Molekularne podstawy pośredniej

diagnostyki pasożytów tkanek narządowych

Opracowała

Paulina

Werner

Procesy immunologiczne w
przebiegu zarażenia pasożytami
tkanek narządowych

W procesach immunologicznych podczas

zakażenia pasożytami przeważa
odpowiedź komórkowa związana z
aktywnością limfocytów T.

Limfocyty T charakteryzują się
obecnością na powierzchni receptora
komórek T (

TCR

) oraz następujących

cząsteczek różnicujących: CD2, CD3,

CD4

, CD5, CD7,

CD8

, CD28, CD154

Limfocyty dzieli się na:

Ze względu

na funkcję

:

Limfocyty Tc

 (cytotoksyczne) - są odpowiedzialne za niszczenie komórek

zakażonych przez drobnoustroje oraz za niszczenie komórek nowotworowych.
Większość tych limfocytów posiada na swojej powierzchni CD8+. Rozpoznają obce
MHC klasy I

Limfocyty Th

 (pomocnicze) - wspomagają odpowiedź

humoralną i komórkową poprzez bezpośredni kontakt oraz wydzielanie cytokin.
Ponadto ułatwiają aktywację limfocytów B i makrofagów. 90% tych limfocytów
posiada CD4+. Rozpoznają MHC klasy II. Dzielimy je na :

• Limfocyty Th1

- wspomagają odpowiedź komórkową. Aktywują makrofagi i

limfocyty Tc, stymulują wytwarzanie przeciwciał 

IgG1 i IgG3

. Wytwarzają 

IL-

2 oraz interferon γ

• Limfocyty Th2

- wspomagają odpowiedź humoralną. Stymulują rozwój reakcji

alergicznych, pobudzają wytwarzanie przeciwciał 

IgA, IgE i IgG4

.

Wytwarzają

 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13

 które są czynnikami wzrostu i

różnicowania limfocytów B

• Limfocyty Th0

- limfocyty będące na etapie rozwoju. Wydzielają wiele różnych

cytokin

• Limfocyty Th17

- dzięki wydzielanej 

IL-17

 są odpowiedzialne za szybki rozwój

reakcji
zapalnej i pojawienie się neutrofilów

Limfocyty Treg

 (regulatorowe) - są odpowiedzialne za hamowanie nadmiernej

reakcji przeciwzapalnej i reakcji nadwrażliwości, zabezpieczają organizm przed
autoagresją, zwiększają tolerancję na zewnętrzne antygeny, chronią płód przed
odrzuceniem przez układ odpornościowy matki

Ze względu na

budowę receptora TCR

:

Limfocyty Tαβ

- 90% limfocytów w organizmie człowieka

Limfocyty Tγδ

 - uczestniczą w odpowiedzi przeciwzakaźnej

(przeciw wirusom, bakteriom i pierwotniakom) oraz w
odpowiedzi przeciwnowotworowej, rozpoznają białka szoku
cieplnego

kompleks receptorowy limfocytów

T

Jest receptorem glikoproteinowym, którego białkowa część przenika
całkowicie błonę komórkową- jest białkiem transbłonowym o strukturze podobnej
do immunoglobulin. Składa się z

łańcuchów α i β

(rzadziej: γ i δ; wyjątkowo: γ i γ, β i

β, β i δ) posiadających część zmienną i stałą.

W błonie komórkowej

obok TCR znajduje się glikoproteina CD3, której

kompleks przekazuje sygnał do wnętrza komórki o związaniu antygenu

przez TCR. CD3 posiadają charakterystyczny

motyw sekwencji dla

fosforylacji tyrozyny

, znany jako

ITAMs

(Immunoreceptor Tyrosine-based

Activation Motifs)

Schemat TCR (łańcuch TCR-α i TCR-β).
Niebieskie segmenty

- ITAMs

. Obok TCR

znajdują się 4 łańcuchy CD3 ( gamma,
delta, epsilon) oraz łańcuch CD4 lub CD8

Przebieg reakcji immunologicznej z udziałem
limfocytów T

1.Związanie antygenu z cząsteczkami

MHC

(glikoproteiny głównego

układu zgodności tkankowej kodowane przez geny na chromosomie 6).
Wyróżnia się:

• MHC I

- występują na powierzchni

wszystkich komórek jądrowych

.

