Molekularne

Molekularne

podstawy pośredniej

podstawy pośredniej

diagnostyki

diagnostyki

pasożytów krwi i

pasożytów krwi i

chłonki.

chłonki.

Wojciech Więcek

Wojciech Więcek

Molekularne podstawy

Molekularne podstawy

rozpoznawania antygenu

rozpoznawania antygenu

przez limfocyty B.

przez limfocyty B.



Aby limfocyt B mógł spełnić swoją funkcję musi zostać

Aby limfocyt B mógł spełnić swoją funkcję musi zostać

aktywowany. Do rozpoczęcia tego procesu niezbędne jest

aktywowany. Do rozpoczęcia tego procesu niezbędne jest

bezpośrednie rozpoznanie antygenu przez

bezpośrednie rozpoznanie antygenu przez

kompleks

kompleks

receptora BCR l

receptora BCR l

ub pośrednio poprzez kontakt z innymi

ub pośrednio poprzez kontakt z innymi

komórkami APC, wówczas następuje przekazanie sygnału

komórkami APC, wówczas następuje przekazanie sygnału

przez fragment błonowy receptora do wnętrza komórki.

przez fragment błonowy receptora do wnętrza komórki.

Receptor ten s

Receptor ten s

kłada się z:

kłada się z:



Podjednostki wiążącej antygen –

Podjednostki wiążącej antygen –

cząsteczki przeciwciała (

cząsteczki przeciwciała (

IgD, IgM,

IgD, IgM,

IgG,

IgG,

IgA

IgA

lub

lub

IgE

IgE

)

)

wbudowanego w błonę.

wbudowanego w błonę.



Podjednostki

Podjednostki

przekazującej sygnał – heterodimeru

przekazującej sygnał – heterodimeru

Ig-

Ig-

α/

α/

Ig-

Ig-

β

β

(

(

CD79) wraz

CD79) wraz

z cytoplazmatyczną

z cytoplazmatyczną

sekwencją ITAM.

sekwencją ITAM.

Prezentacja antygenu i

Prezentacja antygenu i

aktywacja limfocytów B.

aktywacja limfocytów B.



We wczesnym etapie przekazania sygnału, dochodzi do

We wczesnym etapie przekazania sygnału, dochodzi do

aktywacji

aktywacji

kinaz tyrozynowych

kinaz tyrozynowych

i

i

fosfolipazy C.

fosfolipazy C.

Aktywacja

Aktywacja

kinaz powoduje fosforylację tyrozyn w obrębie sekwencji ITAM

kinaz powoduje fosforylację tyrozyn w obrębie sekwencji ITAM

oraz fragmentów receptora Igα i Igβ. Do ufosforylowanych

oraz fragmentów receptora Igα i Igβ. Do ufosforylowanych

cząsteczek ITAM przyłączają się kolejne białka z różnych

cząsteczek ITAM przyłączają się kolejne białka z różnych

szlaków biorące udział w przekazywaniu sygnału do wnętrza

szlaków biorące udział w przekazywaniu sygnału do wnętrza

komórki.

komórki.



Ostateczny efekt działania na receptor jest regulowany przez

Ostateczny efekt działania na receptor jest regulowany przez

wiele cząsteczek powierzchniowych. Do najważniejszych

wiele cząsteczek powierzchniowych. Do najważniejszych

cząsteczek kostymulujących

cząsteczek kostymulujących

należą CD40 oraz kompleks

należą CD40 oraz kompleks

CD19/CD21/CD81.

CD19/CD21/CD81.

Na tym etapie limfocyt B łączy się z

Na tym etapie limfocyt B łączy się z

limfocytem Th.

limfocytem Th.

Cząsteczki kostymulujące pozwalają na

Cząsteczki kostymulujące pozwalają na

wytworzenie

wytworzenie

synapsy immunologicznej

synapsy immunologicznej

i wzajemnej

i wzajemnej

współpracy obu komórek. Wówczas, prócz wydzielaniu dużej

współpracy obu komórek. Wówczas, prócz wydzielaniu dużej

ilości cytokin może dojść do

ilości cytokin może dojść do

prezentacji antygenu

prezentacji antygenu

limfocytowi T.

limfocytowi T.

