Barwienie bakterii:

Aby zaobserwować bakterie w mikroskopie

świetlnym, ocenić właściwie ich wielkość,

kształt, niektóre cechy morfologiczne,

należy je zabarwić.

Bakterie słabo załamują promienie

świetlne. Związki stosowane do barwienia

to głównie sole. Najczęściej stosuje się

barwniki o charakterze zasadowym, w

którym barwny jest kation.Barwniki

obojętne lub kwaśne są stosowane

znacznie rzadziej.

Do najczęściej stosowanych

barwników należą:

• błękit metylenowy,
• fiolet krystaliczny,
• fuksyna zasadowa,
• fuksyna kwaśna,
• safranina,
• zieleń malachitowa.

Barwienie bakterii ogólnie

Barwienie bakterii ogólnie

można podzielić na:

można podzielić na:

Barwienie bakterii ogólnie

Barwienie bakterii ogólnie

można podzielić na:

można podzielić na:



proste

proste

(stosuje się jeden barwnik)

(stosuje się jeden barwnik)



złożone

złożone

(stosuje się kolejno kilka barwników. Pozwala to

(stosuje się kolejno kilka barwników. Pozwala to

wyszczególnić w badanym preparacie bakterie gram

wyszczególnić w badanym preparacie bakterie gram

dodatnie i gram ujemne, różnią się one budową ściany

dodatnie i gram ujemne, różnią się one budową ściany

komórkowej a co za tym idzie-zdolnością do

komórkowej a co za tym idzie-zdolnością do

przepuszczania barwnika).

przepuszczania barwnika).

W zależności od stosowanych barwników,

można wyróżnić 3 sposoby barwienia:



barwienie pozytywowe - polegające na

zabarwieniu komórek, podczas gdy tło zostaje

bezbarwne; może być proste lub złożone,



barwienie negatywowe - uzyskanie kontrastu

między ciemnym tłem a nie zabarwionymi

komórkami; stosowane jest zwykle do barwienia

krętków i otoczek bakterii; wykorzystuje się roztwór

nigrozyny, tuszu chińskiego lub cyjanochiny. Rozmaz

wykonuje się z zawiesiny komórek zmieszanych z

barwnikiem, nie utrwala się, tylko od razu po

wysuszeniu ogląda pod mikroskopem; może być

proste lub złożone,



barwienie pozytywowo-negatywowe -

połączenie powyższych metod, najpierw wykonuje

się barwienie negatywowe, a po wyschnięciu
dobarwia się barwnikiem pozytywowym.

Technika każdego barwienia polega na pokrywaniu

szkiełka podstawowego z naniesionym i

utrwalonym preparatem-barwnikiem na

określony czas,

a następnie spłukiwaniu poszczególnych barwników

wodą przed nalaniem następnych.

Czasami w zależności od przepisu stosuje się także

takie substancje jak alkohol, czy płyn Lugola, a

także podgrzewanie preparatu nad palnikiem.

Preparat po wysuszeniu obserwuje się pod imersją.

Wyróżnić można także barwienie bakterii:
■przyżyciowe (rzadkie)
■pośmiertne (częściej stosowane).

Przyżyciowe:

Stosuje się je np. w celu

odróżnienia komórek żywych od martwych,
stwierdzenia obecności substancji zapasowych,
w badaniu przepuszczalności błony

cytoplazmatycznej.

Polega ono na wprowadzeniu do żywych komórek

nietoksycznego barwnika o dużej kontrastowości.

Używa się barwników o dużym rozcieńczeniu.

Stwierdzono, że bakterie w ten sposób barwione

przestają się rozmnażać.

Do przygotowania preparatu barwionego na

„żywo”, na szkiełku przedmiotowym, obok kropli

zawiesiny drobnoustrojów umieszcza się kroplę

barwnika. Obie krople miesza się ezą, przykrywa

szkiełkiem nakrywkowym i po upływie

określonego czasu ogląda pod mikroskopem.

Eza

Technika sporządzania

preparatu utrwalonego

Przed sporządzeniem preparatu należy odtłuścić

szkiełko przedmiotowe, przeciągając parokrotnie nad

płomieniem palnika gazowego. Na dobrze

odtłuszczonym szkiełku kropla wody powinna się

swobodnie rozlewać.
Sporządzanie rozmazu
Na odtłuszczone szkiełko nanosi się kroplę hodowli lub

badanego materiału i sporządza zawiesinę, którą

rozprowadza się ezą na powierzchni szkiełka

przedmiotowego i pozostawia do wyschnięcia na

wolnym powietrzu. Po wysuszeniu rozmaz powinien

być cienki, ledwo widoczny. Wysuszony preparat

utrwala się.

