Termostabilna β-amylaza

Joanna Czarnecka

Marcin Herok

Marcin Szulc

Biotechnologia, grupa
CH1

Źródło otrzymywania enzymu:

Bakterie Clostridium thermosulfurigenes 4B, na których opiera
się produkcja termostabilnej β-amylazy wyizolowano pierwotnie
z biofilmu z Octopus Spring w Parku Yellowstone w USA, obecnie
znajdują się w kolekcji American Type Culture Collection (ATCC
33743).

Octopus Spring Park Yellowstone

Otrzymywanie enzymu:

Kulturę wyjściową namnaża się w specjalnych 26ml

probówkach w temp. 60

O

C. W probówce utrzymuje się

warunki beztlenowe, fazę gazową stanowi N

2

/CO

2

w

proporcjach 95:5, pożywkę jest natomiast 10ml medium
TYE zawierające 0.5% skrobi.

Właściwą produkcje przeprowadza się w bioreaktorach

o pojemności od 10 do 20 litrów wypełnionych pożywką TYE
z 0.5% maltozy jako substratem. Faza gazowa w
bioreaktorze wypełniona jest mieszaniną N

2

/CO

2

w

proporcjach 95:5. Wzrost biomasy przy temp. 60

O

C, aż do

późnej trofofazy (faza wzrostu logarytmicznego).

BioFlo 415 – fermentator do
produkcji w skali laboratoryjnej o
pojemności 10 – 20l

Otrzymywanie enzymu:

Supernantant oddzielony od biomasy jest zagęszczany
początkowo przez precypitacje (strącanie), dodaje się do niego
porcjami zimnym etanol do uzyskania stężenia 20%. Następnie
osad jest zbierany przez filtracje i zawieszany w 300ml 20mM
octanu sodu, po czym dodaje się do niego siarczanu amonu do
stężenia 70%. Roztwór jest wirowany, a otrzymany osad
zawieszany w 100ml tego samego buforu. Kolejnym krokiem jest
ponowne strącenie białka, tym razem 2 objętościami zimnego
acetonu. Otrzymany osad zawiesza się ponownie w 100ml buforu
z octanem sodu. Na zakończenie 100ml roztworu enzymu
dializuje się w 4 litrach podwójnie destylowanej wody.
Amylazę uzyskuje się również z oddzielonej na początku biomasy.
W tym celu należy zdegradować ścianę komórkową bakterii np.
działaniem lizozymu, a następnie rozbić komórki np. poprzez
szybką zmianę ciśnienia (prasa francuska). Otrzymany roztwór
wiruje się przez 30min w temp. 4

O

C. Uzyskany supernanant

poddawany jest oczyszczaniu opisanemu powyżej.

Reakcje β-amylazy

Hydroliza amylopektyny:

amylopektyna

β-maltoza

lub

dekstryna graniczna

Reakcje β-amylazy

Hydroliza amylozy:

β-maltoza

amyloza

Reakcje β-amylazy

β-maltoza

lub

dekstryna graniczna

Hydroliza glikogenu:

glikogen

Ogólny schemat reakcji

skrobia

maltodekstryna

maltoza

β-amylaza

Mechanizm 1 na przykładzie

Mechanizm katalizy β-amylazy został wywnioskowany na
podstawie struktury β-amylazy pochodzącej z soi
skompleksowanej z maltozą.

Bunzo Mikami (Research Institute for Food Science, Kyoto

University)

Mechanizm 1 na przykładzie

Na rysunku widać dwie cząsteczki maltozy połączone z enzymem z

obydwu stron punktu rozszczepienia. Produkt (β-maltoza) to

pierścienie G1 i G2, kolejne jednostki glukozy łączą się z enzymem

jako G3 i G4.

Rysunek przedstawia reszty aminokwasów w interakcji z maltozą.

Jednostki glukozy G1-G3 formują 8-10 wiązań wodorowych z

resztami białka.

Jednostka glukozy G4 tworzy tylko jedno wiązanie wodorowe z

His300, ale ma wiele wiązań van der Waalsa z otaczającymi ją

hydrofobowymi resztami.

Elastyczna pętla przyjmuje otwartą konformację w apoenzymie i

zamkniętą w kompleksie z maltozą po interakcji z substratem.

Mechanizm 1 na przykładzie

Bunzo Mikami (Research Institute for Food Science, Kyoto

University)

Na rysunku przedstawiony jest zakładany
mechanizm katalizy. W proces
zaangażowane są Glu186 i Glu380. Glu186
znajduje się blisko wiązania glikozydowego,
Glu 380 jest umiejscowiona w pobliżu β-
anomerycznego tlenu.

