Interferencja RNA w komórkach

z ekspansją sekwencji

powtórzonej

w genie choroby Huntingtona

Włodzimierz J.

Krzyżosiak

Instytut Chemii Bioorganicznej

PAN

Geny, Mutacje, Choroby

2250

0

5500

1750

5200

0

Genów w ludzkim genomie

Chorób genetycznych

Chorób z poznanymi genami
sprawczymi

Różnych mutacji w tych genach

Poznane genomy ssaków

Człowiek

Mysz

Szczur

Szympans

2.9
Gb

2.6
Gb

2.75
Gb

3.1
Gb

Przykłady sekwencji powtarzających się w genomie

g t g g a a g a t t c a g c c a a g c t c a a g g a t g g a a g t g c a g t t a

g g g c t g g g a a g g g t c t a c c c t c g g c c g c c g t c c a a g a c c t

a c c g a g g a g c t t t c c a g a a t c t g t t c c a g a g c g t g c g c g a

a g t g a t c c a g a a c c c g g g c c c c a g g c a c c c a g a g g c c g c g

a g c g c a g c a c c t c c c g g c g c c a g t t t g c t g c t g c t g

c a a g a g a c t a g c c c c a g g

c a g c a g c a g c a g c a g c a g g g t g a g g a t g g t t c t c c c c a a g

c c c a t c g t a g a g g c c c c a c a g g c t a c c t g g t c c t g g a t g a

g g a a c a g c a a c c t t c a c a g c c g c a g t c g g c c c t g g a g t g c

c a c c c c g a g a g a g g t t g c g t c c c a g a g c c t g g a g c c g c c g

t g g c c g c c a g c a a g g g g c t g c c g c a g c a g c t g c c a g c a c c

t c c g g a c g a g g a t g a c t c a g c t g c c c c a t c c a c g t t g t c c

c a g c

a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a

g c a g c a g c a g c a g c a g c a g c a g

a g c c a g a g a t c a a a a g a t g a a a a g g c a g t c a g g t c t t c a g

t a g c c a a a a a a c a a a a c a a a c a a a a a c a a a a a a g c c g a a a

t a a a a g a a a a a g a t a a t a a c t c a g t t c t t a t t t g c a c c t a

c t t c a g t g g a c a c t g a a t t t g g a a g g t g g a g g a t t t t g t t

t t t t t c t t t t a a g a t c t g g g

t c t t t t g a a t c t a c c c t t c a a g t a t t a a g a g a c a

g a c t g t g a g c c t a g c a g g g c a g a t c t t g t c c a c c g t g t g t

c t t c t t c t g c a c g a g a c t t t g a g g c t g t c a g a g c g c t t t t

t g c g t g g t t g c t c c c g c a a g t t t c c t t c t c t g g a g c t t c c

c g c a g g t g g g c a g c t a g c t g c a g c g a c t a c c g c a t c a t c a

c a g c c t g t t g a a c t c t t c t g a g c a a g a g a a g g g g a g g c g g

g g t a c a g g g a a g t a g g t g g a a g a t t c a g c c a a g c t c a a g g

c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a

c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a c a

c a c a c a

g c t g c g a g c a g a g a g g g a t t c c t c g g a g g t c a t c t g t t c c

a t c t t c t t g c c t a t g c a a a t g c c t g c c t g a a g c t g c t g g a

g g c t g g c t t t g t a c c g g a c t t t g t a c a g g g a a c c a g g g a a

a c g a a t g c a g a g t g c t c c t g a c a t t g c c t g t c a c t t t t t c

c c a t g a t a c t c t g g c t t c a c a g t t t g g a g a c t g c c a g g g a

c c a t g t t t t g c c c a t t g a c t a t t a c t t t c c a c c c c a g a a g

a c c t g c c t g a t c t g t g g a g a t g a a g c t t c t g g g t g t c a c t

a t g g a g c t c t c a c a t g t g g a a g c t g c a a g g t c t t c t t c a a

a a g a g c c g c t g a a g g g a a a c a g a a g t a c c t g t g c g c c a g c