 Utrwalanie termiczne:

Polega na kilkukrotnym przesunięciu szkiełka przedmiotowego

z rozmazem nad płomieniem palnika od spodu preparatu,

przerywając kiedy szkło zacznie lekko parzyć.

 Utrwalanie chemiczne:

Stosuje się przy badaniu struktur komórkowych.Do tego

utrwalania używa się związków odwadniających, takich jak:

alkohol etylowy, metylowy, mieszanina alkoholu i eteru w

stosunku 1:1, 10- procentowy roztwór formaliny, sublimatu itp.
Utrwalanie chemiczne polega na zalaniu wysuszonego

rozmazu na określony czas utrwalaczem. Następnie utrwalacz

się zlewa i preparat suszy na powietrzu.Używając formaliny

lub sublimatu, należy preparat dobrze przemyć wodą i

wysuszyć.

Metoda Grama

Została opracowana w 1884 roku przez

Duńczyka, Hansa Christiana Grama (1853–
1938). Pozwala ona doświadczalnie
zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy
(Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu
na różnice w budowie ściany komórkowej oraz,
co za tym idzie, także pewne różnice w
fizjologii i podatności na leki.

Barwienie metodą Grama

odczynniki: fiolet krystaliczny, płyn Lugola, alkohol

etylowy, roztwór fuksyny zasadowej.

1.  Nanieść bakterie na szkiełko podstawowe.

       W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej

wystarczy nanieść na szkiełko kroplę hodowli lub pobrać

odrobinę bakterii jałową ezą (czyli wyżarzoną w płomieniu

palnika) i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka.

       W przypadku wykonywania preparatu z bakterii

wyrosłych na podłożach stałych należy materiał pobrać

jałowa ezą (czyli wyżarzoną w płomieniu palnika),

 następnie zawiesić bakterie w kropli soli fizjologicznej

naniesionej na szkiełko podstawowe.

Zabiegi te mają na celu przygotowanie bakterii w postaci
niezbyt gęstej zawiesiny. Po wysuszeniu utrwalamy
preparat przez przeciągnięcie szkiełka podstawowego
nad płomieniem palnika. Należy uważać, żeby nie trwało
to zbyt długo i żeby bakterii nie przypalić!!!

  2. Na utrwalone bakterie zakroplić fiolet krystaliczny w

ten sposób by pokrył on powierzchnię, na którą
naniesiono bakterie. Barwnik pozostawić na 2 minuty. Po
tym czasie zmyć fiolet wodą destylowaną.

3. Nanieść płyn Lugola na 1 minutę. Płyn spłukać obficie

najpierw alkoholem etylowym, a później wodą
destylowaną.

   4. Nanieść na preparat roztwór fuksyny zasadowej na 40

sekund. Po tym czasie spłukać szkiełko wodą destylowaną
i wysuszyć preparat. Przed umieszczeniem na stoliku
mikroskopu nanieść na szkiełko kroplę olejku
immersyjnego. Oglądać używając obiektywu dającego
stukrotne powiększenie.

Bakterie

Gram-dodatnie

Bakterie

Gram-ujemne

Schemat barwienia bakterii metodą Grama

Utrwalenie

preparatu

Fiolet krystaliczny

Płyn Lugola

Odbarwienie

roztworem

alkoholu

Fuksyna zasadowa

Wąglik zabarwiony

metodą Grama

Barwienie metodą Grama należy przeprowadzać
na hodowlach 18- 24 godzinnych. W starych
komórkach zdolność do tworzenia trwałego
kompleksu z fioletem zmniejsza się.

Bakterie:

G (+) barwią się na kolor

niebiesko-

fioletowy,

     

G (-) na

czerwono-różowy

Te bakterie których część komórek barwi się na
fioletowo a część na czerwono noszą nazwę
gramozmiennych.

