Immunohematologia

Antygeny grup krwi

Badanie przeciwciał

Testy zgodności przed

przetoczeniem Przetaczanie

krwi

Historia odkryć antygenów grupowych krwi

Antygeny

Odkrycie

 Układ

rok

 Autorzy

A B O

1900

Landsteiner

MNS

1927

Landsteiner and Levin

P

1927

Landsteiner and Levin

Rh -Hr

1937

Landsteiner and Wiener

Kell

1946

Coombs, Mourant and
Race

Lewis

1946

Mourant

Lutheran

1946

Callender and Race

Duffy

1950

Cutbush, Mollison and
Parker

Kidd

1951

Allen, Diamond and
Niedziela

Diego

1954

Levine, Koch, McGee and
Hill

Js

1957 Giblett

 

 

Antygeny krwinek czerwonych

Antygeny krwinek czerwonych charakteryzują

następujące cechy:

1.

Ich obecność stwierdza się na podstawie reakcji ze

swoistym przeciwciałem. Wynikiem tej reakcji jest:

aglutynacja (ag +ab)
lub liza (ag+ab+C’)
2. Są one dziedziczone zgodnie z prawami Mendla
3.

Ich ekspresja pojawia się w życiu płodowym,

w pełni wykształca się po urodzeniu i
wczesnym okresie noworodkowym,
pozostaje do końca życia
4. Układ antygenów ABO jest jedynym, przeciwko

któremu w surowicy i osoczu znajdują się regularne,

naturalne przeciwciała przeciwko antygenom

nieobecnym na własnych krwinkach

Podstawy genetyki

• Geny strukturalne
- zawiadują syntezą białek

• Geny regulatory (hamujące, modyfikujące)
- kontrolują ilość antygenu produkowanego przez

geny strukturalne

• Geny amorficzne – gen niemy (produkty nieznany)

• Genotyp – to zespół genów odpowiedzialnych za

syntezę cech

• Fenotyp – to cechy, które można wykryć

badaniami laboratoryjnymi

Podstawy genetyki

Geny zajmujące jedno locus w chromosomie

• geny alternatywne

• geny alleliczne

• allele
Układ, w którym są dwa lub więcej alleli to układ polimorficzny
Niezależnie od liczby allelicznych genów tylko jeden z nich

może zająć odpowiednie locus w danym chromosomie

Chromosomy dziedziczy się po jednym z każdej pary ( 22 pary u

człowieka)

Homozygota = dwa odpowiednie loci zajęte jest przez dwa

identyczne allele (geny)

Heterozygota = dwa odpowiednie loci zajęte przez różne allele
Homozygota syntetyzuje antygen w podwójnej dawce
Heterozygota syntetyzuje antygen w pojedynczej dawce
Charakter genu może być :

• dominujący

• ustępujący (recesywny)

• kodominujący (ekspresja genu ujawnia się zawsze)

Podstawy genetyki grup krwi -

Zasady genetyki grup krwi :

1.Antygeny wielocukrowe są budowane przy pomocy

transferaz

2.Każdy swoisty cukier jest dodawany do określonego

substratu

3. Włączenie nowego cukru odbywa się przy pomocy

transferazy będącej pod nadzorem odpowiedniego genu

4. Powstanie antygenu przy pomocy transferazy musi być

poprzedzone prawidłowym wykształceniem substratu

5. Niektóre transferazy mogą używać wiecej niż jednego

substratu

6. Dodanie nowego cukru do substratu powoduje powstanie

nowego antygenu, który maskuje poprzednio zbudowany

antygen.

Podstawy genetyki grup krwi

-

Układ ABO - układ polimorficzny
Znane są 3 geny : A, B, i 0, niektórzy uważają że są 4 geny

(A1,A2,B i 0)

Transferaza A1 różni się od transferazy A2 niższą

efektywnością.

