209

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

P R A C A P O G L Ą D O W A

Magdalena Czajka-Uhryn

1

, Ilona Bednarek

2

1

Katedra i Zakład Biologii Molekularnej i Genetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach

2

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach

Interferencja RNA — nowe narzędzie

molekularne w modulacji zjawiska

oporności wielolekowej

RNA interference — a new molecular tool in MDR modulation

A B S T R A C T

The multidrug resistance (MDR), intrinsic or acquired, is nowadays one of the major reasons for chemotherapeutic

treatment failure in many cancer patients. The etiology of MDR is rather multifactorial, but often the classical MDR is

associated with the overexpression of the plasma membrane ABC (ATP-binding cassette) transporters, resulting in
increased efflux of the drugs from the cancer cells. In the last few years a vast number of strategies have been

proposed and tested to reverse the MDR. One of the most promising methods for modulation of the classical MDR

phenotype is RNA interference (RNAi). RNAi is a conserved biological response to dsRNA, which results in sequence-
specific gene silencing. The RNAi is a powerful tool, which gives an opportunity for highly specific inhibition

of expression of the individual ABC transmembrane proteins. The results obtained from the experiments in the preclini-

cal models with the usage of RNAi are very encouraging. It gives hope that the MDR problem will finally be overcome.
KEY WORDS: multidrug resistance (MDR), RNA interference (RNAi), Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS)

S T R E S Z C Z E N I E

Oporność wielolekowa, zarówno pierwotna jak i nabyta, jest obecnie jedną z głównych przyczyn niepowodzenia terapii
nowotworów. Etiologia oporności wielolekowej jest wieloczynnikowa, jednak klasyczną oporność wielolekową wiąże

się najczęściej z nadmierną ekspresją transporterów błonowych należących do rodziny białek ABC (ABC family),
których nadekspresja powoduje nadmierny wyrzut leków z komórek nowotworowych i zmniejszenie skuteczności terapii.
W ostatnim czasie opracowano i testowano liczne strategie mające na celu zwalczanie oporności wielolekowej nowo-

tworów. Ostatnio jedną z najbardziej obiecujących metod terapii okazała się interferencja RNA, określana jako RNAi.

Jest to etiologicznie konserwatywna odpowiedź komórki na krótki, 2-niciowy RNA (dsRNA), prowadząca do specyficz-
nej, zależnej od sekwencji dsRNA inhibicji ekspresji homologicznego genu. Technika RNAi umożliwia specyficzne

zahamowanie ekspresji białek uczestniczących w powstawaniu fenotypu MDR. Rezultaty eksperymentów przeprowa-

dzanych w warunkach in vitro z wykorzystaniem techniki RNAi okazały się bardzo zachęcające. Daje to nadzieje
na szybsze i skuteczniejsze rozwiązanie problemu oporności wielolekowej u pacjentów z chorobami nowotworowymi.

SŁOWA KLUCZOWE: oporność wielolekowa, interferencyjny RNA (RNAi), potranskrypcyjne wyciszanie

ekspresji genów (PTGS)

Adres do korespondecji:
Dr n. biol. Ilona Bednarek
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śl. AM
ul. Narcyzów 1, 41–200 Sosnowiec
Tel./faks:([phone]
e-mail: [e-mail]

Annnales Academiae Medicae Silesiensis 2005, 59, 3, 209–218
Copyright © Śląska Akademia Medyczna
ISSN 0208–56077

210

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

Wstęp

Choroby nowotworowe obecnie zalicza się do jednej

z najczęstszych przyczyn zgonów wśród populacji ludzkiej.
Wysoka śmiertelność często jest spowodowana zbyt późną
lub nietrafną diagnostyką samej choroby oraz wciąż nie-
dostatecznie efektywną terapią. Są to między innymi przy-
czyny, dla których wielu badaczy i lekarzy skupia się na
opracowaniu skutecznej i wydajnej terapii nowotworów
zmniejszającej śmiertelność chorych.

Chemioterapia zajmuje ważne miejsce w leczeniu cho-

rób nowotworowych. Często obserwuje się dalszy wzrost
komórek nowotworowych w obecności zastosowanego
chemioterapeutyku lub całej grupy zastosowanych związ-
ków. Wiąże się to głównie z wytworzeniem tzw. mecha-
nizmu oporności wielolekowej komórek nowotworowych.
Oporność wielolekowa (MDR, multidrug resistance) to
swego rodzaju „fenomen” komórek nowotworowych,
dzięki któremu komórki eksponowane na działanie jed-
nego czynnika chemioterapeutycznego rozwijają opor-
ność krzyżową w stosunku do dużej grupy ksenobioty-
ków niezwiązanych ze sobą pod względem budowy struk-
turalnej i funkcjonowania [1, 2]. W niektórych typach
nowotworów obserwuje się również tzw. pierwotną opor-
ność wielolekową, objawiającą się bez wcześniejszej eks-
pozycji na chemioterapeutyki [2]. Dotychczas nie pozna-
no całkowicie podstaw mechanizmu MDR, wiadomo jed-
nak, że etiologia fenotypu MDR jest złożona i wieloczyn-
nikowa [2]. Oporność wielolekowa może zależeć m.in.
od: nadmiernej aktywacji enzymów detoksykacyjnych, za-
burzeń w przekierowywaniu cyklu komórkowego na szlak
apoptotyczny (np. mutacje w obrębie genu p53, zachwia-
na równowaga białek pro- i antyapoptotycznych), nasi-
lonego efluksu ksenobiotyków z komórki docelowej za
pośrednictwem transporterów błonowych, czy wreszcie
zmniejszonego wychwytu leku ze środowiska zewnątrz-
komórkowego [1, 3]. Uważa się, że tylko dogłębne po-
znanie mechanizmu plejotropowej oporności pozwoli ją
pokonać, a tym samym zwiększy zakres działania dotych-
czas stosowanych leków cytotoksycznych oraz umożliwi
syntezę nowych leków odpowiednio zmodyfikowanych
w celu „omijania” problemu oporności wielolekowej.

Białka transportowe błon komórkowych
jako główne czynniki odpowiedzialne
za zjawisko oporności wielolekowej

Etiologię klasycznej oporności wielolekowej najczęściej

łączy się z nadmierną ekspresją i nieprawidłowościami
w funkcjonowaniu białek transportowych błon komórko-
wych [2]. Białka te należą do nadrodziny białek ABC (ATP-
biniding cassette), których aktywność zależy od energii
powstałej z hydrolizy ATP (adenosine triplosphate) [4].
Białka ABC są osadzone w błonach plazmatycznych i dzia-
łają jak pompy-transportery przenoszące określone sub-
straty przez błonę wbrew gradientowi stężeń do środowi-
ska zewnętrznego [1]. Działanie białek transportowych ma

na celu ochronę komórek przed wniknięciem do ich wnę-
trza egzogennych substancji toksycznych, co potencjalnie
mogłoby doprowadzić do śmierci komórki. Ze względu na
posiadane funkcje transportery rodziny ABC lub ich ana-
logi można spotkać w wielu organizmach nie tylko ludz-
kich, ale i zwierzęcych, roślinnych czy bakteriach. Trans-
portery ABC występują w różnych tkankach (np. płuca,
łożysko, jelito, mózg, serce, nerki). Białka rodziny ABC
mogą przenosić różne substraty, włączając jony, hormo-
ny, lipidy, leki i inne ksenobiotyki [5]. Charakterystykę
wybranych białek należących do rodziny ABC oraz białka
oporności płuc (LRP, lung resistance-related protein), któ-
remu również przypisuje się udział w powstawaniu feno-
typu MDR, przedstawiono w tabeli I.

