BKNB 1213 04

background image

1

5’

Aktywator

Polimeraza RNA

DNA

Promotor Gen

Ligand

mRNA

5’

Ligand

Represor

Ligand

5’

Aktywator

Represor

Ligand

Represor
uniemożliwia
transkrypcję

Aktywator po przyłączeniu
ligandu stymuluje
transkrypcję

Aktywator stymuluje transkrypcję;

W nieobecności ligandu represor

nie wiąże sie z DNA

Represja zachodzi wyłącznie
w obecności ligandu (korepresora)

Dołączenie ligandu
(induktora) inaktywuje
represor i umożliwia transkrypcję

Po przyłączeniu ligandu
aktywator traci
aktywność

Ryc. z: Horton H.R., Moran L.A., Ochs R.S., Rawn D.J., K Gray Scrimgeour K.G, 2003, Principles of Biochemistry ,

Pearson Higher Education; Prentice-Hall, Inc. ISBN: 0130926434

Nagroda Nobla

1965

w Dziedzinie Fizjologii i Medycyny

Fran

çois Jacob

Jacques Monod

Andr

é Lwoff

Instytut Pasteura, Paryż

Zespół składający się z bakteryjnych genów strukturalnych kontrolowanych przez wspólne
elementy regulatorowe (promotor, operator) i czynnik regulatorowy (represor lub aktywator)
kodowany przez swoisty dla danego operonu gen regulatorowy.
Geny strukturalne zorganizowane w dany operon kodują z reguły enzymy zaangażowane w
realizację skoordynowanych reakcji (szlaku metabolicznego).

Operon

background image

2

operator (O

1

)

ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC

-10

miejsce wiązania

białka CAP

region wiązania polimerazy RNA

-35

P

lac

operon lac

lacZ

lacA

lacY

lacI

t

O

2

O

1

P

I

52

pz.

64

pz.

Struktura operonu laktozowego Escherichia coli

lacI

– represor

lacZ

– β-galaktozydaza

lacY

– permeaza laktozy

lacA

– transacetylaza

poz.

– 84

Region DNA oddziałujący z represorem i w ten sposób kontrolujący ekspresję przyległego
genu lub grupy genów. Operator jest zwykle jednym z elementów regulatorowych operonu.

Operator

W operonie laktozowym występują trzy potencjalne miejsca wiązania represora – operatory
w pozycjach:

– 82

,

+ 11

(O

1

) i

+ 412

(O

2

).

Do zablokowania transkrypcji wystarczy przyłączenie się dimeru represora do operatora + 11 (O

1

)

background image

3

Struktura dimeru represora lac z Escherichia coli

Represor lac z Escherichia coli wiąże się z sekwencją operatora w postaci dimeru.
Może tworzyć tetramery wiążąc jednocześnie dwie sekwencje operatorowe

Białko o c. cząst. ok 37 kDa – produkt genu lacI

W dzikich szczepach E. coli występuje w liczbie ok. 10 cząsteczek na komórkę
(co stanowi 0,001% wszystkich białek E. coli).

Z operatorem wiąże się 4 x 10

6

silniej niż z innymi sekwencjami DNA.

Stała dysocjacji kompleksu represor-operator wynosi 10

-13

M

IPTG

(izopropylo-

β-tiogalaktozyd)

allolaktoza

β-galaktozydaza

laktoza

glukoza

galaktoza

silnym, syntetycznym, nie ulegającym
metabolizmowi induktorem jest IPTG

Rozkład laktozy w komórkach Escherichia coli

allolaktoza jest induktorem operonu lac,

słabszym induktorem

jest również laktoza

background image

4

Ryc. z: Horton H.R., Moran L.A., Ochs R.S., Rawn D.J., K Gray Scrimgeour K.G, 2003, Principles of Biochemistry ,

Pearson Higher Education; Prentice-Hall, Inc. ISBN: 0130926434

represor lac

O

1

O

2

Promotor

Polimeraza RNA

Wiązanie tetrameru represora lac z Escherichia coli
do operatorów O

1

i O

2

w nieobecności laktozy

Tworzenie pętli DNA przez jednoczesne wiązanie sie
represora do dwóch operatorów odległych o 535 pz.
zastosowano syntetyczny fragment DNA

Wydajna transkrypcja operonu laktozowego zachodzi jedynie w sytuacji,

gdy w komórce stężenie laktozy jest wysokie, zaś stężenie glukozy jest niskie

(w wyniku czego wzrasta stężenie cAMP)

Regulacja operonu laktozowego

rodzaj cukru w pożywce

relatywny poziom ekspresji

β-galaktozydazy

glukoza

1

glukoza

+

laktoza

50

laktoza

2500

background image

5

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Transkrypcja jest zablokowana

Laktoza

(allolaktoza)

Represor
nieaktywny

Represor

3’

5’

mRNA lac

3’

5’

3’

5’

3’

5’

I

I

O

P

Z

Y

A

O

P

Z

Y

A

Niski poziom glukozy

cyklaza

adenylowa

P

O

Z

O aktywności operonu laktozowego
decyduje stężenie laktozy....

.... i glukozy

Homodimer (2 x 22 kDa), którego podjednostki zawierają domenę wiążącą DNA, oraz miejsce
wiązania cAMP.
Białko CAP może wiązać się ze specyficznymi odcinkami DNA tylko wówczas, jeżeli przedtem
przyłączy cząsteczkę

cAMP

.

Kompleks cAMP-

CAP może powodować 50 krotne zwiększenie wydajności transkrypcji.

Białko CAP (catabolite gene activator protein)

zwane również: CRP (cAMP receptor protein)

cAMP

background image

6

Holoenzym polimerazy RNA

dimer CAP-cAMP

dimer CAP-cAMP

Promotor

Promotor

Wiązanie dimeru białka CAP w pobliżu promotora wspomaga tworzenie się

inicjacyjnego kompleksu otwartego a w konsekwencji zwiększa wydajność transkrypcji

inicjowanej przez np. słaby promotor lac

Represja kataboliczna

Represją kataboliczna nazywamy hamujący wpływ glukozy, jako najefektywniejszego substratu
energetycznego, na katabolizm innych cukrowców.
Obecność glukozy w środowisku powoduje obniżenie stężenia enzymów katabolicznych (np. β-
galaktozydaza, galaktokinaza, izomeraza arabinozowa, tryptofanaza) w komórkach Escherichia coli
.
Sygnałem molekularnym wysokiego stężenia glukozy jest obniżenie stężenia cAMP.
Poziom cAMP wpływa na ekspresję niektórych genów za pośrednictwem białka CAP

Regulonem nazywamy zespół operonów wykorzystujących wspólny mechanizm regulujący ich
ekspresję.
Regulonem jest np. grupa operonów katabolicznych regulowanych przez białko CAP i cAMP.
Operony danego regulonu nie muszą być (i najczęściej nie są) powiązane strukturalnie – mogą być
zlokalizowane w różnych regionach chromosomu bakteryjnego

Regulon

background image

7

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E., 1999,

Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

cAMP-CAP

polimeraza RNA

podjednostka

α

region regulatorowy
operonu laktozowego

miejsce

CAP

miejsce

polimerazy

– 84

– 50

+ 1

Jednoczesne kooperatywne wiązanie białka CAP i polimerazy RNA ze specyficznymi

sekwencjami w obrębie regionu regulatorowego zwiększa wydajność inicjacji transkrypcji

operator (O

1

)

ATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACAC

-10

miejsce wiązania

białka CAP

region wiązania polimerazy RNA

-35

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E., 1999,

Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

białko CAP

Promotor

kompleks
induktor-represor

cAMP

Laktoza
(induktor)