• Lokalizacja – długie ramię chromosomu 9
• Regulują syntezą transferazy glikozylowej, która

dołącza specyficzny cukier do łańcucha
oligosacharydowego

• Różnice w genach A i B są punktowe,( różnice dotyczą

pojedynczej reszty cukrowej) są wynikiem różnicy w
swoistości syntetyzowanej transferazy

• Punktowa różnica w genie 0 powoduje syntezę białka

bez aktywności enzymatycznej

Antygeny węglowodanowe grup

krwi

L-
fukoza

Prekursorowy
łancuch H

grupa krwi 0

N acetylo-
galaktozam
ina

Antygen A
Grupa krwi A1 lub
A2

D-
galaktoza

Antygen B
Grupa krwi B

Antygen A
i B

Grupa krwi
AB

Struktura polisacharydowego

łancucha H typu I i typu II

Podstawy genetyki grup krwi

Krwinki czerwone grupy 0 i A2 mają duże ilości antygenu H.
Gen H i jego allel h dziedziczą się niezależnie od genów ABO

(nie są sprzężone)

Gen H jest dominujący - gen h amorficzny.
Brak genu H (genotyp h/h) zdarza się wyjątkowo rzadko i

powoduje.

brak łańcucha H

(brak transferazy H ).

Erytrocyty nosicieli tej cechy nie wykazują obecności

antygenu układu AB

jednak w ich krwi są obecne odpowiednie transferazy dla

antygenu A i B

Osoby takie posiadają grupę krwi Bombay (pseudo 0)
Oznacza się ją odpowiednio : 0h

A

, 0h

B

,

0h

AB

(

Oh – Bombay lub ABHnull)

Osoby te są bardzo trudnymi pacjentami w sytuacji

konieczności przetoczenia krwi.

Dawca musi być poszukiwany w grupie nosicieli takiego

samego defektu.

Dawca musi mieć taką samą rzadką grupę krwi.

Antygeny krwinek czerwonych w płynach ciała

•

80% ludzi rasy białej jest nosicielem genów, które

determinują obecność antygenów krwinek czerwonych

w płynach ciała (wydzielacze)

swoistość tych antygenów to H, A, B and Le .

• Geny regulujące wydzielanie mają dwa allele Se and se

• Wydzielaczami są osoby z genotypem : SeSe lub Sese

• Gen Se zawiaduje syntezą fukozylotransferazy

dołączajacej fukozę do łańcucha prekursorowego typu I.

Powstaje łancuch H typu I

• Genotyp sese charakteryzuje osoby nie wydzielające
Jeśli

• Erytrocyty są A+ - w płynach są antygeny H i A

• Erytrocyty są B+ - w płynach są antygeny H i B

• Erytrocyty są A+B+ - w płynach są antygeny H, A i B

• Pozwala to na oznaczenie grupy krwi bez pobierania

krwi (np. w ślinie)

• Informacja ta jest ważna dla laboratoriów

kryminalistycznych i jest wykorzystywana w

identyfikacji podgrup i ustalaniu podłoża osób o

nietypowej grupie krwi.

Częstość fenotypu AB0 w

wybranych populacjach

Populacja

A1

A2 B

A1B

A2B

0

Niemiecka

32,5 9,4 11 3,1

1,1 42,

8

Polska

31,5 9,0 19 6,4 1,6

32,
5

Euro-
Amerykanie

35 10

8

3

1

43

Pł. Am.
Indianie

0

0

0

0

0

100

Aborygeni

55,6

0

0

0

0

44,
4

Lapończycy

36,1

18,5

4,8 6,2 6,2 18,

2

Różna gęstość antygenu A na

krwinkach grupy A1 i A2

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A H

H

Antygeny węglowodanowe grup krwi

Inne układy grupowe

częstość w populacji

1.Układ Lewis : antygeny Le

a

and Le

b

-

Le

a

22%, Le

b

72%, Le

a-

6%

Przeciwciała anty Lewis są naturalne klasy IgM
Dwie pary genów uczestniczą w budowie antygenów Lewis
Le i le oraz Se i se. Geny le i se są amorficzne.
Substratem dla tych antygenów jest łańcuch H typu I.
Antygeny te są adsorbowane przez błonę krwinki z osocza

Le/Le lub
Le/le

le/le

Niewydzielacze se/se

Le (a+
b-)

(a-b-)

Wydzielacze Se/Se
lub Se/se

Le (a-
b+)

Le (a-
b-)

Antygeny węglowodanowe grup krwi

Inne układy grupowe

2. Układ Ii lub IH ( słabe antygeny)
Krwinki płodu i pępowiny reagują słabo z przeciwciałem

anty-I i silnie z anty-i.

Antygeny tego układu pojawiają się dopiero w 2 roku życia
Anty-I (IH) przeciwciała są klasy IgM zimnymi

aglutyninami.