Wtedy pobudzony limfocyt T dodatkowo

Wtedy pobudzony limfocyt T dodatkowo

stymuluje komórkę do aktywacji lub wydzielania przeciwciał.

stymuluje komórkę do aktywacji lub wydzielania przeciwciał.

Zmiana klasy

Zmiana klasy

produkowanych

produkowanych

immunoglobulin.

immunoglobulin.



W pierwszym etapie limfocyt B prezentuje limfocytowi

W pierwszym etapie limfocyt B prezentuje limfocytowi

Th antygen który rozpoznał. Następnie dochodzi do

Th antygen który rozpoznał. Następnie dochodzi do

połączenia dwóch komórek i wytworzenia

połączenia dwóch komórek i wytworzenia

synapsy

synapsy

immunologicznej.

immunologicznej.

W wyniku tego połączenia oraz

W wyniku tego połączenia oraz

wydzialanych przez limfocyt Th cytokin (np. IL-4, IL-5,IL-

wydzialanych przez limfocyt Th cytokin (np. IL-4, IL-5,IL-

10), komórka przekazuje limfocytowi B bodziec do

10), komórka przekazuje limfocytowi B bodziec do

zmiany klasy przeciwciał z IgM i IgD na IgG, IgA lub IgE.

zmiany klasy przeciwciał z IgM i IgD na IgG, IgA lub IgE.

Następuje odpowiedź humoralna, polegająca w głównej

Następuje odpowiedź humoralna, polegająca w głównej

mierze na produkcji przeciwciał, obejmuje m.in.:

mierze na produkcji przeciwciał, obejmuje m.in.:

1)

1)

Aktywowanie układu dopełniaczy zabijającego antygen.

Aktywowanie układu dopełniaczy zabijającego antygen.

2)

2)

Opsonizację związanego patogenu (ułatwia fagocytozę

Opsonizację związanego patogenu (ułatwia fagocytozę

3)

3)

przez makrofagi).

przez makrofagi).

4)

4)

Inaktywacje toksyn i umożliwienie ich fagocytozy.

Inaktywacje toksyn i umożliwienie ich fagocytozy.

Molekularne strategie

Molekularne strategie

obronne pasożytów

obronne pasożytów

krwi/chłonki

krwi/chłonki

STRATEGIA ZMIENNOŚCI

STRATEGIA ZMIENNOŚCI

ANTYGENOWEJ

ANTYGENOWEJ

-

-

Trypanosoma brucei

Trypanosoma brucei

Główny antygen powierzchniowy

Główny antygen powierzchniowy

afrykańskiego świdrowca jest dimerem

afrykańskiego świdrowca jest dimerem

glikoproteinowym zwanym 

glikoproteinowym zwanym 

zmienną

zmienną

glikoproteiną powierzchniową

glikoproteiną powierzchniową

 (VSG).

 (VSG).

Świdrowce zawierają więcej niż 1000

Świdrowce zawierają więcej niż 1000

różnych genów VSG, które różnią się

różnych genów VSG, które różnią się

wyraźnie w sekwencji. W kolejnych stadiach

wyraźnie w sekwencji. W kolejnych stadiach

następuje zmiana „płaszcza antygenowego”,

następuje zmiana „płaszcza antygenowego”,

co uniemożliwia skuteczną odpowiedź

co uniemożliwia skuteczną odpowiedź

immunologiczną oraz wytworzenie

immunologiczną oraz wytworzenie

szczepionki przeciw zakażeniu.

szczepionki przeciw zakażeniu.

Hamowanie aktywacji

Hamowanie aktywacji

układu immunologicznego

układu immunologicznego

-Schistosoma

-Schistosoma



Schistosoma haematobium wytwarza

Schistosoma haematobium wytwarza

substancje, które działają immunosupresyjne na

substancje, które działają immunosupresyjne na

limfocyty T gospodarza oraz takie, które

limfocyty T gospodarza oraz takie, które

prowadzą do degranulacji jego komórek

prowadzą do degranulacji jego komórek

tucznych.

tucznych.

Produkcja IL-10 czyli cytokiny

Produkcja IL-10 czyli cytokiny

przeciwzapalnej hamuje wytwarzanie cytokin

przeciwzapalnej hamuje wytwarzanie cytokin

prozapalnych takich, jak interferon-gamma, IL-2,

prozapalnych takich, jak interferon-gamma, IL-2,

IL-3, TNF-α.

IL-3, TNF-α.