Operator

Represor

białko CAP

Glukoza obecna (mało cAMP); brak laktozy

Glukoza obecna (mało cAMP); laktoza obecna

Brak glukozy (dużo cAMP); laktoza obecna

niska wydajność transkrypcji mRNA lac

wydajna transkrypcja mRNA lac

background image

8

Struktura operonu arabinozowego

Ryc. z: Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

kinaza

izomeraza

epimeraza

L-arabinoza L-rybuloza L-rybulozo-5-fosforan D-ksylulozo-5-fosforan

Regulacja operonu arabinozowego

Ryc. z: Lehninger A. L., Nelson D. L., Cox M. M., 1993,

Principles of Biochemistry, 2nd Ed. Worth Publ.Inc.

background image

9

Funkcje białek kodowanych przez poszczególne geny operonu trp

z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Represor
aktywny

Tryptofan
(korepresor)

Represor
nieaktywny

trpR

trpA

trpB

trpC

trpD

trpE

P O

Att

L

RNA po atenuacji

kompletny mRNA operonu trp

mało tryptofanu

dużo tryptofanu

5’
3’

3’
5’

Regulacja operonu trp

przez represję

background image

10

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P.,

Baltimore D., Darnell J. E., 1999, Molecular Cell
Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of

Biochemistry. 4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Struktura dimeru represora trp

związanego (w obecności tryptofanu)

z operatorem operonu tryptofanowego

tryptofan

DNA regionu
operatora trp

koniec odcinka liderowego mRNA

miejsce atenuacji

Białko TrpE

Peptyd liderowy

Parowanie regionów 3 i 4

przy wysokim stężeniu tryptofanu

ATENUATOR

Elementy zaangażowane w proces atenuacji

operonu trp

Parowanie regionów 2 i 3
przy niskim stężeniu tryptofanu

wg. Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

background image

11

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Rybosom

Rybosom

Atenuator

1

2

3

4

RNA

1

2

3

4

1

2

3

4

1

2

3

4

RNA

Rybosom przemieszcza się
bez przeskód i wchodzi na
region 2

Niskie stężenie tryptofanu

Wysokie stężenie tryptofanu

Rybosom zatrzymuje się
w regionie 1 zawierającym
dwa następujące po sobie
kodony Trp

Regulacja operonu trp

przez atenuację

Zjawisko kontrolowanej, przedwczesnej terminacji transkrypcji wywołane obecnością warunkowego
terminatora

– atenuatora zlokalizowanego zwykle pomiędzy operatorem a pierwszym genem strukturalnym

operonu.
Dla zajścia atenuacji niezbędna jest translacja odcinka liderowego mRNA (obejmującego atenuator). W
zależności od jej przebiegu powstaje, lub nie powstaje drugorzędowa struktura mRNA blokująca dalszą
transkrypcję.
Zjawisko atenuacji jako mechanizm regulacyjny występuje w przypadku operonów kodujących geny
biosyntezy aminokwasów.

Atenuacja

Efektywność regulacji przez represję - 70 x

Efektywność atenuacji 8-10 x

łączna efektywność obu mechanizmów 560 - 700 x obniżona ekspresja genów biosyntezy tryptofanu

Atenuacja jest dodatkowym mechanizmem regulatorowym
uzupełniającym działanie represora tryptofanowego

W przypadku niektórych operonów biosyntezy aminokwasów

atenucja jest JEDYNYM mechanizmem regulacyjnym

background image

12

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

5’

AUG AAA CGC AUU AGC ACC ACC AUU ACC ACC ACC AUC ACC AUU ACC ACA

3’

Met

Lys

Arg

Ser

Ile

Ile

Ile

Ile

Phe

Phe

Phe

Phe

Phe

Phe

Phe

5’

AUG AAA CAC AUA CCG UUU UUC UUC GCA UUC UUU UUU ACC UUC CCC UGA

3’

Met

Lys

Ile

His

Pro

Pro

Ala

Thr

Stop

His

His

His

His

His

His

His

5’

AUG ACA CGC GUU CAA UUU AAA CAC CAC CAC CAC CAC CAC CAC CCU GAC

3’

Met

Lys

Arg

Pro

Thr

Val

Gln

Phe

Asp

Sekwencje aminokwasowe peptydów liderowych i kodujące je sekwencje mRNA

niektórych operonów ulegających atenuacji:

treoninowego

fenyloalaninowego

histydynowego

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E.,

1999, Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

– 140

– 108

Enhancer

glnA

σ

54

polimeraza RNA

NtrB

NtrC

aktywne

nieaktywne

kompleks otwarty

kompleks zamknięty

ADP + P

i

ATP

zgninanie DNA

Aktywacja polimerazy RNA współdziałającej

z podjednostką σ

54

związanej z promotorem

genu glnA (syntetaza glutaminowa)

Polimeraza może wiązać się z promotorem, lecz
nie może zainicjować transkrypcji (przejść w postać
kompleksu otwartego) dopóki nie zostanie uaktywniona
przez kontakt z tetramerem białka NtrC utworzonym
w specyficznym miejscu wiązania.
Białko NtrC pozostaje nieaktywne dopóki nie zostanie
ufosforylowane przez specyficzną kinazę NtrB aktywną
wyłącznie przy niskim poziomie glutaminy

background image

13

operon

β

operon

α

operon str

operon S10

operon sps

Regulacja operonów kodujących białka rybosomalne Escherichia coli

W co najmniej 20 operonach kodujących 52 białka rybosomalne nie ma niezależnych

sygnałów startu translacji. Jeżeli brakuje rRNA, wskazane białka wiążą się z mRNA

i blokują translację – a w konsekwencji transkrypcję całego operonu.

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

czynnik odpowiedzi
ścisłej (białko RelA)

polimeraza RNA

rosnący łańcuch
polipeptydowy

Odpowiedź ścisła

– mechanizm regulacyjny uruchamiany w odpowiedzi na głód aminokwasowy

Czynnik odpowiedzi ścisłej przyłącza się do rybosomu gdy w miejscu A znajdzie się nieacylowany tRNA.

w kompleksie z rybosomem jest zdolny do syntezy ppGpp.

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

background image

14

Ryc. z: Strachan T., Read A. P., 1999, Human Molecular Genetics 2,

2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford.

Niektóre motywy strukturalne występujące w białkach wiążących DNA

helisa

α

helisa

α

helisa

α

zwrot

helisa

α

helisa

α

pętla

HLH (helix-loop-helix)
Helisa

– pętla - helisa

HTH (helix-turn- helix)
Helisa

– zwrot - helisa

Zinc finger
Palec cynkowy

Leucine zipper
Suwak leucynowy

Klasyfikacja czynników transkrypcyjnych na podstawie budowy ich domeny wiążącej DNA

Białka zawierające motyw
helisa -

skręt – helisa (HTH)

większość białek regulatorowych u bakterii,
białka homeotyczne u eukariontów

Białka zawierające motywy
palców cynkowych C

2

H

2

(zinc fingers)

TFIIIA

Zif268

SP-1

areA

GATA1

w różnych białkach stwierdzono występowanie
od 1 do 37 palców cynkowych

Białka zawierające
ugrupowania cynkowe (C

4

)

(zinc clusters)

receptory
jądrowe

Białka zawierające motyw
suwaka leucynowego

(leucine zipper)

GCN4

CREB

AP-1

Jun

Fos

zawsze występują w postaci dimerów niektóre
tworzą homodimery, inne heterodimery

background image

15

wg.: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

mniejsza bruzda

większa bruzda

większa bruzda

większa bruzda

większa bruzda

mniejsza bruzda

mniejsza bruzda

mniejsza bruzda

C G

T A

A T

G C

Grupy funkcyjne, które mogą być rozpoznawane przez białka wiążące DNA
w obszarze większej i mniejszej bruzdy zaznaczono kolorem czerwonym

T A

C G

Arginina

Glutamina
(lub asparagina)

Przykłady specyficznych oddziaływań
reszt aminokwasowych z grupami
funkcyjnymi par zasad

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Motyw Helisa

– Zwrot – Helisa (Domena HTH)

Domena HTH represora

laktozowego

Tetramer represora

laktozowego

helisy odpowiedzialne

za wiązanie DNA

helisy odpowiedzialne
za tetrameryzację represora

background image

16

Struktura dimeru represora lac z Escherichia coli

Represor lac z Escherichia coli wiąże się z sekwencją operatora w postaci dimeru.
Może tworzyć tetramery wiążąc jednocześnie dwie sekwencje operatorowe

Białko o c. cząst. ok 37 kDa – produkt genu lacI

W dzikich szczepach E. coli występuje w liczbie ok. 10 cząsteczek na komórkę
(co stanowi 0,001% wszystkich białek E. coli).

