METODY BADAŃ

STOSOWANYCH W

PARAZYTOLOGII

DIAGNOSTYKA 2

BADANIE:

-

KRWI

- PŁYNU MÓZGOWO-RDZENIOWEGO
- WYDZIELIN DRÓG MOCZOWO-
PŁCIOWYCH
- WYDZIELIN DRÓG ODDECHOWYCH

METODY IMMUNOLOGICZNE

BADANIE KRWI



rozmazy krwi mają główne
zastosowanie w diagnostyce zimnicy,
trypanosomatozy



pobranie próbki z opuszki palca

bezpośrednio na szkiełko
mikroskopowe

wykonanie rozmazu lub preparatu

w formie grubej kropli

metoda „grubej kropli” – jest metodą
zagęszczającą

CD. BADANIE KRWI

 czas pobierania krwi istotny w

przypadku gatunków

charakteryzujących się okresowym

występowaniem w krwi obwodowej

w ciągu dnia (

Wuchereria bancrofti

– wieczorem,

Loa loa

–

popołudnie)

krew badana w kierunku malarii

powinna być badana co 8 godzin przez

3 kolejne dni (gdy pierwsze badanie

wyszło negatywne)

CD. BADANIE KRWI



identyfikację ułatwia barwienie

preparatu stosując głównie technikę
barwienia Giemsą i metodę wg.
Pappenheima

BARWIENIE GIEMSĄ

BARWIENIE GIEMSĄ

-

utrwalony preparat barwi się ok. 30 min
roztworem Giemsy, płucze wodą i suszy

-

jądro pierwotniaków barwi się na
karminowy, cytoplazma – bladoniebieski

-

barwienie to stosowane do wymazów z
pochwy, węzłów chłonnych

CD. BADANIE KRWI

METODA Wg. PAPPENHEIMA

METODA Wg. PAPPENHEIMA

- na suchy (nieutrwalony) preparat nalać

barwnik May-Grünwalda i trzymać przez
3 minuty

- spłukanie wodą i podbarwienie

rozcieńczonym barwnikiem Giemsy przez
15 minut

- ponowne spłukanie wodą i wysuszenie

preparatu

CD. BADANIE KRWI

TRYPANOSOMA GAMBIENSE

BADANIE

PŁYNU MÓZGOWO-

RDZENIOWEGO



wykrycie postaci trypomastigota w

płynie M-R jedynym sposobem na
rozpoznanie śpiączki afrykańskiej w II
okresie choroby



badania prowadzi się po zagęszczeniu
płynu przez wirowanie (ponieważ
pasożyty szybko ulegają lizie)

CD.

BADANIE

PŁYNU MÓZGOWO-

RDZENIOWEGO



trofozoity

Naegleria fowleri

rozpoznaje się na podstawie typowego
ruchu lub w rozmazach barwionych na
podstawie cech morfologicznych



wykrywanie podczas analizy obrazu
mikroskopowego w osadzie płynu
mózgowo-rdzeniowego

CD.

BADANIE

PŁYNU MÓZGOWO-

RDZENIOWEGO

Naegleria

fowleri

BADANIE WYDZIELIN

DRÓG MOCZOWO-

PŁCIOWYCH

w moczu wykrywa się

Schistosoma

haematobium

przypadkowo wykrywa się

T. vaginalis,

mikrofilarie

Wuchereria bancrofti,

Onchocerca volvulus

mocz należy badać bezpośrednio po
pobraniu
stosuje się metody sedymentacyjne i
flotacyjne

CD. BADANIE WYDZIELIN

DRÓG MOCZOWO-

PŁCIOWYCH

wydzielina pochwy i cewki

moczowej badana w kierunku

T.

