Metody badania

Metody badania

antybiotykooporno

antybiotykooporno

ści

ści

►

Oznaczanie wrażliwości na leki jest

Oznaczanie wrażliwości na leki jest

jednym z najważniejszych etapów

jednym z najważniejszych etapów

rutynowej diagnostyki

rutynowej diagnostyki

mikrobiologicznej zakażeń

mikrobiologicznej zakażeń

bakteryjnych.

bakteryjnych.

►

Mikrobiolog:

Mikrobiolog:



konsultacja medyczna

konsultacja medyczna



interpretacja wyniku mikrobiologicznego

interpretacja wyniku mikrobiologicznego

Ilość badań mikrobiologicznych wg

Ilość badań mikrobiologicznych wg

WHO

WHO

►

100 badań na jedno łóżko szpitalne

100 badań na jedno łóżko szpitalne

►

dla pacjentów ambulatoryjnych jedno

dla pacjentów ambulatoryjnych jedno

badanie mikrobiologiczne na 16 osób

badanie mikrobiologiczne na 16 osób

populacji

populacji

►

Polska – 5 – 40% tych norm

Polska – 5 – 40% tych norm

►

Zasady doboru testów

Zasady doboru testów

(do oznaczania

(do oznaczania

wrażliwości bakterii na antybiotyki i

wrażliwości bakterii na antybiotyki i

chemioterapeutyki) w rutynowej diagnostyce

chemioterapeutyki) w rutynowej diagnostyce

mikrobiologicznej zawarte są w

mikrobiologicznej zawarte są w

rekomendacjach

rekomendacjach

opracowanych w

opracowanych w

Krajowym Ośrodku

Krajowym Ośrodku

Referencyjnym ds. Lekowrażliwości

Referencyjnym ds. Lekowrażliwości

Drobnoustrojów

Drobnoustrojów

powołanym decyzją Ministra

powołanym decyzją Ministra

Zdrowia i Opieki Społecznej w 1997 roku.

Zdrowia i Opieki Społecznej w 1997 roku.

►

Podstawą metodyczną rekomendacji

Podstawą metodyczną rekomendacji

w zakresie

w zakresie

wykonania, interpretacji i standaryzacji

wykonania, interpretacji i standaryzacji

oznaczania lekowrażliwości jest

oznaczania lekowrażliwości jest

norma

norma

National Committee for Clinical Laboratory

National Committee for Clinical Laboratory

Standards (NCCLS).

Standards (NCCLS).

STANDARYZACJA !!!!!!

STANDARYZACJA !!!!!!

Standaryzacji podlega m. in:

Standaryzacji podlega m. in:

►

skład podłoża (najczęściej agar Mueller-

skład podłoża (najczęściej agar Mueller-

Hintona bez lub z dodatkiem Isovilatexu lub

Hintona bez lub z dodatkiem Isovilatexu lub

4% NaCL

4% NaCL

►

inokulum (0,5 stopnia wzorca skali Mc

inokulum (0,5 stopnia wzorca skali Mc

Farlanda)

Farlanda)

►

warunki i czas inkubacji

warunki i czas inkubacji

►

interpretacja wyników (np.: interpretacja na

interpretacja wyników (np.: interpretacja na

podstawie wielkości stref zahamowania

podstawie wielkości stref zahamowania

wzrostu szczepu wokół krążków w mm zgodna

wzrostu szczepu wokół krążków w mm zgodna

z instrukcją dołączoną do krążków)

z instrukcją dołączoną do krążków)

Wrażliwość

Wrażliwość

►

mikrobiologiczna

mikrobiologiczna

– oznacza, że dany

– oznacza, że dany

szczep należy do wrażliwej populacji i

szczep należy do wrażliwej populacji i

nie posiada mechanizmów oporności, a

nie posiada mechanizmów oporności, a

sukces kliniczny w takiej sytuacji jest

sukces kliniczny w takiej sytuacji jest

wysoce prawdopodobny,

wysoce prawdopodobny,

►

kliniczna

kliniczna

– oznacza skuteczność

– oznacza skuteczność

kliniczną przy zastosowaniu

kliniczną przy zastosowaniu

standardowych dawek leku, (wpływ

standardowych dawek leku, (wpływ

innych czynników takich jak:

innych czynników takich jak:

właściwości farmakokinetyczne i

właściwości farmakokinetyczne i

farmakodynamiczne leku, stan

farmakodynamiczne leku, stan

odporności pacjenta)

odporności pacjenta)