Z operatorem wiąże się 4 x 10

6

silniej niż z innymi sekwencjami DNA.

Stała dysocjacji kompleksu represor-operator wynosi 10

-13

M

Homodimer (2 x 22 kDa), którego podjednostki zawierają domenę wiążącą DNA, oraz miejsce
wiązania cAMP.
Białko CAP może wiązać się ze specyficznymi odcinkami DNA tylko wówczas, jeżeli przedtem
przyłączy cząsteczkę

cAMP

.

Kompleks cAMP-

CAP może powodować 50 krotne zwiększenie wydajności transkrypcji.

Białko CAP (catabolite gene activator protein)

zwane również: CRP (cAMP receptor protein)

cAMP

background image

17

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P.,

Baltimore D., Darnell J. E., 1999, Molecular Cell
Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of

Biochemistry. 4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Struktura dimeru represora trp

związanego (w obecności tryptofanu)

z operatorem operonu tryptofanowego

tryptofan

DNA regionu
operatora trp

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Homeodomena

zaznaczono na czerwono helisa stabilizowana przez dwie pozostałe oddziałuje z grupami funkcyjnymi
w obrębie większej bruzdy DNA.
Przedstawiona struktura jest częścią (domeną) znacznie większego białka Ultrabithorax (Ubx)
zaangażowanego w regulację rozwoju embrionalnego Drosophila

background image

18

Motyw palca cynkowego typu C

2

H

2

helisa

α

struktura

β

Ryc. z: Brown T.A., 2002, Genomes, 2nd ed. , BIOS Scientific Publishers Ltd.

fragment białka Swi5
(S. cerevisiae)

trzy palce cynkowe (kolor szary)

– fragment białka regulatorowego Zif268

Zn

2+

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Palce cynkowe

Zinc fingers

background image

19

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Struktura typowego receptora hormonów steroidowych

Zawiera motywy palców cynkowych typu C

4

(zwanych czasem „ugrupowaniami cynkowymi” – zinc clusters)

region wiązania DNA

(wysoce zachowawczy)

domena wiążąca hormon

(zmienna)

domena aktywująca

transkrypcję (zmienna)

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002), Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Region

wiązania DNA

domena wiążąca hormon

ligand

Struktura domenowa jądrowego receptora hormonów

przedstawiono strukturę monomeru, choć regułą jest dimeryczna struktura receptorów tego typu

background image

20

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E., 1999,

Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

Przykłady białek zawierających motywy palców cynkowych

palec 2

palec 3

palec 1

palec 4

palec 5

Monomeryczne bialko GL1 (H. sapiens) zawiera

pięć motywów palców cynkowych typu C

2

H

2

Receptor glukokortykoidów – homodimeryczne

bialko zawierające palce cynkowe typu C

4

Ssaki

Drożdże

sekwencja

konsensusowa

Region wiążący DNA

Suwak leucynowy

Łącznik
(6 aa.)

Asparagina

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Motyw suwaka leucynowego (leucine zipper)

Suwak leucynowy

fragment białka GCN4 (helisy
tworzące suwak leucynowy)

background image

21

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Motyw Helisa

– Pętla – Helisa (HLH)

(helix-loop-helix)

Leu

Leu

Dimer czynnika transkrypcyjnego Max (H. sapiens)

– jedną z podjednostek

zaznaczono kolorem, druga jest szara

Polimerazy RNA organizmów eukariotycznych

Polimeraza I

transkrypcja: 5,8S rRNA, 18S rRNA,
28S rRNA

niewrażliwa na α-amanitynę

Polimeraza II

transkrypcja: mRNA, większość snRNA wrażliwa na α-amanitynę

Polimeraza III

transkrypcja: 5S rRNA, tRNA, U6
snRNA, snoRNA scRNA np.(7SL RNA)

wrażliwa na podwyższone
stężenie α-amanityny

background image

22

UCE

Polimeraza I RNA

Polimeraza II RNA

Polimeraza III RNA (5S rRNA)

Promotor wewnętrzny

– 45 + 20

– 25 Inr

elementy kontrolujące

Porównanie struktury promotorów rozpoznawanych przez eukariotyczne polimerazy RNA

Polimerazy RNA organizmów eukariotycznych

Polimeraza I

transkrypcja: 5,8S rRNA, 18S rRNA,
28S rRNA

niewrażliwa na α-amanitynę

Polimeraza II

transkrypcja: mRNA, większość snRNA wrażliwa na α-amanitynę

Polimeraza III

transkrypcja: 5S rRNA, tRNA, U6
snRNA, snoRNA scRNA np.(7SL RNA)

wrażliwa na podwyższone
stężenie α-amanityny

background image

23

UCE

Polimeraza I RNA

Polimeraza II RNA

Polimeraza III RNA (5S rRNA)

Promotor wewnętrzny

– 45 + 20

– 25 Inr

elementy kontrolujące

Porównanie struktury promotorów rozpoznawanych przez eukariotyczne polimerazy RNA

Geny kodujące białka regulujące ekspresję innych genów nazywamy genami
regulatorowymi
lub regulatorami.

Białkowe produkty ich ekspresji to czynniki transkrypcyjne - induktory lub represory, ogólnie
nazywane

czynnikami działającymi w układzie trans (trans - acting factors).

Fragment DNA nie kodujący żadnego produktu, lecz wpływający na ekspresję innej sekwencji
DNA (genu), z którym jest fizycznie powiązany (jest elementem tej samej cząsteczki DNA co
gen) nazywamy

sekwencją regulatorową lub elementem działającym w układzie cis (cis -

acting element).

Przykładami elementów działających w układzie cis promotory i terminatory transkrypcji.
Czynniki działające w układzie trans (białka) działają przez wiązanie się z elementami cis
(sekwencje DNA)

Geny kodujące polipeptydy lub stabilne cząsteczki RNA (np. tRNA, rRNA)

GENY REGULATOROWE, CZYNNIKI trans, ELEMENTY cis

GENY STRUKTURALNE

background image

24

GENY ULEGAJĄCE EKSPRESJI

W SPOSÓB CIĄŁY

(konstytutywny)

GENY, KTÓRYCH EKSPRESJA JEST REGULOWANA

Geny indukowane

Geny ulegające represji

Produkty ich ekspresji są niezbędne dla
funkcjonowania

każdej komórki

danego organizmu

Produkty ich ekspresji są niezbędne
tylko w niektórych typach komórek,
lub tylko w pewnych warunkach

Produkty ich ekspresji są niezbędne
tylko w niektórych typach komórek,
lub tylko w pewnych warunkach

Transkrypcja może zostać włączona
pod wpływem aktywatorów
oddziałujących z sygnałami
molekularnymi.

Transkrypcja może zostać wyłączona
pod wpływem represorów. Włączenie
transkrypcji wymaga usunięcia
represora.

Sygnał molekularny może powodować
w pewnych wypadkach dołączenie
aktywatora, w innych jego dysocjację

Sygnał molekularny może powodować
w pewnych wypadkach dołączenie
represora, w innych jego dysocjację

Kodują (na przykład):

Kodują (na przykład):

Kodują (na przykład):

białka rybosomalne, enzymy cyklu
Krebsa i innych przemian
metabolicznych o podstawowym
znaczeniu

białka naprawiające uszkodzenia DNA,
białka specyficzne dla danego typu
typu komórek, itp.

enzymy biosyntezy tryptofanu u bakterii

W komórkach eukariontów ich
promotory

nie zawierają sekwencji

TATA; dla ich transkrypcji zasadniczo
wystarcza obecność sekwencji bogatej
w pary GC wiążącej czynnik
transkrypcyjny SP1

Klasa obejmuje większość genów
eukariotycznych. Ich promotory
zawierają sekwencję TATA oraz
różnorodne sekwencje regulatorowe
wiążące różne czynniki transkrypcyjne.
Sekwencje regulatorowe mogą być
zlokalizowane również poza regionem
promotorowym, często w znacznej
odległości od miejsca startu
transkrypcji.