vaginalis

próba powinna być pobrana za pomocą
jałowego wacika i umieszczona z solą
fizjologiczna (w celu założenia hodowli)
lub rozmazana na szkiełku
podstawowym

rozmazy utrwala się przez suszenie i
barwi

CD. BADANIE WYDZIELIN

DRÓG MOCZOWO-

PŁCIOWYCH

Trichomonas vaginalis

CD. BADANIE WYDZIELIN

DRÓG MOCZOWO-

PŁCIOWYCH

Trichomonas vaginalis

BADANIE

WYDZIELIN

DRÓG ODDECHOWYCH

w plwocinie wykryć można wędrujące

larwy

Ascaris lumbricoides,

jaja

Paragonimus westermani,

trofozoity

Entamoeba gingivalis

i

Trichomonas

tenax, Pneumocystis carinii

próbę pobiera się rano (uzyskanie

plwociny odkrztuszonej)

przed pobraniem jama ustna powinna

być przepłukana wodą utlenioną

CD.

BADANIE

WYDZIELIN

DRÓG ODDECHOWYCH

Pneumocystis

carinii

METODY

IMMUNOLOGICZNE

- SEROLOGICZNE
- AGLUTYNACYJNE
- IMMUNOFLUORESCENCYJNE
- PRECYPITACYJNE
- TESTY SKÓRNE

METODY

IMMUNOLOGICZNE



są to techniki pośrednie



stosowane gdy badania mikroskopowe
zawodzą

 pasożyty i ich p.p.m. wywołują reakcje

typu humoralnego i komórkowego
(następuje wzrost stężenia Ig w
surowicy)

 testy serologiczne wykazują wysoką

swoistość

 konieczność dobrania właściwego

antygenu

 wzrost znaczenia przeciwciał

monoklonalnych

METODY SEROLOGICZNE

z UDZIAŁEM DOPEŁNIACZA



kompleks powstały w wyniku reakcji
połączenia Przeciwciała i Antygenu (P-A)
ma właściwości wiązania dopełniacza



zjawisko to można przeprowadzić stosując
metody:

1)

OWD

(stosowanie rozpuszczalnego

Antygenu)

2)

OSF

(stosowanie całej komórki pasożyta)

CD. METODY SEROLOGICZNE

ODCZYN WIĄZANIA DOPEŁNIACZA

(OWD)

Test wprowadzony do badania poziomu

przeciwciał w przebiegu

inwazji pasożyta

CECHY TESTU:
wysoka swoistość, niska czułość
Odczyn oparty na określeniu hemolizy

(%) krwinek

(50% hemolizę uznaje się za końcowy etap

wiązania dopełniacza)

CD. METODY SEROLOGICZNE

ODCZYN WIĄZANIA DOPEŁNIACZA

(OWD)

ZASADA OWD:

-

naniesienie: Antygenu - Surowicy-
Dopełniacza

-

inkubacja przez 20h w temp. 4

0

C

(wiązanie składników)

-

wprowadzenie uczulonych krwinek

-

i inkubacja w 37

0

C

CD. METODY SEROLOGICZNE

ODCZYN WIĄZANIA DOPEŁNIACZA

(OWD)

OCENA WYNIKÓW:

* wynik dodatni: (A) tworzy kompleks ze

swoistym (P), brak hemolizy (dopełniacz
związany w I etapie testu)

*

* wynik ujemny: układ hemolityczny nie

związał dopełniacza,

z braku przeciwciał

doszło do hemolizy uczulonych krwinek

CD. METODY SEROLOGICZNE

ODCZYN LITYCZNY OSF



zwane też odczynem Sabina-Feldmana
(OSF)



jest to próba barwna



najczulsza i swoista metoda (gł. w
wykrywaniu

Toxoplasma gondii

)

CD. METODY SEROLOGICZNE

ODCZYN LITYCZNY OSF

ZASADA OSF:



Antygen (cała kom.) jest namnażany w
wysięku otrzewnowym myszy



po 48h wysięk miesza się ze
wzrastającymi rozcieńczeniami surowicy
oraz dopełniacza



inkubacja



dodanie błękitu metylenowego



analiza pod mikroskopem kontrastowo-
fazowym



wynik ujemny: brak zabarwienia

AGLUTYNACYJA BEZPOŚREDNIA

(OA)



aglutynacja żywych/zabitych organizmów



są one poddawane działaniu trypsyny
(usuwa receptory dla nieswoistej reakcji) i
utrwalane formaliną



metoda pozwala na wczesne
zdiagnozowanie choroby (IgM aglutynują
szybciej, niż IgG)



podanie 2-merkaptoetanolu w celu
zniesienia aktywności IgM (nastąpi
gwałtowny spadek miana IgM w surowicy i
wynik będzie ujemny)

AGLUTYNACYJA POŚREDNIA
(BIERNA)

Polega na stosowaniu nośników, do których

przyłącza się rozpuszczalny Antygen

Nośnik pełni rolę indykatora reakcji

ODCZYN HEMAGLUTYNACJI

(OH)

 nośnikiem są krwinki czerwone

 technika ma większą czułość od OA i OWD
ZASADA OH
 opłaszczony na powierzchni komórki

A

ntygen wiąże się z

P

rzeciwciałem z

surowicy i powoduje aglutynację nośnika
(krwinek)

+

(P)

Komórki z
(A)

METODY

IMMUNOFLUORESCENCYJNE

Odczyn immunofluorescencji

pośredniej – OIF

(technika stosowana w 2

wersjach)

1. Technika bezpośrednia

(

P

rzeciwciała

znakowane barwnikiem fluoryzującym)

2. Technika pośrednia (dodanie do

kompleksu

(A)

-(P)

znakowanej surowicy

antyglobulinowej)

kompleks

(A

)

-(P)

znakowanie surowicą

CD. METODY

IMMUNOFLUORESCENCYJNE

- zaletą OIF jest możliwość stosowania

monospecyficznych przeciwciał
antyglobulinowych (pozwala to na
określenie każdej grupy IgG)

- wadą jest brak ostrej różnicy w

fluorescencji między dodatnią, a ujemną
reakcją

- modyfikacją OIF jest metoda

SAFA

(Soleble-Antigen-Fluorescent-

Antibody-Test) – gdzie stosuje się Antygen
rozpuszczalny

CD. METODY

IMMUNOFLUORESCENCYJNE

ELISA (Enzyme-Linked-

Immunosorbent-Assay)

- do kompleksu (A-P) przyłącza się

surowica antyglobulinowa znakowana:
peroksydazą / alkaliczną fosfatazą

- aktywność enzymu ujawnia się po dodaniu

właściwego dla enzymu substratu

- wyniki odczytuje się w spektrofotometrze i

porównuje z krzywą kalibracyjną

METODY PRECYPITACYJNE

IMMUNODYFUZJA (ID)

- na obwodzie żelu nakłada się roztwór

Antygenu, a na środku umieszcza się
Przeciwciała (surowica)

- Antygeny z odpowiadającym im

Przeciwciałami

tworzą linie

precypitacyjne o kształcie łuku,
krzyżowanie się linii precypitacyjnych
świadczy o braku zgodności

IMMUNOELEKTROFOREZA (IE)

CD. METODY PRECYPITACYJNE

IE

stosuje się głównie w diagnostyce

chorych na echinokokozę

ID i IE

– wymagają zagęszczenia

Antygenów i surowic i są przydatne do
analizy jakościowej reakcji

W

IE

wykazano linie w schistosomatozy,

filariozy i fascjolozie

TESTY SKÓRNE

- alergenami są ekstrakty z pasożytów w

płynie fizjologicznym, konserwowanym

dodatkiem 0,25% fenolu

- podaje się preparaty śródskórnie

- dodatnia reakcja: ostrego nacieku i

zaczerwienienie

- próba śródskórna jest tylko próbą

jakościową, nie pozwala na określenie

początku inwazji