestrzennej - np. pętli - struktury szpilki do włosów (hairpin).

Praktycznie oznacza to brak wolnego końca nici 3' (replikacja liniowego DNA mitochondrialnego
Paramecium).

4. Końce liniowych cząsteczek DNA mogą nie być precyzyjnie wyznaczone. Liczba kopii krótkich

sekwencji tandemowo powtórzonych w telomerach chromosomów eukariotycznych może być
zmienna.
O strukturze telomerów decyduje enzym telomeraza, co czyni replikację do samego końca 3‘ matrycy

-

zbędną.

Możliwe rozwiązania problemu replikacji końców replikonów liniowych

33

-Ser-C-OH

HO-C-Ser-

55 kDa

3’

5’

3’

5’

3’

5’

80 kDa

3’

3’

3’

5’

5’

5’

3’

5’

5’

55 kDa

80 kDa

25 kDa

białko 55 kDa

25 kDa

białko 80 kDa
ATP, dNTP,

polimeraza DNA
Czynniki komórkowe NF I, NF II, NF III
helikaza, topoizomeraza

Replikacja liniowych cząsteczek DNA genomu adenowirusa

DNA

Telomeraza

matrycowa cząsteczka
RNA

– element

telomerazy

dołączane deoksynukleotydy są
komplementarne do matrycowej
cząsteczki RNA telomerazy

Ryc. z: Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M. (1999)

Introduction to Genetic Analysis. 7th ed., W. H. Freeman & Co, New York.

Częścią telomerazy jest krótka cząsteczka RNA funkcjonująca, jako matryca

w procesie wydłużania końca 3’ podwójnej helisy DNA.

Powtórzenia TTGGGG są charakterystyczne dla Tetrahymena

34

telomeraza

RNA telomerazy

na matrycy jest RNA telomerazy
zachodzi odwrotna transkrypcja
– dołączanie deoksynukleotydów
do końca nici wiodącej

Proces ten jest powtarzany wielokrotnie
co prowadzi do wydłużenia końca 3’ przez
dodawanie tandemowych powtórzeń sekwencji
telomerowych. Kiedy długość dodanej sekwencji
umożliwi inicjację fragmentu Okazaki, nastąpi
wydłużenie nici opóźnionej (koniec 5’ chromosomu)

synteza nici opóźnionej DNA nie może być
kontynuowana przy końcu chromosomu

Synteza telomerów

Sekwencje tandemowych powtórzeń tworzących telomery

różnych gatunków organizmów

Tetrahymena, Paramecium CCCCAA

Stylonychia, Oxytrichia

CCCCAAAA

Trypanosoma

CCCCTA

Saccharomyces

C

2-3

A(CA)

1-3

Arabidopsis

CCCTAAA

Homo sapiens

CCCTAAA

5’ → 3’

35

Telomeraza wydłuża wystający koniec 3’

Nowy DNA

Gdy nowy fragment cząsteczki ma wystarczająca długość,
może zostać zainicjowana synteza nowego fragmentu Okazaki

starter

fragment Okazaki

5’
3’

3’
5’

5’

3’

3’
5’

5’

3’

3’
5’

Telomeraza zabezpiecza liniowy chromosom przed skracaniem

podczas kolejnych rund replikacyjnych

Telomeraza wydłuża wystający koniec 3’

Nowy DNA

Gdy nowy fragment cząsteczki ma wystarczająca długość,
może zostać zainicjowana synteza nowego fragmentu Okazaki

starter

fragment Okazaki

5’
3’

3’
5’

5’

3’

3’
5’

5’

3’

3’
5’

Telomeraza zabezpiecza liniowy chromosom przed skracaniem

podczas kolejnych rund replikacyjnych

36

Transkrypcja

Proces enzymatycznej syntezy RNA na matrycy DNA

►

Inicjacja procesu transkrypcji zachodzi w ściśle określonych regionach cząsteczki DNA

zwanych promotorami

►

Inicjacja transkrypcji jest etapem o najważniejszym znaczeniu dla regulacji ekspresji

informacji genetycznej

►

Regulacja procesu transkrypcji zachodzi zasadniczo na etapie jej inicjacji

znamy przypadki regulacji na drodze przedwczesnej terminacji transkrypcji)