Klasyfikacja genów danego organizmu pod względem regulacji ich ekspresji

Porównanie mechanizmów odpowiedzialnych za regulację ekspresji genów

Organizmy prokariotyczne

Organizmy eukariotyczne

Holoenzym polimerazy RNA jest zdolny do
rozplecenia podwójnej helisy DNA w miejscu
startu transkrypcji (przejścia od kompleksu
promotorowego zamkniętego do kompleksu
promotorowego otwartego)

Polimerazy RNA

nie są zdolne do transkrybowania

DNA bez udziału dodatkowych czynników białkowych.
Z miejsca startu transkrypcji muszą zostać usunięte
nukleosomy

Geny eukariotyczne są w większości nieaktywne,
dopóki nie zostaną włączone
w swoisty dla siebie
sposób

Ekspresja genu może być skutecznie
kontrolowana przez jedno, lub dwa

białka

regulatorowe

Większość genów jest kontrolowana przez liczne
białka, wiążące się do kilku sekwencji regulatorowych i
tworzące między sobą kombinatoryczne połączenia

Geny są zorganizowane w kilkugenowe jednostki
podlegające wspólnej regulacji (operony)
transkrybowane w postaci policistronowego

mRNA

kodującego kilka białek.

Pojedynczy sygnał molekularny może włączać
lub wyłączać jednocześnie wszystkie geny
wchodzące w skład danego operonu.

Geny

nie są zorganizowane w zespoły podlegające

wspólnemu elementowi regulatorowemu.
Monocistronowość eukariotycznego mRNA
wymusza indywidualną regulację każdego genu
strukturalnego.
Dany sygnał molekularny może włączać zestawy
genów, o ile sekwencje regulatorowe, podlegające
aktywowaniu przez ten sygnał, występują w każdym
z elementów tego zestawu.

background image

25

ETAP II

Dołączenie czynników transkrypcyjnych

i inicjacja transkrypcji genu

ETAP I

Zmiana struktury

chromatyny

RNA

kompleks białek
inicjujących
transkrypcję

polimeraza RNA

Główne etapy regulacji ekspresji genów organizmów eukariotycznych

sekwencja rDNA ulegająca

transkrypcji

sekwencja międzygenowa

(nie ulega transkrypcji)

– NTS

28S

ITS1 ITS2

18S

5,8S

ETS

20S

45S

32S

DNA

18S

Transkrypt
pierwotny

41S

5,8S

28S

A

– D – miejsca cięcia prekursora przez

specyficzne endonukleazy

Ryc. z: Strachan T., Read A. P., 1999, Human Molecular Genetics 2,

2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford.

ok. 40 kpz.

background image

26

Liczba kopii genów rRNA i tRNA w genomach różnych organizmów eukariotycznych

Gatunek

Geny 18S/5,8S/28S

rRNA

Geny 5S

rRNA

Geny tRNA

Drożdże (S. cerevisiae)

140

140

250

Dictyostelium discoideum

180

180

?

Drosophila melanogaster

(X)

(Y)

250

150

165

850

Człowiek

280

2 000

1 300

Xenopus laevis

450

24 000

1 150

Dla porównania: W komórkach Escherichia coli jest 7 kopii zespołu genów kodujących prekursory
5S-16S-

23S rRNA, oraz 60 kopii genów tRNA.

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII, Oxford University Press

NTS

rRNA

fot. Oscar Miller

Mikrofotografia elektronowa ulegających transkrypcji tandemowych powtórzeń rDNA

background image

27

Mikrofotografia elektronowa jąderka Notopthalmus viridescens (Amphibia)

fot. Oscar Miller

granularna „kora” jąderka – obszar, w którym
powstają podjednostki rybosomalne

rdzeń jąderka – obszar, w którym
zachodzi transkrypcja rDNA

Ryc. z: Lewin B., (2000), GenesVII, Oxford University Press

CPE

UCE

związanie czynników UBF i SL1

umożliwia przyłączenie
polimerazy I RNA

Polimeraza I RNA

UCE

– upstream control element

CPE

– core promotor element

SL1

– selectivity factor 1

UBF

– upstream binding factor

Ryc. z: Strachan T., Read A. P., 1999, Human Molecular Genetics 2,

2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford.

Struktura promotora rozpoznawanego
przez polimerazę I RNA

background image

28

polimeraza III RNA

Promotory genów 5S rRNA i tRNA (rozpoznawane przez polimerazę III RNA)

są zlokalizowane w obrębie sekwencji kodującej

Inicjacja transkrypcji genu tRNA

Promotory genów 5S rRNA

Promotory genów tRNA

TFIIIC, TFIIIB, polimeraza III RNA

TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC, polimeraza III RNA

Ryc. z: Strachan T., Read A. P., 1999, Human Molecular Genetics 2,

2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford.

+1

– 30

3’

5’

Różne sekwencje

regulatorowe

sekwencja TATA

(kaseta TATA

– TATA box)

Inr

Topografia promotorów genów transkrybowanych przez polimerazę II RNA

organizmów eukariotycznych

background image

29

Ryc. z: Strachan T., Read A. P., 1999, Human Molecular Genetics 2,

2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford.

rdzeń promotora

region proksymalny

promotora

– 200 do – 50

region

dystalny

promotora

BRE

– TFIIB recogniction element

DPE

– downstream promoter element

CTF

– CCAAT-binding transcription factor

CBF

– CCAAT box-binding factor

TBP

– TATA box-binding protein

TAF

– TBP-associated factors

Przykładowa struktura promotora rozponawanego przez polimerazę II RNA

u wyższych eukariontów

Nie wszystkie zaznaczone elementy występują w promotorach wszystkich genów.
Promotory genów ulegających konstytutywnej ekspresji nie zawierają elementu TATA,
dla ich ekspresji wystarcza obecność elementu GC (nie zaznaczono na rysunku)

Ryc. z: Strachan T., Read A. P., 1999, Human Molecular Genetics 2,

2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford.

Promotor ludzkiego genu insuliny zawiera różnorodne elementy rozpoznawane

przez

powszechne

i

tkankowo-specyficzne

czynniki transkrypcyjne

background image

30

(lub TFIID i/lub TFIIA)

Kompleks zamknięty

Kompleks otwarty

rozdzielenie nici

czynniki

elongacyjne

odłączenie i defosforylacja
polimerazy II RNA

elongacja

terminacja

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of

Biochemistry. 4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Białko

l. podj.

M

r

podj.

Funkcja(e)

Inicjacja

Pol. II RNA

12

10 000 - 220 000

Synteza RNA

TBP

1

38 000

Rozpoznanie elementu TATA

TFIIA

3

12-,19-, 35 000

Stabilizuje wiązanie TFIIB i TBP do
promotora

TFIIB

1

35 000

Wiąże się z TBP, powoduje przyłączenie się
kompleksu polimeraza II RNA

– TFIIF

TFIIE

2

34 000, 57 000

Promuje przyłączenie TFIIH, ma aktywność
ATP-azy i helikazy

TFIIF

2

30 000, 74 000

Silnie wiąże się z polimerazą II i z TFIIB,
zapobiega wiązaniu się polimerazy II do
niespecyficznych sekwencji DNA

TFIIH

12

35 000 - 89 000

Rozdziela nici DNA (helikaza); fosforyluje
polimerazę II RNA (w obrębie CTD
największej podjednostki)

Elongacja

zapobiegają zatrzymaniu lub przerwaniu transkrypcji

ELL

1

80 000

p-TEFb

2

43 000, 124 000

fosforyluje polimerazę II RNA (w obrębie
CTD)

SII

1

38 000

SIII (elongina)

3

15-, 18-, 110 000

Czynniki białkowe niezbędne do inicjacji i elongacji transkrypcji kontrolowanej

przez promotory polimerazy II RNA eukariontów

background image

31

Typ elementów działających w układzie cis (sekwencje DNA) zwiększających wykorzystanie
promotorów niektórych genów (wzmacniających transkrypcję). Enhancery mogą funkcjonować
niezależnie od swojej orientacji i położenia względem genu (powyżej lub poniżej), na który
oddziałują.

