Diagnostyka molekularna
 Średni udział czynników genetycznych
w osobowości ocenia się na 40 proc.
Jednak niektóre cechy znacznie bardziej
zależą od genów  np. coś takiego jak
skłonność do ryzyka, którą
psychologowie nazywają poszukiwaniem
doznań. Ono w 65 proc. jest
uwarunkowane genetycznie.
prof. Włodzimierz Oniszczenko
Wydział Psychologii Uniwersytetu Warszawskiego
Polityka - nr 10 (2695) z dnia 2009-03-07; Polityka. Pomocnik psychologiczny. Wydanie 10 ; s. 24-26
Polimorfizmy pojedynczego nukleotydu
SNP
1.2%, które czyni człowieka i 0.1%, które czyni różnicę
(ang. single nucleotide polymorphism)
" 3 miliony SNP odróżnia dwie osoby, SNP co
1.2%
0.1%
1200 pz
" przypuszcza się, że w genomie człowieka jest
10 000 000 SNP, w 2005 roku w publicznych
bazach danych było ich 9 000 000.
" 75% - obszary międzygenowe, 24% - introny,
1% - eksony
" y
ródła SNP  delecje, insercje, duplikacje,
substytucje
Polimorfizmy genów kodujących enzymy oksydacji
leków - Cytochrom P-450
" ostateczne unieczynnienie leku
" w ponad 95% z udziałem cytochromu P-450
Produkty są hydrofilne, co ułatwia ich usuwanie z organizmu
- Najwięcej jest go w wątrobie i rdzeniu nadnerczy
- Wiele izoenzymów
 oksydacja leków nasercowych, psychotropowych, pochodnych
morfiny
- Bierze udział w metabolizmie amfetaminy (oksydacyjna
deaminacja) oraz detoksykacji alkoholowej (obok dehydrogenazy
alkoholowej)
- liczba alleli  80, część alleli powiązano z tempem metabolizmu
poszczególnych leków
- Aktywność można oceniać przez genotypowanie lub
fenotypowanie
1
 przeciętnie metabolizujący
Zastosowanie metod biologii molekularnej:
" Lek metabolizowany zgodnie z
oczekiwaniami
" diagnostyka chorób genetycznych
" poszukiwanie mutacji/polimorfizmów
 wolno metabolizujący
" Prowadzi do gromadzenia się leku w " porównanie ekspresji genów
organizmie, często powyżej zakresu
" genetyczny odcisk palca (np. ustalanie ojcostwa)
terapeutycznego
" Gen posiada mutacje zmniejszające " klonowanie genów
aktywność przynajmniej jednej kopii
" mutageneza
genu
" analiza kopalnego DNA
" &
 szybko metabolizujący
" Nie osiągają stężeń terapeutycznych,
za to produkt metabolizmu leku może
być toksyczny dla organizmu
PCR  Polymerase Chain Reaction
TESTY DIAGNOSTYCZNE
A
ańcuchowa reakcja polimerazy
różnicujące: dystrofia mięśniowa a niektóre
zaburzenia neurologiczne, pląsawica Huntingtona a
niektóre zaburzenia neurologiczne;
poszukiwanie nosicieli w rodzinie (np. CF);
poszukiwanie nosicieli w populacji (diagnostyka
przesiewowa);
testy prenatalne;
diagnoza przed wystąpieniem symptomów
choroby (pląsawica Huntingtona, choroba Alzheimer a,
dziedziczny rak piersi, rodzinna polipowatość jelit)
1983r- dr Kary Banks Mullis wynalazł
YELLOWSTONE NATIONAL
technikę PCR
1993 r - Nagroda Nobla w dziedzinie
PARK
chemii za opracowanie metody PCR
Pierwsza termostabilna polimerazaz
" Thermus aquaticus
(szczep YT-1)
wyizolowana przez
Brockai wsp. w
1967r., a
zastosowana po raz
pierwszy przez Saikii
wsp. w 1988 r.
2
POLIMERAZA Taq
POLIMERAZA Taq
Składniki mieszaniny reakcyjnej
" Matryce
Matrycą może być nawet jedna cząsteczka DNA
(jedno-lub dwuniciowy)
" Startery (forward primer,reverse primer)
Specyficzne Fragmenty oligonukleotydowe, o długości
17-25 nukleotydów lub dłuższe.
Polimerazy
Początkowo polimeraza była dodawana na początku
każdego cyklu reakcji polimeryzacji in vitro;
obecnie dostępne enzymy różnią się
powinowactwem, wydajnością oraz zdolnością do
syntezy dużych fragmentów DNA Rutynowo
stosowana jest polimeraza Taq
Thermus aquaticus
Elektroforeza Żelowa
Składniki mieszaniny reakcyjnej
" Mieszanina dNTP dATP, dTTP, dGTP,
dCTP"
Równomolarne ilości trójfosforanów
nukleozydów
Bufory oraz jony Mg2+
Siła jonowa buforu (głównie stężenie jonów K+)
oraz stężenie jonów Mg2+ kontrolują głównie
specyficzność przyłączania starterów pH
buforu 8,3-8,8
Elektroforeza kapilarna
Przekrój poprzeczny kapilary ze stopionej krzemionki.
Schemat aparatury do elektroforezy kapilarnej.
Kolejność w jakiej rozdzielane cząsteczki poruszają się w kierunku katody.
znik.wbc.lublin.pl/ChemFan/Badania/ce.html
Komercyjny aparat do CE - Waters Capillary Ion Analyzer.
