Diagnostyka

parazytologiczna

Katedra i Zakład Biologii

Medycznej

Laboratoryjna diagnostyka pasożytów
opiera się na następujących zasadach:

•

Właściwy wybór materiału do badania
bezpośredniego i pośredniego

•

Właściwy wybór diagnostycznej metody
badania danego materiału
(zagęszczanie, utrwalanie, barwienie)

•

Znajomość stadiów rozwojowych
pasożyta mogących występować w
badanym materiale oraz znajomość
cech gatunkowych pasożyta

Laboratoryjna diagnostyka pasożytów
opiera się na następujących zasadach

•

Wykluczanie określonej inwazji
pasożytniczej dopiero po
kilkakrotnym (co najmniej 3-
krotnym) badaniu materiału.

Materiał diagnostyczny

•

Tkanki

•

Płyny ustrojowe

•

Wydaliny i wydzieliny

Najczęściej bada się:

•

Kał

•

Krew

•

Wydzielinę pochwową

Najczęściej bada się:

•

Treść dwunastnicy

•

Ślinę, plwocinę

•

Zeskrobiny błon śluzowych

•

Płyn mózgowo-rdzeniowy

•

Materiał z punkcji i biopsji

•

Wycinki tkanek pobrane
przyżyciowo lub w czasie sekcji

Metody bezpośrednie

•

Stosuje się je w celu stwierdzenia
obecności pasożyta w badanym
materiale i określenia jego
przynależności gatunkowej.
Obejmują one:

•

Preparaty bezpośrednie – np.
rozmazy kału, krwi, przyżyciowe
lub barwione po utrwaleniu

Metody bezpośrednie

•

Metody zagęszczające pasożyty –
np. sedymentacyjne,

•

Metody hodowlane – polegające na
namnażaniu pasożyta na
podłożach sztucznych lub w ciele
zwierząt laboratoryjnych.

Metody pośrednie

•

Swoiste – celem ich jest wykazanie reakcji

immunologicznej ze strony żywiciela,

będącej odpowiedzią na inwazję

pasożytniczą (np. oznaczanie poziomu

przeciwciał w surowicy krwi).

•

Nieswoiste – obejmują one badania

hematologiczne, histologiczne,

histopatologiczne, radiologiczne lub USG,

których wyniki np. eozynofilia krwi mogą

pośrednio świadczyć o inwazji

pasożytniczej.

Badania koproskopowe.

Przy

pobieraniu kału należy przestrzegać
następujących zasad:

•

Kał pobierać do czystych, suchych naczyń
lub na czysty papier a następnie
(najlepiej całą wydaloną porcję) przenosić
do naczyń odpowiednich do transportu.

•

Po podaniu środków przeczyszczających
pobierać kał w kolejnych porcjach do
ponumerowanych naczyń i bezpośrednio
dostarczyć do laboratorium.

•

Chronić kał przed zamarznięciem.

Przy pobieraniu kału należy
przestrzegać następujących
zasad

•

Normalny kał pobierać do badania
co najmniej 2-3 krotnie, w
odstępach kilkudniowych. Jeżeli
wyniki badań są ujemne, pobrać
kał po podaniu środków
przeczyszczających.

Płyny utrwalające

•

Formalina 5% i 10% - trwale konserwuje

jaja, larwy robaków i cysty pierwotniaków,

nie konserwuje trofozoitów.

•

PVA (utrwalacz poliwinylowy) – konserwuje

jaja, larwy robaków oraz trofozoity i cysty

pierwotniaków. Jest trwały i odpowiedni do

barwienia różnymi metodami. Odczynnikiem

tym utrwalać można nie tylko cały materiał

diagnostyczny, ale również rozmazy, które

barwi się bezpośrednio lub po pewnym

czasie hematoksyliną.

Płyny utrwalające

•

MJF (roztwór mertiolatu, jodu i
formaliny) – konserwuje jaja, larwy
oraz trofozoity. Jest nieodpowiedni
do sporządzania preparatów
trwałych barwionych.

•

PAF (roztwór fenolu, alkoholu i
formaliny) – charakteryzuje się
podobnymi właściwościami jak MJF.