Glu186 zachowuje się jak kwas i jest
donorem wodorów do rozszczepienia
wiązania glikozydowego.

Glu380 działa jak zasada i aktywuje
cząsteczkę wody, która atakuje atom C1,
który jest możliwym pośredniczącym
karbokationem. Atak cząsteczki wody tylko
ze strony Glu380 daje ścisły produkt
specyficzny dla β-anomerycznej maltozy.
Maltoza jest uwalniana, gdy elastyczna
pętla się otwiera.

Mechanizm 2 na przykładzie

Scope and mechanism of carbohydrase action. Hydrolytic and nonhydrolytic actions
of beta-amylase on alpha- and beta-maltosyl fluoride

E. J. Hehre, C. F. Brewer, and D. S. Genghof

Według źródeł naukowych istnieje oznaka obecności grupy
imidazolowej i karboksylowej w centrum aktywnym β-amylazy.

Grupa imidazolowa przypuszczalnie działa jako donor protonów
dla tlenu w wiązaniu α-1,4 związanego substratu, z grupą
karboksylową występującą w zjonizowanej formie i funkcjonującej
jako zasada, elektrostatycznie stabilizująca grupa lub nukleofil.

Schemat ilustruje mechanizm hydrolizy maltotetrozy, gdzie grupa
imidazolowa działa jako kwas i anion karboksylowy
prawdopodobnie asystuje jako zasada podczas ataku cząsteczki
wody na substrat.

Mechanizm 2 na przykładzie

Aktywność enzymu

Aktywność β-amylazy oznaczana jest przez mierzenie ilości

zredukowanego cukru( maltozy) uwalnianego podczas

reakcji mieszaniny:

• 1 ml 10% rozpuszczonej skrobi

• 1 ml 0,5 M buforującego octanu sodu( pH 6.0)

• 3 ml roztworu β-amylazy odpowiednio rozcieńczonego wodą;

Reakcja zostaje zatrzymana przez inkubację w 60ºC przez 30
min., a następnie chłodzenie w lodzie. Cukier zredukowany,
powstały przez hydrolizę enzymatyczną skrobi, zostaje
określony za pomocą kwasu dinitrosalicylowego.

1μl β-amylazy jest zdefiniowany jako ilość enzymu
produkującego 1μmol maltozy na minutę w powyższych
warunkach.

Maltoza

Wyznaczanie K

m

i V

max

• Metoda Lineweavera-Burka
• Temperatura 60 ºC i 75 ºC
• Oczyszczona β-amylaza
• Rozpuszczona skrobia
• pH 6.0

Wyznaczanie K

m

i V

max

rozpuszczona skrobia,

glikogen lub amylopektyna

β-amylaza

maltoza + β-graniczne
dekstryny

pomiar ilości
maltozy

wykres L-B

Wyznaczanie K

m

i V

max

Temperatu

ra

(ºC)

K

m

(mg/ml)

V

max

(μmol ·

min

-1

·

ml

-1

)

K

kat.

(min

-

1

/mol)

60

2.29

179

400 000

75

1.68

197

440 000

General Biochemical Characterization of Thermostable
Extracellular
3-Amylase from Clostridium thermosulfurogenes

H. H. HYUN AND J. G. ZEIKUS

Inhibitory

Dodany reagent
(mM)

Aktywność enzymu
(%)

Brak
związku ............................................................
...... 100
Nadtlenek wodoru
(1) ....................................................................
.................. 98
(5) ....................... ............................................
.................. 86
Kwas 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoesowy
(0.2) ................. 96
N-Etylolmaleimid
(1)………………………………………………………………..93
(5)………………………………………………………………..54
Octan jodu
(1)
…......................................................................
.............100
(5)…………………………………………………………….....
52
P-CMB
(0.02)…………………………………………………………..
0.2
(0.1 ) …………………….
……………………………………..0.0

Inhibitory

Dodany reagent
(mM)

Aktywność enzymu
(%)

CuCI

2

(1)…………………………………………………….1.8

HgCl

2

(1)…………………………………………………….0.0

ZnCI

2

(1)…………………………………………………………...…..93
(10)………………………………………………….……..……73
CaCl

2

(5)………………………………………………………...…….100
(30)……………………………………………………...……...100

α-Cyklodekstryna (10)……………………………..………..100

β

β-Cyklodekstryna (10)……………………………..………..100

• p-CMB całkowicie blokuje aktywność enzymu,

co sugeruje występowanie grup tiolowych w
miejscu aktywnym; inhibicja przez p-CMB może
być odwrócona przez dodanie 5mM cysteiny;