W organizmie ludzkim transportery ABC pełnią bar-

dzo ważne funkcje fizjologiczne. Eliminacja ksenobioty-
ków i toksyn jest niezbędna dla prawidłowego funkcjono-
wania komórek wątroby, nerek czy układu pokarmowe-
go. Ponadto białka transporterowe uczestniczą w regula-
cji przepuszczalności komórek łożyska i ośrodkowego ukła-
du nerwowego, będąc głównym elementem barier: łoży-
skowej i krew–mózg; tym samym zapobiegają one ekspo-
zycji wrażliwych komórek nerwowych oraz komórek roz-
wijającego się płodu na szkodliwe czynniki cytotoksyczne
[2]. Białka ABC uczestniczą także w licznych procesach
metabolicznych, a mutacja w obrębie genów kodujących
te białka może prowadzić do poważnych chorób metabo-
licznych. Przykładami mogą być dziedziczny niedobór biał-
ka oporności wielolekowej 2 (MRP, multidrug resistance-
associated protein) powodujący syndrom Dubina-Johnso-
na, czy też niedobór MRP6, prowadzący do pseudoxan-
thoma elasticum — wielosystemowego zaburzenia ataku-
jącego skórę, oczy i naczynia krwionośne [5]. Budowa
transporterów ABC jest ściśle podporządkowana pełnio-
nym przez nie funkcjom i wykazywanym własnościom, dla-
tego białka te mają w swej sekwencji aminokwasowej za-
wsze miejsce przyłączania ATP (Walker motifs), występu-
jące w obrębie cytozolowej domeny wiążącej nukleotydy
(NBD, nucleotide binding domain) oraz kilka tandemo-
wych powtórzeń hydrofobowych domen transbłonowych,
przybierających formy segmentów lub helis (TMD, trans-
membrane domains). Sekwencje te są ułożone naprzemien-
nie [8]. Domena transbłonowa jest zaangażowana w przy-
łączanie substratu i jego efluks, domena wiążąca nukle-
otydy przyłącza ATP i uczestniczy w jego hydrolizie [4].
W organizmach eukariotycznych większość białek ABC
ma zwykle 4 domeny, np. glikoproteina P ma strukturę:
NH2-TMD1-NBD1-TMD2-NBD2-COOH. Mniejsza gru-
pa białek rodziny ABC, określana mianem półtranspor-
terów, ma pojedynczą domenę transbłonową i wiążącą
nukleotydy. Do tej grupy należy m.in. białko oporności
raka piersi (BCRP, breast cancer resistance protein): NH2-
-TMD1-NBD1-COOH [1]. Rodzinę białek ABC podzie-
lono zależnie od występujących podobieństw w budowie
domen transbłonowych i miejsc przyłączania nukleotydów.

Pierwszym opisanym transporterem błonowym, które-

go nadekspresja wykazywała związek z powstaniem

211

Magdalena Czajka–Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

oporności wielolekowej, była glikoproteina P (P-gp opisy-
wana również jako PGY1, MDR1, ABCB1). Jest ona zbu-
dowana z 2 domen transbłonowych (każda złożona z 6 seg-
mentów transbłonowych), które oddziałują z wieloma obo-
jętnymi lub dodatnio naładowanymi substancjami hydro-
fobowymi. Zbliżoną budową charakteryzują się także biał-
ka MRP4 i MRP5, podczas gdy MRP1, MPR2, MRP3 oraz
MRP6 mają 5 dodatkowych segmentów transbłonowych
na N-końcu [5]. Dotychczas poznano i opisano 48 białek
należących do rodziny ABC. W przypadku 10 białek udo-
wodniono ich ścisły związek z powstawaniem oporności
wielolekowej (np. MDR1, MRP1-6, BCRP), podczas gdy
nadekspresję 2 innych białek łączy się z powstawaniem
fenotypu MDR [2]. W przypadku posiadania przez ko-
mórkę fenotypu oporności wielolekowej, związanego z nad-
ekspresją białek rodziny ABC, dochodzi do nadmierne-
go, niekontrolowanego wyrzutu substancji egzogennych
z komórki za pośrednictwem transporterów ABC. Powo-
duje to znaczny spadek akumulacji leku w przestrzeni wew-
nątrzkomórkowej, co prowadzi do zmniejszenia ilości te-
rapeutyku mogącego osiągnąć swoje miejsce docelowe.
Ostatecznie obserwuje się spadek skuteczności leku
i w efekcie terapia jest nieskuteczna. Przyczyną nasilone-
go efluksu może być nadmierna ekspresja białek trans-
portowych. Według Scotto oporność wielolekową nowo-
tworu, związaną z nadekspresją białka P-gp, można po-
dzielić zależnie od mechanizmu jej powstania na 3 typy:
oporność pierwotną, nabytą i przejściową [5]. Pierwotna
oporność wiąże się z nasiloną konstytutywną ekspresją

genu MDR1 w komórkach; może ona wynikać z charak-
teru tkanki, z której wywodzi się nowotwór, lub też być
rezultatem zmian w ekspresji genu represyjnego dla genu
MDR. W tym przypadku chemioterapia ma mały wpływ
na rozwój fenotypu MDR. Oporność nabyta powstaje na
bazie komórek nowotworowych pierwotnie wrażliwych na
chemioterapię. W czasie leczenia dochodzi do pojawienia
się i wzrostu subpopulacji zmutowanych komórek, cechu-
jących się nadekspresją glikoproteiny P. W tym przypadku
chemioterapia eliminuje tylko wrażliwe komórki, a zmu-
towana grupa komórek pozostaje i nadal się rozwija. Trzeci
typ oporności, określany też jako indukowany, dotyczy
komórek nowotworowych pierwotnie wrażliwych na leki,
które nagle pod wpływem stosowanej chemioterapii in-
dukują nasiloną ekspresję genu MDR1, co pozwala im na
przetrwanie terapii i dalszy rozwój [5]. Inną przyczyną
nasilonego wyrzutu leku z komórek może być nieprawi-
dłowa ekspresja białek rodziny ABC. Zmieniona, wadli-
wa ekspresja białek transportowych może tłumaczyć fakt
istnienia tak dużej rozbieżności w budowie strukturalnej
substratów przenoszonych przez jeden transporter. Doy-
le i Ross potwierdzili, że mutacja w obrębie białka BCRP
w pozycji 482 polegająca na wymianie aminokwasu (argi-
niny na treoninę lub glicynę) zmienia specyficzność sub-
stratową tego białka [1]. Wystąpienie u pacjenta oporno-
ści komórek nowotworowych wobec przyjmowanego leku
wymusza zwiększenie stosowanej dawki leku lub włączenie
do terapii dodatkowych, farmakologicznie aktywnych czyn-
ników w celu uzyskania pożądanego efektu terapeutycz-

Tabela I. Charakterystyka wybranych transporterów rodziny ABC i białka LRP zaagażowanych w powstawanie fenotypu MDR, przykłady

ich substratów i miejsc wystepowania [5–7]

Table I. Characteristics of LRP protein and chosen ABC transporters involved in MDR phenotype forming; substrates and localization [5–7]

Gen

Alternatywna nazwa

Przykłady substratów

Przykłady miejsca występowania

MDR1

ABCB1, PGY1, P-GP

Kolchicyna, doxorubicyna,

Tkanki o funkcji sekrecyjnej

winblastyna, winkrystyna

MRP1

ABCC1

Kolchicyna, etopozyd, VP16

Płuca, jądra

MRP2

ABCC2, cMOAT

Winblastyna, sulfinpyrazon

Wątroba, jelito, nerki

MRP3

ABCC3

Metotreksat, etopozyd

Nerki, jelito

MRP4

ABCC4

Puryny i analogi nukleozydów

Powszechnie w wielu tkankach

MRP5

ABCC5

Puryny i analogi nukleozydów,

Wątroba, powszechnie w wielu tkankach

mitoxantron, topotecan, doxorubicyna

MRP6

ABCC6

Etopozyd, doxorubicyna

Wątroba, nerki

MRP8

ABCC11

5-FU, ddC, PMEA

Wątroba, gruczoły piersiowe

BCRP

ABCG2, MXR1, ABCP

Topotekan, daunorubicyna, doxorubicyna

Mózg, nerki, płuca, serce

LRP

Daunorubicyna

Nabłonek oskrzeli, jelito,
komórki okładzinowe żołądka, kanaliki
proksymalne nerek, kora nadnerczy

MDR (multidrug resistance) — oporność wielolekowa; MRP (multidrug resistance-associated protein) — białka oporności wielolekowej; BCRP (breast cancer

resistance protein) — białka oporności raka piersi; LRP (lung resistance-related protein) — białka oporności płuc

212

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

nego. To jednak automatycznie wiąże się ze wzrostem tok-
syczności i zwiększeniem działań niepożądanych terapii.