►

Transkrypcja jest katalizowana przez polimerazy RNA

►

Substratami dla syntezy RNA są trifosforany nukleozydów (ATP, UTP, GTP i CTP)

►

Dołączenie pierwszego nukleotydu RNA nie wymaga obecności startera

►

Matrycą dla syntezy RNA jest zwykle tylko jedna nić DNA (znane są stosunkowo

nieliczne wyjątki od tej reguły)

Promotor

Element regulatorowy genu

– sekwencja nie ulegająca transkrypcji lecz decydująca

o jej inicjacji. Zawiera miejsca wiązania polimerazy RNA i czynników transkrypcyjnych.

5’

GGTAAGCGCCAGTCACCTAGTAGATGACATCCA

3’

3’ CCATTCGCGGTCAGTGGATCATCTACTGTAGGT 5’

5’

GGUAAGCGCCAGUCACCUAGUAGAUGACAUCCA

3’

nić kodująca DNA (lub nić +)

nić matrycowa DNA (lub nić -)

transkrypt - RNA

TRANSKRYPCJA

Nazewnictwo nici w ulegającym transkrypcji odcinku DNA

37

5’
3’

3’
5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

3’

5’

DNA

RNA

RNA

RNA

RNA

RNA

W różnych regionach cząsteczki DNA dana nić może być nicią kodującą (+) lub matrycową (-)

Informacja genetyczna przenoszona przez DNA adenowirusa jest kodowana

przez obie nici jego genomu (36 kpz.)

Ten sam fragment danej nici DNA może być w różnym czasie nicią kodującą lub matrycową

38

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Przebieg reakcji dołączani nukleotydu w procesie transkrypcji

zaznaczono rolę Asp460, Asp462 i Asp464 podjednostki β polimerazy RNA
Escherichia coli. Jeden jon Mg

2+

wspomaga atak nukleofilowy 3’OH,

drugi ułatwia odłączenie pirofosforanu

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

RNA

(transkrypt)

hybryd DNA-RNA

miejsce aktywne

kanał NTP

nić matrycowa

nić kodująca

skręcanie DNA

rozkręcanie DNA

kierunek transkrypcji

Struktura pęcherzyka transkrypcyjnego

39

Superskręty pozytywne

Superskręty negatywne

kierunek transkrypcji

RNA

(transkrypt)

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

W czasie przemieszczania się pęcherzyka transkrypcyjnego
powstają, kompensujące się wzajemnie, superskręty DNA

Podjednostki

α, β i β' mają podobną wielkość i strukturę w komórkach różnych gatunków bakterii.

Podjednostki

ζ (czynniki ζ) są zróżnicowane.

Podjednostka

Gen kodujący
podjednostkę

Masa

cząst. [D]

Liczba

podj.

Lokalizacja

Funkcja

α

rpoA

ok. 40 000

2

rdzeń

asocjacja podjednostek

β

rpoB

ok. 155 000

1

rdzeń

wiązanie nukleotydów

β'

rpoC

ok. 160 000

1

rdzeń

wiązaniematrycy

ζ

rpoD

32 000 -
- 92 000

1

czynnik

ζ

wiązanie promotora

Struktura polimeraz RNA Eubacteria

podjednostki

α - odpowiadają za stabilność struktury czwartorzędowej polimerazy, uczestniczą

w rozpoznaniu sekwencji promotorowych,

podjednostka

β - wiąże substrat (NTP) - najprawdopodobniej obejmuje centrum katalityczne – miejsce

tworzenia wiązania fosfodiestrowego,

podjednostka

β' - wiąże nić matrycową DNA

Podjednostki

ζ - łącząc się z rdzeniem (2αββ'), tworząc holoenzym, nadaje mu zdolność rozpoznawania

i specyficznego wiązania się z sekwencjami promotorowymi.

