Synteza i badania

Synteza i badania

biologiczne dimerycznych

biologiczne dimerycznych

analogów fragmentu

analogów fragmentu

ubikwityny

ubikwityny

mostkowanych za pomoc

mostkowanych za pomoc

ą

ą

glikoli polietylenowych

glikoli polietylenowych

Cel pracy:

Cel pracy:

• Optymalizacja warunków syntezy dimerycznych oraz

monomerycznych analogów fragmentu ubikwityny
mostkowanych za pomocą glikoli polietylenowych



LEDGRTLSDY

LEDGRTLSDY

 PEG jednorodny
 PEG niejednorodny

• Oczyszczenie zsyntezowanych związków.
• Określenie immunomodulatorowych właściwości

otrzymanych związków.

Kierunki działania

Kierunki działania

ubikwityny -

ubikwityny -

ubikwitynacja

ubikwitynacja

•

działanie

działanie

immunomodulatorowe

immunomodulatorowe

•

związanie, a następnie

związanie, a następnie

prezentowanie nieprawidłowo

prezentowanie nieprawidłowo

funkcjonującego białka

funkcjonującego białka

proteasomowi w celu jego proteolizy

proteasomowi w celu jego proteolizy

•

regulacja cyklu komórkowego,

regulacja cyklu komórkowego,

•

białko szoku termicznego, białko

białko szoku termicznego, białko

stresu,

stresu,

•

komponent PHF w chorobach

komponent PHF w chorobach

neurodegeneracyjnych,

neurodegeneracyjnych,

•

regulacja ekspresji genów,

regulacja ekspresji genów,

utrzymanie struktury chromatyny,

utrzymanie struktury chromatyny,

•

białko transferowe,

białko transferowe,

•

białka typu UCRP,

białka typu UCRP,

 stymulacja różnicowania
limfocytów T oraz B
 immunofilina
 aktywność
immunosupresorowa

Struktura

Struktura

trzeciorzędowa

trzeciorzędowa

ubikwityny

ubikwityny

Funkcja:

Funkcja:



nieodwracalna,

nieodwracalna,

selektywna destrukcja

selektywna destrukcja

białek

białek



odwracalna,

odwracalna,

posyntetyczna

posyntetyczna

modyfikacja białek

modyfikacja białek

Gly-76

Gly-76

Lys-48

Lys-48

Działanie

Działanie

immunomodulatorow

immunomodulatorow

e

e

Struktura ubikwityny z wyeksponowanym

Struktura ubikwityny z wyeksponowanym

fragmentem wykazującym aktywność

fragmentem wykazującym aktywność

immunomodulatorową (50-59)

immunomodulatorową (50-59)

LEDGRTLSDY

LEDGRTLSDY

Dimeryzacja

Dimeryzacja

glikolem

glikolem

polietylenowym

polietylenowym

H

2

N-LEDGRTLSDY-OH

•

dobrze rozpuszczalne w wodzie

i rozpuszczalnikach

organicznych

• nietoksyczne, nie wykazują
cytotoksyczności

• nie wykazują immunogenności

• zwiększenie stabilności związku
• zmniejszona degradacja przez enzymy

metaboliczne

• zmniejszenie lub eliminacja
immunogenności
•wzrost rozpuszczalności oraz
biodostępności
• podwyższa walory farmakologiczne

HO-(CH

2

CH

2

-O)

n

-CH

2

-CH

2

-OH

Peptydy

Peptydy

dimeryczne

dimeryczne

Peptydy
monomeryczn
e

F

F

F

F

F

O

C

C

C

C

C

C

H

DIE
A

,

DCC

Schemat

Schemat

procesu

procesu

dimeryzacji

dimeryzacji

958.4706

3+

1203.1398

1415.1938

2+

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700 m/z

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

8

x10

Intens.

Wysokorozdzielcze widmo MS dimerycznego peptydu
mostkowanego glikolem niejednorodnym

899.7695

3+

907.0967

914.4444

3+

921.7717

929.1206

3+

936.4467

3+

943.7956

3+

958.4706

3+

965.7984

3+

973.1462

3+

980.4733

3+

987.8218

3+

1002.4980

3+

1009.8247

3+

1017.1740

3+

1031.8500

3+

1046.8593

900

920

940

960

980

1000

1020

1040

m/z

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

8

x10

Intens.

n = 10

n = 9

n = 8

n = 7

n = 6

n = 11

n = 12

n = 13

n = 14

n = 15

n = 16

2H

+

+

Na

+

2H

+

+ Na

+

2H

+

+ Na

+

2H

+

+ Na

+

2H

+

+ Na

+

2H

+

+ Na

+

Wysokorozdzielcze widmo MS dimerycznego peptydu
mostkowanego glikolem niejednorodnym – seria [MH