Cząsteczki te łączą się z peptydami antygenowymi oraz mikrotubuliną b2
w kompleks, który po przejściu przez aparat Golgiego jest eksponowany
na zewnętrznej stronie błony komórkowej. Z tym kompleksem wiążą się
za pomocą TCR limfocyty

Tc (CD8)

• MHC II

– występują

na powierzchni komórek prezentujących antygeny

(gł. komórek dendrytycznych) , które za pomocą receptorów wiążą obce
białka , endocytują i poddają proteolizie. Następuje synteza MHC,
połączenie go z obcym peptydem i prezentacja na powierzchni błony
komórkowej. Z tym kompleksem wiążą się limfocyty

Th (CD4).

2. Wytworzenie synapsy immunologicznej – struktury powstającej na
styku komórki prezentującej antygen (APC) oraz pobudzanego limfocytu.
Dzięki utworzeniu synapsy obydwie komórki mogą zostać zaktywowane.

3. Przekazanie 2 sygnałów aktywacji

4. Dojrzewanie synapsy

5. Przekazanie sygnału do wnętrza
limfocytu

6. Transkrypcja genów i produkcja
białek

7. Wydzielanie cytokin i proliferacja

Cytokiny

Cytokiny − białka wpływające na wzrost, proliferację i pobudzenie komórek biorących
udział w odpowiedzi odpornościowej oraz komórek hemopoetycznych. Cytokiny mogą
wybiórczo pobudzać odpowiedź komórkową lub humoralną, co w połączeniu z ich ilością
(ponad 100 opisanych cytokin i wciąż odkrywane nowe) powoduje, że powstaje niezwykle
skuteczny, ale także bardzo skomplikowany i czuły system powiązań pomiędzy komórkami
układu odpornościowego, tzw. sieć cytokin.

interleukiny są cytokinami, które umożliwiają komunikację leukocytów ze sobą i pozwalają na
wpływ jednych populacji leukocytów na inne. Najważniejsze interleukiny to:

•Interleukina 1 

- niezwykle istotna w procesach inicjujących stan zapalny, pobudza

wytwarzanie Interleukiny 6

•Interleukina 2 

- bardzo ważna w pobudzeniu limfocytów T oraz komórek NK

•Interleukina 3

 - zaliczana także do cytokin hemopoetycznych, silnie stymuluje

krwiotworzenie

•Interleukina 4

 - pobudza podział limfocytów B 

•Interleukina 6 

- indukuje zapalenie, bierze udział w krwiotworzeniu i uczestniczy w wielu

różnych mechanizmach odpornościowych

•Interleukina 7 

- jedna z podstawowych cytokin w limfopoezie

•Interleukina 8

 - cytokina zaliczana również do chemokin, główna cytokina

aktywująca neutrofile

•Interleukina 10

 - cytokina immunosupresyjna, uczestniczy w wygaszaniu odpowiedzi

odpornościowej i wytwarzaniu immunotolerancji

•Interleukina 12

 - stymuluje komórki NK, limfocyty T oraz bierze udział w polaryzacji

immunologicznej

•Interleukina 18

 - efekty podobne do efektów IL-1, działa przez te same receptory

Do grupy cytokin zaliczmy także

interferony

zaangażowane w reakcje

przeciw wirusom, bakteriom,

pasożytom

i nowotworom. Wyróżniamy:

• interferony typu I (oznaczone literami α, β, κ i ω) są wydzielane
przez leukocyty i inne komórki

•

interferon typu II (IFN-γ) - wydzielany przez limfocyty T i

komórki NK

Molekularne strategie obronne pasożytów tkanek narządowych

I. Toxoplasma gondii

1. budowanie niszy w wakuoli:

• szczególna rola białek mikronem

MIC2 i M2AP

, których domeny

cytoplazmatyczne wiążą się z aldolazą. Tworzy się kompleks, który
umożliwia wsunięcie pasożyta do komórki

• Odcinanie mikronem przez proteazy i zamknięcie pasożyta w
wakuoli pasożytniczej powstałej ze zlania się błony zewnętrznej, z
którą związane są białka pasożyta

ROP1-9

-> ich funkcją jest ułatwienie formowania wakuoli i

uniemożliwienie fuzji wakuoli z lizosomem komórki gospodarza.