Tym samym

Tym samym

hamując reakcje

hamując reakcje

immunologiczną

immunologiczną

przeciwko temu pasożytowi.

przeciwko temu pasożytowi.

Kamuflaż antygenowy

Kamuflaż antygenowy

-

-

Schistosoma

Schistosoma

Larwy Schistosoma mansoni wnikają przez skórę i

Larwy Schistosoma mansoni wnikają przez skórę i

wędrują do płuc, a następnie do układu krążenia. Zanim

wędrują do płuc, a następnie do układu krążenia. Zanim

wejdą do płuc, larwy te otaczają się

wejdą do płuc, larwy te otaczają się

warstwą

warstwą

glikolipidów antygenów grupowych krwi ABO i

glikolipidów antygenów grupowych krwi ABO i

cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej

cząsteczek głównego układu zgodności tkankowej

(MHC), pochodzących od gospodarza.

(MHC), pochodzących od gospodarza.

Prawdopodobnie do powierzchni larw przywr

Prawdopodobnie do powierzchni larw przywr

przytwierdza się wiele innych cząsteczek gospodarza.

przytwierdza się wiele innych cząsteczek gospodarza.

Płaszcz z białek gospodarza maskuje antygeny pasożyta

Płaszcz z białek gospodarza maskuje antygeny pasożyta

i w efekcie organizm pasożyta jest postrzegany przez

i w efekcie organizm pasożyta jest postrzegany przez

system immunologiczny żywiciela jako własny.

system immunologiczny żywiciela jako własny.

Diagnostyka pośrednia

Diagnostyka pośrednia

pasożytów krwi i chłonki.

pasożytów krwi i chłonki.



Aglutynacja bezpośrednia

Aglutynacja bezpośrednia



Odczyny immunoenzymatyczne

Odczyny immunoenzymatyczne



Odczyn immunofluorescencji

Odczyn immunofluorescencji

pośredniej

pośredniej

Aglutynacja bezpośrednia

Aglutynacja bezpośrednia



Aglutynacja- reakcja, w wyniku której

Aglutynacja- reakcja, w wyniku której

aglutynogen jest wiązany przez aglutyniny, co

aglutynogen jest wiązany przez aglutyniny, co

powoduje powstanie dużych, wytrącających się

powoduje powstanie dużych, wytrącających się

kompleksów.

kompleksów.



Antygenem wykorzystywanym do odczynów

Antygenem wykorzystywanym do odczynów

aglutynacyjnych bezpośrednich jest zawiesina

aglutynacyjnych bezpośrednich jest zawiesina

zabitych i utrwalonych pasożytów.

zabitych i utrwalonych pasożytów.



Pod wpływem przeciwciał zawartych w badanej

Pod wpływem przeciwciał zawartych w badanej

surowicy antygen aglutynuje, wytwarzając

surowicy antygen aglutynuje, wytwarzając

charakterystyczny wzór.

charakterystyczny wzór.



Wykrywanie

Wykrywanie

:

:

Leishmania donovani, Trypanosoma

Leishmania donovani, Trypanosoma

brucei

brucei

Odczyny

Odczyny

immunoenzymatyczne.

immunoenzymatyczne.

Bardzo czułe i swoiste testy serologiczne, które

zostały przystosowane do oznaczania klasy

przeciwciał, wykrywania krążących antygenów

rozpuszczalnych oraz swoistych kompleksów

immunologicznych.

Odczyn pośredni.

Odczyn pośredni.



Pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych

Pozwala wykryć obecność przeciwciał niekompletnych

w surowicy.

w surowicy.



Używa się antygenu rozpuszczalnego pasożyta do

Używa się antygenu rozpuszczalnego pasożyta do

opłaszczania fazy stałej np. zagłębień płytek

opłaszczania fazy stałej np. zagłębień płytek

hemaglutynacyjnych, aby związać na opłaszczonej

hemaglutynacyjnych, aby związać na opłaszczonej

powierzchni przeciwciała występujące w badanej surowicy.

powierzchni przeciwciała występujące w badanej surowicy.



Po zakończeniu inkubacji z próbką badanej surowicy,

Po zakończeniu inkubacji z próbką badanej surowicy,

dodaje się surowicy przeciwglobulinowej sprzężonej z

dodaje się surowicy przeciwglobulinowej sprzężonej z

enzymem (peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną).

enzymem (peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną).