α

σ

α

β’

β

40

α

β’

σ

ω

β

α

Struktura przestrzenna holoenzymu polimerazy RNA z Thermus aquaticus

jest bardzo podobna do struktury polimerazy RNA Escherichia coli

podjednostka

β

podjednostka

β’

podjednostki

α

podjednostka

ω

miejsce aktywne

Struktura rdzenia polimerazy RNA z Thermus aquaticus

Miejsce aktywne może pomieścić 16 pz. DNA

41

α

α

β

β’

σ

α

α

β

β’

σ

α

α

β

β’

σ

σ

promotor

10

4

razy

10

3

razy

ok.

10

7

razy

T

1/2

= ok. 60 min.

T

1/2

= ok. 1 sekunda

T

1/2

– kilka godzin

Podjednostka

ζ

bakteryjnej polimerazy RNA decyduje o specyficzności wiązania

holoenzymu do sekwencji promotorowej

Sekwencja konsensusowa

lac

trp

araBAD

recA

rrnB P1

+1

region -10

region -35

element UP

T

80

A

95

t

45

A

60

a

50

T

96

T

82

T

84

G

78

A

65

C

54

a

45

region -10
sekwencja Pribnowa
Pribnow box

sekwencja -35

Struktura niektórych promotorów Escherichia coli rozpoznawanych

przez polimerazę RNA z podjednostka ζ

70

42

Zdolność polimerazy RNA z Eschrerichia coli do inicjowania transkrypcji w promotorach, o różnych
sekwencjach regionów – 10 i – 35 wskazuje na relatywnie niską specyficzność enzymu (jeżeli przyjąć
za punkt odniesienia np. specyficzność endonukleaz restrykcyjnych).

Jednocześnie obserwuje się zróżnicowaną wydajność transkrypcji genów pozostających pod kontrolą
różnych promotorów. W zależności od względnej częstości inicjacji transkrypcji zachodzących w ich obrębie,
promotory dzielimy na „silne” i „słabe”.
Wydajność transkrypcji kontrolowanej przez różne promotory zależy od powinowactwa polimerazy RNA
do ich sekwencji.

Dowodem na fundamentalną rolę sekwencji elementów – 10 i – 35 w wyznaczaniu aktywności promotora
mogą być doświadczenia polegające na wymianie nukleotydów – wprowadzaniu mutacji do tych
fragmentów DNA

region

– 10

region

– 35

TATAAT

TTGACA

17

± 1 pz.

TATGTT

TTTACA

AA

→ wzmocnienie promotora

sekwencja konsensusowa promotorów

σ

70

sekwencja słabego promotora Lac

Wiązanie polimerazy

Inicjacja

kompleks zamknięty

kompleks otwarty

Inicjacja transkrypcji

postać elongacyjna

opuszczenie promotora

Wiązanie polimerazy i inicjacja transkrypcji w Escherichia coli

podjednostka

ζ opuszcza kompleks (holoenzym polimerazy RNA) po włączeniu pierwszych 8-9

nukleotydów. Etap elongacji jest katalizowany przez rdzeń polimerazy

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry. 4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

β

β’

α

α

43

łącząc się z rdzeniem (2αββ'), tworząc holoenzym, nadaje mu zdolność rozpoznawania i
specyficznego wiązania się z sekwencjami promotorowymi.

Określony typ podjednostki ζ jest właściwy dla danego gatunku bakterii, lecz również dla danej klasy
genów.
ζ

70

-

dominujący typ podjednostki w Escherichia coli (90% w standardowych warunkach wzrostu),

ζ

32

-

podjednostka polimerazy RNA rozpoznającej promotory genów szoku cieplnego w Escherichia coli

ζ

24

-

w połączeniu z rdzeniem enzymu warunkuje transkrypcję genów htrA i rpoH

ζ

28

-

uczestniczy w strukturze holoenzymu polimerazy RNA prowadzącego transkrypcję genów

odpowiedzialnych za powstawanie rzęsek i chemotaksje

ζ

54

-

występuje w polimerazach Escherichia coli i Salmonella typhimurium tworząc holoenzym

przepisujący sekwencje genów uczestniczących w asymilacji amoniaku.
Występuje również w polimerazach prowadzących transkrypcję genów nif w Klebsiella pneumoniae,
genów vir Pseudomonas syringae, oraz genów metabolizmu wodoru w komórkach Alcaligenes
eutrophus