Z enhancerami oddziałują czynniki transkrypcyjne - niektóre z nich mogą być takie same jak te,
który wiążą się z promotorem.

Uważa się, że działanie wzmacniające enhancerów wynika z bezpośredniego oddziaływania
związanych z nimi czynników transkrypcyjnych z czynnikami związanymi z promotorem.
Interakcja tych dwóch zestawów czynników jest warunkiem wydajnej transkrypcji.

Sekwencja wzmacniająca transkrypcję

(enhancer)

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Kompleks pośredniczący
TFIID lub Mediator

Kompleks polimerazy II RNA

białka HMG

Gal80p

Gal4p

Gal3p

Gal3p

+

galaktoza

Kompleks pośredniczący

Regulacja transkrypcji genów

metabolizmu galaktozy w drożdżach

Gal4p

jest transaktywatorem wiążącym się z elementem

regulatorowym UAS

G

występującym w regionach

promotorowych genów metabolizmu galaktozy

Gal80p

jest inhibitorem transkrypcji uniemożliwiającym

jej aktywację przez Gal4p

Gal3p

jest induktorem, który po związaniu

galaktozy

uzyskuje zdolność wypierania Gal80p z kompleksu z Gal4p

background image

32

Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry. 4th Ed.
W.H. Freeman & Co.; New York

Kompleks polimerazy II RNA

białka HMG

Związanie się transaktywatorów z elementami
regulatorowymi może być warunkiem niezbędnym
dla powstania głównego kompleksu transkrypcyjnego
i przyłączenia polimerazy II RNA

białka HMG

Gal4p

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Typowe transaktywatory wiążące się z DNA
zawierają domenę wiążącą DNA i domenę
aktywacyjną odpowiedzialną za oddziaływanie
z koaktywatorami (takimi jak TFIID lub Mediator)

Domeny aktywacyjne często wykazują
charakterystyczne cechy strukturalne, np. :
Sp1

– domena bogata w glutaminę,

Gal4p

– domena kwasowa

CTF1

– domena aktywacyjna bogata w prolinę,

Transaktywatory mają często budowę modułową
białko chimeryczne zawierające domenę wiążącą DNA
z Sp1 i domenę aktywacyjną z CTF1 może aktywować
transkrypcję o ile w regionie promotora znajduje się element
GC rozpoznawany przez Sp1 (sekwencja konsensusowa
GGGCGG)

białko
chimeryczne

background image

33

Struktura końca 5’ cząsteczek eukariotycznych mRNA

„Cap” - czapeczka

zasada

zasada

Grupa metylowa
w strukturach cap 0, 1 i 2

Grupa metylowa
w strukturze cap 2

Grupa metylowa
w strukturach cap 1 i 2

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002), Biochemistry 5ed.,

W.H. Freeman and Co., New York

Kompleks

syntetyzujący Cap

CBC

Cap

region CTD
(carboxyl-terminal domain)
największej podjednostki
polimerazy II RNA

Cap pozostaje związany z domeną CTD za pośrednictwem
kompleksu CBC (Cap binding complex
)

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004,

Lehninger Principles of Biochemistry.
4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Biosynteza cap

background image

34

„Dojrzały” koniec 5’ pre-mRNA
– z przyłączoną strukturą cap)

fosfohydrolaza

guanylilotransferaza

guanino-7-metylotransferaza

2’-O-metylotransferaza

koniec 5’ pre-mRNA po transkrypcji

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

adoMet

– S-adenozylometionina

(donor grupy metylowej)

adoHcy

– S-adenozylohomocysteina

Mechanizm dołączania struktury „cap”
do końca 5’ pre-mRNA

Polimeraza II RNA

Nić matrycowa DNA

Cap

RNA

Kompleks
enzymatyczny

endonukleaza

polimeraza
poliadenylanowa

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Poliadenylacja eukariotycznych

pre-mRNA

background image

35

Sygnały poliadenylacji pre-mRNA w komórkach Eukaryota

1

przedstawiono sekwencje najwyższej zgodności

2

-

miejsce przyłączenia pierwszego nukleotydu A (miejsce poliadenylacji)

3

dla roślin podano nie sekwenckję najwyższej zgodności, lecz najlepiej poznany sygna

poliadenylacji mRNA wirusa mozaiki kalafiora (CaMV)

Organizm

Sekwencja wyznaczająca miejsce

poliadenylacji

1

Drożdże

(Saccharomyces cerevisiae)

UAG-UAUGU-UUU-10N-

2

lub UACAUA-100N-

lub -50N-UAUAUA

Rośliny

3

UUAGUAUGUAUUUGUA-13N-AAUAAA-14N-

Ssaki

AUAAA-10-30N- -10N-(GU)n lub (U)n

Nie ma uniwersalnego mechanizmu wycinania intronów

z transkryptów genów nieciągłych

Wycinanie intronów z jądrowego mRNA wyższych eukariotów jest realizowane przez system
rozpoznający krótkie sekwencje konsensusowe w miejscach połączeń ekson - intron, oraz tzw. miejsce
rozgałęzienia w obrębie intronu.

w reakcji uczestniczą kompleksy snRNA z białkami snRNP, które łącząc się z podlegającą obróbce częścią
cząsteczki mRNA, tworzą spliceosom

W obrębie spliceosomu następują reakcje transestryfikacji prowadzące do połączenia końców 3' i 5'
sąsiednich eksonów, zaś wycięty intron jest uwalniany w postaci pętli (zwanej czasem lassem - ang. lariat).

Wycinanie niektórych intronów jest autonomiczną właściwościa samego RNA.
Znamy dwa typy intronów zdolne do autokatalicznego usuwania sie z prekursorów RNA: Introny grupy I,
oraz Introny grupy II.
Autokatalityczne właściwości RNA moga są obserwowane również podczas cięcia RNA wiroidów, oraz w
przypadku rybonukleazy P

W przeciwieństwie do powyższych mechanizmów wycinania intronów, które zachodzą na drodze reakcji
transestryfikacji

, wycinanie intronów z prekursorów tRNA (np. w drożdżach, ok. 40 z ok. 400 genów tRNA

zawiera introny o długości 14-46 nt.) przebiega jako następujące po sobie reakcje cięcia i ligacji
fragmentów RNA.

background image

36

Introny grupy I

-

wycinane przez dwukrotną reakcję transestryfikacji

-

w pierwszej reakcji uczestniczy guanozyna (pochodzenia zewnętrznego) jako grupa atakująca

(nukleofilowa)

-

w niektórych wypadkach wymagają obecności białek wspomagających proces (maturazy)

-

występują w genach mRNA, rRNA i tRNA genomu mitochondrialnego, chloroplastowego i jądrowego

różnych eukariontów, lecz nie stwierdzono ich obecności w genach kręgowców

-

występowanie stosunkowo nieregularne: niektóre gatunki Tetrahymena mają intron grupy I w genach 26S

rRNA, w genach innych gatunków tego Rodzaju intronu nie ma.