3

]

3+

Schemat

Schemat

procesu

procesu

monomeryzacj

monomeryzacj

i

i

, DIEA

Struktura amidoestru

Struktura amidoestru

dikarboksylowego analogu

dikarboksylowego analogu

glikolu polietylenowego

glikolu polietylenowego

CH

2

CH

2

C

H

2

O

CH

2

C

H

2

O

F

F

F

F

F

O

C

C

C

C

C

C

C

H

2

O

C

CH

3

CH

2

CH

2

CH

2

NH

O

C

12

6 3 2 . 3 3 9 1

3 +

7 5 6 . 9 3 1 6

2 +

8 5 7 . 9 6 1 4

2 +

9 4 8 . 0 0 2 8

2 +

' 1 0 1 5 . 5 1 7 9

3 +

1 0 5 4 . 4 8 4 6

1 +

6 0 0

7 0 0

8 0 0

9 0 0

1 0 0 0

1 1 0 0

m / z

0 . 0

0 . 2

0 . 4

0 . 6

0 . 8

1 . 0

1 . 2

9

x 1 0

I n t e n s .

M

obl.

= 1894,0021

g/mol
M

dośw

. = 1894,0158

g/mol

Wysokorozdzielcze widmo MS monomerycznego
peptydu mostkowanego glikolem jednorodnym

Widmo fragmentacyjne MS/MS-CID dimerycznego peptydu

mostkowanego glikolem jednorodnym PEG(LEDGRTLSDY-NH

2

)

2

dla jonu

m/z 1495,2341 ([MH

2

]

2+

) - energia kolizji 45eV

630.3194

1+

811.3923

1+

926.4192

1+

'1314.6448

2+

'1405.1809

2+

'1495.7172

2+

1768.8813

1+

1883.9430

1+

1998.9674

1+

2180.0459

1+

D

E

G

D

18.0163

E

D

D

Y

Y

D

Y

D

18.0099

18.0104

D - 0.0004

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

m/z

0

1

2

3

4

8

x10

Intens.

y

8

y

7

y

9

y

6

b

9

b

3

b

2

b

9

b

8

b

2

Schemat fragmentacji peptydu II (A) oraz jego etapy

fragmentacji (B i C)

(jon m/z 1495,2341, energia kolizji 45eV)

A

A

C

C

B

B

Wyniki badań biologicznych

Wyniki badań biologicznych

–

–

badanie humoralnej

badanie humoralnej

odpowiedzi immunologicznej*

odpowiedzi immunologicznej*

•

test Jernego

• określenie liczby AFC
produkujących IgM

peptyd

dawka

(μg)

AFC

(średni

a)

SE

P (test

studen

ta)

%

supres

ji

Próbka

kontrol

na

 

1000,00

37,42

 

 

I

1

609,25

35,01

0,0001

39

10

430,00

26,46

0,0001

57

100

545,00

45,00

0,0001

46

II

1

568,25

29,95

0,0001

43

10

511,00

41,56

0,0001

49

100

470,00

23,80

0,0001

53

IV

1

745,00

20,62

0,0008

26

10

550,00

64,55

0,0001

45

100

435,00

33,04

0,0001

57

Ubikwit

yna

1

654,50

25,69

0,0001

35

10

559,00

15,62

0,0001

44

100

645,50

75,35

0,0001

35

1 μg

10 μg

100

μg

Peptyd
I

Peptyd
II

Peptyd
IV

Ubikwity
na

*Instytut Immunologii i Terapii
Doświadczalnej Polskiej
Akademii Nauk we Wrocławiu;
Zakład prof. M. Zimeckiego

Podsumowani

e

• Zsyntezowałam, oczyściłam oraz potwierdziłam

strukturę nowych dimerycznych analogów

immunomodulatorowego fragmentu ubikwityny

– Zsyntezowałam, oczyściłam oraz potwierdziłam

strukturę monomerycznych analogów

immunomodulatorowego fragmentu ubikwityny

• Zbadanie właściwości immunomodulatorowych

otrzymanych peptydów*

– Zastosowanie łącznika glikolu polietylenowego wpływa

na wzrost hamowania humoralnej odpowiedzi

immunologicznej

– Dimeryzacja immunomodulatorowego fragmentu (50-

59) ubikwityny powoduje wzrost immunosupresji

peptydu

*Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we
Wrocławiu; Zakład prof. M. Zimeckiego