• α i β-dekstryny są inhibitorami innych β-

amylaz lecz nie są inhibitorami termostabilnej
β-amylazy otrzymywanej z Clostridium
Thermosulfurogenes

• Aktywność β-amylazy jest mocno hamowana

przez jony Cu

2+

i Hg

2+

, a słabo przez nadtlenek

wodoru, octan jodu, kwas 5,5’-ditiobis-2-
nitrobenzoesowy, N-etylomaleimid i jony Zn

2+

;

p-CMB

Inhibitory

• Stabilność enzymu otrzymywanego z

C.thermosulforogenes polepszana jest przez

dodanie 5mM CaCl

2

. Enzym jest

termostabilny przez 2h przy nieobecności

substratu i CaCl

2

w 70ºC, a w 80ºC już nie.

Natomiast przy obecności substratu (1%)

bądź 5mM Ca

2+

β-amylaza jest stabilna w

80ºC

• Stabilność enzymu otrzymywanego z Bacillus

cereus nie jest polepszana przez jony wapnia

• Etanol (3%) nie wpływa na aktywność β-

amylazy, natomiast przy stężeniu 10%

aktywność enzymu wynosi 65% (efekt ten

wykorzystywany jest do precypitacji

substratów skrobiowych, enzym w temp.

65ºC jest całkowicie stabilny przez 1h w

obecności 10% etanolu)

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic
acid

N-
ethylmaleimid

Inhibitory

Zastosowanie

W przemyśle do produkcji syropów maltozowych z

pululanazą otrzymywaną z C.thermohydrosulfuran

(mają prawie identyczne optimum temperaturowe i

pH)

Syropy maltozowe otrzymywane metodą

enzymatyczną znajdują zastosowanie w

piwowarstwie, produkcji napojów, konserw i

wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do żywności

ułatwia kontrolę wodochłonności. Syropy te stosuje

się także jako wypełniacze i stabilizatory żywności

przetworzonej. Można je, podobnie jak

maltodekstryny, stosować do opóźniania wzrostu

kryształów.

Dodatkowo z syropu o wysokiej zawartosci maltozy

produkuje się maltozę krystaliczną wykorzystywaną

w produkcji leków jako zamiennik glukozy dla

diabetyków, maltitolu, maltulozy.

W produkcji syropów wysokoscukrzonych ( wraz z α-
amylazą).

Syrop wysokoscukrzony znajduje zastosowanie w
produkcji wyrobów piekarskich tj. pierniki, miodowniki,
sucharki, ciastka, wyroby drożdżowe, chleb.
Higroskopijność syropu i związana z nią zdolność
utrzymywania wilgoci wykorzystywana jest w produkcji
wyrobów ciastkarskich o przedłużonym okresie
świeżości.

Ponadto wykorzystywany jest w produkcji przetworów
owocowych tj. dżemy, galaretki owocowe, owoce w
cukrze, owoce mrożone, syropy owocowe oraz w
produkcji wyrobów cukierniczych tj. galaretki, chałwy,
korpusy pomadkowe. Może być także stosowany w
produkcji lodów, w których wytwarza niezbyt twardą,
jednorodna  konsystencję o drobnych kryształkach;

Zastosowanie

Zastosowanie

Zastosowania analityczne - badanie
produktów hydrolizy skrobi ma istotne
znaczenie w poznaniu budowy ziarenek
skrobiowych, jak i wewnętrznej struktury
amylopektyny. Najcześciej wykorzystywane
są w tym celu egzoamylazy, głównie β
-amylaza, bowiem pozostające po ich
działaniu dekstryny graniczne dostarczają
istotnych informacji na temat rozgałęzień.

Przykładem zastosowania skrobi
pozbawionej rozgałązień do celów
analitycznych jest wykorzystanie jej jako
wzorca do kalibracji mas cząsteczkowych w
chromatografii żelowej.

Amylopekty
na

Literatura:

• Purification and characterization of a novel thermostable β-

amylase from Clostridium thermosuiphurogenes, Gwo-Jenn SHEN,
Badal C. SAHA, Yong-Eok LEE, Lakshmi BHATNAGAR and J. Gregory
ZEIKUS

• General Biochemical Characterization of Thermostable

Extracellular β-Amylase from Clostridium thermosulfurogenes, H.
H. HYUN' AND J. G. ZEIKUS

• http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/saccharide/SA-

B04E.html

• http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?

ecno=3.2.1.2\

• http://siechu.dmw.wroc.pl/mirror_iic/bio/beta_atak/beta_atak.htm
• http://www.pepees.pl/index.php?wiad=40