Slajd 1
Badania immunologiczne
a diagnostyka różnicowa.
lek med Julia Kulczycka
Zakład Immunopatologii AMG
2007r
Slajd 2
Skierowanie na badania immunologiczne
Slajd 3
Materiał biologiczny
Badania na obecność autoprzeciwciał, RF,
składowych dopełniacza, immunoglobulin -
surowica:
1. Krew pobrana do probówki  na skrzep w ilości
3-5 ml.
2. Transport  do 2h w temperaturze pokojowej,
do 24h w temperaturze 4°C (surowica do 72h).
3. Przesyłka pocztą - surowica w plastikowej
probówce lub fiolce typu  eppendorf
dodatkowo zabezpieczona kopertÄ… ochronnÄ…,
list priorytetowy, do 72h.
Slajd 4
Materiał biologiczny c.d.
Diagnostyka zaburzeń odporności typu komórkowego
- pełna krew pobrana na EDTA (min. 2 ml)
Immunofenotypizacja -
pełna krew/szpik pobrane na EDTA (min. 2 ml)
Phagotest/burtest -
pełna krew pobrana na heparynę (2 ml)
Przeciwciała przeciwpłytkowe
- surowica około 3ml krwi  na skrzep , oraz krew pełna pobrana
do próbówki z cytrynianem:
np. u osób dorosłych < 20 G/l płytek  40 ml, 21-50 G/l  30 ml,
51-150 G/l  20 ml, > 150 G/l  10 ml.
(uwaga!  wskazany jest kontakt z LIK).
Slajd 5
Materiał biologiczny c.d.
Oznaczanie krioglobulin:
- około 10 ml krwi pobranej do probówki w
temperaturze 370C - zestaw strzykawkowy lub
próżniowy powinien ogrzany poprzez
umieszczony na około 40 min w cieplarce o
temp. 370C. Bezpośrednio po pobraniu
surowicę należy dostarczyć do laboratorium
zachowujÄ…c temperaturÄ™ 370C.
- Zaleca się pobranie materiału
bezpośrednio w Laboratorium
Slajd 6
Materiał biologiczny c.d.
Oceny wczesnego antygenu CMV pp 65:
2 ml krwi - jałowa probówki z EDTA ( bezpośrednio po
pobraniu przesłać do laboratorium)
Ocena subpopulacji limfocytów:
2x2 ml krwi - probówka z EDTA ( bezpośrednio po pobraniu
przesłać do laboratorium)
Oznaczanie HLA metodÄ… serologicznÄ…:
6ml krwi - probówka z heparyną ( bezpośrednio po pobraniu
przesłać do laboratorium)
Oznaczanie HLA metodÄ… genetycznÄ… (analiza DNA):
6 ml krwi - probówka z EDTA (maksymalny czas transportu
24 godzin)
Slajd 7
Materiał biologiczny c.d.
Mocz dobowy (oznaczanie białek specyficznych):
Mocz zbierany przez 24 godziny do naczynia ze środkiem
konserwujÄ…cym (np. tymol) i przechowywany w temperaturze
4-8°C, po wymieszaniu przesÅ‚any do laboratorium w
probówce (5 ml).
Płyn mózgowo-rdzeniowy lub stawowy:
2 ml w jałowej probówce (maksymalny czas transportu - 24h)
Slajd 8
Materiał biologiczny c.d.
Tkanki
1. Badania immunohistohemiczne - bioptaty narządów
miąższowych (wątroba, nerka) lub wycinki skórno-
mięśniowe.
2. Transport  do 24h, w temperaturze 4°C, w Å›rodowisku
0,9% NaCl (zalecane jest umieszczenie bioptatu na bibułce
nasączonej solą fizjologiczną, a nie bezpośrednio w
pojemniku z 0,9% NaCl).
Nie zamrażać! Nie utrwalać!
Slajd 9
Badania w diagnostyce immunologicznej
- Metody immunohistochemiczne:
1. Metody immunofluorescencyjne (pośrednia,
bezpośrednia)
2. Techniki immunoenzymatyczne (ELISA)
3. Techniki z wykorzystaniem znakowanych
ligandów (złoto koloidalne)
- Metody serologiczne (nefelometryczna, inne)
- Metody typu Dot blot, Western blot
- Cytometria przepływowa
- RT-PCR, PCR.
Slajd 10
Metoda immunofluorescencyjna
Metoda immunomorfologiczna, pozwalającą określić
miejsce wiązania antygenu z przeciwciałem in situ w
badanej tkance lub w komórkach.