Makroskopowe badanie kału

•

Materiał diagnostyczny umieszcza się w
zlewce lub na płytce Petriego, rozcieńcza
wodą i dekantuje

•

Pasożytów poszukuje się w osadzie za
pomocą lupy i igieł preparacyjnych lub
cedzi się zawiesinę kału przez gazę lub
sitka

•

Wyizolowane z kału robaki bada się
najpierw gołym okiem lub za pomocą lupy
w płynie fizjologicznym

Makroskopowe badanie kału

•

W celu uwidocznienia szczegółów
budowy anatomicznej nicieni dodaje
się do wody barwniki np. czerwień
obojętną, błękit metylenowy

•

Przywry i człony tasiemców z rodziny
Taenidae należy przed badaniem
spłaszczyć, umieszczając je między
dwoma szkiełkami podstawowymi

Makroskopowe badanie kału

•

Preparat można prześwietlić

wprowadzając między szkiełka parę

kropli 5% kwasu octowego lub gliceryny

•

W razie problemów z ustaleniem

przynależności gatunkowej pasożyta

wykonuje się preparaty trwałe

•

Przed utrwaleniem robaki płucze się w

ciepłym roztworze fizjologicznym NaCl

lub przechowuje w chłodni w celu

rozkurczenia wora skórno – mięśniowego.

Makroskopowe badanie kału

•

Barwnik na ogół słabo przenika
przez oskórek nicieni, dlatego
utrwalonych okazów zazwyczaj się
nie barwi, tylko prześwietla, np. w
ksylenie lub olejku cedrowym i
zamyka w balsamie kanadyjskim.

Makroskopowe badanie kału

•

Robaki płaskie utrwala się w płynie
Bouina lub mieszaninie alkoholu i
formaliny, umieszczając je w butelce
z utrwalaczem lub rozciągając między
szkiełkami podstawowymi, między
które wkrapla się utrwalacz pipetą.

•

Czas utrwalania zależnie od grubości
preparatu wynosi 0,5-3h

Makroskopowe badanie kału

•

Utrwalone okazy można przechowywać w

70% alkoholu lub sporządzać z nich

preparaty trwałe barwione

•

Do barwienia robaków płaskich używa

się : karminu ałunowego (małe przywry i

proglotydy tasiemców), karminu

boraksowego (większe przywry i

tasiemce), karminu z kwasem mlekowym

(tasiemce) oraz hematoksyliny ałunowej

lub kwaśnej (mniejsze robaki).

Makroskopowe badanie kału

•

Po zabarwieniu preparaty odwadnia się w

szeregu alkoholi o wzrastających stężeniu

aż do alkoholu absolutnego, prześwietla w

ksylenie, olejku goździkowym lub cedrowym

i zamyka w balsamie kanadyjskim.

•

Robaki obłe utrwala się w płynie Barbagallo,

mieszaninie alkoholu z glicerolem (drobne

nicienie), płynie Zenkera, w ciepłej 5-10%

formalinie z dodatkiem gliceryny (duże

nicienie), w ciepłym 70% alkoholu lub

wodnym roztworze gliceryny.

Mikroskopowe badanie kału

•

Celem tych badań jest wykrycie
trofozoitów i cyst pierwotniaków oraz jaj,
larw i postaci dojrzałych robaków
pasożytniczych. Zwraca się również uwagę
na komórki żywiciela i pewne twory,
których obecność może być związana z
inwazją pasożytniczą np. erytrocyty
świadczące o owrzodzeniach lub zmianach
krwotocznych i naczyniowych, makrofagi
świadczące o infekcji.

Mikroskopowe badanie kału w
kierunku pierwotniaków

•

Rozmaz świeżego kału:

-

preparat mokry niebarwiony

-

preparat mokry podbarwiony (1%
płyn Lugola, odczynnik Quensela)

-

preparat trwały barwiony

Gatunki pierwotniaków, które
mogą występować w kale

•

Lamblia intestinalis – trofozoity i cysty

•

Chilomastix mesnili – trofozoity i cysty

•

Enteromonas hominis – trofozoity i

cysty

•

Retortamonas intestinalis – trofozoity i

cysty

•

Isospora hominis – oocysty

•

Isospora belli - oocysty

Gatunki pierwotniaków, które
mogą występować w kale

•

Entamoeba histolytica – trofozoity i
cysty

•

Entamoeba coli – trofozoity i cysty

•

Entamoeba hartmanni – trofozoity i
cysty

•

Entamoeba polecki – trofozoity i
cysty

•

Endolimax nana – trofozoity i cysty

Gatunki pierwotniaków, które
mogą występować w kale

•

Dientamoeba fragilis – trofozoity

•

Iodomoeba bütschlii – trofozoity i
cysty

•

Balantidium coli – trofozoity i cysty

Cysty pierwotniaków

Balantidium coli

Giardia lamblia

Cysty pierwotniaków

Entamoeba histolytica

Mikroskopowe badanie kału w
kierunku robaków
pasożytniczych

•

Badać można zarówno kał świeży, jak i utrwalony

w płynach konserwujących

•

W badaniach helmintologicznych stosuje się

najczęściej:

-

rozmaz bezpośredni

-

gruby rozmaz kału

-

metodę Kato i Miura

-

metody zagęszczające

-

wymazy z odbytu i odbytnicy

-

metody hodowli i izolowania larw z kału

-

ilościowe metody koproskopowe

Gruby rozmaz kału

•

Około 50 mg kału miesza się na
szkiełku podstawowym z kroplą
płynu fizjologicznego lub wody,
rozmazuje na powierzchni 2 x 4 cm,
po czym suszy w cieplarce. Preparat
bada się w małym powiększeniu
mikroskopu, w kropli oleju
parafinowego, który rozjaśnia obraz.

Metoda Kato i Miura

•

40-60 mg kału umieszcza się za pomocą igły

preparacyjnej na czystym szkiełku

podstawowym i przykrywa skrawkiem

celofanu, wymoczonego uprzednio w ciągu

24 godzin w roztworze zawierającym wodę,

glicerol i zieleń malachitową. Następnie za

pomocą gumowego korka rozgniata się kał do

odpowiednio grubego rozmazu i po godzinie

w temperaturze pokojowej lub po 20-30

minutach w cieplarce bada się preparat w

słabym powiększeniu mikroskopu.

Metody zagęszczające

•

Sedymentacyjne

Polegają na zanurzeniu badanego materiału w

płynach o mniejszym ciężarze własnym, niż

ciężar jaj, larw robaków i cyst pierwotniaków.

•

Flotacyjne

W metodach tych stosuje się płyny o większym

ciężarze właściwym, niż ciężar cyst, jaj i

larw, które w wyniku tego wypływają i

gromadzą się na powierzchni płynu, skąd

łatwo je pobrać do badania.

Metody zagęszczające
sedymentacyjne

•

Sedymentacja z kwasem i eterem
(Telemanna)

•

Sedymentacja z formaliną i eterem
(Ritchie)

•

Sedymentacja z odczynnikiem MJF

Metody zagęszczające flotacyjne

•

Flotacja z roztworem chlorku sodu
(Fülleborna)

•

Flotacja z roztworem siarczanu
cynku (Fausta)

Wymazy z odbytu i odbytnicy

•

Wymazy należy wykonywać wcześnie rano
lub późnym wieczorem, przed myciem i
wypróżnieniem. Badanie przeprowadza się
bezpośrednio po pobraniu materiału, a w
przypadku jeśli nie jest to możliwe, można
wymazy przez kilka dni, a nawet tygodni
przechowywać w lodówce. Metodą
wymazów wykrywa się jaja Enterobius
vermicularis i Taenia sp.

Wymazy z odbytu i odbytnicy

•

Metoda przylepca celofanowego
(Grahama)
Przezroczysty przylepiec celofanowy o
długości 10 cm i szerokości 2 cm przykłada
się lepką stroną w okolicy odbytu tak, aby
uzyskać wymaz śluzu fałdów odbytniczych.
Następnie taśmę przykleja się do szkiełka
podstawowego i ogląda w małym
powiększeniu mikroskopu.

Wymazy z odbytu i odbytnicy

•

Metoda pałeczki szklanej z celofanem (NIH)
Przygotowuje się pałeczki szklane z

zaokrąglonym końcem, na którym owija się i

przymocowuje gumką kawałek celofanu.

Przeciwległy koniec wkłada się do korka i

umieszcza w probówce. Ruchem obrotowym

pałeczki wymazuje się dokładnie fałdy skóry i

błony śluzowej odbytu. W laboratorium

zdejmuje się pęsetą celofan z pałeczki,

rozprostowuje między dwoma szkiełkami

podstawowymi i ogląda w małym powiększeniu

mikroskopu w kropli glicerolu z wodą.