ROP1 pojawia się w początkowej fazie inwazji i ułatwia wnikanie
pasożyta do komórki żywiciela,

ROP2 umożliwia dołączenie do

wakuoli mitochondriów gospodarza.

• wnętrze wakuoli budują białka granul o dużej gęstości

GRA

–

umożliwiają kontakt z komórką gospodarza i transport substancji
odżywczych (

GRA 3,5,8

) oraz budują wewnętrzną sieć mikrotubul,

która stabilizuje strukturę i umożliwia wzrost wakuoli (

GRA

1,2,4,6,7,9

)

• wakuola jest oddzielona od szlaków endo i egzocytozy komórki
gospodarza, obojętne pH, obecność inhibitorów proteaz nie
powodują degradacji cząsteczek co umożliwia namnażanie komórek
pasożyta

2. Molekularna manipulacja metabolizmu zarażonej
komórki:

T. gondii wykształcił kilka technik do modyfikowania funkcji
komórek gospodarza:
• Blokuje apoptozę w zarażonych komórkach poprzez:
a). włączanie transkrypcji czynników anty-apoptotycznych
(Bcl2) i ubiwyktynację pro-apoptotycznych (Bax i Bak)
b). Zmniejszone uwalnianie cytochromu c (blokada szlaku
mitochondrialnego)
c). Blokadę kaspazy 8 (blokada szlaku receptorowego)
• Zaburza funkcje czynników transkrypcyjnych gospodarza
włącznie ze STAT1
->

obniżenie ekspresji genów kodujących antygeny

powierzchowne MHC II i tym samym odpowiedzi komórkowej

• Blokuje ekspresję genów zapalnych cytokin takich jak TNF-

α

oraz IL-12 (odpowiedzialne białko pasożyta

ROP16

) –> ich brak

powoduje

zahamowanie produkcji IFN-γ

od którego zależy

odporność na pasożyta
• Pobudza aktywność czynników transkrypcyjnych STAT3/6
(białko pasożyta

ROP16

)

• „ rozbraja” makrofagi przez fosforylację

IRG

– GTPaz

związanych z odpornością
(odpowiedzialne białko pasożyta

ROP18

)

3. profilowanie odpowiedzi immunologicznej żywiciela:
Odpowiedź humoralna polega na wytwarzaniu różnych klas
przeciwciał w zależności od fazy zakażenia.

-W pierwszych tygodniach po zarażeniu pojawiają się
przeciwciała:

IgM

(przeciwko antygenowi ROP-1 oraz

antygenom GRA) ,

IgG

(przeciwko GRA 7,8 i SAG1),

IgA

-W 3 do 6 miesiąca najwyższe stężenie przeciwciał

IgG

przeciwko GRA1

-Od 6 do 12 miesiąca od zarażenia pojawiają się

IgG

anty

rSAG1 i

IgM

anty ROP-1c

- powyżej 12 miesięcy przeciwciała IgA i IgM zazwyczaj już nie
występują, obecne

IgG

dla antygenu rSAG1.

Molekularne strategie obronne pasożytów tkanek narządowych:

II. Leishmania

1.Kryjówka w fagosomie:

• Postacie promastigota wykorzystują proteazę powierzchniową

GP63 by ułatwić fagocytozę poprzez receptory błonowe
makrofagów

• Powierzchniowy lipofosfoglikan LPG postaci promastigota

opóźnia fuzję fagosomu z lizosomem oraz wydzielanie lokalnych
nadtlenków co umożliwia namnażanie.