Zastosowanie:
badania immunohistochemiczne - identyfikacja
antygenów (wirusologia, patogeneza chorób o podłożu
autoimmunizacyjnym), organelli komórkowych,
receptorów, ligandów, miejsc syntezy hormonów itp.
Slajd 11
Testy immunoenzymatyczne
Metoda ELISA - wykrywanie określonych białek w badanym materiale z
użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych sprzężonych z
odpowiednim enzymem.
Szerokie zastosowanie w diagnostyce (choroby z autoagresji, serologia infekcji
wirusowych, grzybiczych i bakteryjnych, alergie).
Badania jakościowe i ilościowe.
Wysoka specyficzność i czułość.
Biochemicznie scharakteryzowane antygeny.
A
atwe i wygodne przeprowadzenie testu.
Duża powtarzalność wyników.
Slajd 12
Metody weryfikacji stosowane w
diagnostyce immunologicznej.
Jakościowe oznaczanie in-vitro ludzkich przeciwciał
skierowanych przeciwko antygenom własnym,
bakteryjnym lub wirusowym.
" Western blot  inkubacja surowicy pacjenta z
paskami membrany z ekstraktem antygenów
poddanym rozdziałowi elektroforetycznemu (do
kilkudziesięciu różnych antygenów na pasku).
" Dot blot  kombinacja testu krążkowego i Western
blot. Szybka detekcja specyficznych przeciwciał w
surowicy pacjenta. Do badania jest wykorzystywana
membrana z naniesionym substratem antygenowym -
jeden lub kilka antygenów nałożonych w określonej
kombinacji (bez rozdziału elektroforetycznego).
Slajd 13
Znaczenie kliniczne miana przeciwciał
Grupa I
Grupa II
istotne diagnostycznie od małych
istotne diagnostycznie od
rozczeńczeń surowicy:
wyższych rozczeńczeń surowicy:
1:5 - Większość przeciwciał
1:20 - AMA, ASMA, SMA i td.
narzÄ…dowo-swoistych.
1:40 - ANA, ANCA.
1:2 - przeciwciała przeciw
1:80  ANA-HEp.
wyspom trzustki
Slajd 14
Wartości referencyjne
Zakres wartości normalnych
(referencyjnych), obejmujÄ…cych 95%
wyników stwierdzanych u osób zdrowych
niezależnie od metody badań.
Norma - pojęcie statystyczne.
Slajd 15
Znaczenie badań
immunologicznych
Slajd 16
Przypadek kliniczny 1
- pacjent 60-letni
- od około 6 miesięcy osłabienie, zawroty
głowy, zaburzenia czucia w obrębie
kończyn, nudności, zaparcia.
- w badaniach laboratoryjnych  anemia
megaloblastyczna, retikulocytopenia,
? poziom wit. B12 w surowicy, niewielki ?
LDH i bilirubiny.
Slajd 17
Algorytm postępowania diagnostycznego
w anemii.
Podejrzenie niedokrwistości (objawy kliniczne)
Gastroskopia,
Badanie biochemiczne Poziom
Badanie szpiku.
(morfologia, poziom B12, żelaza,
autoprzeciwciał
transferyny, bilirubiny i td)
Choroby szpiku,
Choroby przewodu
Obraz
Niedokrwistość
pokarmowego
prawidłowy
Przeciwciała Przeciwciała
ujemne
przeciw IFA przeciw ATPazie
Anemia złośliwa,
Anemia o innym tle
Przewlekłe zanikowe
zapalenie żołądka
Slajd 18
Anemia złośliwa
" Niedobór witaminy B12
" Objawy anemii hiperchromicznej
" Występowanie megaloblastów w szpiku kostnym i
megalocytów we krwi
" Wycofywanie objawów po podaniu witaminy B12
lub czynnika wewnętrznego.
Slajd 19
Przeciwciała przeciwko komórkom
okładzinowym żołądka
Antygen docelowy - H/K-ATPaza, biorąca udział w
Antygen docelowy - H/K-ATPaza, biorąca udział w
produkcji kwasu solnego
produkcji kwasu solnego
Inny typ autoprzeciwciał - przeciwko receptorowi
Inny typ autoprzeciwciał - przeciwko receptorowi
gastryny
gastryny
Oba antygeny znajdują się na powierzchni komórek
Oba antygeny znajdują się na powierzchni komórek
okładzinowych
okładzinowych
Znaczenie diagnostyczne:
80-90% anemia złośliwa
20-30% endokrynopatie
immunologicznie uwarunkowane
2-5% osoby zdrowe
Slajd 20
Przeciwciała przeciwko czynnikowi
wewnętrznemu (intristic factor)
Przeciwciała typu I reagują z miejscem
wiążącym witaminę B12 - blokowanie
tworzenia kompleksu
Przeciwciała typu II łączą się z czynnikiem
wewnętrznym poza miejscem wiązania,
występują zwykle w obecności przeciwciał
typu I (wartość diagnostyczna ograniczona)
Znaczenie diagnostyczne:
- przewlekłe zanikowe zapalenie żołądka bez objawów klinicznych anemii złośliwej.