Średnia wrażliwość

Średnia wrażliwość

►

dotyczy grupy szczepów, które znajdują się

dotyczy grupy szczepów, które znajdują się

pomiędzy mikrobiologicznie wrażliwymi i

pomiędzy mikrobiologicznie wrażliwymi i

mikrobiologicznie opornymi. Sukces

mikrobiologicznie opornymi. Sukces

kliniczny jest trudny do przewidzenia, ale

kliniczny jest trudny do przewidzenia, ale

może być osiągnięty:

może być osiągnięty:



zastosowanie antybiotyku w wyższej dawce

zastosowanie antybiotyku w wyższej dawce



zwiększenie częstotliwości podawania leku

zwiększenie częstotliwości podawania leku



jeśli antybiotyk ulega zagęszczenie w miejscu

jeśli antybiotyk ulega zagęszczenie w miejscu

zakażenia, osiągając wysokie stężenia

zakażenia, osiągając wysokie stężenia



Konieczność potwierdzenia oznaczeniem MIC.

Konieczność potwierdzenia oznaczeniem MIC.

MIC oznaczony !!!

Oporność

Oporność

►

mikrobiologiczna

mikrobiologiczna

– szczep posiada

– szczep posiada

mechanizm oporności, (oporność niskiego lub

mechanizm oporności, (oporność niskiego lub

wysokiego stopnia)

wysokiego stopnia)

►

farmakokinetyczna

farmakokinetyczna

– bakterie mogą przeżyć

– bakterie mogą przeżyć

w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym

w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym

niż jest możliwy do osiągnięcia

niż jest możliwy do osiągnięcia

in vivo

in vivo

w

w

miejscu zakażenia,

miejscu zakażenia,

►

kliniczna

kliniczna

– sukces terapeutyczny jest

– sukces terapeutyczny jest

niemożliwy do osiągnięcia, pomimo

niemożliwy do osiągnięcia, pomimo

zastosowania maksymalnych dawek

zastosowania maksymalnych dawek

antybiotyku.

antybiotyku.

Oporność naturalna

Oporność naturalna

►

stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny

stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny

drobnoustrojów; również oporność występująca

drobnoustrojów; również oporność występująca

u znacznej części populacji (

u znacznej części populacji (





-laktamazy u

-laktamazy u

Staphylococcus sp., Moraxella catarrhalis

Staphylococcus sp., Moraxella catarrhalis

)

)

!!!!

!!!!

Oporność naturalna może wynikać:

Oporność naturalna może wynikać:



z braku w komórce miejsca docelowego/niskiego

z braku w komórce miejsca docelowego/niskiego

powinowactwa

powinowactwa



z braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku

z braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku

przez ścianę komórkową

przez ścianę komórkową



z wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk

z wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk

Oporność nabyta

Oporność nabyta

jeżeli nie stanowi naturalnej cechy

jeżeli nie stanowi naturalnej cechy

szczepów danego gatunku drobnoustroju,

szczepów danego gatunku drobnoustroju,

wynika z presji selekcyjnej, związanej z

wynika z presji selekcyjnej, związanej z

powszechnym stosowaniem antybiotyków

powszechnym stosowaniem antybiotyków

(nie tylko do celów terapeutycznych).

(nie tylko do celów terapeutycznych).

Oporność

krzyżowa

niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki
należące do tej samej grupy chemicznej (np.: -laktamy,

aminoglikozydy, makrolidy) lub niespokrewnionej grupy
chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków
znajdują się blisko siebie (np.: makrolidy i linkozamidy).

Tolerancja

Tolerancja

►

brak aktywacji enzymów autolitycznych

brak aktywacji enzymów autolitycznych

przez antybiotyk

przez antybiotyk





-laktamowy i spadek

-laktamowy i spadek

lub brak jego działania bakteriobójczego

lub brak jego działania bakteriobójczego

bez utraty działania hamującego;

bez utraty działania hamującego;

►

MBC/MIC

MBC/MIC





32.

32.

►

np. niektóre szczepy

np. niektóre szczepy

S.pneumoniae

S.pneumoniae

„tolerują” penicylinę do czasu, gdy jej

„tolerują” penicylinę do czasu, gdy jej

działanie jest tylko bakteriostatyczne.

działanie jest tylko bakteriostatyczne.