Pacjenci chorujący na mononukleozę lub zapalenia płuc

wywołane mycoplasmą mają wysokie miano zimnych

aglutynin ze swoistością anty I lub anty i, które są

odpowiedzialne za rozwój autoimmunologicznej anemii

hemolitycznej

3. P system: częstość -

P1 - 79%, P2 amorficzny – 21%

(brakP1),

P1- determinuje D-galaktoza w łańcuchu H typu II (bez

fukozy)

Przeciwciała anty P1 są przeciwciałami naturalnymi (IgM)

Antygeny białkowe grup krwi

Układ antygenów

częstość w populacji

• 1. Kidd (Jk

a

and Jk

b)

Ab. odpornościowe -

Jk

a

25%, Jk

ab

50%, Jk

b

25%

• 2. Duffy ( Fy

a

Fy

b

)

Ab. odpornościowe -

Fy

a

17%, Fy

ab

49%, Fy

b

34%

Ag Duffy jest receptorem dla

Zach. Afryka -70% Duffy

minus

zarodźca malarii (Plasmodium vivax)

Rasa Kaukaska –większość

Duffy

positive

• 3. Kell (Kk)
ab odpornościowe -

K 10%, k 90% (K+, k = K- )

• 4. MNS
Przeciwciała naturalne IgM -

M 35%,MN,48%,

Anty s zawsze odpornościowe

N16%, S10%, Ss44%, s45%

• 5. Rh

Układ Kell

Układ Kell. Geny kodujace antygen k i K sa

kodominujace. Przeciwciala anty Kell ( anty k i anty

K ) maja podobne dzialanie jak anty Rh D z ukladu

Rh. Mogą być przyczyną konfliktu pomiedzy matka i

płodem i są przyczyną odczynow poprzetoczeniwych.

10% osób rasy kaukaskiej jest K+

2% afroamerykanów jest K+

Zgodnie z obowiazującymi przepisami

dziewczynkom i kobietom do okresu

menopauzy wolno przetaczać krew zgodną w

ukladzie KELL ( K- dla K-)

Sprzężenie genów kodujących syntezę

antygenów MNS

Układ Rh

Układ antygenów Rh jest złożony
Istnieje różna terminologia

Amerykańska Wiener’a

Angielska Fisher’a-

Race,a

Rh-hr

CDE-cde

Chromosom Ag czynnik Ab

Chromosome

Ag Ab

krwi

pojedynczy Rh1 Rho anti-Rho

silnie D

D anti- D

gen R1 rh’ anti-rh’

sprzężone C

C anti- C

rh’’ anti-rh”

geny E

E anti-E

Wiener

Fisher-Race

Gen Ag cz. krwi

Gen Ag

r rh hr’ i rh”

cde c, d, e

r’ rh’ rh’ i hr”

Rh -

Cde C, d, e

r” rh” rh”i hr’

(minus)

cdE c, d, E

ry rh rh’ i rh’’

CdE C, d, E

R0 Rho Rho, hr’ i hr”

cDe c, D, e

R1 Rh1 Rho, rh’ i hr’’

Rh+

CDe C, D, e

R2 Rh2 Rho, rh” i hr’

(plus)

cDE e, D, C

Rz Rhz Rho, rh” i rh”

CDE C, D, E

Ważne Rho = D = Rh+ (plus) = 80% populacji

Układ Rh

Dziedziczenie antygenu RhD

(Rh+) zależnosci od genotypu

ojca

matka ma genotyp d/d
(Rh-)

Przykład różnic w budowie antygenu

RhD wyjaśnia dlaczego osoba RhD+

może mieć przeciwciała anty D

Przykład tłumienia ekspresji

antygenu RD przez gen C kodujący

antygen RhC

Oznaczanie antygenów układu

ABO -

sprawdzanie odczynników

Surowica kontrolna
Krwinki anty A anty B
kontrolne
0

A

B

Oznaczanie antygenów ABO -

próba właściwa z krwinkami i surowicą

pacjenta

Pacjent Surowica kontrolna Kontrolne krwinki
nr anty A anty B 0 A B

Dolichotest Wynik

Krwinki pacjenta Surowica pacjenta

0

A1\A2

B

AB

123

345

234

367

Badanie Rh ( antygen białkowy)

–

1.