• Postacie amastigota są oporne na kwaśne środowisko

fagolizosomu

• Białka

A2

u postaci amastigota chronią pasożyta przed

działaniem szoku cieplnego i stresu oksydacyjnego

• Adaptacją do wewnątrzkomórkowego środowiska jest ekspresja

genu białka błony mitochondrialnej Ldp27, który jako składnik
kompleksu COX związany jest z produkcją ATP u postaci
amastigota co umożliwia efektywne namnażanie

2.Molekularna manipulacja metabolizmu zarażonej komórki:

•Hamowanie kinazy PKC makrofagów

•Wybiórcze hamowanie ekspresji genów dla IL-12 ->

brak produkcji

INF-g

• pobudzanie

nadekspresji czynnika HIF-1a

przez wyczerpywanie

zasobów żelaza w komórce gospodarza , co sprzyja
wewnątrzkomórkowemu wzrostowi pasożyta

• inhibicja szlaków apoptozy komórek

Molekularne strategie obronne pasożytów tkanek
narządowych

III. Trypanosoma cruzi

Ucieczka z endosomu do cytoplazmy

• Mechanizm tego procesu zależy od pH wewnątrz endosomu

• Uwalniany jest czynnik

TcTox

a później czynnik lityczny

LYT1

kiedy endosom ulegnie fuzji z lizosomem

• Błona ulega lizie i umożliwia wyjście pasożyta z endosomu

do cytoplazmy

IV. Trichinella spiralis

Kryjówka w cyście

Po wniknięciu do mięśni nicień modyfikuje mechanizm regeneracji

komórki mięśniowej, która staje się komórką-piastunką:

• Utrata organizacji miofibrylarnej komórki

• Tworzy się przegroda z bazofilnej cytoplazmy, która ma odgraniczyć

zarażoną część od zdrowej

• Aktywacja komórek satelitarnych, które tworzą eozynofilną

cytoplazmę, zanik cytoplazmy bazofilnej

• W formowaniu cysty bierze udział ścieżka sygnalizacyjna

TGF-b -

zatrzymanie podziałów komórkowych w fazie G2/M

• Jądra komórkowe ulegają hipertrofii

• Tworzy się kolagenowa otoczka dookoła komórki z larwą

Nurse cell formation:

F

: Invasion of Trichinella larva causes dissolution and

complete loss of myofibrillar organization;

G

: Satellite cells are activated.

Basophilic transformation occurs in the infected muscle cell. A septum is formed
to limit damaged area;

H

: Activated satellite cells proliferate, differentiate and

fuse to each other or with the infected muscle cell, which provides eosinophilic
cytoplasm. The infected muscle cell dedifferentiates, reenters cell cycle and
arrests at G2/M. There are many hypertrophy nuclei;

I and J

: The eosinophilic

cytoplasm (which is provided by satellite cells) increases in volume and the
basophilic cytoplasm (which originates from infected muscle cell) decreases in
volume;

K:

The mature nurse cell is formed. The cytoplasm of nurse cell is

eosinophilic.

Diagnostyka pośrednia pasożytów tkanek narządowych

1. Odczyn barwny Sabina-Feldmana (1948r.) –

rozpoznanie

toksoplazmozy

• Tachyzoity Toxoplasma gondii pochłaniają barwnik błękitu

metylenowego

• Tachyzoity nie barwią się w obecności dopełniacza i przeciwciał

klasy IgM i IgG

• Odczyn jest wysoce czuły i swoisty ale nie różnicuje przeciwciał,

naraża personel laboratoryjny na zakażenia (stosuje się żywe
tachyzoity)

2. Test transformacji blastycznej limfocytów

•ocenia zdolność limfocytów do proliferacji

•Izolacja limfocytów z krwi poprzez metodę sedymentacji lub w
gradientach gęstości (do krwi dodawany antykoagulant,
nawarstwienie na warstwę gradientu,wirowanie)

•Limfocyty stymuluje się swoistymi antygenami

• 2 metody uzyskania wyników:

1. metoda morfologiczna

– odsetek komórek blastycznych ocenia

się w mikroskopie świetlnym, w preparacie wykonanym z osadu
3-5 dniowej hodowli izolowanych limfocytów z antygenem.

2. metoda izotopowa

– proliferację ocenia się przez pomiar

włączania tymidyny znakowanej trytem do DNA jąder dzielących
się intensywnie komórek blastycznych po stymulacji antygenem.
Określa się indeks stymulacyjny w stosunku do kontroli (hodowla
limfocytów bez stymulacji).

Dziękuję za
uwagę