Slajd 21
Przypadek kliniczny 2
- pacjent 12-letni
- od kilku miesięcy nawracające pieniste
biegunki i bóle brzucha.
- w badaniu fizykalnym: niedobór masy ciała
i wzrostu (przy dobrym apetycie i
odpowiedniej dla wieku diecie).
- od 5 rż insulinoterapia z powodu cukrzycy
typu I
Slajd 22
Algorytm postępowania diagnostycznego
w celiakii.
Podejrzenie celiakii (objawy kliniczne)
Eliminacja glutenu
Poziom
z diety
Biopsja jelita cienkiego
autoprzeciwciał
Wynik pozytywny
Obraz
Atrofia kosmków
prawidłowy
Rozrost krypt
Przeciwciała Przeciwciała Przeciwciała
ujemne
przeciw AGA przeciw EmA przeciw TGA
Inne choroby jelit Celiakia
Slajd 23
Wartość diagnostyczna testów
serologicznych
W porównaniu z badaniem histopatologicznym wykazano, że testy
serologiczne charakteryzujÄ… siÄ™:
Przeciwciała przeciw gliadynie 
czułość 80-90%; swoistość 70-95%.
Przeciwciała przeciw endomysium 
czułość 90-95%; swoistość 90-100%.
Przeciwciała przeciw transglutaminazie tkankowej 
czułość 97-100%; swoistość 70-80%.
(w testach z użyciem ludzkiego antygenu rekombinowanego czułość i swoistość
sięgała 100%)
Oznaczenie jednocześnie dwóch lub trzech parametrów zwiększa szansę
diagnozy serologicznej.
Slajd 24
Znaczenie kliniczne testów
serologicznych
W badaniach klinicznych stwierdzono że u osób, u których
występują charakterystyczne objawy, wykrycie w surowicy
przeciwciał przeciw TGA i EmA pozwala ustalić z ponad 98%
prawdopodobieństwem rozpoznanie celiakii.
Natomiast u osób bez objawów, uzyskanie dodatnich wyników
TGA i EmA zwiększa wprawdzie prawdopodobieństwo
celiakii, ale w stopnie niewystarczajÄ…cym do postawienia
jednoznacznego rozpoznania.
Przeciwciała przeciw gliadynie w klasach IgA i IgG występują
przede wszystkim w fazie aktywnej enteropatii
(monitorowanie recydyw).
Slajd 25
Wskazania do badania przesiewowego
- krewni pierwszego stopnia na celiakiÄ™
- pacjenci z cukrzycÄ… typu 1
- inne choroby autoimmunologiczne (np. pierwotne stwardniajÄ…ce
zapalenie dróg żółciowych, autoimmunologiczne zapalenie
wÄ…troby, zespół Sjögrena)
- idiopatyczna bezpłodność
- selektywny niedobór przeciwciał IgA
Slajd 26
Przypadek kliniczny 3
- pacjent, lat 65
- od około 4 miesięcy zmiany skórne - duże
i małe pęcherze o dobrze napiętej
pokrywie, ustępujące bez pozostawienia
blizn.
- błony śluzowe bez zmian.
- stan po leczeniu operacyjnym i
onkologicznym rozpoznanego 3 lata
wcześniej raka pęcherza moczowego.
Slajd 27
Algorytm postępowania diagnostycznego
w pęcherzycy.
Podejrzenie pęcherzycy (objawy kliniczne)
Badanie biochemiczne,
Poziom Biopsja skóry
Testy alegrologiczne
autoprzeciwciał
Różnicowanie zmian
na podstawie obrazu
Zakażenia,
TÅ‚o alergiczne histo-patologicznego
Toksyny
i badania immunologicznego.
i td
Przeciwciała Przeciwciała
ujemne
typu pemphigus typu pemphigoid
Pemphigus vulgaris Pemphigoid
Inne tło pęcherzycy
Pemphigus filliaceus bullosum
Slajd 28
Pemphigus
Odmiany pęcherzycy:
Pęcherzyca zwykła - przeciwciała przeciw
desmogleinie III. - kadherynie o masie 130 kD.
