β-amylaza

β-amylaza

EC 3.2.1.2

EC 3.2.1.2

Amylazy:

Amylazy:

Enzymy hydrolityczne z grupy hydrolaz,

rozkładające skrobię i inne wielocukry.

Rodzaje amylaz:



α-Amylaza



β-Amylaza



γ-Amylaza

β

β

-amylaza jest egzoamylazą i hydrolizuje

-amylaza jest egzoamylazą i hydrolizuje

wiązania α-1,4 glikozydowe. Enzym atakuje

wiązania α-1,4 glikozydowe. Enzym atakuje

cząsteczki skrobi na ich nieredukujących

cząsteczki skrobi na ich nieredukujących

końcach (jednostkach glukozy z niezwiązanym

końcach (jednostkach glukozy z niezwiązanym

węglem C4) odcinając cząsteczkę maltozy

węglem C4) odcinając cząsteczkę maltozy

(dimer glukozy)

(dimer glukozy)

Schemat działania enzymu:

Schemat działania enzymu:

Podjednostki glukozy zaznaczono jako okręgi niebieskie

lub brązowe (w przypadku punktów rozgałęzienia). Koniec

redukjący w cząsteczce amylopektyny odpowiada

małemu fioletowemu punktowi zaznaczonemu na jednej

skrajnej podjednostce glukozy. Miejsce ataku enzymu

("cięcia") zaznaczono czerwoną strzałką.

Skład enzymu:

Skład enzymu:

Zależność wydajności enzymu

Zależność wydajności enzymu

od pH:

od pH:

Zależność wydajności enzymu

Zależność wydajności enzymu

od temperatury:

od temperatury:

Wpływ czynników chemicznych

Wpływ czynników chemicznych

na aktywność enzymu:

na aktywność enzymu:

Produkty działania enzymu:

Produkty działania enzymu:



maltoza



dekstryny graniczne

Zastosowanie maltozy:

Zastosowanie maltozy:



środek słodzący



składnik pożywek bakteriologicznych



stabilizator wielosiarczków

Etapy produkcji enzymu:

Etapy produkcji enzymu:



pozyskanie preparatu



oczyszczenie preparatu

Źródła preparatu:

Źródła preparatu:



Mikroorganizmy (np. Bacillus sp.)



Ziarna zbóż (np. jęczmienia,

pszenicy)

Enzym może być wykorzystywany w

Enzym może być wykorzystywany w

naturalnej formie bez konieczności jego

naturalnej formie bez konieczności jego

izolacji – proces słodowania podczas

izolacji – proces słodowania podczas

produkcji piwa.

produkcji piwa.

Pozyskiwanie preparatu:

Pozyskiwanie preparatu:

Konkretny przykład produkcji zostanie przedstawiony z

użyciem Clostridium thermosulfurogenes – termofilnej

bakterii pozyskanej z gorących źródeł w parku

narodowym Yellowstone. Mikrob produkuje termostabilny

enzym o optymalnej temperaturze pracy wynoszącej 80

C.

Pozyskiwanie preparatu:

Pozyskiwanie preparatu:

Bakterie we współpracy z Clostridium

thermohydrosulfuricum wykazują

zwiększoną aktywność fermentacji skrobi

i większą wydajnością syntezy enzymów.

Ta zmiana metabolizmu była podstawą

do poszukiwania bardziej wydajnych

mutantów.

Hodowla bakterii:

Hodowla bakterii:

Hodowla okresowa: 60 C

w kolbach 125 ml bez

wstrząsania z 50 ml TYE i

źródło węgla oraz N2-

CO2 (95:5) w celu

uzyskania warunków

beztlenowych.

Hodowla ciągła: mieszanie

200 rpm, przepływ 40

ml/min w fermentorze o

pojemności 320 ml, brak

kontroli pH.

Skład TYE:

Skład TYE:

Izolacja czystych kultur:

Izolacja czystych kultur:

Do izolacji czystych kultur można użyć

płytek z TYE, 0,5% skrobi i 3% agaru

zamkniętych w komorze beztlenowej.

Wpływ źródła węgla na

Wpływ źródła węgla na

wydajność:

wydajność:

Wpływ dodatku 2-

Wpływ dodatku 2-

deoksyglukozy:

deoksyglukozy:

Mutagenizacja:

Mutagenizacja:

Przeprowadzono mutagenizacje

metodą chemiczną wykorzystując N-

metylo-N'-nitro-N nitrozoguanidyne

(250 ug/ml). Komórki traktowano

związkiem przez 1 godzinę w

temperaturze 60 C co skutkowało

zabiciem ponad 99% mikroorganizmów.

Porównanie mutantów:

Porównanie mutantów:

Porównanie mutantów:

Porównanie mutantów:

Oczyszczanie preparatu:

Oczyszczanie preparatu:



ultrafiltracja



precypitacja



chromatografia jonowymienna



filtracja żelowa

Ultrafiltracja:

Ultrafiltracja:

Ultrafiltracja (filtracja molekularna) - to proces

filtracji z użyciem sit molekularnych, membran i

wszelkich materiałów porowatych, o porach

których rozmiary są zbliżone do wielkości

pojedynczych cząsteczek.

Ultrafiltracje zastosowano w celu zagęszczenia

materiału.

Po filtracji enzym pozostaje w frakcji komórkowej.

Precypitacja etanolem:

Precypitacja etanolem:

Frakcje komórkową wiruje się przez 30

min przy 15 000 g. Do supernatantu

dodaje się schłodzonego etanolu do

uzyskania stężenia 20% (v/v). Tak

przygotowany roztwór pozostawia się

na noc w temperaturze 4 C. Wytrącony

osad rozpuszcza się w buforze

imidazolowym (50 mM, pH 6).

Chromatografia

Chromatografia

jonowymienna:

jonowymienna:

Do chromatografii jonowymiennej

należy użyć kolumny wypełnionej

słabym anionitem np. DEAE-Sepharose

CL-6B. Do elucji można użyć np. octanu

sodu.

Chromatografia

Chromatografia

jonowymienna:

jonowymienna:

Filtracja żelowa:

Filtracja żelowa:

Końcowym etapem oczyszczania jest

zastosowanie filtracji żelowej (sączenia

molekularnego), pozwalającej na

rozdział cząstek pod względem

wielkości Po zastosowaniu tej techniki

otrzymuje się gotowy preparat.

Oczyszczanie:

Oczyszczanie:

Metody sprawdzenia czystości

Metody sprawdzenia czystości

enzymu:

enzymu:



SDS-PAGE



Ogniskowanie izoelektryczne

SDS-PAGE:

SDS-PAGE:

Elektroforeza w żelu

denaturującym

pozwala na rozdział

cząstek pod

względem wielkości.

Uzyskanie

pojedynczego paska

świadczy o czystości

produktu.

Ogniskowanie

Ogniskowanie

izoelektryczne:

izoelektryczne:

Pozwala na rozdział

białek ze względu

na ich punkt

izoelektryczny.

Otrzymanie

pojedynczego paska

świadczy o czystości

produktu.

Leki:

Leki:

Poza

zastosowaniami

przemysłowymi

enzym może być

stosowany jako

składnik leków na

trawienie np. lek

ENZOsystem