Termostabilna β-amylaza
Joanna Czarnecka
Marcin Herok
Marcin Szulc
Biotechnologia, grupa
CH1
Termostabilna β-amylaza
Joanna Czarnecka
Marcin Herok
Marcin Szulc
Biotechnologia, grupa
CH1
Źródło otrzymywania enzymu:
Bakterie Clostridium thermosulfurigenes 4B, na których opiera
się produkcja termostabilnej β-amylazy wyizolowano pierwotnie
z biofilmu z Octopus Spring w Parku Yellowstone w USA, obecnie
znajdują się w kolekcji American Type Culture Collection (ATCC
33743).
Octopus Spring Park Yellowstone
Otrzymywanie enzymu:
Kulturę wyjściową namnaża się w specjalnych 26ml
probówkach w temp. 60
O
C. W probówce utrzymuje się
warunki beztlenowe, fazę gazową stanowi N
2
/CO
2
w
proporcjach 95:5, pożywkę jest natomiast 10ml medium
TYE zawierające 0.5% skrobi.
Właściwą produkcje przeprowadza się w bioreaktorach
o pojemności od 10 do 20 litrów wypełnionych pożywką TYE
z 0.5% maltozy jako substratem. Faza gazowa w
bioreaktorze wypełniona jest mieszaniną N
2
/CO
2
w
proporcjach 95:5. Wzrost biomasy przy temp. 60
O
C, aż do
późnej trofofazy (faza wzrostu logarytmicznego).
BioFlo 415 – fermentator do
produkcji w skali laboratoryjnej o
pojemności 10 – 20l
Otrzymywanie enzymu:
Supernantant oddzielony od biomasy jest zagęszczany
początkowo przez precypitacje (strącanie), dodaje się do niego
porcjami zimnym etanol do uzyskania stężenia 20%. Następnie
osad jest zbierany przez filtracje i zawieszany w 300ml 20mM
octanu sodu, po czym dodaje się do niego siarczanu amonu do
stężenia 70%. Roztwór jest wirowany, a otrzymany osad
zawieszany w 100ml tego samego buforu. Kolejnym krokiem jest
ponowne strącenie białka, tym razem 2 objętościami zimnego
acetonu. Otrzymany osad zawiesza się ponownie w 100ml buforu
z octanem sodu. Na zakończenie 100ml roztworu enzymu
dializuje się w 4 litrach podwójnie destylowanej wody.
Amylazę uzyskuje się również z oddzielonej na początku biomasy.
W tym celu należy zdegradować ścianę komórkową bakterii np.
działaniem lizozymu, a następnie rozbić komórki np. poprzez
szybką zmianę ciśnienia (prasa francuska). Otrzymany roztwór
wiruje się przez 30min w temp. 4
O
C. Uzyskany supernanant
poddawany jest oczyszczaniu opisanemu powyżej.
Reakcje β-amylazy
Hydroliza amylopektyny:
amylopektyna
β-maltoza
lub
dekstryna graniczna
Reakcje β-amylazy
Hydroliza amylozy:
β-maltoza
amyloza
Reakcje β-amylazy
β-maltoza
lub
dekstryna graniczna
Hydroliza glikogenu:
glikogen
Ogólny schemat reakcji
skrobia
maltodekstryna
maltoza
β-amylaza
Mechanizm 1 na przykładzie
Mechanizm katalizy β-amylazy został wywnioskowany na
podstawie struktury β-amylazy pochodzącej z soi
skompleksowanej z maltozą.
Bunzo Mikami (Research Institute for Food Science, Kyoto
University)
Mechanizm 1 na przykładzie
Na rysunku widać dwie cząsteczki maltozy połączone z enzymem z
obydwu stron punktu rozszczepienia. Produkt (β-maltoza) to
pierścienie G1 i G2, kolejne jednostki glukozy łączą się z enzymem
jako G3 i G4.
Rysunek przedstawia reszty aminokwasów w interakcji z maltozą.
Jednostki glukozy G1-G3 formują 8-10 wiązań wodorowych z
resztami białka.
Jednostka glukozy G4 tworzy tylko jedno wiązanie wodorowe z
His300, ale ma wiele wiązań van der Waalsa z otaczającymi ją
hydrofobowymi resztami.
Elastyczna pętla przyjmuje otwartą konformację w apoenzymie i
zamkniętą w kompleksie z maltozą po interakcji z substratem.
Mechanizm 1 na przykładzie
Bunzo Mikami (Research Institute for Food Science, Kyoto
University)
Na rysunku przedstawiony jest zakładany
mechanizm katalizy. W proces
zaangażowane są Glu186 i Glu380. Glu186
znajduje się blisko wiązania glikozydowego,
Glu 380 jest umiejscowiona w pobliżu β-
anomerycznego tlenu.
