2014-01-28

1

Doc. Ewa Swoboda – Kope

ć

Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej

Warszawski Uniwersytet Medyczny

Badania serologiczne w infekcjach o etiologii

grzybiczej –

wa

ż

ny element uzupełniaj

ą

cy

rutynow

ą

diagnostyk

ę

mikologiczn

ą

pozwalaj

ą

ce

odró

ż

ni

ć

zaka

ż

enie układowe od kolonizacji

oraz podj

ąć

decyzj

ę

o wdro

ż

eniu leczenia

przeciwgrzybicznego.

Inwazyjne grzybice układowe

Inwazja grzyba

Infekcje gł

ę

bokie Fungemia

Rozsianie

Kolonizacja

Inwazyjne grzybice układowe

Czynniki etiologiczne (USA)

Układowa kandydoza 59%

Aspergilloza

14%

Kryptokokoza 9%

Histoplzmoza

4%

Kokcydioidomykoza

3%

Blastomykoza 3%

Fusarium spp. 1%

Scedosporium spp. 1%

Zygomykoza

1%

Inne (Penicillium spp.,

Malssezia, Trichosporon spp.) 5%

Czynniki ryzyka Inwazyjnych grzybic układowych

Inwazyjna aspergilloza

chemioterapia (białaczki, guzy lite)

terapia immunosupresyjna
kortykosterydy (GVHD)

Inwazyjna kandydoza

chemioterapia (białaczki, guzy lite)

terapia immunosupresyjna
kortykosterydy (GVHD)
operacje w obr

ę

bie jamy brzusznej

hospitalizacja w OIOM i chirurgicznym OIT
antybiotykoterapia o szerokim spektrum
cewniki

ż

ywienie pozajelitowe

noworodki przedwcze

ś

nie urodzone

hemodializoterapia
oparzenia

Kryptokokoza

AIDS

onkohematologia
terapia immunosupresyjna

,

Inwazyjne grzybice układowe

Wyzwanie diagnostyczne

Metody tradycyjne pozwalaj

ą

na uzyskanie wyników z

opó

ź

nieniem, interpretacja utrudniona

niecharakterystyczne objawy kliniczne

badania Rtg i skany CT nie s

ą

ani swoiste ani czułe

badania histopatologiczne wymagaj

ą

inwazyjnych

procedur i s

ą

mało czułe

hodowla mikrobiologiczna – ograniczona czuło

ść

,

trudna interpretacja

Odpowiednio wczesne rozpoznanie jest krytyczne dla

efektywnego leczenia

unikania zb

ę

dnego podawania kosztownej i toksycznej

terapii przeciwgrzybiczej

2014-01-28

2

Stosowane techniki serologiczne

Odczyny precypitacyjne

- podwójna dyfuzja w

ż

elu

- immunoelektroforeza przeciwpr

ą

dowa

Aglutynacyjne – „Pastorex”

Fluorescencyjne – immunofluorescencja po

ś

rednia

Immunoemzymatyczne – ELISA

Diagnostyka inwazyjnych zaka

ż

e

ń

grzybiczych

Badania serologiczne powinny by

ć

wykonywane równolegle z

posiewami i preparatami bezpo

ś

rednimi z materiału klinicznego

Post

ę

powanie diagnostyczne powinno si

ę

opiera

ć

o wszystkie

dost

ę

pne metody badania: kliniczne, radiologiczne, histologiczne,

metody klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej, metody
serologiczne, enzymatyczne oraz biologii molekularnej

Ka

ż

da z metod diagnostycznych obarczona jest znacz

ą

cymi

ograniczeniami, decyzja o niezb

ę

dno

ś

ci wdro

ż

enia terapii

przeciwgrzybiczej powinna si

ę

opiera

ć

o interpretacj

ę

wyników co

najmniej kilku bada

ń

Diagnostyka inwazyjnych zaka

ż

e

ń

grzybiczych

Wykrywanie antygenów kr

ążą

cych Candida i Aspergillus w surowicy

wydaje si

ę

poprawi

ć

diagnostyk

ę

u pacjentów z grup ryzyka

Regularne badanie pacjentów z grup ryzyka mo

ż

e by

ć

pomocne w

diagnostyce

Aktualnie stosowane metody opieraj

ą

si

ę

na wykrywaniu komponentów

ś

ciany komórkowej okre

ś

lonych gatunków grzybów – mannoprotein,

pełni

ą

cych role markerów antygenowych.

