Podstawy biotechnologii żywności

Ćwiczenie 6

Produkcja enzymów amylolitycznych przez bakterie z rodzaju Bacillus oraz grzyby strzępkowe Aspergillus niger

Część teotretyczna

Do najbardziej rozpowszechnionej grupy enzymów produkowanych przez drobnoustroje zalicza się amylazy hydrolizujące skrobię. Węglowodan ten jest mieszaniną glukanów, które syntetyzowane są w tkankach roślin jako podstawowy materiał zapasowy. Gromadzi się on w cytoplazmie komórek roślinnych w formie nierozpuszczalnych granulek złożonych z α-amylozy (liniowy polimer wielu tysięcy reszt glukozy połączonych wiązaniami α (1 → 4) i amylopektyny (rozgałęziony polimer glukozy połączonej w łańcuchu głównym wiązaniami α (1 → 4) z rozgałęzieniami bocznymi w pozycji α (1 → 6), występującymi średnio co 24 do 30 reszt).

Najważniejszymi enzymami biorącymi udział w procesie rozkładu skrobi są α-1,4-glukano-glukanohydrolaza (EC. 3.2.1.1 α-amylaza) i α-glukano-glukohydrolaza (EC 3.2.1.3 glukoamylaza) (VoET i voet, 1995).

α-Amylazy zalicza się do endoenzymów rozcinających wiązania α-1,4-O-glikozydowe amylozy i amylopektyny, w wyniku czego powstają oligosacharydy (dekstryny) o różnej długości łańcuchów. W warunkach przemysłowych proces upłynniania skrobi jest przeprowadzany w temperaturze 67°C, przy udziale termostabilnych α-amylaz. Enzymy takie są produkowane na skalę przemysłową przez przedstawicieli rodzaju Bacillus, a także Aspergillus sp. Po pierwszym etapie upłynniania powstające dekstryny poddaje się działaniu glukoamylaz, które odłączają jednostki glukozy od nieredukującego końca łańcuchów. Dostępne na rynku glukoamylazy są produkowane przez Aspergillus niger lub Rhizopus niveus. Jednym z ważniejszych zastosowań glukoamylaz jest ich wykorzystanie w produkcji syropów o dużej zawartości glukozy (90—97%). Syropów tych używa się do produkcji krystalicznej glukozy lub syropów o dużej zawartości fruktozy. Przekształcanie glukozy do słodszej fruktozy jest możliwe dzięki zastosowaniu izomerazy glukozowej produkowanej przez Bacillus coagulans, Streptomyces rubiginosus, Actinoplanes missouriensis lub Flavobacterium arborescens.

W przemyśle spożywczym amylazy wykorzystuje się także

• w gorzelnictwie — do scukrzania zacierów,

• w piekarnictwie — do wypieku pieczywa o przedłużonej trwałości i modyfikacji skrobi w takich produktach jak: puree ziemniaczane, spaghetti, płatki owsiane, sosy słodkie i sosy do mięs, oraz czekolady.

• Amylazy znalazły także zastosowanie w przemyśle papierniczym

• i w produkcji detergentów.

Cel doświadczenia: Określenie zdolności wybranych izolatów drobnoustrojów (Bacillus subtilis i Aspergillus niger) do wytwarzania enzymów amylolitycznch. Prezentowana metoda jest oparta na spektrofotometrycznym pomiarze ilości glukozy uwolnionej w procesie rozkładu skrobi pod wpływem amylazy.

Materiały

Szkło i sprzęt:

• Płytka agarowa z 24 - godzinną hodowlą Bacillus sp.,

• Autoklaw,

• Mieszadła magnetyczne,

• Sterylne pipety o objętości 5ml i 10 ml,

• Inkubator z wytrząsaniem o temp. 30^oC,

• Łaźnia wodna o temp. 100^oC,

• 1 kolba stożkowa o objętości 1000ml z korkiem z gazy.