kontrola odczynników

• Kontrola pozytywna

surowica RBCs
anty-D O Rh +

• Kontrola

negatywna

surowica
RBCs
anty-D O
Rh -

Odczyt po 1 min (RUM) lub po 15 min
(BLEND)
inkubacji w temp. Pokojowej
i po odwirowaniu 1 min 1800
obr/min
Wynik:
Aglutynacja RBCs Brak
aglutynacji RBCs

Ocena Rh

próba własciwa kontrola

pacjenta

może być pozytywna (+)

lub
negatywna (-)

powinna być negatywna

(-)

surowi
ca
anty-D

krwink
i
pacjen
ta

surowi
ca

pacjen
ta

krwink
i
pacjen
ta

1 min inkubacja (RUM) lub 15 min
(BLEND)
temp. pokojowa
wirowanie 1 min. 1800 obr./min.
odczyt

wynik:
aglutynacja znaczy
erytocyty Rh+
brak aglutynacji znaczy Rh
-

erytrocyty nie powinny
aglutynować jeśli jest
aglutynacja - diagnozować
chorobę
autoimmunologiczną

Oznaczanie przeciwciał

definicje

Przeciwciała kompletne

-

zawsze klasy

IgM

najczęściej są to

ab

naturalne

zimne ab

- reagują z

antygenem

w temp. pokojowej

regularne ab

-anty-A lub

anty-B

nieregularne ab

- IgM ab

anty inne antygeny np.:

H, Le, K

Silnie aglutynują krwinki

czerwone ponieważ mają

budowę pentameru,

wielkość cząsteczki

pozwala na łączenie kilku

krwinek

Przeciwciała niekompletne -

klasy

IgG

nie aglutynują krwinek

bezpośrednio

tylko opłaszczają błonę

krwinek

ab odpornościowe –

powstają

w wyniku kontaktu z ag

ciepłe ab –

optymalna reakcja

z antygenem w środowisku

z białkiem i temp. 37

0

C

Aglutynacja krwinek z ab klasy IgM

+

Ab kompletne anty -x krwinki z ag x Reakcja Ag - Ab
=aglutynacja
(IgM)

=

Wpływ buforu o niskiej sile jonowej

(LISS low ionic strength solution) na

aglutnację krwinek ab anty IgG

Schemat bezposredniego i pośredniego testu

Coombsa Reakcja pomiedzy ab IgM anty X z

ag X na krwinkach

i ab IgG anty X i ag X na krwinkach

anty
IgG

Ab klasy

IgG
antyX

Ab klasy IgM
anty X

Bezpośredni test antylobulinowy

(BTA)

Bezpośredni test Coombsa

Krwinki oplaszczone swoistymi

przeciwciałami klasy IgG (czarne Y)

aglutynują przeciwciała anty IgG ( białe Y –

surowica Coombsa)

Pośredni test antyglobulinowy (PTA)

1.inkubacja krwinek z badaną surowicą

2. odpłukanie

3. dodanie do krwinek ab antyIgG

Badanie obecności przeciwciał

testami antyglobulinowymi

1. Cząsteczki IgG są małe, niezdolne do spowodowania aglutynacji , ale

po rozpoznaniu swoistego antygenu wiążą się trwale z błoną krwinek

2. Do wywołania aglutynacji krwinek opłaszczonych abs IgG muszą być

dodane abs rozpoznające anty ludzkie IgG ( surowica Coombsa)

Bezpośredni test

antyglobulinowy (BTA)

–

jednostopniowa

procedura

1. ab anty ludzkie IgG jest dodane do badanych krwinek

Wynik

: aglutynacja oznacza - krwinki były opłaszczone przez abs

brak aglutynacji oznacza – krwinki nie były opłaszczone abs

Pośredni test antyglobulinowy (PTA) – dwustopniowa

procedura

1. krwinki są dodawane do badanej serowicy - inkubacja,

płukanie

2. Ab anty- ludzkie IgG jest dodawane do krwinek

Wynik

: aglutynacja znaczy - w badanej surowicy były abs przewiwko

antygenowi na krwinkach
brak aglutynacji znaczy – w surowicy badanej nie było abs.