W okresie utrzymywania si

ę

układowego zaka

ż

enia grzybiczego

antygeny te wyst

ę

puj

ą

w krwiobiegu przej

ś

ciowo, s

ą

łatwo eliminowane

przez powstaj

ą

ce kompleksy immunologiczne oraz na drodze

endocytozy przez komórki Kupffera w w

ą

trobie

„Złoty standard” w rozpoznaniu kandydozy
układowej / inwazyjnej kandydozy

Dodatnia hodowla z krwi

Dodatni wynik badania histologicznego

bioptatów

Diagnostyka inwazyjnej kandydozy

Mannan

polisacharyd niekowalentnie zwi

ą

zany ze

ś

cian

ą

komórkow

ą

stanowi około 7% suchej masy komórki

jeden z wielu antygenów Candida spp. i główny
marker inwazyjnej kandydozy

Diagnostyka inwazyjnej kandydozy

Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznania ze wzgl

ę

du na

bardzo niskie st

ęż

enia i szybkie eliminowanie mannanu w

toku zaka

ż

enia

Ł

ą

czne wykrywanie antygenu mannanowego i przeciwciał

anty-mannanowych

U pacjentów dodatnich w kierunku przeciwciał anty-
mannanowych trudniej jest wykry

ć

antygen mannanowy

Na wykrywanie antygenu mannanowego w surowicy ma
wpływ ilo

ść

testów wykonanych dla pacjenta – regularne

monitorowanie tych dwóch parametrów pozwala na
wczesne wykrycie konwersji na wynik dodatni

2014-01-28

3

Aspergilloza

Inwazyjna aspergilloza (IA) - osoby ze
znacznym upo

ś

ledzeniem odporno

ś

ci

Aspergilloza u osób
immunokompetentnych

- Aspergilloza allergiczna

- aspergilloza nie-alergiczna –

grzybniak

kropidlakowy

Inwazyjna aspergilloza

Płucna (75%) w pocz

ą

tkowej fazie, pó

ź

niej

rozsiew drog

ą

krwi do innych narz

ą

dów (oczy,

nerki, ko

ś

ci)

Rhinosinusitis – zapalenie błony

ś

luzowej jam

nosa i zatok przynosowych (5 -10%)

Rozsiana wielonarz

ą

dowa – 25%

Rozsiana z zaj

ę

ciem OUN – 10 – 40 %

Inwazyjna aspergilloza

Metody tradycyjne

Diagnostyka histopatologiczna jest limitowana uzyskaniem
materiału do bada

ń

metod

ą

inwazyjn

ą

oraz nisk

ą

czuło

ś

ci

ą

– na podstawie stwierdzenia strz

ę

pków grzybni

nie mo

ż

na zidentyfikowa

ć

rodzaju grzyba oraz oznaczy

ć

wra

ż

liwo

ść

na leki przeciwgrzybicze

Uzyskanie hodowli z krwi – niemo

ż

liwe. Niezb

ę

dna

hodowla z miejsca tocz

ą

cego si

ę

zaka

ż

enia (metody

inwazyjne: BAL, bioptaty)

Inwazyjna aspergilloza

Istotn

ą

warto

ść

ma wykrywanie kr

ążą

cego w krwi antygenu

galaktomannanowego (GM).

GM jest polisacharydem

ś

ciany komórkowej grzybów ple

ś

niowych

nale

żą

cych do rodzaju Aspergillus (A. fumigatus, A. flavus, A. Niger,

A.terreus i in.)

Dodatni wynik badania w kierunku antygenemii Aspergillus jest
jednym z kryteriów mikrobiologicznych rekomendowanych przez
Europian Organization for Research and Treatment of Cancer oraz
Mycosis Study Group (EORTC/MSG) do rozpoznania IA pomimo
ujemnych wyników uzyskanych w klasycznych badaniach
mikologicznych u pacjentów z nowotworami hematologicznymi

Dla wszystkich pacjentów, u których uzyskano wynik dodatni,
rekomendowane jest powtórzenie badania z nowej próbki krwi.
Zgodnie z kryteriami EORTC/MSG, dwa kolejno uzyskane wyniki
dodatnie s