Możliwości tłumienia zjawiska oporności
wielolekowej. Chemouczulacze

W związku z coraz częstszym pojawianiem się oporno-

ści nowotworu na stosowane chemioterapeutyki, koniecz-
ne okazało się poszukiwanie nowych strategii terapii w celu
odwrócenia czy zapobiegania oporności wielolekowej [9].
Duże nadzieje wiązano z tzw. terapią objawową, polega-
jącą na opracowaniu czynnych farmakologicznie modula-
torów MDR, tzw. chemouczulaczy, których działanie spro-
wadza się do inhibicji funkcjonowania pomp-transporte-
rów, a tym samym — zmniejszania wyrzutu leku z komór-
ki. Działanie stosowanych chemouczulaczy często spro-
wadza się do wypierania leków z ich połączeń z pompami
na podstawie mechanizmu inhibicji konkurencyjnej [10].
Do najczęściej stosowanych inhibitorów MDR stosowa-
nych w warunkach in vitro należą blokery kanałów wap-
niowych, antagoniści kalmoduliny, peptydy hydrofobowe,
antybiotyki, inhibitory kinazy białkowej, pochodne hor-
monów lub flawonidy [11]. Dużą przeszkodą w wykorzy-
stywaniu modulatorów MDR okazała się konieczność sto-
sowania ich w bardzo dużych dawkach w celu uzyskania
niezbędnego wewnątrzkomórkowego stężenia prowadzą-
cego do ujawnienia się ich działania cytotoksycznego [12].
Duże dawki chemouczulaczy mogą jednak powodować
wiele poważnych działań niepożądanych terapii, jak np.
zaburzenia przewodzenia w komórkach mięśnia sercowe-
go, hipotensja, hiperbilirubinemia, czy immunosupresja
[12]. Dodatkowo wiele modulatorów MDR oddziałuje
z innymi białkami transportującymi oraz licznymi układa-
mi enzymatycznymi (np. wywołują izoenzym 3A4 cytochro-
mu p450), prowadząc do nieprzewidywalnych interakcji
farmakokinetycznych [4]. Innym niezwykle istotnym utrud-
nieniem terapii z udziałem chemouczulaczy stało się wy-
twarzanie przez niektóre nowotwory tzw. trzeciorzędowej
oporności, w tym wypadku skierowanej wobec stosowa-
nych modulatorów MDR [12].

Regulacja zjawiska oporności wielolekowej
na poziomie ekspresji genów

Ze względu na liczne przeszkody w modulowaniu zja-

wiska MDR na poziomie białek zaangażowanych w ten
proces alternatywą stała się terapia przyczynowa, obejmu-
jąca regulację ekspresji białek ABC. Regulacja procesu
transkrypcji wiąże się z zastosowaniem inhibitorów wią-
żących się z matrycowym DNA (np. oligonukletydów, bia-
łek, związków chemicznych) lub modulacją działania re-
gulatorów transkrypcji. Regulacja transkrypcji jest proce-
sem bardzo złożonym, gdyż każda grupa genów podlega
regulacji przez wyspecjalizowany, wielobiałkowy kompleks
zawierający zarówno wspólne, podstawowe komponenty
(np. czynniki transkrypcyjne), jak również unikatowe, spe-

cyficzne komponenty (np. kompleks przenoszący sygnał
zainicjowany przez stymulację metaboliczną lub środowi-
skową) [5]. Konstytutywna ekspresja niektórych białek, np.
glikoproteiny P lub MRP, może w niektórych komórkach
podlegać regulacji przez komponenty zaangażowane
w transformację nowotworową komórki. Istnieją donie-
sienia potwierdzające fakt, że forma dzika białka p53 może
wyciszać transkrypcję genu MDR1, podczas gdy całkowi-
ta inhibicja ekspresji białka p53 lub obecność w komórce
niektórych mutantów białka p53 może aktywować ekspre-
sję genu MDR1 [13–15]. Ponadto induktorami ekspresji
białka P-gp mogą być: metale ciężkie, szok termiczny, sta-
ny zapalne, kancerogeny, hipoksja oraz promieniowanie
X i UV [5, 16].

Alternatywnym sposobem modulowania ekspresji bia-

łek rodziny MDR jest inhibicja zachodząca na poziomie
translacji. W tym przypadku celem modulacji staje się
matrycowy RNA znajdujący się w cytoplazmie. Dotych-
czasowe próby inhibicji translacji polegały m.in. na wpro-
wadzaniu do komórki specjalnie zaprojektowanych oligo-
nukletydów antysensownych, które posiadają sekwencję
komplementarną do wybranego odcinka mRNA, przyłą-
czają się do niego, uniemożliwiając syntezę łańcucha pep-
tydowego [12, 17]. Inną techniką wyciszania genów docelo-
wych na poziomie mRNA jest stosowanie rybozymów, czyli
oligonukleotydów o właściwościach katalitycznych. Oligo-
nukleotydy te, odpowiednio zaprojektowane, przyłączają się
do docelowego mRNA i dzięki posiadanej aktywności en-
donukleazy przecinają łańcuch nukleotydowy mRNA, unie-
możliwiając tym samym syntezę określonego białka.

Nową, konkurencyjną i, jak się często podkreśla, bar-

dziej wydajną i specyficzną techniką wyłączania genów jest
metoda interferencji RNA (RNAi, RNA interference).
Mimo że jest to stosunkowo nowa metoda, to jej wysoka
specyficzność i potencjalne możliwości zastosowania w na-
uce i medycynie budzą coraz większe zainteresowanie.
Świadczyć o tym może ciągle rosnąca liczba publikacji na-
ukowych poświęconych tematyce RNAi, np. liczba wyszu-
kanych artykułów w bazie internetowej PubMed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) na hasło „RNA interferen-
ce” w 1998 roku wynosiła 5 publikacji, w 2000 roku — 71,
a w 2003 roku — już 898 i obecnie liczba ta nieustannie
wzrasta. Warto również uwzględnić fakt, że czasopismo
„Science” uznało odkrycie RNAi za przełomowe wyda-
rzenie 2002 roku.

