-interferencja RNA

-architektura jądra interfazowego

-remodelowanie chromatyny

Interferencja RNA:

-zachowawczy ewolucyjnie mechanizm regulacji procesów komórkowych przez krótkie cząsteczki RNA

-termin RNAi użyto po raz pierwszy w 1998 roku, opisując wyciszenie genu u C. elegant poprzez wprowadzenie do komórki egzogennego dsRNA

Niekodujące RNA (ncRNA):

-cząsteczki RNA, które nie są matrycą do syntezy białka

-około 97-98% wszystkich transkryptów genomu ludzkiego to ncRNA zakodowane zarówno w obrębie niektórych genów jak i w rejonach między genowych

ncRNA:

a)ulegające ekspresji konstytutywnej , odgrywają rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórki

b)pełniące funkcje regulatorowe: regulatory transkrypcji, regulatory potranskrypcyjnej, modulatory aktywności białek.

Zaangażowane w proces translacji: tRNA transferowe RNA; rRNA rybosomalne RNA.

Biorą udział w procesie składania pre-mRNA – snRNA małe jądrowe RNA

Odgrywają rolę w procesie chemicznej modyfikacji tRNA : snoRNA – małe jąderkowe RNA

RNA telomer azowe.

miRNA:

-najszerzej badana klasa ncRNA

-długość ok. 22 nukleotydy

-post-transkrypcyjne wyciszanie genów

-regulacja przy pomocy miRNA dotyczy ok. 60% genów kodujących białka

piRNA:

-długość ok. 24-30 nt

-biogeneza niezależnie od kompleksu Dicer

-wiążą się z białkami PIWI, które zaangażowane są w utrzymywanie stabilności genomu w komórkach zarodkowych

-transkrybowane z regionów genomu zawierających transpozony i inne sekwencje powtarzalne

-kompleksy piRNA i białek PIWI wycisza ekspresję elementów transpozycyjnych.

lncRNA (long ncRNA):

-długość ponad 200 nt

-różne mechanizmy regulacji ekspresji genów przez ncRNA:

*uczestniczą w epigenetycznych modyfikacjach DNA poprzez rekrutację kompleksów re modelujących chromatynę do specyficznych loci

*przykłady: inaktywacja chromosomu X, regulacja ekspresji genów HOX, udział w regulacji ekspresji loci imprintingowych

Interferencja RNA:

-złożony system regulacji genów wykorzystujący 22-26 nt małe interferujące RNA powstające z prekursorów dsRNA

-mechanizmy:

*potranskrypcyjnej wyciszanie genów: indukcja degradacji mRNA zawierającego komplementarną sekwencję do małych RNA; blokowanie translacji takiego mRNA

*wyciszanie transkrypcyjne: indukcja zmian w strukturze chromatyny w locus, w którym znajduje się sekwencja, do której są komplementarne małe RNA.

Małe cząsteczki RNA biorąc udział w potranskrypcyjnym wyciszaniu genów:

-siRNA –małe interferujące RNA ()pochodzenie egzogenne) – dwuniciowy RNA, dł. 21-22 nt – uczestniczy w degradacji transkryptu. W kompleksie z białkami siRNA rozplata się i łączy z komplementarnymi fragmentami tranksryptu, następnie za pomocą kompleksu białkowego dochodzi do degradacji

-miRNA – mikroRNA (pochodzenie endogenne) – jednonicowy RNA wraz z kompleksem białkowym łączą się z nieulegającą translacji końcem 3’ transkryptu, co prowadzi do zablokowania translacji.

Enzymy (kompleksy) zaangażowane w interferujące RNA:

RISC –kompleks wyciszający indukowany przez RNA

Dicer; Drosha – rybonukleazy o aktywności RNAazy klasy III.

siRNA:

-powstają z dsRNA będących produktami transkrypcji nietypowych trans genów (konstruktów genowych wprowadzanych z zew. Lub wytwarzanych w trakcie replikacji wirusów)

-z prekursorów wycinane są dwuniciowe fragmenty przez kompleks Dicer

-dwuniciowy siRNA włączany jest do kompleksu RISC, w którym zostają usunięta nić sensowna

-kompleksy z nicą antysensowaną odnajduje komplementarny mRNA

-jeśli komplementarność siRNA i mRNA jest całkowita następuje kataliczne cięcie i degradacja mRNA

-jeśli komplementarność siRNA jest częściowa mRNA zostaje zachowany ale jego translacja zostaje zablokowana.