Podłoże mineralne (MSB) - podstawowe, stężenie końcowe g/l:

• K₂HPO₄ 1,0g

• (NH₄)₂SO₄ 2,0g

• MgSO₄ x 7H₂O 0,2g

• FeSO₄ x 7H₂O 0,01g

• CaCl₂ x 6H₂O 0,02g

• MnCl₂ x 4H₂O 0,002g

Woda destylowana 1000ml

pH 7,0

Podłoże skrobiowe:

1. Jedynym źródłem węgla jest skrobia z mąki kukurydzianej. Do jednego litra podłoża mineralnego (MSB) dodać 10g mąki kukurydzianej, mieszać aż do zawieszenia, zagotować i sterylizować w autoklawie w temp. 121^oC przez 15 min.

2. Jedynym źródłem węgla jest skrobia rozpuszczalna. Do jednego litra podłoża mineralnego (MSB) dodać 10g skrobi rozpuszczalnej, mieszać aż do zawieszenia, zagotować i sterylizować w autoklawie w temp. 121^oC przez 15 min.

odczynnik C: 1% roztwór DNS (rozpuścić 10 g kwasu 3,5-dinitrosalicylowego w 500ml wody destylowanej, dodać 200ml 2M NaOH, dodać 300g winianu sodowo - potasowego i uzupełnić wodą do objętości 1000ml)

Część praktyczna

1. Przygotowanie hodowli drobnoustrojów

1. Wykonać zmyw roztworów hodowli drobnoustroju rosnącego na odpowiednim podłożu agarowym, roztworów tym celu:

2. Przelać całą zawartość do jałowej probówki

3. Równymi objętościami otrzymanej zawiesiny zaszczepić (po 5ml) zaszczepić odpowiednio 45 ml podłoża skrobiowego roztworów (z mąką kukurydzianą) i podłoża skrobiowego B ( ze skrobią rozpuszczalną).

4. Warunki hodowli:

• Próby zaszczepione bakteriami inkubować w temperaturze 37^OC

• Próby zaszczepione grzybami strzępkowymi inkubować w temperaturze 26^OC

• Czas inkubacji 7 dni

2. Przygotowanie roztworów glukozy do krzywej wzorcowej

• Przygotować 25ml roztworu wzorcowego glukozy (3,6mg/ml)

• Odpipetować roztwór glukozy i wody pipetą automatyczną wg tabeli:

Nr próby	Wzorzec glukozy [ml]	Woda [ml]	Stężenie glukozy [mg/ml]
0	-	1,000	-
1-2	0,125	0,875	0,45
3-4	0,250	0,750	0,90
5-6	0,500	0,500	1,80
7-8	0,750	0,250	2,70
9-10	1,000	-	3,60

3. Przygotowanie płynu pohodowlanego do oznaczeń cukrów redukujących

a) Odwirować hodowlę przy 3500 x g przez 10 min., wykorzystać supernatant do przygotowania próbek.

b) Przygotować rozcieńczenia płynu pohodowlanego w objętości 1 ml zgodnie ze schematem:

Próbka 1 2 3 4 5

Rozcieńczenie 1:0 1:1 1:2 1:4 1:9

W celu ustalenia ilości uwolnionej glukozy wykonać oznaczenia według procedury zamieszczonej w punkie 4 - zmierzyć w spektrofotometrze absorbancję przy długości fali 550nm. Jeżeli absorbancja jest wyższa niż 0,8 próbkę należy rozcieńczyć wodą destylowaną.

Określić ilość glukozy uwolnionej ze skrobi, posługując się uprzednio przygotowaną krzywą wzorcową.

4. Wykonanie oznaczenia zawartości cukrów redukujących

• do wszystkich probówek dodać po 1 ml odczynnika C

• do wszystkich probówek dodać po 5 ml wody destylowanej

• wszystkie probówki przykryć korkiem - bardzo delikatnie zakręcić

• wszystkie probówki dokładnie wymieszać

• wszystkie probówki od razu włożyć na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej (100^OC)

• następnie schłodzić w zimnej wodzie

• zmierzyć absorbancję względem próby zerowej przy długości fali λ=550nm

na podstawie krzywej wzorcowej wykreślonej na podstawie pomiarów ekstynkcji roztworów wzrocowych glukozy obliczyć ilość cukrów redukujących w płynie pohodowlanym (glukozę wyrazić w mg/1ml płynu pohodowlanego)

---