Glu186 zachowuje się jak kwas i jest
donorem wodorów do rozszczepienia
wiązania glikozydowego.
Glu380 działa jak zasada i aktywuje
cząsteczkę wody, która atakuje atom C1,
który jest możliwym pośredniczącym
karbokationem. Atak cząsteczki wody tylko
ze strony Glu380 daje ścisły produkt
specyficzny dla β-anomerycznej maltozy.
Maltoza jest uwalniana, gdy elastyczna
pętla się otwiera.
Mechanizm 2 na przykładzie
Scope and mechanism of carbohydrase action. Hydrolytic and nonhydrolytic actions
of beta-amylase on alpha- and beta-maltosyl fluoride
E. J. Hehre, C. F. Brewer, and D. S. Genghof
Według źródeł naukowych istnieje oznaka obecności grupy
imidazolowej i karboksylowej w centrum aktywnym β-amylazy.
Grupa imidazolowa przypuszczalnie działa jako donor protonów
dla tlenu w wiązaniu α-1,4 związanego substratu, z grupą
karboksylową występującą w zjonizowanej formie i funkcjonującej
jako zasada, elektrostatycznie stabilizująca grupa lub nukleofil.
Schemat ilustruje mechanizm hydrolizy maltotetrozy, gdzie grupa
imidazolowa działa jako kwas i anion karboksylowy
prawdopodobnie asystuje jako zasada podczas ataku cząsteczki
wody na substrat.
Mechanizm 2 na przykładzie
Aktywność enzymu
Aktywność β-amylazy oznaczana jest przez mierzenie ilości
zredukowanego cukru( maltozy) uwalnianego podczas
reakcji mieszaniny:
• 1 ml 10% rozpuszczonej skrobi
• 1 ml 0,5 M buforującego octanu sodu( pH 6.0)
• 3 ml roztworu β-amylazy odpowiednio rozcieńczonego wodą;
Reakcja zostaje zatrzymana przez inkubację w 60ºC przez 30
min., a następnie chłodzenie w lodzie. Cukier zredukowany,
powstały przez hydrolizę enzymatyczną skrobi, zostaje
określony za pomocą kwasu dinitrosalicylowego.
1μl β-amylazy jest zdefiniowany jako ilość enzymu
produkującego 1μmol maltozy na minutę w powyższych
warunkach.
Maltoza
Wyznaczanie K
m
i V
max
• Metoda Lineweavera-Burka
• Temperatura 60 ºC i 75 ºC
• Oczyszczona β-amylaza
• Rozpuszczona skrobia
• pH 6.0
Wyznaczanie K
m
i V
max
rozpuszczona skrobia,
glikogen lub amylopektyna
β-amylaza
maltoza + β-graniczne
dekstryny
pomiar ilości
maltozy
wykres L-B
Wyznaczanie K
m
i V
max
Temperatu
ra
(ºC)
K
m
(mg/ml)
V
max
(μmol ·
min
-1
·
ml
-1
)
K
kat.
(min
-
1
/mol)
60
2.29
179
400 000
75
1.68
197
440 000
General Biochemical Characterization of Thermostable
Extracellular
3-Amylase from Clostridium thermosulfurogenes
H. H. HYUN AND J. G. ZEIKUS
Inhibitory
Dodany reagent
(mM)
Aktywność enzymu
(%)
Brak
związku ............................................................
...... 100
Nadtlenek wodoru
(1) ....................................................................
.................. 98
(5) ....................... ............................................
.................. 86
Kwas 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowy
(0.2) ................. 96
N-Etylolmaleimid
(1)………………………………………………………………..93
(5)………………………………………………………………..54
Octan jodu
(1)
…......................................................................
.............100
(5)…………………………………………………………….....
52
P-CMB
(0.02)…………………………………………………………..
0.2
(0.1 ) …………………….