miRNA (mikroRNA):

-powstają z prekursorów o strukturze spinki do włosów tzw. pre-miRNA, które są pochodzenia endogennego (zakodowane w genomie)

-prekursory miRNA w jądrze są cięte najpierw na krótsze dwuniciowe fragmenty przez RNAazę III Drosha

-z produktów tej reakcji Dicer wycina miRNA

-następnie tworzą się kompleksy typu RISC zdolne do wyciszanie RNA lub podobne kompleksy RITS

-RITS z chwilą gdy jednoniciowy miRNA odnajdzie komplementarny odcinek jest w stanie indukować modyfikacje histonów i DNA.

RNAi jako narzędzie badawcze:

-badanie funkcji genów – alternatywna do nokautów genowych czy antysensownych oligonukloetydów

-terapeutyka – wyciszanie genów związanych z chorobą

Badania nad opracowaniem terapii z wykorzystaniem RNAi prowadzi się m.in. w odniesieniu do:

-chorób wirusowych

-nowotworów złośliwych

-chorób neurodegeneracyjnych

-chorób alergicznych

-chorób autoimmunologicznych

-cukrzycy

Inaktywacja chromosomu X ssaków jest zależna od genu Xist:

-proces ten jest inicjowany przez specjalne cząsteczki RNA, będące produktami transkrypcji genu Xist, zlokalizowanego w rejonie Xic.

Xist:

-produkt genu Xist w specyficzny sposób pozostaje związany z jego chromatyną, stanowiąc molekularny znacznik dla rekrutacji czynników białkowych, które z kolei dokonują modyfikacji histonów i DNA.

Inaktywowany chromosom X podlega silnej hipermetylacji lizyny 9 histonu H3, deacytylacji histonów i metylacji DNA.

Architektura jądra interfazowego:

-każdy chromosom zajmuje w jądrze ściśle określone miejsce zwane terytorium chromosomowym

-wielkość i umiejscowienie terytoriów chromosomowych jest tkankowo specyficzna, zależy od fazy cyklu komórkowego, wielkości chromosomów oraz liczby genów aktywnie transkrybowanych

-architektura wewnątrzjądrowa odgrywa znaczącą rolę w epigenezie i stanowi jeden z elementów regulacji ekspresji genów.

Organizacja chromatyny w jądrze interfazowym nie jest przypadkowa.

W tym wykorzystuje się: mikroskop konfokalny, metody fluorescencyjne hybrydyzacji in situ, barwienie immunofluorescencyjne.

Zasady organizacji chromatyny w jądrze interfazowym:

1.Teoria radialna:

-położenie chromosomów w jądrze zależy od liczby genów

-położenie chromosomów zależy od ich wielkości

2.Teoria mówiąca o położeniu względnym:

-niektóre chromosomy wykazują tendencję do skupiania się

-inne lokują się w pobliżu określonych domen jądra

Położenie CT podlega zmianom w trakcie spermatogenezy u świni:

-w trakcie procesu spermatogenezy zaobserwowane istotne przegrupowania chromosomów m.in. X, Y które w spermatocytach położenie były na peryferiach jadra, a przesuwają się ku środkowi

Trójwymiarowa organizacja genomu w jądrze interfazowym może odgrywać rolę w powstawaniu translokacji chromosomowych w nowotworach:

-translokacje chromosomów są mutacjami swoistymi w wybranych typach nowotworów

-wykazano, że znacznie częściej dochodziło do translokacji takich chromosomów, które sąsiadowały ze sobą w przestrzenie jądra interfazowego.

W trackie różnicowania adipocytów badano położenie dwóch chromosomów człowieka 12 i 16, które uczestniczą w translokacji w tłuszczakomięsakach.

Remodelowanie chromatyny:

-proces polegający na zmianie struktury chromatyny przy pomocy określonych kompleksów białkowych, którego celem jest regulacja ekspresji genów poprzez zmianę dostępności chromatyny dla czynników transkrypcyjnych.

Kompleksu białkowe re modelujące chromatynę:

-składają się z kilku-kilkunastu podjednostek

-w ich skład wchodzą białka posiadające aktywność zależną od hydrolizy ATP

-efektem ich działania jest zwykle przemieszczanie DNA względem oktameru histonowego.

Remodelowanie chromatyny wymaga wyspecjalizowanych enzymów, które wykorzystują energię z hydrolizy ATP.