Pęcherzyca liściasta  przeciwciała przeciw
desmogleinie I.
Slajd 29
Znaczenie kliniczne autoprzeciwciał
w diagnostyce pęcherzyc:
" Częstość występowania 90%
" Antygeny docelowe - desmogleina III. lub
desmogleinie I.
" Miano przeciwciał koreluje z aktywnością
choroby.
" Przeciwciała te wykrywane są w nielicznych
przypadkach oparzeń i alergii polekowych
Slajd 30
Pemfigoid
- autoimmunologiczna choroba
pęcherzowa skóry zależna od
patogennych przeciwciał skierowanych
przeciw antygenom granicy skórno-
naskórkowej
Slajd 31
Znaczenie kliniczne autoprzeciwciał
w diagnostyce pemfigoidu:
" Przeciwciała głównie w klasie G immunoglobulin
" Częstość występowania  60-70 %
" Antygeny docelowe: białko keratynocytów (BPAg-1)
i hemidesmosomalny kolagen typu XVII (BPAg-2).
" Miano przeciwciał nie odzwierciedla aktywności
choroby
Slajd 32
Przypadek kliniczny 4
- pacjent, lat 43
- od 3 dni:
temperatura do 38°C
ból w klatce piersiowej o charakterze stenokardialnym
uczucie duszności
tachykardia
- osłuchowo - tarcie osierdzia
- W badania biochemicznych:
leukocytoza, przyspieszone OB, wysokie CRP
- EKG: obraz "płaszczowego" uszkodzenia serca.
- Pacjent 6 tygodni wcześniej przebył zawał mięśnia
sercowego.
Slajd 33
Algorytm postępowania diagnostycznego
w zapaleniu mięśnia sercowego.
Podejrzenie zapalenia mięśnia sercowego (objawy kliniczne)
Badanie biochemiczne Poziom
(morfologia z rozmazem, OB,
autoprzeciwciał
CRP, troponiny, CK i td)
Diagnostyka
Obrazowa
(ECHO, RTG)
Badania
mikrobiologiczne
(krew, płyn osierdziowy)
Przeciwciała
ujemne
przeciw sercowe
Autoimmunologiczne
Myocarditis o innym tle
zapalenie mięśnia sercowego
Slajd 34
Zespół Dresslera
(syn. zespół pozawałowy Dresslera)
" 0, 5 - 4, 5% pacjentów po zawale mięśnia sercowego.
" w 2 - 10 tygodniu po zawale serca.
" Zespół:
nawracajÄ…cego zapalenia osierdzia
gorÄ…czka
niedokrwistość
podwyższone OB i CRP.
" Patogeneza nieznana.
" Autoagresyjna reakcja na antygeny komórek mięśnia
sercowego uszkodzonego w czasie zawału?
" Leczenie - niesteroidowe leki przeciwzapalne/
kortykosteroidy.
Slajd 35
Zaburzenia odporności
Nabyte:
Wrodzone:
- immunosupresja
- Niedobory odporności humoralnej
radioterapia
(zaburzenie syntezy przeciwciał)
leczenie cytostatykami
wrodzona agammaglobulinemia
- zakażenia
HIV
grużlica
malaria
- Niedobory odporności komórkowej - nowotwory
samoistny niedobór komórek CD4 - zaburzenia metaboliczne
cukrzyca
niedobór komórek NK
niewydolność wątroby
- choroby o podłożu autoimmunizacyjnym
SLE
- Złożone niedobory odporności
RZS
sprzężony z chromosomem X
- czynniki środowiskowe
zespół Wiskotta i Aldricha promieniowanie UV
substancje chemiczne
- inne
stres
ciąża
Slajd 36
Diagnostyka:
Zaburzeń humoralnych
- Elektroforeza bialek (ocena poziomu Å‚-globulin)
- Poziom immunoglobulin w surowicy (IgM, IgG, IgA)
- Subpopulacja limfocytów B
- Podklasy immunoglobulin
Zaburzeń komórkowych
- Morfologia krwi z rozmazem
- Subpopulacja limfocytów T i komórek NK
- Cytokiny
Ocena czynności komórek fagocytarnych
- zdolność do fagocytozy (Phagotest)
- ocena metabolizmu tlenowego (Bursttest)
Ocena układu dopełniacza
- aktywnosć i stężenie składowych dopełnicza
Alergie
- całkowite i swoiste IgE
- wykładniki nadreaktywnosci mastocytow
Slajd 37
Skierowanie na badania immunologiczne