Barwienie przetrwalników

Budowa przetrwalników, a szczególnie obecność
wielowarstwowych błon powoduje, że
przetrwalniki należą do słabo barwiących się i
konwencjonalne metody nie dają efektu. W
zabarwionych komórkach są widoczne jako
bezbarwne obszary. Barwniki mogą przenikać do
wnętrza po podgrzaniu preparatu.
Nieprzepuszczalność ściany przetrwalnika
zapobiega ich odbarwianiu podczas płukania
wodą czy alkoholem. Dlatego stosuje się
barwienie kontrastowe przetrwalników i
komórek wegetatywnych.

Metoda Schaeffera- Fultona

1. Uwalony preparat zalać 5- procentowym wodnym

roztworem zieleni malachitowej na 5 minut, po czym
nie zalewając barwnika, delikatnie podgrzać palnikiem
od spodu preparatu do momentu ukazania się
obłoczka pary. Podgrzewanie powtarza się 3-krotnie,
nie dopuszczając do odparowania barwnika,

2. Po skończonym ogrzewaniu preparat spłukać

delikatnym strumieniem wody w czasie 30 sekund,

3. Preparat dobarwić 0,5- procentowym roztworem

safraniny w czasie 30 sekund,

4.Po zakończonym barwieniu, preparat spłukać

wodą i osuszyć.

Przetrwalniki barwią się na

zielono

, a komórki

wegetatywne na

czerwono

.

Do znanych metod barwienia złożonego należą
metody barwienia bakterii, zawierających w
swych ścianach duże ilości tłuszczu i wosków.
Bakterie te, zabarwione na gorąco barwnikiem,
nie odbarwiają się pod działaniem alkoholu i
silnych kwasów mineralnych. Noszą one nazwę
bakterii alkoholo-kwaso-opornych.
Dla tej grupy najczęściej jest polecana metoda
barwienia prątków Ziehl-Neelsena, w której
podstawowym barwnikiem jest fuksyna
karbolowa.

Bakterie gruźlicy zabawione metodą Ziehla-Neelsena

Barwienie otoczek

Polega na barwieniu otoczek bakterii w
celu ułatwienia obserwacji.

Otoczki bakteryjne bardzo trudno

zaobserwować w mikroskopie świetlnym,
bez zastosowania specjalnych metod
barwienia. Jest to związane z tym, jak
otoczki załamują światło. W barwieniu
otoczek stosuje się najczęściej barwienie
negatywne z pewnymi modyfikacjami.

Na szkiełko przedmiotowe nanosi się kroplę

zawiesiny drobnoustrojów i kroplę nigrozyny lub tuszu.
Używając drugiego szkiełka przedmiotowego,
wykonuje się rozmaz i suszy na powietrzu. Preparat po
wyschnięciu jest gotowy do oglądania.

Na ciemnym tle są widoczne jasne komórki z

otoczkami.

Inną metodą jest barwienie różnicujące według

Anthony’ego w modyfikacji Tylera. Rozmaz komórek,
po wysuszeniu na powietrzu i utrwaleniu, barwi się 4-
7 minut fioletem krystalicznym według Anthony’ego-
Tylera. Barwnik zlewa się i preparat zmywa roztworem
siarczanu miedzi. Otoczki przyjmują barwę
niebieskofioletową, a komórki są ciemnoniebieskie.

Barwienie innych

Barwienie innych

substancji zapasowych

substancji zapasowych

Barwienie innych

Barwienie innych

substancji zapasowych

substancji zapasowych

Przy wykrywaniu wolutyny, rozmaz komórek po

Przy wykrywaniu wolutyny, rozmaz komórek po

wysuszeniu i utrwaleniu, barwi się przez kilka

wysuszeniu i utrwaleniu, barwi się przez kilka

sekund błękitem według Lofflera, spłukuje wodą i

sekund błękitem według Lofflera, spłukuje wodą i

suszy. Ziarnistości metachromatyczne barwią się

suszy. Ziarnistości metachromatyczne barwią się

na fioletowo, a komórki na niebiesko.

na fioletowo, a komórki na niebiesko.

Do barwienia glikogenu i granulozy stosuje się

Do barwienia glikogenu i granulozy stosuje się

płyn Lugola. Glikogen barwi się na kolor

płyn Lugola. Glikogen barwi się na kolor

czerwonobrunatny, a granuloza na

czerwonobrunatny, a granuloza na

ciemnoniebieski.

ciemnoniebieski.