Metoda RNAi — regulator ekspresji genów

Pierwsze doniesienia o możliwości wyciszania genów

przy udziale RNA opublikowano w połowie lat 90. XX
wieku. Wówczas Guo i Kemphus oświadczyli, że po wpro-
wadzeniu do organizmu nicienia Caenorhabditis elgans
mieszaniny sensownego i antysensownego RNA zaobser-
wowali wyciszenie odpowiedniego, komplementarnego
genu. Tę informację zgłębił Fire, który wraz ze współpra-
cownikami w 1998 roku ogłosił, że to właśnie 2-niciowy

213

Magdalena Czajka–Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNA odpowiada za proces wyciszania genów w Caenor-
habditis elegans [18]. Od tego czasu w celu pełniejszego
opisania eksperymentalnego wykorzystania RNA do in-
hibicji ekspresji nowo odkrytą metodę zaczęto określać
mianem RNA interference (RNAi). Mechanizm RNAi za-
obserwowano również w organizmach roślin, niektórych
bezkręgowców i kręgowców. Następnie dowiedziono, że
jest to ewolucyjnie konserwatywny mechanizm obecny od
dawna w świecie zwierzęcym i roślinnym [9, 19]. Fizjolo-
giczna rola mechanizmu RNAi sprowadza się głównie do
ochrony genomu komórki gospodarza przed inwazją mo-
bilnych nośników informacji genetycznej, takich jak trans-
pozony czy wirusy [19–23]. Podejrzewa się również, że
cząstki 2-niciowego RNA zaangażowane w mechanizm
RNAi mogą odpowiadać za metylację wybranych sekwen-
cji promotorowych DNA, hamując w ten sposób transkryp-
cję wybranych genów [24–26]. Możliwe, że metylacja DNA
ma na celu inhibicję rozwoju retrowirusów, których mate-
riał genetyczny zintegrował się z genomem zainfekowa-
nej komórki [27]. W ostatnio prowadzonych badaniach na
komórkach drożdży dowiedziono, że mutanty pozbawio-
ne komponentów niezbędnych do istnienia zjawiska RNAi
tracą zdolność do metylacji chromatyny i supresji trans-
pozonów w genomie [28]. Może to sugerować wpływ me-
chanizmu RNAi na strukturę chromatyny w jądrze komór-
kowym. Jak dotąd w pełni nie poznano mechanizmu dzia-
łania RNAi. Pierwsze obserwacje przebiegu RNAi po-
twierdzały istnienie korelacji między destabilizacją mRNA
a wprowadzaniem komplementarnego
dsRNA do komórki [29, 30].

Obecnie wiadomo, że RNAi przebiega w komórkach

w 2 etapach: inicjacyjnym i efektorowym. Mechanizm
RNAi zostaje w komórce zainicjowany przez enzym nale-
żący do rodziny RNazy III. Enzym ten specyficznie tnie
wprowadzoną do komórki, długą, 2-niciową cząsteczkę
RNA (zarówno pochodzenia egzo- lub endogennego) na
krótkie, długości rzędu 21–23 nukleotydów dsRNA
(dsRNA, double stranded RNA) [23, 31]. Powstałe krótkie
oligonukleotydy, określane mianem siRNA (siRNA, short
interefering RNA), mają po 2–3 niesparowane nukleotydy
na każdym końcu 3’ (tzw. lepkie końce), grupę fosfora-
nową na końcach 5’ oraz hydroksylową na końcach 3’. Jed-
na z nici siRNA, określana jako antysensowna, ma sekwen-
cję nukleotydów komplementarną do sekwencji mRNA
wybranego odcinka docelowego genu. Taka budowa po-
wstałych krótkich, interferujących oligonukleotydów RNA
(siRNA) jest niezbędna do prawidłowego przebiegu eta-
pu efektorowego [32]. Enzym katalizujący reakcję „cię-
cia” długiego dsRNA należy pod względem swojej budo-
wy do III klasy enzymów RNazy III. Rodzina enzymów
III klasy, nazwana DICER, jest ewolucyjnie konserwatyw-
na i można ją znaleźć w wielu organizmach w świecie roś-
linnym i zwierzęcym [33]. Rodzina DICER składa się
z N-końcowej domeny helikazowej, zależnej od ATP, do-
meny PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), podwójnej domeny
RNazy III i domeny przyłączającej dsRNA (dsRBD) [33].

Uważa się, że enzymy RNazy III działają jako dimery, dla-
tego DICER dzięki posiadanym dwóm domenom RNazy
III może katalizować jednorazowo przerwanie wiązań fos-
fodiestrowych kwasu nukleinowego w 4 miejscach, two-
rząc w ten sposób siRNA o typowej charakterystyce. Do-
tychczas odkryte enzymy RNazy III nie wymagały do swo-
jego funkcjonowania energii czerpanej z hydrolizy ATP,
tym bardziej może zastanawiać obecność domeny ATP-
-zależnej w strukturze DICER. Jednak domena helikazo-
wa może sugerować konieczność chwilowego rozdziele-
nia nici dsRNA tuż przed przecięciem 2-niciowego RNA
[33]. Alternatywnie ATP może regulować przyłączanie się
DICER do dsRNA lub modulować aktywność domeny
katalitycznej. Należy jednak podkreślić, że badania pro-
wadzone przez Nykänen i wsp. jednoznacznie wskazują
na udział energii pochodzącej z rozpadu ATP w procesie
generowania krótkich siRNA [34]. Różnice w długościach
powstających małych interferencyjnych RNA (21–25 nu-
kleotydów) u różnych organizmów mogą wynikać z typo-
wych dla danego gatunku zmian w domenach katalitycz-
nych enzymu DICER [35]. W przypadku ludzkich komó-
rek niestety nie jest możliwe zainicjowanie zjawiska RNAi
przez wprowadzenie długołańcuchowego dsRNA. Prze-
szkodą jest indukcja w komórkach większości ssaków nie-
specyficznej odpowiedzi interferonowej. Odpowiedź in-
terferonowa jest swego rodzaju mechanizmem obronnym
komórek, uruchamianym m.in. w czasie infekcji wiruso-
wych. W odpowiedzi tej wprowadzony obcy materiał ge-
netyczny aktywuje kinazę białkową zależną od dsRNA
(PKR, dsRNA-dependent protein kinase) oraz 2’,5’-oligoA
syntetazę (2’,5’-AS) [36–38]. Aktywna forma PKR powo-
duje zahamowanie translacji poprzez fosforylację małej
podjednostki eukariotycznego czynnika inicjacji trans-
lacji eIF2a, a zaaktywowana 2’,5’-AS katalizuje proces
degradacji mRNA za pośrednictwem rybonukleazy L [36–
–38]. Zainicjowana inhibicja ekspresji genów ma charak-
ter niespecyficzny i nie zależy od sekwencji wprowadzo-
nego długoniciowego dsRNA, a częstym jej następstwem
jest szybka śmierć komórki (zarówno na drodze apopto-
zy, jak i na ścieżce nieapoptotycznej) [22]. Ścieżki interfe-
ronowej nie stwierdzono w niezróżnicowanych komórkach
embrionalnych, co umożliwiło zainicjowanie specyficzne-
go wyciszania ekspresji genów za pomocą długiego dsR-
NA w mysich oocytach lub embrionach, jak również ko-
mórkach nowotworowych wywodzących się z komórek em-
brionalnych [38, 39]. Ta ostatnia informacja jest bardzo
istotna dla prowadzenia dalszych badań nad nowotwora-
mi wywodzącymi się z tego typu komórek. Kittler i Buch-
holz w swoich badaniach stwierdzili, że minimalna dłu-
gość dsRNA, która indukuje śmierć komórki w następ-
stwie odpowiedzi interferonowej dla komórek ssaków,
wynosi 30 par zasad [40]. Przeszkodę tę ostatecznie poko-
nano, wprowadzając do komórek gotowe, laboratoryjnie
syntetyzowane 21- 22-nukleotydowe siRNA [20, 22].