Inokulum

Inokulum

liczba komórek bakteryjnych w

liczba komórek bakteryjnych w

podłożu płynnym, wyrażana jako liczba

podłożu płynnym, wyrażana jako liczba

jednostek tworzących kolonie na

jednostek tworzących kolonie na

mililitr (

mililitr (

colony-forming units

colony-forming units

per

per

mililitre

mililitre

– CFU/ml) = zmętnienie,

– CFU/ml) = zmętnienie,

gęstość optyczna zawiesiny

gęstość optyczna zawiesiny

bakteryjnej.

bakteryjnej.

Efekt inokulum !!!!

Stężenie graniczne

Stężenie graniczne

(

(

breakpoint

breakpoint

)

)

określona wartość MIC lub określona wielkość

określona wartość MIC lub określona wielkość

strefy zahamowania wzrostu, będąca

strefy zahamowania wzrostu, będąca

podstawą do zakwalifikowania danego szczepu

podstawą do zakwalifikowania danego szczepu

do jednej z trzech kategorii klinicznych:

do jednej z trzech kategorii klinicznych:



S (sensitive) wrażliwy – wartość MIC jest równa lub

S (sensitive) wrażliwy – wartość MIC jest równa lub

niższa od stężenia antybiotyku osiąganego w

niższa od stężenia antybiotyku osiąganego w

surowicy przy normalnym dawkowaniu leku

surowicy przy normalnym dawkowaniu leku



I (intermediate) średniowrażliwy – w leczeniu może

I (intermediate) średniowrażliwy – w leczeniu może

być użyty przez zwiększenie jednorazowych dawek

być użyty przez zwiększenie jednorazowych dawek

leku

leku



R (resistant) oporny – wartość MIC będzie wyższa od

R (resistant) oporny – wartość MIC będzie wyższa od

stężenia leku osiągniętego w surowicy.

stężenia leku osiągniętego w surowicy.

►

MBC

MBC

(minimal bactericidal activity

(minimal bactericidal activity

concentration)

concentration)

najmniejsze stężenie

najmniejsze stężenie

bakteriobójcze, jest miarą aktywności

bakteriobójcze, jest miarą aktywności

bakteriobójczej antybiotyku.

bakteriobójczej antybiotyku.

►

MIC

MIC

(minimal inhibitory concentration)

(minimal inhibitory concentration)

najmniejsze stężenie hamujące, jest miarą

najmniejsze stężenie hamujące, jest miarą

zdolności antybiotyku do zahamowania

zdolności antybiotyku do zahamowania

wzrostu bakterii.

wzrostu bakterii.

Znakomitą aktywność bakteriobójczą wykazują
te preparaty, dla których wartość MBC jest
równa lub bliska wartości MIC.

Czynniki wpływające na

Czynniki wpływające na

aktywność

aktywność

przeciwbakteryjną

przeciwbakteryjną



pH środowiska

pH środowiska

(niektóre leki są bardziej aktywne w pH

(niektóre leki są bardziej aktywne w pH

kwaśnym (np. nitrofurantoina) a inne w pH zasadowym (np.

kwaśnym (np. nitrofurantoina) a inne w pH zasadowym (np.

aminoglikozydy, sulfonamidy)),

aminoglikozydy, sulfonamidy)),



skład podłoża

skład podłoża

(np. detergenty hamuja aktywność

(np. detergenty hamuja aktywność

aminoglikozydów),

aminoglikozydów),



trwałość leku

trwałość leku

(liczne leki tracą aktywność w temp. inkubacji (np.

(liczne leki tracą aktywność w temp. inkubacji (np.

chlorotetracyklina)), inne są trwałe przez długi okres czasu (np.

chlorotetracyklina)), inne są trwałe przez długi okres czasu (np.

aminoglikozydy, chloramfenikol),

aminoglikozydy, chloramfenikol),



wielkość inokulum

wielkość inokulum

(im większe inokulum, tym mniejsza

(im większe inokulum, tym mniejsza

wrażliwość bakterii),

wrażliwość bakterii),



czas inkubacji

czas inkubacji

(często podczas krótkiego działania leku bakterie

(często podczas krótkiego działania leku bakterie

nie są zabijane, a tylko hamowany jest ich wzrost. Im dłuższy

nie są zabijane, a tylko hamowany jest ich wzrost. Im dłuższy

czas inkubacji, tym większe prawdopodobieństwo pojawienia się

czas inkubacji, tym większe prawdopodobieństwo pojawienia się

mutantów opornych, gdy działanie antybiotyku jest słabsze),

mutantów opornych, gdy działanie antybiotyku jest słabsze),



aktywność metaboliczna drobnoustrojów

aktywność metaboliczna drobnoustrojów

(na ogół aktywne i

(na ogół aktywne i

szybko rosnące organizmy są wrażliwsze na działanie leku od

szybko rosnące organizmy są wrażliwsze na działanie leku od

tych, które znajdują się w fazie spoczynkowej).

tych, które znajdują się w fazie spoczynkowej).