Formy rozwojowe robaków
pasożytniczych, które można wykryć
badaniem mikroskopowym w kale

•

Fasciola hepatica – jaja

•

Fasciolopsis buski – jaja

•

Dicrocoelium dendriticum – jaja

•

Opisthorchis felineus – jaja

•

Clonorchis sinensis - jaja

•

Paragonimus westermani – jaja

•

Schistosoma haematobium – jaja

•

Schistosoma mansoni – jaja

•

Schistosoma japonicum – jaja

Formy rozwojowe robaków
pasożytniczych, które można wykryć
badaniem mikroskopowym w kale

•

Diphyllobothrium latum – jaja

•

Dipylidium caninum – torebki maciczne

•

Taenia saginata – jaja

•

Taenia solium – jaja

•

Hymenolepis diminuta – jaja

•

Hymenolepis nana – jaja

•

Ascaris lumbricoides – jaja

•

Trichuris trichiura – jaja

•

Enterobius vermicularis - jaja

Formy rozwojowe robaków
pasożytniczych, które można wykryć
badaniem mikroskopowym w kale

•

Strongyloides stercoralis – larwy

•

Ancylostoma duodenale – larwy,
jaja

•

Necator americanus – jaja, larwy

Jaja robaków

Trichiurus trichiura

Taenia solium/saginata

Jaja robaków

Hymenolepis diminuta

Fasciola hepatica

Diagnostyka parazytologiczna
pasożytów krwi

•

Preparat bezpośredni

•

Cienki rozmaz krwi

•

Gruby rozmaz krwi

Preparat bezpośredni

•

Świeżą kroplę krwi przykrywamy
szkiełkiem nakrywkowym i
oglądamy pod mikroskopem,
zaczynając od małego
powiększenia przez średnie i duże.
W preparacie bezpośrednim
poszukuje się świdrowców łatwo
dostrzegalnych dzięki ich ruchowi.

Cienki rozmaz krwi

Kroplę krwi umieścić na brzegu suchego,

odtłuszczonego szkiełka. Drugie szkiełko,

większe od pierwszego o szlifowanej

krawędzi przykłada się pod kątem około

30

o

, tak aby krawędź dotykała kropli,

która po chwili rozpływa się na całej jej

długości. Jednym zdecydowanym ruchem

przesuwa się szkiełko pomocnicze w

kierunku drugiego brzegu szkiełka

podstawowego, uzyskując równomierny

rozmaz krwi.

Gruby rozmaz krwi

•

2-3 krople pobrane na szkiełko
podstawowe łączy się ze sobą i rozmazuje
na powierzchni około 1 cm

2

.

Następnie

miesza się krew przez 30 sekund,
wykonując ruchy obrotowe szkiełkiem,
aby nie dopuścić do wytrącenia się
włóknika. Gruby rozmaz pozwala na 15-
20 –krotne zagęszczenie pasożytów na tej
samej powierzchni w porównaniu z
rozmazem cienkim.

Barwienie rozmazów krwi

•

Metoda Giemsy

•

Metoda Wrighta

•

Metoda barwienia oranżem
akrydyny

•

Metoda barwienia zielenią
metylową i pironiną

Rozmazy krwi

Trypanosoma gambiense

Plasmodium falciparum

Metody immunologiczne

•

Polegają na wykazaniu reakcji
immunologicznych ze strony
gospodarza jako odpowiedzi na
zarażenie. Pasożyty i ich produkty
metabolizmu działając jako bodźce
antygenowe mogą wyzwalać reakcje
odpornościowe zarówno humoralne,
jak i typu komórkowego.

Metody immunologiczne

•

Odczyny serologiczne polegające na

wykrywaniu swoistych przeciwciał,

prócz wartości diagnostycznej, mają

duże znaczenie w dociekaniach

epidemiologicznych. Szczególną wagę

mają testy serologiczne o wysokim

stopniu swoistości w badaniach

epidemiologicznych na obszarach o

słabym nasileniu endemii

pasożytniczej.