……………………………………..0.0
Inhibitory
Dodany reagent
(mM)
Aktywność enzymu
(%)
CuCI
2
(1)…………………………………………………….1.8
HgCl
2
(1)…………………………………………………….0.0
ZnCI
2
(1)…………………………………………………………...…..93
(10)………………………………………………….……..……73
CaCl
2
(5)………………………………………………………...…….100
(30)……………………………………………………...……...100
α-Cyklodekstryna (10)……………………………..………..100
β
β-Cyklodekstryna (10)……………………………..………..100
• p-CMB całkowicie blokuje aktywność enzymu,
co sugeruje występowanie grup tiolowych w
miejscu aktywnym; inhibicja przez p-CMB może
być odwrócona przez dodanie 5mM cysteiny;
• α i β-dekstryny są inhibitorami innych β-
amylaz lecz nie są inhibitorami termostabilnej
β-amylazy otrzymywanej z Clostridium
Thermosulfurogenes
• Aktywność β-amylazy jest mocno hamowana
przez jony Cu
2+
i Hg
2+
, a słabo przez nadtlenek
wodoru, octan jodu, kwas 5,5’-ditiobis-2-
nitrobenzoesowy, N-etylomaleimid i jony Zn
2+
;
p-CMB
Inhibitory
• Stabilność enzymu otrzymywanego z
C.thermosulforogenes polepszana jest przez
dodanie 5mM CaCl
2
. Enzym jest
termostabilny przez 2h przy nieobecności
substratu i CaCl
2
w 70ºC, a w 80ºC już nie.
Natomiast przy obecności substratu (1%)
bądź 5mM Ca
2+
β-amylaza jest stabilna w
80ºC
• Stabilność enzymu otrzymywanego z Bacillus
cereus nie jest polepszana przez jony wapnia
• Etanol (3%) nie wpływa na aktywność β-
amylazy, natomiast przy stężeniu 10%
aktywność enzymu wynosi 65% (efekt ten
wykorzystywany jest do precypitacji
substratów skrobiowych, enzym w temp.
65ºC jest całkowicie stabilny przez 1h w
obecności 10% etanolu)
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic
acid
N-
ethylmaleimid
Inhibitory
Zastosowanie
W przemyśle do produkcji syropów maltozowych z
pululanazą otrzymywaną z C.thermohydrosulfuran
(mają prawie identyczne optimum temperaturowe i
pH)
Syropy maltozowe otrzymywane metodą
enzymatyczną znajdują zastosowanie w
piwowarstwie, produkcji napojów, konserw i
wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do żywności
ułatwia kontrolę wodochłonności. Syropy te stosuje
się także jako wypełniacze i stabilizatory żywności
przetworzonej. Można je, podobnie jak
maltodekstryny, stosować do opóźniania wzrostu
kryształów.
Dodatkowo z syropu o wysokiej zawartosci maltozy
produkuje się maltozę krystaliczną wykorzystywaną
w produkcji leków jako zamiennik glukozy dla
diabetyków, maltitolu, maltulozy.
W produkcji syropów wysokoscukrzonych ( wraz z α-
amylazą).
Syrop wysokoscukrzony znajduje zastosowanie w
produkcji wyrobów piekarskich tj. pierniki, miodowniki,
sucharki, ciastka, wyroby drożdżowe, chleb.
Higroskopijność syropu i związana z nią zdolność
utrzymywania wilgoci wykorzystywana jest w produkcji
wyrobów ciastkarskich o przedłużonym okresie
świeżości.
Ponadto wykorzystywany jest w produkcji przetworów
owocowych tj. dżemy, galaretki owocowe, owoce w
cukrze, owoce mrożone, syropy owocowe oraz w
produkcji wyrobów cukierniczych tj. galaretki, chałwy,
korpusy pomadkowe. Może być także stosowany w
produkcji lodów, w których wytwarza niezbyt twardą,
jednorodna konsystencję o drobnych kryształkach;
Zastosowanie
Zastosowanie
Zastosowania analityczne - badanie
produktów hydrolizy skrobi ma istotne
znaczenie w poznaniu budowy ziarenek
skrobiowych, jak i wewnętrznej struktury
amylopektyny. Najcześciej wykorzystywane
są w tym celu egzoamylazy, głównie β
-amylaza, bowiem pozostające po ich
działaniu dekstryny graniczne dostarczają
istotnych informacji na temat rozgałęzień.
Przykładem zastosowania skrobi
pozbawionej rozgałązień do celów
analitycznych jest wykorzystanie jej jako
wzorca do kalibracji mas cząsteczkowych w
chromatografii żelowej.
Amylopekty
na
Literatura:
• Purification and characterization of a novel thermostable β-
amylase from Clostridium thermosuiphurogenes, Gwo-Jenn SHEN,
Badal C. SAHA, Yong-Eok LEE, Lakshmi BHATNAGAR and J. Gregory
ZEIKUS
• General Biochemical Characterization of Thermostable
Extracellular β-Amylase from Clostridium thermosulfurogenes, H.
H. HYUN' AND J. G. ZEIKUS
• http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/saccharide/SA-
B04E.html
• http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?
ecno=3.2.1.2\
• http://siechu.dmw.wroc.pl/mirror_iic/bio/beta_atak/beta_atak.htm
• http://www.pepees.pl/index.php?wiad=40