Etap efektorowy, obejmujący degradację mRNA, za-

chodzi w cytoplazmie, w przeciwieństwie do etapu inicju-

214

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

jącego, który wg Waterhouse’a może wystąpić w jądrze
komórkowym [27]. Hipotezę o przebiegu etapu efektoro-
wego w cytoplazmie prawdopodobnie potwierdzają bada-
nia z wykorzystaniem znaczników fluorescencyjnych wpro-
wadzonych do siRNA, które wykazały, że w 48 godzin po
transfekcji oligonukleotydy znajdowały się w pobliżu bło-
ny jądrowej po stronie cytoplazmy [41]. Istnieją założe-
nia, że siRNAs znajdują się w cytoplazmie w pobliżu por
błony jądrowej i odgrywają rolę, tzw. „skanerów” trans-
kryptów wydostających się z jądra komórkowego, dzięki
czemu mogą kontrolować większość mRNA wchodzących
do cytoplazmy [41]. Powstałe siRNAs przyłączają się do
wielobiałkowego kompleksu enzymatycznego, określane-
go jako RISC (RISC, RNA-induced silencing complex),
który następnie ulega aktywacji. Przejście RISC ze stanu
latencji do stanu aktywnego odbywa się na drodze roz-
działu nici kwasów nukleotydowych siRNA [11, 34]. Jed-
noniciowe siRNAs przyłączone do RISC występują w roli
przewodnika i naprowadzają kompleks na homologiczny
mRNA. Nie stwierdzono jednak dokładnie, który enzym
odpowiada za proces rozdziału nici siRNA; podejrzewa
się udział helikazy [29]. Istnieją także dowody, że proces
rozdziału nici RNA zależy od energii dostarczonej z hy-
drolizy ATP [34]. Należy podkreślić, że rozpoznawanie
sekwencji docelowej mRNA przez naprowadzającą nić
siRNA jest bardzo specyficzne — wystarczy niezgodność
1–2 nukleotydów między mRNA a 1-niciowym RNA na-
prowadzającym, by zapobiec dopasowaniu się RISC do
danego fragmentu mRNA i tym samym uniemożliwić
jego degradację. Uważa się, że antysensowna nić siRNA
naprowadza kompleks enzymatyczny na docelowy trans-
krypt, dlatego w przypadku nici sensownej siRNA 2 lub
3 niesparowane nukleotydy na końcu 3’ nie muszą być
komplementarne do degradowanego mRNA. Po znale-
zieniu komplementarnej sekwencji docelowej następuje
hybrydyzacja RISC do mRNA i kompleks enzymatyczny
przecina hybrydę: siRNA/mRNA w miejscu znajdującym
się w środku (w odległości około 10–12 nukleotydów od
końca 3’) rozpoznanej 21-nukleotydowej sekwencji [37].
Nie poznano dokładnie enzymu odpowiedzialnego za
przecięcie obu nici, wiadomo jednak, że musi on posia-
dać właściwości endonukleazy. Według Waterhouse’a oba
etapy mechanizmu RNAi można ująć w następującym
stwierdzeniu: najpierw dsRNA jest przecinany periodycz-
nie, w odstępach ~21 nukleotydów od strony obu koń-
ców dsRNA, a następnie docelowy mRNA ulega prze-
cięciu z tą sama częstotliwością, ale w miejscu nacięcia
przesuniętym o ~10 nukleotydów [27]. Mechanizm
RNAi schematycznie przedstawiono na rycinie 1.

Przypuszcza się, że duży udział w procesie RNAi mogą

odgrywać białka należące do rodziny Argonaute, zwane
czasem ze względu na swoją budowę białkami PPD (PPD,
PAZ and PIWI domains) [34, 42]. Białka te mogą odpo-
wiadać za interakcje z DICER lub spełniać funkcję prze-
nośnika siRNA do odpowiedniego kompleksu enzymatycz-
nego. Może za tym przemawiać silnie zasadowy charakter

białek Argonaute, co z kolei sprzyja ich wiązaniu z cząs-
teczkami kwasu nukleinowego [43]. Dodatkowym i bar-
dzo istotnym „fenomenem” RNAi jest możliwość jego
rozprzestrzeniania się na komórki sąsiednie i potomne.
Mechanizm tego procesu sugeruje jednoznacznie koniecz-
ność obecności w komórce enzymu amplifikującego efekt
wyciszania. Podejrzewa się, że rolę tę pełni polimeraza
RNA zależna od RNA [22]. Byrom i wsp. wykazali, że
w czasie podziału komórek siRNA jest zlokalizowane do-
kładnie w centralnym regionie komórki, co sugeruje, że
jest przekazywany obu komórkom potomnym [41]. Nie-
stety, badania wykazują, że w przypadku ssaków efekty
wywołane RNAi mają charakter przejściowy, okres jego
utrzymywania się zależy od liczby wprowadzonych cząstek
siRNA oraz częstości podziału komórek [41]. Według
Kima czas utrzymywania się efektu RNAi w komórkach
ssaków równa się 5 czasom podwojenia liczby komórek
(five doubling limest) [44]. Wskazuje to raczej na brak me-
chanizmu amplifikującego w komórkach ssaków. Stwier-
dzenie to prawdopodobnie potwierdza fakt, że zaledwie
kilka molekuł potrzeba do wywołania RNAi w Caenor-
habditis elegans, podczas gdy w ludzkich komórkach po-

Rycina 1. Mechanizm RNAi w wyciszaniu genów

Figure 1. RNAi mechanism in gene silencing

215

Magdalena Czajka–Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

trzebna jest znacznie większa liczba wprowadzonego
siRNA do uzyskania tego samego efektu wyciszenia [9].

Warto nadmienić, że mechanizm RNAi uznaje się za

jeden ze składowych mechanizmów ogółu procesów po-
transkrypcyjnego wyciszania ekspresji genów (PTGS,
post-transcriptional gene silencing). W potranskrypcyjnej
regulacji ekspresji genów oprócz siRNA mogą uczestni-
czyć również inne cząstki kwasu rybonukleinowego. Przy-
kładem takich cząstek są miRNA (miRNA, microRNA)
— krótkie cząsteczki RNA o długości około 22 nukle-
otydów, które podobnie jak siRNA są ewolucyjnie kon-
serwatywne i występują w świecie roślin i zwierząt. Cząst-
ki miRNA w odróżnieniu od siRNA są 1-niciowe. Inhi-
bicja ekspresji genu przy udziale miRNA odbywa się
prawdopodobnie poprzez tworzenie hybryd miRNA/
mRNA, co uniemożliwia prawidłowy przebieg procesu
translacji docelowych transkryptów. W tym przypadku
nie obserwuje się degradacji mRNA; parametry, takie
jak stabilność mRNA, poziom poliadenylacji czy inicja-
cja translacji wydają się być niezmienione [45]. Dotych-
czas jednoznacznie potwierdzono udział miRNA w re-
gulacji czasu trwania poszczególnych etapów rozwoju
nicienia Caenorhabditis elegans [46]. Nadal poszukuje się
istnienia pewnych analogii między miRNA a mechani-
zmem RNAi. Godnym uwagi jest fakt, że zarówno siR-
NA, jak i miRNA, powstają w komórce na skutek dzia-
łania enzymu DICER na terenie cytoplazmy. Szlak po-
wstawania miRNA jest jednak charakterystyczny — pre-
kursory miRNA (pri-miRNA oraz pre-miRNA) dojrze-
wają na terenie jądra komórkowego, następnie pre-miR-
NA przedostają się do cytoplazmy, przyjmując strukturę
przestrzenną typu „spinki do włosów” (hairpin). W cyto-
plazmie nukleaza DICER przecina je i powstają cząstki
miRNA [47].

Badacze są zdania, że mimo licznych w ostatnim czasie

odkryć wielu nowych cząstek RNA, pełniących istotne
funkcje katalityczne czy regulatorowe, znaczna ich część
nadal pozostaje nieodkryta [48]. Nasuwa to przypuszcze-
nie, że w przyszłości liczba cząstek RNA zaangażowanych
w proces PTGS może jeszcze wrosnąć.