Introny grupy II

-

występują dwa typy intronów tej grupy (IIA i IIB) różniące się niektórymi nukleotydami sekwencji

konsensusowych

-

wycinane przez dwukrotną reakcję transestryfikacji

-

grupą atakującą w pierwszej reakcji jest grupa 2' adenozyny w domenie VI

-

samowycinanie jest możliwe w warunkach niefizjologicznych (in vitro). In vivo w procesie uczestniczą

białka, jak maturaza kodowane przez ORF w obrębie intronu, lub białka kodowane przez genom jądrowy

-

wszystkie znane introny grupy II napotkano w genomie organellowym eukariontów, stanowią one

większość intronów w roślinnym mitochondrialnym DNA

Struktura końca 5’ cząsteczek eukariotycznych mRNA

„Cap” - czapeczka

zasada

zasada

Grupa metylowa
w strukturach cap 0, 1 i 2

Grupa metylowa
w strukturze cap 2

Grupa metylowa
w strukturach cap 1 i 2

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002), Biochemistry 5ed.,

W.H. Freeman and Co., New York

background image

37

Polimeraza II RNA

Nić matrycowa DNA

Cap

RNA

Kompleks
enzymatyczny

endonukleaza

polimeraza
poliadenylanowa

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Poliadenylacja eukariotycznych

pre-mRNA

Nie ma uniwersalnego mechanizmu wycinania intronów

z transkryptów genów nieciągłych

Wycinanie intronów z jądrowego mRNA wyższych eukariotów jest realizowane przez system
rozpoznający krótkie sekwencje konsensusowe w miejscach połączeń ekson - intron, oraz tzw. miejsce
rozgałęzienia w obrębie intronu.

w reakcji uczestniczą kompleksy snRNA z białkami snRNP, które łącząc się z podlegającą obróbce częścią
cząsteczki mRNA, tworzą spliceosom

W obrębie spliceosomu następują reakcje transestryfikacji prowadzące do połączenia końców 3' i 5'
sąsiednich eksonów, zaś wycięty intron jest uwalniany w postaci pętli (zwanej czasem lassem - ang. lariat).

Wycinanie niektórych intronów jest autonomiczną właściwościa samego RNA.
Znamy dwa typy intronów zdolne do autokatalicznego usuwania sie z prekursorów RNA: Introny grupy I,
oraz Introny grupy II.
Autokatalityczne właściwości RNA moga są obserwowane również podczas cięcia RNA wiroidów, oraz w
przypadku rybonukleazy P

W przeciwieństwie do powyższych mechanizmów wycinania intronów, które zachodzą na drodze reakcji
transestryfikacji

, wycinanie intronów z prekursorów tRNA (np. w drożdżach, ok. 40 z ok. 400 genów tRNA

zawiera introny o długości 14-46 nt.) przebiega jako następujące po sobie reakcje cięcia i ligacji
fragmentów RNA.

background image

38

Introny grupy I

-

wycinane przez dwukrotną reakcję transestryfikacji

-

w pierwszej reakcji uczestniczy guanozyna (pochodzenia zewnętrznego) jako grupa atakująca

(nukleofilowa)

-

w niektórych wypadkach wymagają obecności białek wspomagających proces (maturazy)

-

występują w genach mRNA, rRNA i tRNA genomu mitochondrialnego, chloroplastowego i jądrowego

różnych eukariontów, lecz nie stwierdzono ich obecności w genach kręgowców

-

występowanie stosunkowo nieregularne: niektóre gatunki Tetrahymena mają intron grupy I w genach 26S

rRNA, w genach innych gatunków tego Rodzaju intronu nie ma.

Introny grupy II

-

występują dwa typy intronów tej grupy (IIA i IIB) różniące się niektórymi nukleotydami sekwencji

konsensusowych

-

wycinane przez dwukrotną reakcję transestryfikacji

-

grupą atakującą w pierwszej reakcji jest grupa 2' adenozyny w domenie VI

-

samowycinanie jest możliwe w warunkach niefizjologicznych (in vitro). In vivo w procesie uczestniczą

białka, jak maturaza kodowane przez ORF w obrębie intronu, lub białka kodowane przez genom jądrowy

-

wszystkie znane introny grupy II napotkano w genomie organellowym eukariontów, stanowią one

większość intronów w roślinnym mitochondrialnym DNA

Mechanizm wycinania intronów grupy I

Ekson 3’

Intron

Transkrypt pierwotny

RNA po usunięciu intronu

Intermediat

Ekson 5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

Grupa 3’ OH guanozyny

działa jako nukleofil

atakując miejsce

splicingowe 5’

Grupa 3’ OH intronu 5’ staje się

nukleofilem odpowiedzialnym

za drugą transestryfikację

Wycięty intron

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

background image

39

Intron

Transkrypt pierwotny

RNA po usunięciu intronu

Intermediat

Wycięty intron

5’

3’

5’

3’

5’

3’

OH (3’)

Grupa 3’ OH intronu 5’ staje się

nukleofilem odpowiedzialnym

za drugą transestryfikację

Grupa 2’ specyficznej adenozyny

intronu działa, jako nukleofil atakujący

miejsce splicingowe 5’

wiązanie fosfodiestrowe 2’, 5’

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Mechanizm wycinania intronów grupy II

Struktura drugorzędowa intronu grupy I

Ekson 3’

Ekson 5’

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

(z genu rRNA Tetrahymena)

background image

40

cząsteczki snRNA
w spliceosomie

Intron grupy II

pre-mRNA

Dwukrotna transestryfikacja prowadząca do wycięcia intronu

wynika z autokatalitycznych właściwości RNA.

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E.,

1999, Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

Czynnikiem odpowiadającym za przestrzenne ułożenie reagujących ze sobą
fragmentów RNA jest w przypadku intronów – struktura trzeciorzędowa intronu,
zaś w przypadku intronów pre-mRNA – struktura przestrzenna kompleksu tworzonego
przez spliceosom, z którą odpowiadają sekwencje snRNA tworzące poszczególne
cząsteczki snRNP (U1, U2, U4, U5 i U6).

Elementy typowego intronu eukariotycznych, pre-

mRNA pełniące

funkcje w procesie wycinania intronów (splicing)

Miejsce

rozgałęzienia

Ekson 5’

Ekson 3’

Miejsc połączenia

intron-

ekson 5’

Miejsc połączenia
intron-

ekson 3’

background image

41

Wycinanie intronów i łączenie eksonów (splicing) zachodzi

na drodze dwóch reakcji transestryfikacji

Intron uwolniony w
postaci pętli (lariat)

Ekson 1

Ekson 2

Miejsce
rozgałęzienia

Miejsce

splicingowe 5’

Miejsce
splicingowe 3’

Prekursor

Intermediat

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002), Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Sekwencje nukleotydowe niektórych miejsc połączeń intron - ekson w różnych genach

Intron

Ekson

Intron

Ekson

drugi genu owoalbuminy

UAAG

GUGAGC***************UUACAG

GUUG

trzeci genu owoalbuminy

UCAG

GUACAG***************AUUCAG

UCUG

pierwszy genu β-globiny

GCAG

GUUGGU***************CCUUAG

GCUG

drugi genu β-globin

CAGG

GUGAGU***************CCACAG

UCUC

pierwszy genu immunoglobuliny λ1

UCAG

GUCAGC***************UUGCAG

GGGC

genu wczesnego antygenuT SV 40

UAAG

GUAAAU***************UUUUAG

AUUC

background image

42

Splicing pre-

mRNA zachodzący

z udziałem snRNP

Powstawanie i funkcja spliceosomu

Nieaktywny spliceosom
Aktywność U6
jest blokowana przez U4

Aktywny spliceosom

zachodzi reakcja transestryfikacji
powstawanie struktury lariat

Uwolnienie wyciętego intronu

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger
Principles of Biochemistry 4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Ekson 5’

Ekson 3’

Za rozpoznanie połączeń intron exon oraz miejsca rozgałęzienia odpowiadają snRNA

stanowiące zrąb snRNA

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

background image

43

cząsteczki snRNA
w spliceosomie

Intron grupy II

pre-mRNA

Dwukrotna transestryfikacja prowadząca do wycięcia intronu

wynika z autokatalitycznych właściwości RNA.

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E.,

1999, Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

Czynnikiem odpowiadającym za przestrzenne ułożenie reagujących ze sobą
fragmentów RNA jest w przypadku intronów – struktura trzeciorzędowa intronu,
zaś w przypadku intronów pre-mRNA – struktura przestrzenna kompleksu tworzonego
przez spliceosom, z którą odpowiadają sekwencje snRNA tworzące poszczególne
cząsteczki snRNP (U1, U2, U4, U5 i U6).