a g a a a t g a t t g c a c t a t t g a t a a a t t c c g a a g g a a a a a t t

g t c c a t c t t g t c g t c t t c g g a a a t g t t a t g a a g c a g g g a t

g a c t c t g g g a g c c c g g a a g c t g a a g a a a c t t g g t a a t c t g

a a a c t a c a g g a g g a a g g a g a g g c t t c c a g c a c c a c c a g c c

T g a a g g c t a t g a a t g t c a g c c c a t c t t t c t g a a t g t c c t g

g a a g c c a t t g a g c c a g g t g t a g t g t g t g c t g g a c a c g a c a

a c a a c c a g c c c g a c t c c t t t g c a g c c t t g c t c t c t a g c c t

c a a t g a a c t g g g a g a g a g a c a g c t t g t a c a c g t g g t c a a g

t g g g c c a a g g c c t t g c c t g g c t t c c g c a a c t t a c a c g t g g

a c g a c c a g a t g g c t g t c a t t c a g t a c t c c t g g a t g g g g c t

c a t g g t g t t t g c c a t g g g c t g g c g a t c c t t c a c c a a t g t c

a a c t c c a g g a t g c t c t a c t t c g c c c c t g a t c t g g t t t t c a

a t g a g t a c c g c a t g c a c a a g t c c c g g a t g t a c a g c c a g t g

t g t c c g a a t g a g g c a c c t c t c t c a a g a g t t t g g a t g g c t c

c a a a t c a c c c c c c a g g a a t t c c t g t g c a t g a a a g c a c t g c

t a c t c t t c a g c a t t a t t c c a g t g g a t g g g c t g a a a a a t c a

a a a a t t c t t t g a t g a a c t t c g a a t g a a c t a c a t c a a g g a a

Typy sekwencji w ludzkim genomie

2 5 %

7 5 %

2 3 %

2 %

5 5 %

2 0 %

1 0 %

4 5 %

L T R

3 %

L I N E

1 3 %

8 %

2 1 %

3 %

S I N E

1 %

5 %

G e n o m C z ło w ie k a

R e g i o n y m i ę d z y g e n o w e

S e k w e n c j e

p o w ta r z a j ą c e s ię

S e k w e n c je

u n ik a to w e

I n tr o n y

p r o m o to r y

p s e u d o g e n y

R e g i o n y

k o d u j ą c e

i r e g u l a t o r o w e

P o w tó r z e n ia ta n d e m o w e

S a te lit y

M in is a t e l ity

M ik r o s a te lit y

D N A

tr a n s p o z o n o w y

G e n y i s e k w e n c j e r e g u l a t o r o w e

P o w tó r z e n ia r o z p r o s z o n e

Choroby spowodowane ekspansją tandemowych

powtórzeń



Dentatorubral Pallidoluysian
Atrophy (Haw River Syndrome)



Spinocerebellar Ataxia Type 1



Spinocerebellar Ataxia Type 2



Spinocerebellar Ataxia Type 3



Spinocerebellar Ataxia Type 6



Spinocerebellar Ataxia Type 7



Spinocerebellar Ataxia Type 8



Spinocerebellar Ataxia Type 10



Spinocerebellar Ataxia Type 12



Spinocerebellar Ataxia Type 17



Fragile X Syndrome



Tremor/Ataxia Syndrome



Premature Ovarian Failure



Fragile XE Syndrome



Myotonic Dystrophy type 1



Myotonic Dystrophy type 2



Huntington Disease



Huntington Disease-like type

2



Spinal  Bulbar Muscular

Atrophy



Oculopharyngeal Muscular

Dystrophy



Friedreich Ataxia

Exon

Exon

Intron

5’

3’

orf

orf

5’UTR

3’UTR

FXS
FRAXE
FXTAS
POF

FRDA

SBMA

HD

DRPLA/HRS

SCA1
SCA2

MJD/SCA3

SCA6
SCA7

SCA17

PAB2

COMP

DM1

SCA8

CTG

GCG-Ala

GAC-Asp

CAG-Gln

AAG

CGG/CCG

DM2

CCTG

SCA12

CAG

SCA10

ATTCT

HDL2

CTG-Ala/Leu

HDL2

CTG

Lokalizacja powtórzeń krótkich motywów sekwencji

ulegających ekspansji w genach związanych z TREDs

G

G

C

G

G

C

C

C

C

G

G

C

A

A

G

C

U

U

C

G

G

C

C A G

C U G

C G G

C C G

T 1

S 1

T 2

P b

V 1

5 '