ą

konieczne do zaklasyfikowania badania jako prawdziwie

dodatniego

Inwazyjna aspergilloza

Przesiewowa diagnostyka u pacjentów z grup ryzyka

Badanie w kierunku Aspergillus GM dwa razy w tygodniu

Wymóg kolejnych bada

ń

dodatnich – wynik prawdziwie

dodatni

Badanie kolejnych próbek po otrzymaniu pierwszego
wyniku dodatniego maksymalizuje swoisto

ść

wyniku

badania (wyniki fałszywie-dodatnie)

Inwazyjna aspergilloza

Monitorowanie leczenia

Obni

ż

aj

ą

ce si

ę

poziomy GM u pacjentów

odpowiadaj

ą

cych na terapi

ę

Rosn

ą

ce st

ęż

enia u pacjentów umieraj

ą

cych

Brak obni

ż

enia miana antygenu –

niepowodzenie terapii

modyfikacja leczenia

2014-01-28

4

Inwazyjna aspergilloza

Wskazania do badania antygenemii

Screening IA dwa razy w tygodniu w fazie ci

ęż

kiej

immunosupresji

Diagnostyka IA u pacjentów z koresponduj

ą

cymi

objawami klinicznymi

Monitorowanie terapii przeciwgrzybiczej raz lub dwa razy
w tygodniu celem oceny odpowiedzi na wdro

ż

one

leczenie

Ś

ledzenie historii próbek dodatnich

Aspergilloza u osób
immunokompetentnych

Aspergilloza alergiczna

Uczulenie na ple

ś

nie – alergiczna aspergilloza

oskrzelowo-płucna (astma). Pacjenci z
mukowiscydoz

ą

– wysokie zagro

ż

enie

Ci

ą

głe wdychanie spor w

ś

rodowisku –

zewn

ą

trzpochodne zapalenie p

ę

cherzyków

płucnych: płuco hodowcy ptaków

płuco farmera

Aspergilloza u osób
immunokompetentnych

Aspergilloza nie-alergiczna

Aspergilloma (grzybniak kropidlakowy) – skutek
kolonizacji istniej

ą

cych wcze

ś

niej jam płucnych

(gru

ź

lica, rozedma, sarkoidoza, rak płuca) przez

micelium grzyba tworz

ą

ce kul

ę

grzybni, tzw.

„Aspergillus ball”

Przewlekła martwicza aspergilloza płuc jest
szczególnie progresywn

ą

,

ś

mierteln

ą

postaci

ą

choroby

Serologiczna diagnostyka inwazyjnych grzybic
układowych

Inwazyjna kandydoza –

Platelia Candida AG Plus (EIA)

wykrywanie kr

ążą

cego antygenu mannanowego w

surowicy

Platelia Candida Ab Plus (EIA)

wykrywanie przeciwciał przeciw mannanowi w

surowicy

Inwazyjna aspergilloza

Platelia Aspergillus EIA

wykrywanie kr

ążą

cego antygenu

galaktomannanowego w surowicy

Serologiczna diagnostyka zaka

ż

enia Aspergillus

spp. u osób immunokompetentnych

Platelia Aspergillus IgG

Po

ś

redni, mikropłytkowy test immunoenzymatyczny do

wykrywania przeciwciał klasy IgG skierowanych przeciw
rekombinowanemu antygenowi Aspergillus

Narz

ę

dzie do przesiewowej diagnostyki w ró

ż

nych

przewlekłych formach aspergilloz wyst

ę

puj

ą

cych u osób

immunokompetentnych

astma, aspergilloma, przewlekła martwicza aspergilloza płuc

zewn

ą

trzpochodne zapalenie p

ę

cherzyków płucnych: płuco

farmera, płuco hodowcy ptaków

Serologiczna diagnostyka inwazyjnych grzybic
układowych

Kryptokokoza

Rozpoznanie no

ż

e by

ć

ustalone wył

ą

cznie w oparciu o ł

ą

czone wyniki

bada

ń

klinicznych, radiologicznych i biologicznych (mikrobiologia,

histologia, serologia) – ka

ż

dy z tych elementów pojedynczo powinien

by

ć

interpretowany z gł

ę

bok

ą

rozwag

ą

Premier Cryptococcal Antigen (Bioscience, Inc.) – test
immunoenzymatyczny do „screeningu” lub półilo