ζ

43

-

podstawowy typ podjednostki w komórkach Bacillus subtilis w fazie wegetatywnej wzrostu kultury

ζ

26

-

podjednostka rozpoznająca promotory genów ulegalących transkrypcji w okresie pośrednim

ζ

13,24

-

podjednostka uczestnicząca w inicjacji transkrypcji z promotorów genów późnych Bacillus subtilis

(okres sporulacji)

Wszystkie wymienione powyżej typy podjednostek zawierają regiony o budowie homologicznej (ζ

70

i

ζ

43

mają ich cztery, mniejsze - trzy lub mniej).
Podjednostka

ζ

54

ma budowę całkowicie odmienną.

Podjednostki

ζ

prokariotycznych polimeraz RNA

Gen kodujący

podjedn.

ζ

Podjednostka

sekwencja

-35

sekwencja

-27

fragm.

oddz.

sekwencja

-10

rpoD

ζ

70

(

ζ

D

)

TTGACA

-

N

17

TATAAT

rpoH (htpD)

ζ

32

(

ζ

H

)

TNTCNCCCTTGAA

-

N

13-15

CCCCATTTA

rpoE

ζ

24

(ζ

E

)

GAACTT

-

N

16

TCTGA

rpoF (flaI ?)

ζ

28

(ζ

F

)

TAAA

-

N

15

GCCGATAA

rpoS (katF)

ζ (ζ

S

)

CTGCAA

-

N

16-20

CGGCNAGTA

rpoN (glnF, ntrA)

ζ

54

(ζ

N

)

-

CTGGYAYR

N

4

TTGCA

N - nukleotyd dowolny; Y - nukleotyd pirymidynowy; R - nukleotyd purynowy
W komórce Escherichia coli występuje około 7000 cząsteczek polimerazy RNA.
Z tego 2 000 -

5 000 jest zaangażowanych w procesie transkrypcji.

Porównanie struktury promotorów Escherichia coli rozpoznawanych

przez polimerazy RNA związane z różnymi podjednostkami ζ

44

Porównanie wielkości, struktury i właściwości polimerazy RNA z Escherichia coli

i polimerazy RNA bakteriofaga T7

Dlaczego duży, multimeryczny kompleks enzymatyczny jest wykorzystywany w reakcji,

którą z większą szybkością może katalizować pięciokrotnie mniejszy enzym monomeryczny?

1.

Polimerazy fagowe (np. T7, T3) wykazują specyficzność wyłącznie w stosunku do kilku promotorów
fagowych. Ich aktywność praktycznie nie podlega regulacji.

2. Polimeraza RNA z E. coli

rozpoznaje w sposób specyficzny różnorodne promotory co najmniej

1000 jednostek transkrypcyjnych.

3.

Rozpoznanie niektórych z nich wymaga udziału specyficznych podjednostek ζ lub dodatkowych
czynników białkowych.

4. Polimeraza RNA z E. coli

może współdziałać z induktorami i represorami.

Złożoność strukturalna polimerazy RNA z E. coli jest niezbędna dla jej oddziaływać z licznymi
czynnikami regulatorowymi, a nie dla realizacji jej funkcji katalitycznej - biosyntezy RNA!

Polimeraza RNA z Escherichia coli
Pięć polipeptydów (2αββ’ζ) – łącznie ok 480 kDa
Szybkość polimeryzacji RNA - 40-50 nukleotydów/s

α

α

β

β’

σ

Polimeraza RNA bakteriofaga T7
Jeden polipeptyd

– ok. 100 kDa

Szybkość polimeryzacji RNA - ok. 200 nukleotydów/s

W komórkach prokariontów procesy transkrypcji i translacji zachodzą w tym samym czasie

Promotor

podjednostka

ζ

Terminator

białka

mRNA

podjednostki
rybosomalne

holoenzym
polimerazy RNA

rdzeń polimerazy RNA

mRNA

fot. Oscar Miller

45

Terminacja transkrypcji u Escherichia coli

Terminacja transkrypcji polega na uwolnieniu powstającego transkryptu z hybrydu: RNA – nić matrycowa DNA,
w obrębie rdzenia polimerazy RNA.
Polimeraza zatrzymuje się przejściowo po napotkaniu niektórych sekwencji DNA.
W przypadku, gdy sekwencje te wykazują pewne określone cechy, transkrypcja nie może być kontynuowana –
następuje jej terminacja.