- 4 5 ,9 k c a l/m o l

- 3 2 ,6 k c a l/m o l

- 2 8 ,3 k c a l/m o l

- 3 3 ,7 k c a l/m o l

C

G

A

A

G

C

A

A

G

C

C

G

C

G

U

U

G

C

C

G

U

U

G

C

C

G

5 '

G

G

G

C

C

G

G

G

G

C

C

G

5 '

C

C

G

C

C

G

C

C

G

C

C

G

5 '

G

C

C

G

G

C

C

G

G

C

C

G

G

C

C

G

Budowa trzonów struktur spinki przyjmowanych

przez powtórzenia typu CNG jest podobna

Sobczak i wsp. 2003 NAR

Postulowane mechanizmy patogenezy w chorobach

związanych

z ekspansją powtórzeń krótkich motywów sekwencji

Exon

Exon

Intron

5’

3’

orf

orf

5’UTR

3’UTR

FXS
FRAXE
FXTAS
POF

FRDA

SBMA

HD

DRPLA/HRS

SCA1
SCA2

MJD/SCA3

SCA6
SCA7

SCA17

PAB2

COMP

DM1

SCA8

CTG

GCG-Ala

GAC-Asp

CAG-Gln

AAG

CGG/CCG

DM2

CCTG

SCA12

CAG

SCA10

ATTCT

HDL2

CTG-Ala/Leu

HDL2

CTG

Utrata

RNA/Białka

Toksyczny

RNA

Toksyczne

białko

Współwystępowanie

mechanizmów

Do czego potrzebna jest znajomość struktur RNA?



RNA zawierający nadmiernie wydłużone
sekwencje powtarzające się, a właściwie jego
struktura odgrywać może istotną rolę w
patogenezie TREDs.



Znajomość tej struktury jest pomocna w
planowaniu metod terapii mających likwidować
przyczyny choroby a nie usuwać jej skutki.

Centralny dogmat biologii

molekularnej

DNA

RNA

Białko

mRNA
rRNA
tRNA
inne

RNAi: celem jest degradacja mRNA

Interferencja RNA
to zachowawczy
ewolucyjnie mechanizm
regulacji procesów
komórkowych przez
krótkie cząsteczki RNA

Gen (DNA)

transkrypcja

mRNA

translacja

Białko

Funkcja komórkowa

Zjawisko i technologia interferencji RNA

Choroby spowodowane ekspansją

tandemowych powtórzeń



Dentatorubral Pallidoluysian
Atrophy (Haw River Syndrome)