W końcowym etapie stosuje się układ indykatorowy reakcji

W końcowym etapie stosuje się układ indykatorowy reakcji

enzymatycznej, dodając mieszaniny substratu enzymu i

enzymatycznej, dodając mieszaniny substratu enzymu i

nadtlenku wodoru.

nadtlenku wodoru.



Gdy reakcja jest dodatnia powstaje barwny produkt

Gdy reakcja jest dodatnia powstaje barwny produkt

końcowy w ilości proporcjonalnej do stężenia oznaczanego

końcowy w ilości proporcjonalnej do stężenia oznaczanego

komponentu surowicy.

komponentu surowicy.

Odczyn wychwytu

Odczyn wychwytu

przeciwciał.

przeciwciał.



Fazę stałą okrywa się preparatem surowicy odpornościowej przeciw

Fazę stałą okrywa się preparatem surowicy odpornościowej przeciw

globulinom: G, M, A, lub E.

globulinom: G, M, A, lub E.



Po zakończeniu inkubacji z próbką badanej surowicy dodaje się

Po zakończeniu inkubacji z próbką badanej surowicy dodaje się

kompleks antygenu pasożyta z przeciwciałem wyznakowanym

kompleks antygenu pasożyta z przeciwciałem wyznakowanym

enzymem.

enzymem.



W końcowym etapie stosuje się układ indykatorowy reakcji

W końcowym etapie stosuje się układ indykatorowy reakcji

enzymatycznej, dodając mieszaniny substratu enzymu i nadtlenku

enzymatycznej, dodając mieszaniny substratu enzymu i nadtlenku

wodoru.

wodoru.



Gdy reakcja jest dodatnia powstaje barwny produkt końcowy w

Gdy reakcja jest dodatnia powstaje barwny produkt końcowy w

ilości proporcjonalnej do stężenia oznaczanego komponentu

ilości proporcjonalnej do stężenia oznaczanego komponentu

surowicy.

surowicy.



Ma większą swoistość wyników niż odczyn pośredni

Ma większą swoistość wyników niż odczyn pośredni

Odczyn w kierunku

Odczyn w kierunku

antygenu

antygenu

Pierwszym krokiem jest umieszczenie specyficznego

względem danego antygenu przeciwciała na fazie stałej,
np. płytce. Po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały
się z płytką, można dodać badany materiał. Jeśli w owym
materiale znajduje się poszukiwane białko, będzie się ono
łączyć z przeciwciałami związanymi z płytką. Nastąpi
reakcja barwna. Ważna jest specyficzność przeciwciała,
od niej bowiem zależy, czy dany antygen zostanie
związany i czy nie nastąpi sfałszowanie testu w wyniku
związania innych, podobnych białek.

Odczyn immunoflorescencji

Odczyn immunoflorescencji

pośredniej.

pośredniej.



Umożliwia wykrycie przeciwciał obecnych w

Umożliwia wykrycie przeciwciał obecnych w

płynach ustrojowych, najczęściej w surowicy

płynach ustrojowych, najczęściej w surowicy

krwi, przez inkubację badanego płynu z

krwi, przez inkubację badanego płynu z

antygenem szkiełkowym pasożyta.

antygenem szkiełkowym pasożyta.



Przeciwciała związane w czasie inkubacji z

Przeciwciała związane w czasie inkubacji z

antygenem wykrywa się za pomocą surowicy

antygenem wykrywa się za pomocą surowicy

przeciwglobulinowej sprzężonej z

przeciwglobulinowej sprzężonej z

fluorochromem (zazwyczaj z izotiocyjaninem

fluorochromem (zazwyczaj z izotiocyjaninem

fluorosceiny wykazującym charakterystyczne

fluorosceiny wykazującym charakterystyczne

świecenie podczas oglądania preparatu pod

świecenie podczas oglądania preparatu pod

mikroskopem w świetle ultrafioletowym).

mikroskopem w świetle ultrafioletowym).

Modyfikacje

Modyfikacje

ELISA

ELISA

czyli płytkowy test immunoenzymatyczny fazy stałej –jeden z

czyli płytkowy test immunoenzymatyczny fazy stałej –jeden z

najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych,

najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych,

zarówno naukowych, jak i diagnostycznych.

zarówno naukowych, jak i diagnostycznych.