Testy antyglobulinowe

są stosowane

:

1. do oceny zgodności krwi biorcy i dawcy przed

transfuzją

2. do rozpoznania anemii hemolitycznej noworodków
3. do oceny niekompletnych auto-przeciwciał w

anemii autoimmunologicznej

4. do badań przesiewowych np.: surowic ciężarnych i

dawców krwi

5. do identyfikacji swoistości przeciwciał znalezionych

w badaniach przesiewowych

6. do określenia antygenów innych układów grup

krwi np.: Duffy, Kell i innych

Poszukiwanie przeciwciał w

surowicy

Aktywowane komponenty dopełniacza C3

przyłączone do receptora C3 na krwinkach

aglutynują je w obecności ab anty IgG

Próba zgodności

Proba zgodności obejmuje:
• próbę własciwą
• kontrolę własną biorcy
• kontrolę dodatanią
• kontrolę ujemną
Do testu stosuje się metodą LEN tzn.:
krwinki zawieszone są w LISS i

traktowane enzymem papainą.

Próba zgodności

Etap 1:
- do 4 probowek dodać 1 kroplę buforu LISS zmiesznego z

papainą w stosunku 2:1

- do probowki nr 1 dodać 2 krople krwinek dawcy
- do probowki nr 2 „ „ „ „ biorcy
- do probowek nr 3 i 4

„ „ „ „ wzorcowych Rh+

INKUBACJA 10 min w 37 st. C
Etap 2 :
- do probowek nr 1 i 2 dodać po 2 krople surowicy biorcy
- do probówki nr 3 dodać 2 krople surowicy anty D
- do probowki nr 4 dodać surowicę anty AB
INKUBACJA 3-5 min w 37 st.C
WIROWANIE w 1000 obr/min
ODCZYT PO lekkim wstrząśnieniu

Próba zgodności – schemat

(zawsze z krwią zgodną w ukladzie ABO)

Nr LISS +

Enzym
=LEN

Krwinki

Surowica

Aglutynacja

1

1 kropla

Dawcy

Biorcy

Jeśli brak
to zgodna

2

1 kropla

Biorcy

Biorcy

brak

3

1 kropla

Wzorcowe
Rh+ (plus)

Anty D

+++
Silna

4

1 kropla

Wzorcowe
Rh +
( plus)

Grupy AB

Brak

Taki wynik upoważnia do przetoczenia, jeśli jest
aglutynacja w probowce 1 trzeba zidentyfikować
swoistość przeciwciał.
Jeśli jest aglutynacja w probowce 2 lub 4 test nieudany
technicznie.

Poszukiwanie przeciwciał w

surowicy

z zastosowaniem krwinek

wzorcowych

• Krwinki wzorcowe są zawsze grupy

O:

• zestaw 14, data ważności 24.04.04

• 1. dccee Kk Fy(a+b+) Jk(a+b-) MNSsP1 Le(a-b+}
• 2. Dccee kkFy(a+b-) Jk(a-b+) ssP1 Le(a-b+)
• 3. DccEe Kk Fy(a+b+) Jk)a+b+) MMSsP1 Le(a-b+)

• zestaw 15, data ważności 31.04 04

• 1. Dccee Kk Fy(a+b-) Jk(a+b-) NN ss P2 Le(a-b-)
• 2. DCcEe KK Fy(a+b+) Jk((a+b-) MMSsP1Le(a+b-)

Próba zgodności – Ważne !!!

WYNIK PRÓBY
ZGODNOŚCI WAŻNY 48 GODZIN

Krew po wykonanej próbie musi

być

przechowywana w

laboratorium

przez 5 dni

Postępowanie w przypadku podejrzenia o ostry

odczyn poprzetoczeniowy

• 1. Natychmiast przerwać transfuzję i zawiadomić lekarza
odpowiedzialnego za zabieg
• 2. Utrzymać wkłucie dożylne , przetaczać 0,9% roztwór NaCl

do

wdrożenia właściwego leczenia
• 3. W celu wykluczenia błędu w dokumentacji sprawdzić:
- dane na pojemniku z krwia
- wynik próby zgodności
- dane identyfikujące pacjenta
• 4. Niezwłocznie zawiadomić Regionalne Centrum

Krwiodawstwa i

Krwiolecznictwa o wystąpieniu poprzetoczeniowego

odczynu

hemolitycznego
• 5. Przesłać tam :

- świeżo pobrane z innej żyły 15 ml krwi z antykoagulantem

• - pojemnik z pozostałą krwia toczoną
• - próbki krwi chorego z których wykonano badania

zgodności

• - świeżo pobraną próbkę moczu