Struktury niskocząsteczkowych jądrowych rybonukleoproteidów

(snRNP)

uczestniczących w splicingu pre-mRNA

snRNP

wielkość snRNA

[nt]

Funkcja w splicingu

U1

165

wiąże się do połączenia intron-ekson (najpierw 5',
następnie 3')

U2

185

wiąże się z miejscem rozgałęzienia, tworzy część
centrum katalitycznego

U5

116

wiąże się z połączeniem intron-ekson po stronie 5'

U4

145

maskuje aktywność katalityczną U6

U6

106

katalizuje splicing

background image

44

Porównanie mechanizmów wycinania różnych intronów
przebiegającego poprzez dwie reakcje transestryfikacji

Introny pre-mRNA wycinane

z udziałem spliceosomu

Introny ulegające autokatalicznemu wycinaniu

grupa I

grupa II

Ryc. z: Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. E.,

1999, Molecular Cell Biology, W. H. Freeman & Co.; New York

KOD GENETYCZNY

Zasada zapisu sekwencji aminokwasowych białek w genomach organizmów żywych, w postaci
następujących po sobie trójek zasad sekwencji DNA (i w konsekwencji także mRNA).
Trójki zasad (triplety) zwane są kodonami.

UUU

Phe

UCU

Ser

UAU

Tyr

UGU

Cys

UUC

UCC

UAC

UGC

UUA

Leu

UCA

UAA

STOP

UGA

STOP

UUG

UCG

UAG

UGG

Trp

CUU

CCU

Pro

CAU

His

CGU

Arg

CUC

CCC

CAC

CGC

CUA

CCA

CAA

Gln

CGA

CUG

CCG

CAG

CGG

AUU

Ile

ACU

Thr

AAU

Asn

AGU

Ser

AUC

ACC

AAC

AGC

AUA

ACA

AAA

Lys

AGA

Arg

AUG

Met

ACG

AAG

AGG

GUU

Val

GCU

Ala

GAU

Asp

GGU

Gly

GUC

GCC

GAC

GGC

GUA

GCA

GAA

Glu

GGA

GUG

GCG

GAG

GGG

background image

45

KOD GENETYCZNY

nie jest w pełni uniwersalny

strzałkami zaznaczono kodony, które w mitochondriach człowieka

mają odmienny sens (podany w nawiasie)

UUU

Phe

UCU

Ser

UAU

Tyr

UGU

Cys

UUC

UCC

UAC

UGC

UUA

Leu

UCA

UAA

STOP

UGA

STOP

(Trp)

UUG

UCG

UAG

UGG

Trp

CUU

CCU

Pro

CAU

His

CGU

Arg

CUC

CCC

CAC

CGC

CUA

CCA

CAA

Gln

CGA

CUG

CCG

CAG

CGG

AUU

Ile

(Met)

ACU

Thr

AAU

Asn

AGU

Ser

AUC

ACC

AAC

AGC

AUA

ACA

AAA

Lys

AGA

Arg

(STOP)

AUG

Met

ACG

AAG

AGG

GUU

Val

GCU

Ala

GAU

Asp

GGU

Gly

GUC

GCC

GAC

GGC

GUA

GCA

GAA

Glu

GGA

GUG

GCG

GAG

GGG

ramię dodatkowe

ramię
akceptorowe

pętla TψC

pętla antykodonowa

antykodon

pętla DHU

Struktura drugorzędowa tRNA

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Cechy wspólne wszystkich poznanych tRNA

-

Długość 73-93 rybonukleotydy (ok. 25 kDa),

-

Zawierają nietypowe (modyfikowane) zasady - zwykle 7-15 na cząsteczkę,

-

Koniec 5' zawsze jest fosforylowany, nukleotydem końcowym jest zwykle pG,

- Koniec 3' zawsze stanowi sekwencja 5'CCA3',
-

mniej więcej połowa nukleotydów jest sparowana i tworzy struktury dwuniciowe,

-

Pętla antykodonowa zawiera sekwencję:

5 '- pirymidyna - pirymidyna - X - Y - Z - zmod. puryna - zasada zmienna - 3'

background image

46

pętla DHU

pętla TψC

pętla

antykodonowa

ramię akceptorowe

antykodon

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Struktura trzeciporzędowa tRNA

Phe

z drożdży

adenina

adenina

Reakcja aminoacylacji tRNA

etap I

– aktywacja aminokwasu

aminokwas

ATP

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

aminoacylo-AMP

background image

47

Reakcja aminoacylacji tRNA

etap II

– przeniesienie reszty aminoacylowej na 2’ lub 3’ -OH tRNA

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

adenina

aminoacylo-AMP

adenozyna

adenozyna

adenina

AMP

koniec 3’

tRNA

aminoacylo-tRNA

AMP

tRNA

tRNA

transestryfikacja

syntetazy aminoacylo- tRNA klasy I

syntetazy aminoacylo- tRNA klasy II

aminoacylo-AMP

Klasa I

Klasa II

Arg

α

Ala

α

4

Cys

α

Asn

α

2

Gln

α

Asp

α

2

Glu

α

Gly

α

2

β

2

Ile

α

His

α

2

Leu

α

Lys

α

2

Met

α

Phe

α

2

β

2

Trp

α

2

Ser

α

2

Tyr

α

2

Pro

α

2

Val

α

Thr

α

2

Klasyfikacja i struktura podjednostkowa

syntetaz aminoacylo-tRNA z Escherichia coli

background image

48

ramię dodatkowe

ramię akceptorowe
(aminoacylowe)

ramię TψC

ramię DHU

ramię
antykodonowe

antykodon

pozycje nukleotydów istotnych dla specyficzności rozpoznania tRNA przez wszystkie syntetazy aminoacylo-tRNA

pozycje nukleotydów istotnych dla specyficzności rozpoznania tRNA przez jedną syntetazę aminoacylo-tRNA

pozycje nukleotydów istotnych dla specyficzności rozpoznania tRNA przez kilka syntetaz aminoacylo-tRNA

Elementy struktury tRNA ważne dla specyficzności oddziaływania

z syntetazami aminoacylo-tRNA

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Syntetazy aminoacylo-tRNA w kompleksie z rozpoznawanymi

przez siebie specyficznymi cząsteczkami tRNA

Syntetaza glutaminowa (Gln) z E. coli

typowa monomeryczna syntetaza

klasy I

Syntetaza asparaginianowa (Asp) z drożdży

typowa dimeryczna syntetaza

klasy II

background image

49

Rybosom prokariotyczny

70S

M. cz. 2,7 x 10

6

Rybosom eukariotyczny

80S

M. cz. 4,2 x 10

6

M. cz. 1,8 x 10

6

5S rRNA (120 nt.)
23S rRNA (3 200 nt.)
36 białek

M. cz. 2,8 x 10

6

5S rRNA (120 nt.)
28S rRNA (4 700 nt.)
5,8S rRNA (160 nt.)
ok. 49 białek

M. cz. 1,4 x 10

6

18S rRNA (1 900 nt.)
ok. 33 białka

M. cz. 0,9 x 10

6

16S rRNA (1 540 nt.)
21 białek

50S

40S

30S

60S

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Porównanie struktury rybosomów organizmów prokariotycznych i eukariotycznych

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

fot. James Lake

Mikrofotografia elektronowa

(A) podjednostek 30S (B) podjednostek 50S (C) rybosomów 70S

Polirybosomy (polisomy) w komórce Escherichia coli

z: Miller Jr. O.L., Hamkalo B.A., Thomas Jr. C.A.,

(1970), Science 169: 392.

background image

50

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

rybosom 70S

podjednostka 50S

podjednostka 30S

Model struktury rybosomu prokariotycznego opracowany na podstawie

analizy krystalograficznej (analiza dyfrakcji promieniowania X)

kolor żółty – 23S rRNA
kolor pomarańczowy – 5S rRNA
kolor zielony

– 16S rRNA

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Struktura drugorzędowa

Struktura trzeciorzędowa

16S rRNA

background image

51

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

miejsce syntezy wiązania peptydowego
zawiera wyłącznie RNA (kolor żółty)