Egzogenne krótkie oligonukleotydy (siRNA)
jako regulatory ekspresji genów

W przypadku ludzkich komórek w celu wyciszenia

genu za pomocą RNAi konieczne jest wprowadzenie
gotowych oligonukleotydów siRNA. Jest to proces skom-
plikowany, ponieważ wymaga wcześniejszego zaprojek-
towania siRNA. Należy precyzyjnie dobrać sekwencje
docelową z uwzględnieniem struktury drugorzędowej
docelowego mRNA i wykluczeniem obecności w geno-
mie komórki drugiej, identycznej sekwencji nukleotydów
[44]. Laboratoryjna synteza cząstek siRNA jest metodą
bardzo kosztowną — tym bardziej, że często konieczne
jest kilkakrotne projektowanie oligonukleotydów dla 1
docelowego transkryptu. Alternatywną i niewątpliwie

tańszą metodą jest enzymatyczny proces preparowania
cząstek siRNA poprzez kontrolowaną inkubację w warun-
kach in vitro długoniciowego dsRNA z oczyszczoną RNazą
III, wyizolowaną z Escherichia coli lub też z oczyszczoną
formą enzymu DICER [36, 49, 50]. Powstałe w wyniku
inkubacji produkty, określane często mianem esiRNA
(esiRNA, endoribonuclease-prepared short interfering
RNA), są mieszaniną cząstek RNA przyłączających się w
wielu miejscach docelowego fragmentu mRNA, co znacz-
nie zwiększa szanse powodzenia eksperymentu [36, 49, 50].
Inną metodą dającą szanse nawet na otrzymanie względ-
nie trwałej ekspresji, a tym samym wysokiej produkcji siR-
NA w komórce, jest projektowanie odpowiednich ekspre-
syjnych wektorów plazmidowych czy wektorów wirusowych
[51]. Wektory te są zbudowane z DNA i zawierają wbudo-
wane sekwencje DNA, odpowiadające sekwencjom obu
nici siRNA. Poszczególne sekwencje DNA znajdują się
pod kontrolą określonych, odrębnych promotorów, dzię-
ki czemu ekspresja obu nici siRNA może przebiegać nie-
zależnie [52]. Bardziej wydajna i korzystna okazała się
ekspresja siRNA w formie struktury „krótkiej spinki do
włosów” (shRNA, short hairpin RNA). Gdy shRNA ule-
gnie ekspresji w komórce, jest rozpoznawana przez DI-
CER i pocięta w celu otrzymania funkcjonalnego siRNA
[21]. Zaletą shRNA jest fakt, że w czasie generowania
wektora DNA niezbędny jest tylko 1 etap ligacji, czyli włą-
czania sekwencji DNA odpowiadającej sekwencji shRNA,
do struktury wektora [21].

Wektory wirusowe — zbudowane na bazie retrowiru-

sów czy lentiwirusów —zwiększają pulę komórek docelo-
wych, gdyż mają one zdolność infekowania komórek dzie-
lących się i nieulegających podziałom. Wektory lentiwiru-
sowe mogą uczestniczyć w inicjacji procesu RNAi w ko-
mórkach macierzystych i transgenicznych modelach zwie-
rząt. Przy wykorzystaniu zrekombinowanych wektorów
adenowirusowych udało się wyciszyć ekspresję genu ko-
dującego białko p53 w komórkach nowotworu piersi
(linia komórkowa MCF7) i nowotworu płuc (linia komór-
kowa A549) [53]. Uważa się jednak, że wektory adenowi-
rusowe, choć wysoce wydajne, pozwalają tylko na przej-
ściową ekspresję siRNA [53]. Z wektorami wirusowymi
i plazmidowymi wiąże się duże nadzieje na wzrost specy-
ficzności terapii względem komórek docelowych, gdyż wy-
bór odpowiedniego, tkankowo-specyficznego promotora
umożliwi ekspresję wektora tylko w wybranych komórkach.

Istotną rolę w wydajności RNAi ma również dobór

metody transferu do wybranych komórek siRNAs lub
wektorów kodujących siRNA. Obecnie najczęściej wyko-
rzystywaną metodą transfekcji jest metoda chemiczna
z udziałem czynników lipofilowych. W piśmiennictwie ist-
nieje wiele doniesień potwierdzających wysoką wydajność
RNAi w komórkach ludzkich po wprowadzeniu siRNA
metodą lipofekcji [9, 12, 26]. Alternatywną techniką wpro-
wadzania siRNA do komórek jest elektroporacja; jednak
ze względu na wysoką śmiertelność transferowanych ko-
mórek metodę tę stosują rzadziej.

216

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

Metoda RNAi — sposób na modulację MDR

Metoda RNAi jest nowatorskim sposobem wyciszania

genów, który będzie mógł przyspieszać rozwój terapii cho-
rób nowotworowych, również w aspekcie znoszenia czy
osłabiania oporności wielolekowej komórek nowotworo-
wych. Badania nad modulacją MDR w nowotworach
z wykorzystaniem opisanej powyżej metody prowadziły
m.in. dwie grupy naukowe, które wyniki swoich ekspery-
mentów badawczych opublikowały w 2003 roku. Nieth
i wsp. podjęli próbę inhibicji ekspresji jednego z białek
transporterowych rodziny ABC — glikoproteiny P (P-gp),
produktu ekspresji genu MDR1. W swoich eksperymen-
tach Nieth wykorzystał ludzkie komórki wywodzące się
z nowotworów żołądka i trzustki [12]. Z kolei Wu i wsp. pró-
bowali wyciszyć ekspresję genu MDR1, w liniach komórko-
wych wyprowadzonych z raka piersi i raka jajników [9].
Linie komórkowe wykorzystane w obu eksperymentach
charakteryzowały się nadmierną ekspresją glikoproteiny
P uzyskaną w wyniku wcześniejszej ekspozycji komórek
na działanie leku wywołującego, będącego substratem dla
P-gp. Obie grupy naukowców prowadziły badania w wa-
runkach in vitro i próbowały zainicjować mechanizm RNAi
przez wprowadzenie do komórek metodą lipofekcji goto-
wych egzogennych siRNAs. Badaczom udało się przepro-
wadzić RNAi w komórkach nowotworowych, w następ-
stwie czego uzyskano obniżoną ekspresję genu MDR1, co
znalazło swoje odzwierciedlenie zarówno na poziomie
transkryptu — mRNA , jak i białka — glikoproteiny P.
Potwierdziły to obie grupy na podstawie techniki Western
Blot i odwrotnej transkrypcji sprzężonej z łańcuchową re-
akcją polimerazową (RT-PCR, reverse transcription-poly-
merase chain reaction). Nieth i wsp. obniżyli poziom eks-
presji P-gp do 9% w przypadku linii komórkowej nowo-
tworu trzustki (91% aktywności wyciszania genu), a do
13% (87% aktywności wyciszania genu) dla komórek no-
wotworu żołądka [12]. Oporność badanych linii komórko-
wych wobec stosowanego leku spadła do 42% wartości po-
czątkowej dla komórek trzustki, a dla komórek żołądka
— do 11% wartości początkowej [12]. Ze względu na róż-
nice w procedurach eksperymentów trudno bezpośrednio
porównać wyniki eksperymentów Nietha i wsp. z efektami
pracy Wu i wsp. Należy jednak wspomnieć, że maksymalna
inhibicja ekspresji P-gp w badaniach Wu wynosiła 65% [9].