Metody immunologiczne

1. Reakcje serologiczne z udziałem

dopełniacza

- odczyn wiązania dopełniacza (OWD)
- odczyn lityczny (odczyn Sabina-

Feldmana – OSF)

2. Odczyn aglutynacji bezpośredniej
3. Aglutynacja pośrednia lub bierna

Metody immunologiczne

4. Odczyn hemaglutynacji – OH
5. Odczyn immunofluorescencji

pośredniej (OIF)

6. Test ELISA (Enzyme – Linked –

Immunosorbent – Assay)

7. Immunodyfuzja,

immunoelektroforeza

8. Odczyny skórne

Metoda OWD

OWD

•

Odczyn wiązania dopełniacza stosuje się do

wykrywania swoistych przeciwciał w badanej

surowicy przy użyciu znanego antygenu. Odczyn

ten jest wykonywany w dwóch fazach. W fazie

pierwszej łączy się badaną surowicę ze znanym

antygenem. Jeżeli w surowicy znajdują się swoiste

dla danego antygenu przeciwciała, to powstaje

kompleks antygen-przeciwciało, który wiąże

dodany dopełniacz.
Jeżeli w badanej surowicy brak swoistych

przeciwciał, to kompleks antygen-przeciwciało nie

powstaje i dopełniacz pozostaje w stanie wolnym.

OWD

•

W fazie drugiej do układu antygen-przeciwciało-

dopełniacz dodaje się układ wskaźnikowy

krwinka czerwona-hemolizyna. Jeżeli dopełniacz

został uprzednio związany przez kompleks

antygen-przeciwciało, to hemoliza krwinek nie

wystąpi. Wynik będzie wówczas dodatni.
Jeżeli natomiast w badanej surowicy nie będzie

poszukiwanych przeciwciał, to kompleks

antygen-przeciwciało nie powstanie. Wolny

dopełniacz zwiąże się z układem wskaźnikowym

krwinka czerwona –hemolizyna, co spowoduje

hemolizę. Wynik będzie wówczas ujemny.

OWD

•

Dopełniacz – czyli komplement, jest to

nieswoisty składnik krwi zwierząt

stałocieplnych, bardzo wrażliwy na

temperaturę. Unieczynnia (inaktywuje) się go

przez ogrzewanie 30 min. w temp. 56

o

C.

Powoduje rozpuszczanie bakterii (bakteriolizę)

związanych ze swoistym przeciwciałem, a

także rozpuszczanie czerwonych krwinek

(hemolizę) związanych ze swoistym

przeciwciałem przeciwko tym krwinkom – tzw.

hemolizyną, inaczej amboceptorem.

Schemat próby ELISA

Test ELISA

•

Jest to próba wykonywana zwykle w fazie

stałej. Stosowane w niej enzymy powinny być

łatwo rozpuszczalne, stabilne, łatwo łączyć się

z białkiem, nie występować lub występować

jedynie w minimalnych ilościach w płynach

biologicznych, a ich substraty muszą być łatwo

dostępne i dawać wyraźną barwę. Do

najczęściej używanych należą: peroksydaza

chrzanowa i fosfataza zasadowa. Ich

substratami są odpowiednio o-dionizydyna lub

kwas 5-aminosalicylowy i para-

nitrofenylofosforan sodowy.

Test barwny Sabina - Feldmanna

•

Test wykorzystuje zmiany w cytoplazmie żywych

trofozoitów toksoplazm wywołane działaniem

przeciwciał obecnych w surowicy krwi osobnika

chorego, które stają się dobrze widoczne po

wybarwieniu toksoplazm silnym roztworem

błękitu metylowego.

•

Komórki pasożyta namnaża się przez 48 godzin

w wysięku otrzewnowym myszy, miesza ze

wzrastającymi rozcieńczeniami badanej

surowicy oraz aktywatorem i inkubuje w temp.

37

o

C.

Test barwny Sabina - Feldmana

•

Po upływie godziny dodaje się alkalicznego

roztworu błękitu metylowego i ogląda w

wilgotnych preparatach w mikroskopie

świetlnym w dużym powiększeniu lub

stabilizuje reakcję 0,4% roztworem

formaliny, a wynik odczytuje w mikroskopie

kontrastowo-fazowym.

•

Pasożyty nie uszkodzone silnie wybarwiają

się na niebiesko, w przeciwieństwie do

uszkodzonych , które nie ulegają

zabarwieniu

Test barwny Sabina - Feldmana

•

W reakcji dodatniej większość
pasożytów ulega lizie i nie barwi
się. Miano surowicy dodatniej
określa to rozcieńczenie surowicy,
przy którym stosunek organizmów
zabarwionych do bezbarwnych
wynosi 1:1 /dawka śmiertelna dla
50% pasożytów/.