ś

ciowej detekcji

otoczkowego polisacharydowego antygenu Cryptococcus neoformans w
surowicy lub płynie mózgowo-rdzeniowym

2014-01-28

5

Wykrywanie swoistych przeciwciał anty-Candida

Dotyczy osób z prawidłowo działaj

ą

cym układem

odporno

ś

ciowym

IgM – wczesne zaka

ż

enie

IgG dodatnie – du

ż

y odsetek populacji – cz

ę

sty

kontakt z grzybami, flora fizjologiczna

Miano przeciwciał u zdrowych – od1:20 do 1:40

Warto

ść

miana 1:160 i powy

ż

ej oraz dynamika zmiany

ilo

ś

ci przeciwciał

ś

wiadczy o zaka

ż

eniu

Materiałem do badania słu

ż

y surowica

Badania serologiczne powinny by

ć

wykonywane równolegle

z posiewami i preparatami bezpo

ś

rednimi z materiału

klinicznego

Diagnostyka serologiczna grzybic obejmuje wykrycie u

chorego w surowicy i innych płynach ustrojowych:

przeciwciał przeciwgrzybiczych i okre

ś

lenie ich ilo

ś

ci

poprzez podanie miana

antygenów kr

ążą

cych i okre

ś

lenie ich miana

Wykrycie antygenów kr

ążą

cych grzybów z rodzaju

Candida, Cryptococcus, Aspergillus

ma znaczenie u osób s upo

ś

ledzon

ą

odporno

ś

ci

ą

przydatne w diagnostyce chorób z ostrym
przebiegiem (inwazyjna aspergiloza, kryptokokoza
OUN)

kilkakrotne badanie ilo

ś

ciowe w przebiegu

choroby w skojarzeniu z objawami klinicznymi
mo

ż

e słu

ż

y

ć

do monitorowania skuteczno

ś

ci

leczenia

Wykrycie antygenu mannanowego w surowicy

Test Pastorex – oznaczenie jako

ś

ciowe wykorzystuj

ą

ce

zjawisko aglutynacji.

wa

ż

na rola diagnostyczna w kandydozach układowych

cz

ą

steczki lateksu opłaszczone szczurzym przeciwciałem

monoklonalnym EBCA-1 przeciwko

β

1-5 oligomannozydowi.

Reaguj

ą

c z antygenem, cz

ą

stki daj

ą

aglutynacj

ę

widoczn

ą

„gołym okiem”

czuło

ść

– 2,5 ng/ml

swoisto

ść

– 99,7%

Trudno

ś

ci

ą

jest b. mała ilo

ść

kr

ążą

cego mannanu, rz

ę

du 1 ng/ml, wskutek

czego nale

ż

y wykonywa

ć

sukcesywne oznaczenia z kolejnych próbek

Pastorex® Candida

Czuło

ść

okre

ś

lono

ś

rednio na 32% podczas badania 173

pacjentów.
Okres półtrwania mannanu w surowicy jest bardzo krótki –
uzyskane wyniki zale

żą

od cz

ę

sto

ś

ci pobrania próbek

Czuło

ść

testu zale

ż

y od odpowiedzi immunologicznej

pacjenta
Czuło

ść

testu zale

ż

y od gatunku:

Monoklonalne ab rozpoznaj

ą

ag gatunków w kolejno

ś

ci od

reaguj

ą

cych z najwy

ż

szej czuło

ś

ci

ą

:

glabrata > guillermondii, albicans, tropicalis > parapsilosis >

pseudotropicalis (kefyr)

Ag C.krusei reaguje z tymi przciwciałami bardzo słabo

Platelia

TM

Candida Ag

Platelia Candida Ag – jest to
immunoenzymatyczny jednostopniowy
„kanapkowy” test do jako

ś

ciowego oraz

ilo

ś

ciowego wykrywania kr

ążą

cego antygenu.

czuło

ść

– 0,5 ng/ml

2014-01-28

6

Platelia

TM

Candida Ag

Badania kliniczne

Retrospektywne dla 106 pacjentów (336 surowic) w trzech szpitalach

akademickich we Francji: czuło

ść

– 51,5%

Czuło

ść

ró

ż

ni si

ę

w zale

ż

no

ś

ci od gatunku:

C.tropicalis – 70%

C.glabrata

– 58,3%

C.albicans

– 52,2,%

C.kefyr

–

50%

C.parapsilosis – 37,5%

C.krusei

–

20%

Wyniki badania czuło

ś

ci koreluj

ą

z liczb

ą

i cz

ę

sto

ś

ci

ą

badania próbek

Platelia

TM

Candida Ag

Uzasadnione jednoczasowe wykrywanie Ab i Ag

Pacjenci bez ab antymannanowych: czuło

ść

78,8%

Pacjenci z dodatnim wynikiem ab: antygen mannanowy jest
znacznie trudniejszy do wykrycia

Niektórzy pacjenci wykazuj

ą

dodatni wynik dla obu markerów

Prognoza rozwoju infekcji mo

ż

e by

ć

ł

ą

czona z równowag

ą

pomi

ę

dzy antygenemi

ą

a wytwarzaniem przeciwciał

Poł

ą

czenie dwóch testów zwi

ę

ksza czuło

ść

do 78,8%

Platelia

TM

Candida Ag

Studzienki mikropłytki opłaszczone s

ą

szczurzymi

przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko

α

1-5

oligomannozydom Candida

Ogrzanie surowicy do100˚C celem rozpuszczania kompleksów
immunologicznych i wytr

ą

cenie białek surowicy, które mog

ą

interferowa

ć

w reakcji immunoenzymatycznej

Inkubacja surowicy pacjenta i koniugatu (przeciwciał
antymannanowych znakowanych peroksydaz

ą

). W obecno

ś

ci

antygenu mannanowego powstaje kompleks mAb-mannan-
mAb/peroksydaza

Wywoływanie reakcji barwnej po płukaniu, uwidocznienie
powstałych kompleksów po dodaniu substratu dla peroksydazy

Odczytu absorbancji dokonuje si

ę

przy długo

ś

ci fali

450/620 nm

W diagnozowaniu inwazyjnych zaka

ż

e

ń

wywołanych przez grzyby

z rodzaju Aspergillus poszukuje si

ę

kr

ążą

cego antygenu

galaktomannanowego w surowicy pacjenta.

Platelia Aspergillus Ag

Antygen wykrywany jest testem immunoenzymatycznym.
Studzienki mikropłytki opłaszczono monoklonalnymi

przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenowi
galaktomannanowemu, które wi

ążą

rozpuszczalny antygen

wyst

ę

puj

ą

cy w surowicy pacjenta. Do wykrycia zwi

ą

zanego

antygenu u

ż

yto koniugatu mAb z peroksydaz

ą

. W przypadku

obecno

ś

ci antygenu galaktomannanowego powstaje kompleks

mAb-galaktomannan-mAb/peroksydaza. Reakcja barwna
powstaje po dodaniu substratu dla peroksydazy. Absorbancj

ę

odczytuje si

ę

przy długo

ś

ci fali 450/620 nm.

Czuło

ść

metody – 1 ng/ml

Platelia

TM

Aspergillus EIA

Wynik ujemny nie wyklucza rozpoznanie aspergillozy inwazyjnej

Pacjentom zagro

ż

onym wyst

ą

pieniem aspergillozy inwazyjnej

badanie nale

ż

y wykonywa

ć

dwa razy w tygodniu

Celowana terapia przeciwgrzybicza mo

ż

e obni

ż

y

ć

czuło

ść

metody

Wykryto powinowactwo m-przeciwciał stosowanych w te

ś

cie do

Penicillium, Alternaria, Paecilomyces

Reakcje dodatnie wyst

ę

puj

ą

zazwyczaj przed objawami

klinicznymi oraz radiologicznymi

Wykrywanie swoistych przeciwciał anty-Aspergillus

Nie stwierdza si

ę

u ludzi zdrowych

Ma znaczenie u ludzi z prawidłowo działaj

ą

cym

układem odporno

ś

ciowym

Wa

ż

ne w diagnostyce chorób z długim i łagodnym

przebiegiem (grzybniak kropidlakowy, alergiczna
posta

ć

aspergilozy płucnej)

Ograniczone w innych schorzeniach

Materiałem do badania słu

ż

y surowica

2014-01-28

7

Pastorex Aspergillus

Odczyn aglutynacji lateksowej.