W Escherichia coli

znane są dwa typy sekwencji terminujących – terminatorów:

1. Terminatory niezależne od białka rho (

ρ

).

Są to palindromowe sekwencje (15-25 pz.) bogate w pary G-C, za którymi wystepują, co najmniej
3 (często 6) nukleotydy adenylowe (na nici matrycowej DNA).
Powstający w rezultacie ich transkrypcji RNA tworzy strukturę typu spinki do włosów (hairpin), za którą
występują powtórzenia nukleotydów urydylowych (oligoU). Spośród wszystkich hybrydów DNA-RNA
hybryd składający się z par rU-dA wymaga najmniejszej energii rozdzielenia nici.

2. Sekwencje rut (rho utilization).

Są to sekwencje bogate w CA (w obrębie powstającego transkryptu RNA) a ubogie w G, co uniemożliwia
tworzenie struktur drugorzędowych. Nie określa się sekwencji zgodnej miejsca rut – sekwencje te
nie wykazują podobieństwa.
Z sekwencjami rut

zlokalizowanymi w obrębie jednoniciowych fragmentow DNA wiąże sie białko

ρ

(rho).

3’

5’

struktura drugorzędowa
typu spinki do włosów
(hairpin) RNA

sekwencja palindromowa

RNA

DNA

3’

5’

3’

5’

3’

5’

Powstawanie struktury drugorzędowej RNA typu spinki do włosów (hairpin)

Przykład z: Horton H.R., Moran L.A., Ochs R.S., Rawn D.J., K Gray Scrimgeour K.G, 2003, Principles of Biochemistry ,

Pearson Higher Education; Prentice-Hall, Inc. ISBN: 0130926434

46

Zatrzymanie
polimerazy RNA

Izomeryzacja kompleksu

Terminacja transkrypcji

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Model niezależnej od

ρ

terminacji transkrypcji genów prokariotycznych

5’

3’

Terminator transkrypcji

Struktura typu spinki
do włosów (hairpin)
bogata w pary GC

powtórzenie co najmniej
3 nukleotydów U

Białko

ρ

ppp

5’

polimeraza RNA

ADP + PPi

ATP

Terminacja transkrypcji z udziałem białka

ρ

w Escherichia coli

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002), Biochemistry.

5ed., W.H. Freeman and Co., New York

47

Białko

ρ

(rho)

► Funkcjonuje jako heksamer – zbudowane jest z sześciu identycznych podjednostek

► Specyficznie wiąże się z jednoniciowym RNA

► W obecności jednoniciowego RNA (lecz nie dwuniciowego, lub hybrydu DNA-RNA)

wykazuje aktywność ATP-azy

białko

ρ

RNA

odcinek RNA
długości 72 nt.

miejsca wiązania

ρ

- sekwencje rut (rho-utilization)

Inicjacja

Terminacja bez udziału

ρ

RNA

(transkrypty)

matryca DNA

brak

ρ

→ transkrypt 23S

5’

3’

ρ

obecny od początku transkrypcji → transkrypt 10S

ρ

dodany po 30 sekundach

→ transkrypt 13S

ρ

dodany po 2 minutach

→ transkrypt 17S

5’

3’

5’

3’

5’

3’

Przykład z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002), Biochemistry,

5th ed., W.H. Freeman and Co., New York

Dowód doświadczalny na istnienie dwóch typów terminatorów transkrypcji

w obrębie genów prokariotycznych

Transkrypcję in vitro prowadzono w nieobecności białka

ρ

lub dodając je

w różnym czasie od rozpoczęcia reakcjijej inicjacji