Wyniki obu opisanych eksperymentów badawczych

dostarczyły nowych i bardzo przydatnych wskazówek i spos-
trzeżeń dotyczących stosowania i mechanizmu RNAi
w modulacji MDR nowotworów. Przede wszystkim obser-
wacje te potwierdziły możliwość zainicjowania i efektyw-
nego działania RNAi w ludzkich komórkach nowotworo-
wych. Nieth i wsp., testując kilka różnych sekwencji
siRNA, wywnioskowali, że w wyborze sekwencji docelo-
wej warto sugerować się sprawdzonymi dotychczas sekwen-
cjami mRNA dla oligonukleotydów antysensownych czy
rybozymów. Nieth i wsp. przypuszczają, że w tym wypad-
ku zmniejsza się prawdopodobieństwo niepowodzenia eks-
perymentu, choćby poprzez wykluczenie potencjalnych

interakcji ze struktura drugorzędową mRNA [12]. Ponadto
w obu eksperymentach zauważalne były różnice w wydaj-
ności wyciszania tego samego genu zależnie od rodzaju
badanych komórek nowotworowych. Może to świadczyć
o specyficzności tkankowej mechanizmu RNAi, czyli o róż-
nych zdolnościach komórek, wywodzących się z poszcze-
gólnych tkanek do wychwytu siRNA lub o innej efektyw-
ności samego procesu RNAi w poszczególnych tkankach
[12]. Oba przeprowadzone eksperymenty dowiodły wyso-
kiej specyficzności siRNA względem sekwencji docelowej.
Świadczyć o tym może niezmieniona ekspresja białek kon-
trolnych przy zachodzącym jednocześnie spadku ekspre-
sji glikoproteiny P. Ponadto Wu i wsp. ocenili zdolność
transfekowanych komórek do akumulacji leków. Wyniki
ich badania jednoznacznie wykazały, że wzrosła zdolność
akumulacji w komórkach tylko leków będącymi substra-
tami dla P-gp, podczas gdy akumulacja innego leku nie
zmieniła się [9]. Uzyskana przez badaczy inhibicja ekspresji
białka rodziny ABC w obu przypadkach miała charakter
przejściowy i po kilku dniach poziom ekspresji MDR1
wracał do stanu wyjściowego. Nieth i wsp. zaobserwowali,
że widoczny efekt działania RNAi na poziomie białka jest
nieco przesunięty w czasie względem spadku stężenia
mRNA [12]. Wiąże się to prawdopodobnie z długim cza-
sem półtrwania białek P-gp (14–17 godzin).

Osiągnięto zamierzony cel w obu grupach badawczych.

Dzięki metodzie RNAi udało się wpłynąć na ekspresję
białka odpowiedzialnego za powstanie fenotypu oporno-
ści wielolekowej komórek nowotworowych, co pozwoliło
na wzrost (choć przejściowy) stężenia wewnątrzkomórko-
wego stosowanego leku. Stwarza to nowe możliwości
i budzi wielkie nadzieje na modyfikację MDR nowotwo-
rów przy użyciu RNAi, co z kolei byłoby szansą na sku-
teczna terapię antynowotworową dla wielu chorych.

Perspektywy wykorzystania metody RNAi

Metoda RNA interference jest narzędziem o wielu moż-

liwościach, dzięki czemu znajduje duże zastosowanie w na-
uce i medycynie. Odkrycie RNAi umożliwiło tzw. funk-
cjonalną analizę genomu wielu organizmów, a także lep-
sze poznanie funkcji niektórych genów w komórkach bak-
teryjnych czy roślinnych [54, 55]. Metoda RNAi umożli-
wia także regulację czasu trwania poszczególnych etapów
rozwoju w Caenorhabditis elegans [56]. Uważa się, że od-
krycie mechanizmu RNAi znacznie przyspieszy i ułatwi
poznanie funkcji wszystkich genów zawartych w genomie
ludzkim. Obecnie część naukowców, wykorzystując tech-
nikę RNAi, bada funkcje genów podejrzanych o udział
w procesie transformacji nowotworowej komórek. Są
wśród nich geny kodujące białka uczestniczące w proce-
sie apoptozy, w regulacji cyklu komórkowego, transdukcji
sygnału wewnątrzkomórkowego czy białka supresorowe
[40]. Mechanizm RNAi rozpatruje się jako metodę przy-
datną do poszukiwania specyficznych terapeutyków. Wie-
le współczesnych laboratoriów interesuje się wykorzysta-

217

Magdalena Czajka–Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

RNAi w modulacji oporności wielolekowej

niem RNAi do kontroli przebiegu infekcji wirusowej. Wy-
kazano już zdolność RNAi do inhibicji infekcji wirusem
HIV, polio, oraz wirusami zapalenia wątroby typu B i C
[57–60]. Metoda RNAi daje również szanse na leczenie
wielu chorób związanych z zaburzeniami genetycznymi
i neurodegeneracyjnymi [61].

P I Ś M I E N N I C T W O

1.

Doyle L.A., Ross D.D. Multidrug resisitance mediated by the breast can-
cer resistance protein BCRP (ABCG2). Oncogene 2003; 22: 7340–7358.

2.

Thomas H., Coley H.M. Overcoming multidrug resistance in cancer: an
update on the clinical strategy of inhibiting P-glycoprotein. Cancer Con-
trol 2003; 10: 159–165.

3.

Arts H.J.G., Van der Zee A.G.J., de Jong S., de Vries E.G.E. Options for
modulation of drug resistance in ovarian cancer. Int. J. Gynecol. Cancer
2000; 10: 47–52.

4.

Jones P.M., George A.M. Mechanism of ABC transporter: a molecular
dynamics simulation of a well characterized nucleotide-binding subunit.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 12639–12644.

5.

Scotto K.W. Transcriptional regulation of ABC drug transporters. Onco-
gene 2003; 22: 496–7511.

6.

Michieli M., Damiani D., Ermacora A. i wsp. P-glycoprotein, lung resi-
stance-related protein and multidrug resistance associated protein in de
novo acute non-lymphocytic leukaemias: biological and clinical implica-
tions. Br. J. Haematol. 1999; 104: 328–335.

7.

Michieli M., Damiani D., Ermacora A. i wsp. P-glycoprotein (PGP), lung
resistance-related protein (LRP) and multidrug resistance-associated pro-
tein (MRP) expression in acute promyelocytic leukaemia. Br. J. Haema-
tol. 2000; 108: 703–709.

8.

Kast C., Canfield V., Levenson R., Gros P. Transmembrane organization
of mouse P-glycoprotein determined by epitope insertion and immuno-
fluorescence. J. Biol. Chem. 1996; 271: 9240–9248.

9.

Wu H., Hait W.N., Yang J.-M. Small interfering RNA-induced suppression
of MDR1 (P-Glycoprotein) restores sensitivity to multidrug-resistant can-
cer cells. Cancer Res. 2003; 63: 1515–1519.

10. Fojo T., Bates S. Strategies for reversing drug resistance. Oncogene

2003; 22: 7512–7523.

11. Di Pietro A., Conseil G., Perez-Victoria J.M. i wsp. Modulation by flavo-

noids of cell multidrug resistance mediated by P-glycoprotein and related
ABC transporters. Cell. Mol. Life Sci. 2002; 59: 307–322.

12. Nieth C., Prebisch A., Stege A., Lage H. Modulation of the classical

multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi). FEBS
Lett. 2003; 545: 144–150.

13. Bahr O., Wick W., Weller M. Modulation od MDR/MRP by wild-type and

mutant p53. J. Clin. Invest. 2001; 107: 643–646.

14. Sampath J., Sun D., Kidd V.J. i wsp. Mutant p53 Cooperates with ETS

and selectively up-regulates human MDR1 Not MRP1. J. Biol. Chem.
2001; 276: 39359–39367.

15. Bush J.A., Li G. Regulation of the Mdr1 isoforms in a p53-deficient

mouse model. Carcinogenesis 2002; 23: 1603–1607.

16. Kim S-H., Hur W-Y., Kang C-D., Lim Y-S., Kim D-W., Chung B-S. Invo-

lvement of heat shock factor in regulating transcriptional activation of
MDR1 gene in multidrug-resistant cells. Cancer Lett. 1997; 115: 9–14.

