Proteiny

Oddziaływania z

powierzchnią

Zachowanie protein na powierzchni materiału determinuje oddziaływania
tkanek z implantem. Zaadsorbowane białka wpływają przede wszystkim
na koagulację krwi oraz adhezję bakterii i komórek.

O oddziaływaniu protein z powierzchnią decydują czynniki takie jak:

1. budowa protein

2. budowa powierzchni

3. właściwości powierzchni

O właściwości powierzchni decydują 3 główne czynniki:

• geometryczny (morfologia: gładka, chropowata, jednorodna, itp.)

• chemiczny (skład powierzchni, hydrofobowość)

• elektryczny (decyduje o uporządkowaniu na powierzchni)

Ad.1. Wpływ budowy protein

Na stopień oddziaływań protein z
powierzchnią duży wpływ ma rozmiar
proteiny – na ogół im większa proteina tym
więcej punktów kontaktu z powierzchnią

albumina (66 kDa) – 77 punktów
kontaktowych,

fibrynogen (330 kDa) – 707 punktów

ale np. hemoglobina (65 kDa) tworzy więcej
punktów kontaktu niż fibrynogen

Rozmiar protein

proteina

punkty kontaktu

powierzchnia

proteina

biomateriał

Wpływ budowy protein

Ładunek

Cząsteczki blisko swego punktu izoelektrycznego (pI)
absorbują się najłatwiej.

Dlaczego??

Nawet niewielka objętość roztworu
protein zawiera V*N

A

cząsteczek,

które oddziaływują ze sobą.
W punkcie izoelektrycznym następuje
zrównoważenie ładunków, co prowadzi
do zredukowania oddziaływań
elektrostatycznych między proteinami.
Tym samym ułatwiony
jest proces osiadania na powierzchni.

Wpływ budowy protein

Stabilność struktury proteiny

Im słabsza struktura determinowana oddziaływaniami wewnątrzcząsteczowymi,
tym łatwiej proteina ulega rozfałdowaniu (zwiększa się tym samym ilość punktów
kontaktu z powierzchnią). W konsekwencji proteiny takie ulegają lepszej adsorpcji.

Ad.3. Właściwości powierzchni

1. Morfologia powierzchni:

powierzchnia niejednorodna (np. porowata) jest lepiej rozwinięta i tym samym,
w porównaniu z powierzchnią gładką, posiada większą liczbę miejsc kontaktu z
proteinami.

2. Struktura chemiczna:

budowa chemiczna powierzchni decyduje o tym jakie rodzaje grup będą eksponowane
w kontakcie z proteinami. Wiadomo z prac eksperymentalnych, że powierzchnie
zawierające grupy o charakterze hydrofobowym wykazują większa zdolność do
wiązania protein niż powierzchnie bogate w grupy hydrofilowe.

3. Właściwości elektryczne:

determinują skład i strukturę warstwy elektrolitowej będącej w kontakcie z powierzchnią.
Ułożenie zhydratowanych jonów oraz potencjał powierzchni określają zdolność do
kontaktu z proteinami.

Mechanizm transportu

Proteiny transportowane są do powierzchni w wyniku działania różnych
mechanizmów:

• dyfuzji

• konwekcji termicznej

• przepływu

• transportu mieszanego

W transporcie protein ważną rolę odgrywają ponadto czynniki takie jak: stężenie,
czy ciężar cząsteczkowy, które determinują np. prędkość przemieszczania cząsteczek.

Dyfuzja:

Opisana prawem Ficka:

2

2

x

C

D

t

C











C – stężenie,
D – współczynnik dyfuzji,
x – odległość

Mechanizm oddziaływań

gdy szybkość dyfuzji zrównoważona jest przez szybkość adhezji:

2

/

1

0















t

D

C

dt

dn



n – stężenie protein przy
powierzchni,
C

0

– stężenie protein w masie,

t - czas

wniosek: im wyższe stężenie protein w roztworze (masie) oraz/lub im
wyższe współczynniki dyfuzji cząsteczek (wielkość odwrotnie proporcjonalna do
ciężaru), tym więcej cząsteczek protein dociera do powierzchni.

duże stężenie

małe stężenie

Mechanizm oddziaływań

Nawet gdy w roztworze obecny jest
jeden rodzaj protein,
zaadsorbowane cząsteczki ułożone
są w sposób heterogeniczny.

W adsorpcji protein na powierzchni
najważniejszą rolę odgrywają
oddziaływania jonowe, hydrofobowe
oraz przeniesienia elektronu. Wiązania
wodorowe natomiast nie odgrywają roli
w wiązaniu cząsteczek białek do
powierzchni.