Podstawą testów ELISA jest tworzenie kompleksów immunologicznych

Podstawą testów ELISA jest tworzenie kompleksów immunologicznych

między antygenem a przeciwciałem (rozpoznającym specyficznie

między antygenem a przeciwciałem (rozpoznającym specyficznie

antygen)

antygen)



Służy on do wykrycia i ilościowej oceny określonych antygenów (np.

Służy on do wykrycia i ilościowej oceny określonych antygenów (np.

białek, antygenów bakteryjnych, wirusowych, pasożytniczych,

białek, antygenów bakteryjnych, wirusowych, pasożytniczych,

hormonów, leków) lub przeciwciał (np. przeciwciał antywirusowych) w

hormonów, leków) lub przeciwciał (np. przeciwciał antywirusowych) w

badanym materiale z użyciem specyficznych dla danego antygenu

badanym materiale z użyciem specyficznych dla danego antygenu

przeciwciał lub specyficznych dla danego przeciwciała antyprzeciwciał

przeciwciał lub specyficznych dla danego przeciwciała antyprzeciwciał

skoniugowanych (wyznakowanych) z odpowiednim enzymem.

skoniugowanych (wyznakowanych) z odpowiednim enzymem.

SAFA

SAFA



Jest pośrednim testem antygenowym, który

Jest pośrednim testem antygenowym, który

umożliwia

umożliwia

obiektywnie ustalić antygen, będący

obiektywnie ustalić antygen, będący

przyczyną choroby.

przyczyną choroby.



Pozwala wyeliminować problem związany z

Pozwala wyeliminować problem związany z

barwieniem.

barwieniem.

Jako substratu dla antygenu używa

Jako substratu dla antygenu używa

się sztucznej matrycy z płyty zawierającej octan

się sztucznej matrycy z płyty zawierającej octan

celulozy. Wyniki testu są odczytywane za

celulozy. Wyniki testu są odczytywane za

pomocą fluorometru.

pomocą fluorometru.

Wykorzystanie testów biologii

Wykorzystanie testów biologii

molekularnej w różnicowaniu

molekularnej w różnicowaniu

pasożytów krwi.

pasożytów krwi.



Nested

Nested

PCR-

PCR-

stosowane są dwa różne primery, użycie

stosowane są dwa różne primery, użycie

pierwszej pary prowadzi do powielenia łatwo dostępnych

pierwszej pary prowadzi do powielenia łatwo dostępnych

segmentów DNA lub RNA, których fragmenty bywają niekiedy

segmentów DNA lub RNA, których fragmenty bywają niekiedy

jednakowe dla różnych gatunków pasożytów, natomiast

jednakowe dla różnych gatunków pasożytów, natomiast

kontynuowanie reakcji za pomocą drugiej pary starterów

kontynuowanie reakcji za pomocą drugiej pary starterów

zawęża amplifikację do fragmentów swoistych już tylko dla

zawęża amplifikację do fragmentów swoistych już tylko dla

jednego gatunku

jednego gatunku



RADP-

RADP-

do amplifikacji używa się arbitralnie dobranych

do amplifikacji używa się arbitralnie dobranych

primerów, zawierających zazwyczaj poniżej 20 nukleotydów w

primerów, zawierających zazwyczaj poniżej 20 nukleotydów w

łańcuchu, które bez trudu odszukują komplementarne

łańcuchu, które bez trudu odszukują komplementarne

sekwencje w badanym DNA, przytwierdzając się w wielu

sekwencje w badanym DNA, przytwierdzając się w wielu

miejscach nici kwasu, oddzielonych fragmentami o różnej

miejscach nici kwasu, oddzielonych fragmentami o różnej

długości zależnej od gatunku pasożyta. W etapie wydłużania

długości zależnej od gatunku pasożyta. W etapie wydłużania

łańcuchów DNA powstają fragmenty nici o różnej długości,

łańcuchów DNA powstają fragmenty nici o różnej długości,

które podczas rozdziału elektroforetycznego zamplifikowanego

które podczas rozdziału elektroforetycznego zamplifikowanego

materiału wędrują z różną prędkością, dając w efekcie wzór

materiału wędrują z różną prędkością, dając w efekcie wzór

prążków charakterystyczny dla danego gatunku.

prążków charakterystyczny dla danego gatunku.