17. Niewiarowski W., Gendaszewska E., Rębowski G. i wsp. Multidrug resi-

sitance-associated protein-reduction of expression in human leukaemia
cells by antisense phosphorothioateoligonucleotides. Acta Biochim. Pol.
2000; 47: 1183–1188.

18. Fire A., Xu S., Mongomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C.

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806–811.

19. Aravin A.A., Naumova N.M., Tulin A.V., Vagin V.V., Rozovsky Y.M., Gvoz-

dev V.A. Double-stranded RNA- mediated silencing of genomic tandem
repeats and transposable elements in the D.melanogaster germline. Curr.
Biol. 2001; 11: 1017–1027.

20. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA intereference is mediated by

21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001; 15: 188–200.

21. Cheng J.C., Moore T.B., Sakamoto K.M. RNA interference and human

disease. Mol. Genet. Metab. 2003; 80: 121–128.

22. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. Specific inhibition

of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and
vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98: 9742–9747.

23. Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., Bartel D.P. RNAi: double-stranded

RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA an 21 to 23 nucleoti-
de intervals cell 2000; 101: 25–33.

24. Mette M.F., Aufsatz W., van der Winden J., Matzke M.A., Matzke A.J.M.

Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-
stranded RNA. EMBO J. 2000; 19: 5194–5201.

25. Dudley N.R., Labbe J-C., Goldstein B. Using RNA interference to identify

genes required for RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002;
99: 4191–4196.

26. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T.

Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured
mammalian cells. Nature 2001; 411: 494–498.

27. Waterhouse P.M., Wang M-B., Lough T. Gene silencing as an adaptive

defence against viruses. Nature 2001; 411: 834–842.

28. Allashire R. Molecular biology. RNAi and heterochromation a hushed-up

affair. Science 2002; 297: 1818–1819.

29. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. An RNA-directed

nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.
Nature 2000; 404: 293–296.

30. Montgomery M.K., Xu S., Fire A. RNA as a target of double-stranded

RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1998; 95: 15502–15507.

31. Provost P., Silverstein R.A., Dishart D. i wsp. Dicer is required for chro-

mosome segregation and gene silencing in fission yeast cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 2002; 99: 16648–16653.

32. Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T.

Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila
melanogaster embryo lysate. EMBO J. 2001; 20: 6877–6888.

33. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a biden-

tate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001;
409: 363–366.

34. Nykänen A., Haley B., Zamore P.D. ATP Requirements and small Interfering

RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 2001; 107: 309–321.

35. Hannon G.J. RNA interference. Nature 2002; 418: 244–251.
36. Yang D., Buchholz F., Huang Z. i wsp. Short RNA duplexes produced by

hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA inter-
ference in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:
9942–9947.

37. Kawasaki H., Suyama E., Iyo M., Taira K. siRNAs generated by recombi-

nant human Dicer induce specific and significant but target site-indepen-
dent gene silencing in human cells. Nucleic Acid Res. 2003; 31: 981–987.

38. Billy E., Brondani V., Zhang H., Mueller U., Filipowicz W. Specific interfe-

rence with gene expression induced by long, double-stranded RNA in
mouse embryonal teratocarcinoma cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2001; 98: 14428–14433.

39. Svoboda P., Stein P., Hayashi H., Schultz R.M. Selective reduction of

dormant maternal mRNA in mouse oocytes by RNA interference. Deve-
lopment 2000; 127: 4147–4156.

40. Kittler R., Buchholz F. RNA interference: gene silencing in the fast lane.

Semin. Cancer Biol. 2003; 13: 259–265.

41. Byrom M., Pallotta V., Brown D., Ford L. Visualizing siRNA in mammalian

cells: fluorescence analysis of the RNAi effect. Ambion TechNotes 2002; 9.
Dostępne na stronie: www.ambion.com/techlib/tn/93/935.html.

42. Carmell M.A., Xuan Z., Zhang M.Q., Hannon G.J. The Argonaute family:

tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell mainte-
nance, and tumorigenesis. Genes Dev. 2002; 16: 2733–2742.

43. Kataoka Y., Takeichi M., Uemura T. Developmental roles and molecular

characterization of a Drosophila homologue of Arabidopsis Argonaute1,
the founder of a novel gene superfamily. Genes Cells 2001; 6: 313–325.

44. Kim V.N. RNA interference in functional genomics and medicine. J.

Korean Med. Sci. 2003; 18: 309–318.

45. Grosshans H., Slack F.J. Micro-RNAs: small is plentiful. J. Cell Biol.

2002; 156: 17–21.

46. Olsen P.H., Ambros V. The lin-4 Regulatory RNA Controls developmental

timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis
after the initiation of translation. Dev. Biol. 1999; 216: 671–680.

47. Król J., Kaczyńska D., Krzyżosiak W.J. MikroRNA — nowi członkowie

rodziny niekodujących RNA. Post. Biochem. 2003; 49: 214–228.

48. Kiss T. Small nucleolar RNA-guided post-transcriptional modification of

cellular RNAs. EMBO J. 2001; 20: 3617–3622.

49. Kittler R., Putz G., Pelletier L. i wsp. An endoribonuclease — prepared

Badania nad metodą RNAi muszą być jednak nadal

kontynuowane, zanim będzie można stosować ją u pacjen-
tów. Jedną z przeszkód, być może najtrudniejszą, będzie
specyficzne dostarczanie efektywnych molekuł wyciszają-
cych do wybranych komórek w organizmie; jednak nowe
prace badawcze wciąż przynoszą interesujące rezultaty.

218

Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3

siRNA screen in human cells identifies genes essential for cell division.
Nature 2004; 432: 1036–1040.

50. Buchholz F. RNA-interference i mammalian cells. Euro. Biotech. News

2005; 4: 39–42.

51. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. Stable suppression of tumorige-

nicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell 2002; 2: 243–247.

52. Sui G., Soohoo C., Affar E.B. i wsp. A DNA vector-based RNAi technolo-

gy to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 2002; 99: 5515–5520.

53. Shen C., Buck A.K., Liu X., Winkler M., Reske S.N. Gene silencing by

adenovirus-delivered siRNA. FEBS Lett. 2003; 539: 111–114.

54. Ashrafi K., Cheng F.Y., Watts J.L. i wsp. Genome-wide RNAi analysis of

Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature 2003; 421: 268–272.

55. Gönczy P., Echeverri Ch., Oegema K. i wsp. Functional genomic analysis

of cell division in C.elegans using RNAi of genes on chromosome III.
Nature 2000; 408: 331–336.

56. Grishok A., Pasquinelli A.E., Conte D. i wsp. Genes and mechanisms

related to RNA interference regulate expression of the small temporal
RNAs that control C. elegans developmental timinig. Cell 2001; 106: 23–34.

57. Randall G., Graukoui A., Rice C.M. Clearance of replicating hepatitis C

virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 2003; 100: 235–240.

58. Wilson J.A., Jayasena S., Khvorova A. i wsp. RNA interference blocks

gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propaga-
ted in human liver cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 235–240.

59. Gitlin L., Karelsky S., Andino R. Short interfering RNA confers intracellu-

lar antivirial immunity in human cells. Nature 2002; 418: 430–434.

60. Novina C.D., Murray M.F., Dykxhoorn D.M. i wsp. siRNA-directed inhibi-

tion of HIV-1 infection. Nat. Med. 2002; 8: 681–686.

61. Caplen N.J., Taylor J.P., Statham V.S., Tanaka F., Fire A., Morgan R.A.

Rescue of polyglutamine-mediated cytotoxicity by double-stranded RNA-
-mediated RNA interference. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 175–184.