Jakościowe

•metoda krążkowo-dyfuzyjna

 m. seryjnych rozcieńczeń

w podłożu stałym lub

płynnym (MIC, MBC)

•metody skriningowe
ocena wrażliwości gronkowców na metycylinę

 E – testy (met.

dyfuzyjna)
ocena wrażliwości enterokoków na wankomycynę,
wysokie stężenia aminoglikozydów

•metody specjalne (dla bakterii trudno hodowlanych
m. in. Mycobacterium, Haemophilus, Mycoplasma)

Ilościowe

•

(rozcieńczeniowe; 2 lub 3 stężenia krytyczne: break-point

dla stopni wrażliwości S, I, R)

• metody automatyczne (VITEK), półautomatyczne (ATB)

Półilościowe

Metoda krążkowo -

Metoda krążkowo -

dyfuzyjna

dyfuzyjna



powszechnie stosowana,

powszechnie stosowana,

łatwa do wykonania,

łatwa do wykonania,



standaryzowana (dwie

standaryzowana (dwie

odmiany: wg ICS i wg NCCLS),

odmiany: wg ICS i wg NCCLS),



umożliwia oznaczenie

umożliwia oznaczenie

wrażliwości badanego

wrażliwości badanego

szczepu na kilka

szczepu na kilka

antybiotyków jednocześnie,

antybiotyków jednocześnie,



krążki nasycone

krążki nasycone

antybiotykami w stężeniu

antybiotykami w stężeniu

takim jakie osiągane jest w

takim jakie osiągane jest w

surowicy,

surowicy,



odczytanie wyników i ich

odczytanie wyników i ich

interpretacja na podstawie

interpretacja na podstawie

wielkości stref zahamowania

wielkości stref zahamowania

wzrostu szczepu wokół

wzrostu szczepu wokół

krążków (zgodnie z instrukcją

krążków (zgodnie z instrukcją

dołączoną do krażków).

dołączoną do krażków).

Metody skriningowe

Metody skriningowe



do wykrywania gronkowców opornych na

do wykrywania gronkowców opornych na

metycylinę (MRSA, MRCNS),

metycylinę (MRSA, MRCNS),



do oceny wrażliwości enterokoków na

do oceny wrażliwości enterokoków na

wankomycynę, wysokiego poziomu

wankomycynę, wysokiego poziomu

oporności na gentamycynę i oporności na

oporności na gentamycynę i oporności na

streptomycynę.

streptomycynę.

Metody rozcieńczeniowe w

Metody rozcieńczeniowe w

podłożu stałym lub płynnym

podłożu stałym lub płynnym



metody określające MIC, umożliwiają też

metody określające MIC, umożliwiają też

określenie wartości MBC (w tym celu

określenie wartości MBC (w tym celu

należy wykonać przesiew z hodowli

należy wykonać przesiew z hodowli

płynnej na podłoże stałe z probówki ze

płynnej na podłoże stałe z probówki ze

stężeniem antybiotyku poniżej MIC i

stężeniem antybiotyku poniżej MIC i

czterech kolejnych w kierunku

czterech kolejnych w kierunku

wzrastającego stężenia),

wzrastającego stężenia),



metody półilosciowe (automatyczne lub

metody półilosciowe (automatyczne lub

półautomatyczne) np.: ATB ANA, ATB

półautomatyczne) np.: ATB ANA, ATB

FUNGUS.

FUNGUS.

Metody rozcieńczeniowe w

Metody rozcieńczeniowe w

podłożu płynnym

podłożu płynnym

Metody rozcieńczeniowe w

Metody rozcieńczeniowe w

podłożu płynnym

podłożu płynnym

E – test

E – test



metoda dyfuzyjna,

metoda dyfuzyjna,

pozwalająca określić

pozwalająca określić

wartość MIC,

wartość MIC,



oparta na dyfuzji

oparta na dyfuzji

antybiotyku

antybiotyku

zawartego w pasku

zawartego w pasku

bibułowym w

bibułowym w

gradiencie stężeń do

gradiencie stężeń do

podłoża, na którym

podłoża, na którym

wzrasta badany

wzrasta badany

szczep.

szczep.

E – test

E – test