Spinocerebellar Ataxia Type 1



Spinocerebellar Ataxia Type 2



Spinocerebellar Ataxia Type 3



Spinocerebellar Ataxia Type 6



Spinocerebellar Ataxia Type 7



Spinocerebellar Ataxia Type 8



Spinocerebellar Ataxia Type 10



Spinocerebellar Ataxia Type 12



Spinocerebellar Ataxia Type 17



Fragile X Syndrome



Tremor/Ataxia Syndrome



Premature Ovarian Failure



Fragile XE Syndrome



Myotonic Dystrophy type 1



Myotonic Dystrophy type 2



Huntington Disease



Huntington Disease-like type

2



Spinal  Bulbar Muscular

Atrophy



Oculopharyngeal Muscular

Dystrophy



Friedreich Ataxia

Choroba Huntingtona

z perspektywy toksyczności białka

normalny ciąg CAG

wydłużony ciąg CAG

normalny ciąg Q

wydłużony ciąg Q

normalna struktura białka

zaburzona struktura białka

normalna biologiczna aktywność

zaburzona funkcja białka

Możliwości wykorzystania technologii iRNA

w terapii TREDs

20 CHORÓB,
GŁÓWNIE
NEUROLOGICZNYCH

-Choroba
Huntingtona

-Zespół łamliwego
chromosomu X

-Ataksje rdzeniowo-
móżdżkowe

GŁÓWNE MIEJSCA
PATOGENEZY

-centralny układ
nerwowy

-mózg, móżdżek

-grupy neuronów

PROPOZYCJE TERAPII
CHORÓB DOMINUJĄCYCH

-degradacja zmutowanego
allelu przez
allelospecyficzną iRNA
-

celowanie w SNP

-

celowanie w

STR

SCA1

CAG

43/29 CAG

ORF

HD

ORF

CAG

44/21 CAG
46/15 CAG

CAG

74/24 CAG

ORF

SCA3

5’UT
R

CGG

>55

ORF

FMR1

SNP1SNP2

SNP1

SNP1

SNP2

MECHANIZMY
PATOGENEZY

-zależny od poli-
Q

-zależny od RNA

-mechanizm
złożony

Transkrypty z trójnukleotydowymi

powtórzeniami

są substratami rybonukleazy Dicer

PAZ

RIIIb

RIIIa

PAZ

RIIIb

RIIIa

PAZ

RIIIb

RIIIa

N=
A

N=U

N=
G

FXTAS

DM
1

HD,SCA

SZLAK

iRNA

BIOGENEZA

mikroRNA

TRANSKRYPT

Z TRAKTEM (CNG)n

?

N

N

N

N

N

N

N

N

~21nt fragmenty sekwencji powtórzonej są

produktami Dicer

Zmutowane transkrypty są pod kontrolą Dicer w komórkach

TREDs

cDNA-Dicer

normal allele

mutan t allele

SCA1 STR region

HD S TR region

cDNA

1

1.5

0.5

1

1.5

0.5

d

e

n

si

to

m

e

tr

y

s

ig

n

a

l

(n

o

rm

a

li

ze

d

)

44

21

53

29

(CAG)

(CAG)

(CAG)
(CAG)

cD

N

A

- D

ic

er

cD

NA

RN

A

/D

Na

se

I

DN

A

SC A1 STR

HD S TR

Actin

GAPDH

Actin

GAPDH





0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Dicer

A

HD SCA1

WT

cell

DM1

Dicer

GAPDH

+siDicer

ex

p

re

s

s

io

n

l

e

ve

l

(n

o

rm

a

liz

e

d

)

D

Dicer

GAPDH

C

B

mutant allele

normal allele

Dicer

DM1 cell line

GAPDH

DM1

DM1

-D icer

1000

(CUG)

15

(CUG)

+ -

18S rRNA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

WT

-Dicer

DM1 DM1

-Dic er

WT

e

xp

re

s

s

io

n

l

e

ve

l

(n

o

rm

al

iz

e

d

)

HDSCA1DM1

DMPK mRNA

WT

d

e

n

s

it

o

m

e

tr

y

s

ig

na

l

(n

o

rm

a

li

ze

d

)

de

ns

ito

m

e

tr

y

si

g

na

l

(n

or

m

a

liz

ed

)

HDSCA1DM1

WT

HD SCA1DM1

WT

siCUG

-Dicer

miR-16

miR-21

U6

let7

(CAG)7 probe

E

W

T

30/30

(CAG)

29/30

(CAG)

19/25

(CAG)

21/20

(CAG)

W

T-

D

ic

er

D

M

1

-D

ic

er

D

M

1

Actin

GAPDH



HD mRNA

SCA1 mRNA

Ago2

GAPDH

DM1 mutant cell line/Dic er knockdown

0

0,5

1

1,5

0

0,5

1

1,5

0

0,5

1

1,5

0

0,5

1

1,5

HD mutant cell line/Dicer knockdown

SCA1 mutant cell line/Dicer knockdown

WT fibroblast cell line/Dicer knockdown

A

C

B

W

T

W

T+

s

iA

go

2

D

M

1+

si

A

g

o2

D

M

1

e

x

p

re

ss

io

n

le

ve

l

(n

or

m

al

iz

ed

)