Struktura fragmentu rybosomu obejmującego region transferazy peptydylowej

w promieniu 20

Ǻ od tego miejsca nie ma białek

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

mRNA

miejsce

A

Aminoacylowe

Miejsce

P

Peptydylowe

Miejsce

E

Wyjścia (Exit)

E

A

P

Miejsca wiązania tRNA na rybosomie prokariotycznym

antykodony aminoacylo-tRNA w miejscu A oraz peptydylo-tRNA w miejscu P

są połączone komplementarnie z właściwymi sobie kodonami mRNA

background image

52

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Tunel przechodzący przez podjednostkę 50S

rozpoczynający się w miejscu tworzenia wiązania peptydowego

Powstający łańcych polipeptydowy opuszcza rybosom przechodząc przez ten tunel

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Tunel

Wiązanie

aminoacylo-tRNA

Tworzenie

wiązania peptydowego

dysocjacja tRNA

Translokacja

EF-G

Przebieg translacji w komórkach prokariotycznych

Inicjacja i pierwsza reakcja elongacji

background image

53

Podjednostka

30S

podjednostka

50S

mRNA

N-formylometionylo-tRNA

wiązanie czynników
inicjujących

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Inicjacja procesu translacji w komórkach prokariotycznych

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Region oddziaływań komplementarnych
z sekwencjami Shine-Dalgarno
bakteryjnych mRNA

background image

54

bakteriofag

λ białko cro

5’

Sekwencje Shine-Dalgarno

E. coli trpA

E.coli araB

E. coli lacI

bakteriofag

ΦX174 białko A

mRNA

5’

koniec 5’ mRNA

3’

koniec 3’ 16S rRNA

kodon

inicjatorowy

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

Miejsce wiązania rybosomu (RBS)

Rozpoznanie kodonu inicjatorowego w komórkach prokariotycznych

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Inicjacja procesu translacji w komórkach eukariotycznych

Podjednostka

40S

podjednostka

60S

mRNA

kompleks
metionylo-tRNA

– eIF2-GTP

wiązanie czynników
inicjujących

Skanowanie

background image

55

Bakteryjne

IF-1

-

zapobiega przedwczesnemu wiązaniu się tRNA w miejscu A,

IF-2

-

niezbędny do wiązania fMet-tRNA

fMet

z podjednostka 30S,

IF-3

-

wiążąc się z podjednostką 30S zapobiega przedwczesnemu dołączeniu sie podjednostki 50S;

zwiększa powinowactwo miejsca P do fMet-tRNA

fMet

.

Eukariotyczne

eIF-2

-

niezbędny do wiązania inicjatorowego Met-tRNA

Met

z podjednostka 40S,

eIF2B

,

eiF3

-

czynniki wiążące się, jako pierwsze z podjednostką 40S; warunek niezbędny

dla zajścia dalszych etapów inicjacji translacji,

eIF4A

- helikaza RNA

– usuwa struktury drugorzędowe mRNA umożliwiając jego wiązanie się

z podjednostką 40S; jest częścią kompleksu eIF4F,

eIF4B

-

wiąże się z mRNA, odpowiada za „skanowanie” mRNA do momentu zlokalizowania

pierwszego kodonu AUG,

eIF4E

-

wiąże się ze strukturą „cap” na końcu 5’ mRNA; jest częścią kompleksu eIF4F,

eIF4G

-

wiąże się z eIF4E oraz białkiem PABP (polyA binding protein);

jest częścią kompleksu eIF4F,

eIF5

-

odpowiada za odłączenie wcześniej związanych czynników inicjatorowych

od podjednostki 40S umożliwiając dołączenie podjednostki 60S i powstanie kompleksu
inicjującego 80S,

eIF6

-

umożliwia dysocjację nieaktywnego rybosomu 80S na podjednostki 40S i 60S.

Funkcje czynników inicjatorowych w translacji w komórkach

bakteryjnych i eukariotycznych

Ryc. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

inicjatorowy

metionylo-tRNA

Aktywny

eIF2

podjednostka rybosomalna

40S

podjednostka rybosomalna

60S

mRNA

Nieaktywny

eIF2

Biosynteza

białka

Rola czynnika inicjującego eIF2 w inicjacji translacji w komórkach eukariotycznych

background image

56

Ryc. z: Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1994,

Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. Garland Publishing Inc.

eIF2B

białko uwalniające

nukleotyd guanylowy

Kinaza białkowa
fosforyluje eIF2

eIF2B

Aktywny

eIF2

Nieaktywny

eIF2

Nieaktywny

eIF2

ufosforylowany eIF2 wiąże

całą pulę eIF2B tworząc

nieaktywny kompleks

W nieobecności aktywnego

eIF2B większość eIF2

pozostaje w formie

nieaktywnego kompleksu

eIF2-GDP

Biosynteza białka zostaje

spowolniona dramatycznie

Udział eIF2 w regulacji translacji w organizmach eukariotycznych

Cykl eIF2

Fosforylacja eIF2 kontroluje
wydajność translacji

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Translokacja

Powstawanie
wiązania peptydowego

aminoacylo-tRNA

EF-TS

nieaktywny

aktywny

5’

5’

5’

5’

Elongacja
Prokaryota

background image

57

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Aminoacylo-tRNA

EF-Tu

GTP

Struktura kompleksu czynnika elongacyjnego Tu (EF-Tu) z aminoacylo-tRNA

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Intermediat

(tetraedralny)

miejsce P

miejsce A

Powstawanie wiązania peptydowego

background image

58

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Mechanizm translokacji

W postaci kompleksu z GTP EF-

G ma zdolność wiązania się do miejsca wiązanie EF-Tu na podjednostce 50S.

Związanie z rybosomem powoduje hydrolizę GTP i w konsekwencji zmianę konformacji EF-G.
Zmiana konformacji związanego EF-G wprowadza jego domenę przypominającą tRNA w miejsce A wymuszając
translokację

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

GTP

Struktura czynnika elongacyjnego G (EF-G)

background image

59

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

GTP

EF-G

Aminoacylo-tRNA

EF-Tu

GTP

EF-Tu

– aa-tRNA

Ryc. z: Nelson D. L., Cox M.M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry.

4th Ed. W.H. Freeman & Co.; New York

tRNA

GDP

Kompleks EFTu

– tRNA

EF-G (w kompleksie z GDP)

background image

60

Ryc. z: Cooper G. M., 2000, The Cell - A Molecular Approach.

2nd ed. Sunderland (MA)

Terminacja translacji

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

Czynnik RF

Prokariotyczne czynniki terminujące:

RF-1

rozpoznaje UAG i UAA

RF-2

rozpoznaje UGA i UAA

RF-3

?

(odłączenie podjednostek?)

W komórkach eukariotycznych:

jeden czynnik

eRF

rozpoznaje wszystkie kodony stop

Ryc. z: Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., (2002),

Biochemistry 5ed., W.H. Freeman and Co., New York

Struktura eukariotycznego czynnika RF

(Release Factor)

Kształt cząsteczki czynnika RF przypomina tRNA. Domena odpowiadająca ramieniu akceptorowemu
może wiązać cząsteczkę wody i przenosić ją do wnętrza centrum transferazy peptydylowej


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
BKNB 1213 03
Wykład 04
04 22 PAROTITE EPIDEMICA
04 Zabezpieczenia silnikówid 5252 ppt
Wyklad 04
Wyklad 04 2014 2015
04 WdK
04) Kod genetyczny i białka (wykład 4)
2009 04 08 POZ 06id 26791 ppt
2Ca 29 04 2015 WYCENA GARAŻU W KOSZTOWEJ
04 LOG M Informatyzacja log
04 Liczby ujemne i ułamki w systemie binarnym
UE i ochrona srodowiska 3 04 2011
04 QueryByExample Access

więcej podobnych podstron