Wraz ze wzrostem ilości zaadsorbowanych
protein zmniejsza się ilość wolnego miejsca
na powierzchni. Taki stan będzie prowadzić
do zminimalizowania energii oddziaływań
między proteinami a tym samym do zmian
w orientacji ułożenia cząsteczek.

Mechanizm oddziaływań

Ze zmianą orientacji proteiny na zaadsorbowanej powierzchni wiąże się również
możliwość zmiany funkcjonalności danego białka. Na przykład, enzymy mogą
adsorbować się w taki sposób, że ich części o aktywności katalitycznej (centra
aktywne, domeny RGD) mogą być (lub nie) eksponowane (zasłaniane przez inne
proteiny) na kontakt z substratami.

biomateriał

ładunki
ujemne

ładunki dodatnie

obszary
polarne

obszary hydrofobowe

Mechanizm oddziaływań

Desorpcja:

Jest procesem odwrotnym do adhezji protein. Cząsteczki przyłączone do powierzchni
ulegają oderwaniu i „wracają” do roztworu. Aby proces desorpcji mógł zajść, proteina
musi utracić jednocześnie wszystkie punkty kontaktowe z powierzchnią.
Jeśli nie stosuje się drastycznych metod osłabiających oddziaływania
proteina-powierzchnia (detergenty, pH, siła jonowa), adsorpcja protein jest procesem
nieodwracalnym.

zerwanie punktów kontaktu

powrót do roztworu

Roztwory wieloskładnikowe

Adsorpcja protein z roztworu wieloskładnikowego ma istotne znaczenie z punktu
widzenia rzeczywistych oddziaływań z powierzchnią wszczepionego biomateriału.
Na przykład, we krwi znajduje się ponad 150 różnego rodzaju protein oraz cząsteczki
tłuszczy, węglowodanów czy hormonów. Jeśli powierzchnia znajduje się
w otoczeniu różnego rodzaju protein, występować będzie preferencyjne osiadanie
cząsteczek na biomateriale. Ponadto, proces adhezji będzie silnie zależał od czasu
(zmiana składu zaadsorbowanej warstwy).

Rozważmy prosty proces kontrolowany dyfuzyjnie. Zgodnie ze znanym już równaniem:

2

/

1

0















t

D

C

dt

dn



najszybciej do powierzchni docierają proteiny najmniejsze. Jeśli w pobliżu znajduje
się cząsteczka proteiny o większym powinowactwie do powierzchni może dojść do
wymiany cząsteczek. Należy podkreślić, że punkty kontaktu nie są wiązaniami
permanentnymi a raczej oscylują, czyli powstają i zanikają. Proteina ulega całkowitej
desorpcji, gdy nowo przybyła cząsteczka „zastąpi” jej wszystkie punkty kontaktu z
powierzchnią.

Roztwory wieloskładnikowe

Procesy adsorpcji oraz wymiany protein na powierzchni określane
są jako

efekt Vromana.

A

A

A

A

B

B

B

B

B

B

B

B

Roztwory wieloskładnikowe

oddziaływanie krwi z powierzchnią:

We krwi znajduje się około 150 różnych protein. Proteiny, które znajdują się w największym
stężeniu będą docierać do powierzchni jako pierwsze.

proteina

stężenie

ciężar cząsteczkowy

współczynnik dyfuzji

albumina
IgG
antytrypsyna
fibrynogen
lipoproteiny
(LDL)
makroglobulina
transferyna
IgA
haptoglobina
lipoproteiny
(HDL)

40
15
3
3
3

3
2,6
2,3
2
2

66 kDa

150 kDa

54 kDa

340 kDa

5 MDa

725 kDa

77 kDa

162 kDa
100 kDa
195 kDa

6,1
4,0
5,2
2,0
5,4

2,4
5,0
3,4
4,7
4,6

[10

-7

cm

2

/s]

[mg/ml]

Układy wieloskładnikowe

Ze względu na duże stężenie oraz niewielki rozmiar cząsteczki najsilniejsze
oddziaływania z powierzchnią występują w przypadku albuminy. Porównując
w tych kategoriach oddziaływania innych protein prawdopodobieństwo
kontaktu IgG z powierzchnią jest 7-krotnie, a LDL aż 1500-krotnie mniejsze
niż albuminy. Na tej
podstawie hierarchia oddziaływań z powierzchnią przedstawia się
następująco:

albumina

adsorbują się w kolejności

IgG

fibrynogen

fibronektyna

faktor XII