DMPK mRNA

Level of normal transcript from longer STR allele

Level of mutant transcript

SCA1 HD SCA3 AR MAB21DMPK SCA8

S TR contains

C AG repeats

STR contains

CUG repeats

SCA1 HD SCA3 AR MAB21 DMPK SCA8

STR contains

CAG repeats

STR contains

CUG repeats

Control

0

0,5

1

1,5

WT

-Ago2

DM1 DM1

-Ago2

WT

d

en

si

to

m

e

tr

y

s

ig

n

al

(n

o

rm

al

iz

ed

)

SCA1 mRNA

0

0,5

1

1,5

HD mRNA

WT

-Ago2

DM1 DM1

-Ago2

WT

0

0,5

1

1,5

SCA1 HD SCA3 AR MAB21DMPK SCA8

SCA1 HD SCA3 AR MAB21 DMPK SCA8

d

en

si

to

m

e

tr

y

s

ig

n

al

(n

o

rm

al

iz

ed

)

W komórkach DM1 ~21nt CUG siRNA wyciszają na

drodze iRNA transkrypty z długimi ciągami powtórzeń

CAG

Model opisujący nowe przykłady iRNA w

komórkach

długi ciąg CUG

Cap

AAA

Dicer

RISC

Cap

AAA

Cap

AAA

siCUG

długi ciąg CAG

zmutowany

transkrypt DMPK

ci g CUG

ą

normalne transkrypty

z ci gami CAG

ą

Cap

AAA

Dicer

RISC

Cap

AAA

Cap

AAA

siCAG

normalne transkrypty

z ci gami CUG

ą

krótki ciąg CUG

krótki ciąg CAG

zmutowany

transkrypt HD

ci g CAG

ą

DM1

HD

Nowa koncepcja allelospecyficznej terapii TREDs

Cap

AA A

Cap

AA A

Cap

AA A

RISC

transkrypt z długim traktem powtórzeń

transkrypt z krótkim traktem powtórzeń

Cap

AA A

Cap

AA A

Cap

AAA

RISC

transkrypt z długim traktem powtórzeń

zmutowany transkrypt

zawierający ciąg CAG

normalne transkrypty

zawierające ciągi CAG

transkrypt z krótkim traktem powtórzeń

zmutowany transkrypt

zawierający ciąg CUG

normalne transkrypty

zawierające ciągi CAG

C o n tr o l

+ (C U G )7

E G F P /3 0 C A G

E G F P /3 0 C A G

E G F P /7 0 C A G

E G F P /7 0 C A G

E G F P /2 0 0 C A G

E G F P /2 0 0 C A G

C o n tr o l

+ (C A G )7

E G F P /3 0 C U G

E G F P /3 0 C U G

E G F P /7 0 C U G

E G F P /7 0 C U G

E G F P /2 0 0 C U G

E G F P /2 0 0 C U G

EGFP/CNG HeLa cells

Egzogenne (CAG)

7

i (CUG)

7

siRNA wyciszają

zmutowane

transkrypty zawierające komplementarne

powtórzenia

Strategie allelospecificzego wyciszania ekspresji

genów

Wniosek:

Celowanie w region tandemowych powtórzeń

może być skutecznym podejściem terapeutycznym

s tr a te gi a

ce lo wan ia

w SNP

s tr a te g i a

c e lo wan ia

w STR

strategia

zastąpienia

alleli

siRNA specyficzny do SNP

siRNA specyficzny do regionu UTR

allel prawid łowy

allel zmutowany

egzogenny allel prawidłowy pozbawiony

sekwencji docelowej dla użytego siRNA

N

G

C

N

G

C

N

G

C

N

G

C

N

G

C

N

G

C

N

G

C

GCNGCNGCNGCNGCNGCNGC

N

P

P

OH

OH

allel prawid łowy

allel zmutowany

allel prawid łowy

allel zmutowany

siRNA specyficzny do STR

P

POH

OH

P

POH

OH

Wyzwania dla technologii RNAi

Dostarczanie leku RNAi do miejsca
choroby:

• jak?

• gdzie?

• jaki reagent?

Sposoby dostarczania leków RNAi

Etapy badań nad nowymi lekami

RNAi

• hodowle komórkowe

• zwierzęta transgeniczne

• badania kliniczne