Cz

ą

steczki lateksu opłaszczone s

ą

monoklonalnymi przeciwciałami

skierowanymi przeciwko cz

ą

stkom galaktomannanu.

Zjawisko aglutynacji jest widoczne „gołym okiem”

czuło

ść

15 ng/ml

swoisto

ść

96%

Nie badano wpływu nadmiaru albuminy, lipidów, hemoglobiny i
bilirubiny na jako

ść

oznaczenia

Czuło

ść

okre

ś

lono na 41% podczas badania 268 pacjentów

Fluktuacja st

ęż

enia galaktomannanu zale

ż

y od przebiegu infekcji

wyniki zale

żą

od liczby i cz

ę

sto

ś

ci pobrania od danego pacjenta

próbek

Wykrywanie kr

ążą

cych antygenów dla grzybów z

rodzaju Cryptococcus

Materiał do badania w przypadku podejrzenia zaka

ż

enia

Cryptococcus neoformans stanowi

ą

surowica i płyn

mózgowo-rdzeniowy (najlepiej oba materiały)

Poszukujemy kr

ążą

cego antygenu polisacharydowego

otoczki (glikuronoksylomannan)

Stosowane testy: - lateksowy

- immunoenzymatyczny (EIA).

Czuło

ść

testu lateksowego – 50 ng/ml

Czuło

ść

odczynu immunoenzymatycznego jest około 10 razy

wi

ę

ksza.

Interpretacja wyników

Badania powinny by

ć

powtarzane kilkakrotnie ze

wzgl

ę

du na zbyt mał

ą

ilo

ść

kr

ążą

cego antygenu w

surowicy pacjenta

Wynik ujemny nie zawsze wyklucza zaka

ż

enie

Wynik dodatni jest wskazaniem do badania ilo

ś

ciowego

poprzez wykonanie szeregu rozcie

ń

cze

ń

surowicy

pacjenta

Wyniki fałszywie dodatnie

Pastorex Crypto-Plus

czynnik reumatoidalny

obecno

ść

niektórych nowotworów zło

ś

liwych

współistnienie zaka

ż

e

ń

: Trichosporon beigelii,

Klebsiella pnemoniae oksydazo(-)

wpływ zanieczyszcze

ń

zewn

ę

trznych (talk z

r

ę

kawic)

Fałszywie dodatnie wyniki testów na wykrywanie galaktomannanu w
diagnostyce aspergilozy (5 – 15%)

Zanieczyszczone pokarmy: warzywa, ry

ż

, produkty zbo

ż

owe

(obecno

ść

galaktofuranozy), mleko w proszku (wysokie

st

ęż

enie galaktomannanu). Przy interpretacji antygenemii u

małych dzieci oraz pacjentów z uszkodzeniem

ś

luzówki

przewodu pokarmowego (radioterapia, choroby jelit) nale

ż

y

uwzgl

ę

dni

ć

rodzaj diety.

Zanieczyszczone powietrze (kurz i tzw airborne fungi:
Penicillium chrysogenum, Aeromonas spp., Alternaria
spp.,Fusarium spp.)

Wykonywanie testów w pomieszczeniu, gdzie przeprowadza
si

ę

hodowle grzybów

Stosowanie niektórych antybiotyków – w niektórych partiach
do

ż

ylnych postaci piperacyliny i amoksycyliny z kwasem

klawulanowym wykryto galaktomannan

Fałszywie dodatnie wyniki testów na wykrywanie
galaktomannanu w diagnostyce aspergilozy (5 – 15%)

Pobieranie materiałów bawełnianym wacikiem

Obecno

ść

niektórych gatunków z rodzaju Candida (nie nale

żą

do nich C.albicans, C.krusei, C.glabrata, C.tropicalis)

Obecno

ść

Trypanosoma cruzi

Krzy

ż

owa reakcja z zawartymi w drobnoustrojach:

β

D-

galaktofuranoz

ą

,

β

D-galaktopyranoz

ą

,

α

D-mannopyranoz

ą

,

polisacharydami zawieraj

ą

cymi w składzie galaktoz

ę

lub sam

galaktomannan

Składniki mleka matki (w przypadku dzieci karmionych piersi

ą

)

2014-01-28

8

Dzi

ę

kuj

ę

za uwag

ę

☺