3
Enzymy restrykcyjne
restryktazy
Sekwencja cięta
Enzym mikroorganizm przez enzym*
5' -->3'
Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C
Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T
Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C
Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G
Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C
Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C
tępe końce
lepkie końce
RFLP  polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
Test metylacji
Test metylacji
Izolacja DNA
M P
Wynik prawidłowy:
1 2 3 K 1 2 3 K dla starterów ojcowskich
obecny produkt 100pz, dla
Modyfikacja DNA
starterów matczynych obecny
produkt 174 pz.
Obecny tylko produkt
PCR z użyciem
matczyny: Zespół Pradera-
starterów
Willi ego
specyficznych dla
Obecny tylko produkt
sekwencji
ojcowski: Zespół Angelman a
metylowanej i
niemetylowanej
Intergen CpGenome Modification kit & CpG Wiz Amplification kit
Intergen CpGenome Modification kit & CpG Wiz Amplification kit
4
VNTR  różna ilość powtórzeń tandemowych
STR - short tandem repeats
P
" VNTR (variable number of tandem repeats);
" krótkie, identyczne segmenty DNA połączone  głowa-
M
ogon powtarzalne w ludzkim genomie;
" liczba i locus powtórzeń różne u różnych osób;
" pojedyncze locus lub liczne loci;
" typowanie nosicieli w rodzinie.
1-2 loci 10-30 loci
Test na ojcostwo
Uzasadnienie Sądu
Najwyższego do wyroku z 2001
roku:
 Wynik badania DNA
przeprowadzony przez uznaną
placówkę naukową wyposażoną
w nowoczesną aparaturę i
opracowany, tzn. wyrażający w
liczbach zarówno szansę, jak i
prawdopodobieństwo ojcostwa
pozwanego, odzwierciedla w
sposób praktycznie pewny (co
najmniej w tysięcznych
częściach procentu)
rzeczywiste związki biologiczne
między parą rodzicielską a
dzeckiem.
1  pozwany, 2  dziecko, 3  matka, 4  DNA pozwanego i dziecka
ASO  Allele specific oligonucleotide hybridization ASO  Allele specific oligonucleotide hybridization
http://www.mun.ca/biology/scarr/ASO_test_for_CF.htm
5
SSCP  single strand conformation polymorphism
InnoLipa CF
firmy Innogenetics
APC Point Mutation.
Wild type DNA was amplified with HEX labeled primers
(shown in black) and run in each lane as a contol. Normal,
heterozygous mutant and homozygous mutant samples are
amplified with TET labeled forward primer (green) and FAM
labeled reverse primer (blue). MDE 0.5X with 10% glycerol
gel run 7 hrs. @10W. Under these conditions only the
forward strand was informative.
DGGE  Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
Elektroforeza w gradiencie denaturującym Southern blotting
izolacja DNA
elektroforeza DNA na żelu poliakrylamidowym  rozdział co do wielkości
transfer na membranę nitrocelulozową
GC-clamp
hybrydyzacja z radioaktywną sondą DNA (32P)
sekwencje
bogate w
Northern Blotting
pary GC
izolacja RNA
elektroforeza DNA na żelu poliakrylamidowym  rozdział co do wielkości
transfer na membranę nitrocelulozową
hybrydyzacja z radioaktywną sondą DNA lub RNA (32P)
Western Blotting
izolacja białka (wstępna)
elektroforeza na żelu poliakrylamidowym  rozdział co do wielkości
DNA posiada strukturę III-rzędową
transfer na membranę nitrocelulozową
W miarę migrowania w żelu i przechodzenia w obszary o
hybrydyzacja ze znakowanym przeciwciałem
większym stężeniu czynnika denaturującego DNA rozplata się
zależnie od sekwencji nukleotydów
Western blotting SNP s snips AAGGCTAA to ATGGCTAA.
DNA sequence variations that occur when a single
nucleotide (A, T, C, or G) in the genome sequence
is altered. Each individual has many single
nucleotide polymorphisms that together create a
unique DNA pattern for that person. SNPs promise
to significantly advance our ability to understand
" RFLP
Band pattern Interpretation
and treat human disease.
1.Lane 1, HIV+ serum (positive control)
" SNaPshot
2.Lane 2, HIV- serum (negative control)
" microarray
3.Lane A, Patient A
4.Lane B, Patient B
5.Lane C, Patient C
Bands at either p31 OR p24
AND bands present at either
gp160 OR gp120
6
sekwencjonowanie
Metoda dideoksy Sangera
Human Genome Project SNP Mapping Goals
W 1998 rozpoczęcie programu: identifikacja i
mapowanie SNPs.
Cele:
" Rozwój technologii umożliwiających szybkie
mapowanie SNPs.
" Identyfikacja podstawowych wariantów w najlepiej
poznanych genów.
" Stworzenie mapy SNP dla co najmniej 100.000
markerów.
" Pomoc dla naukowców prowadzących badania nad
zmiennością genów.
" Stworzenie publicznej bazy linii komórkowych i próbek
DNA.
SEKWENCJONOWANIE
SEKWENCJONOWANIE
MLPA
Multipleks Ligase-dependent Probe
Amplification
Amplifikacja sond zależna od ligacji
7
SEKWENCJONOWANIE
Zalety MLPA:
Wybrane kity MLPA
- niskie wymagania sprzętowe
P070 i P036B  zmiany w regionach subtelomerowych (jedna sonda na
- niski koszt oznaczenia
każdy region subtelomerowy)
- możliwość analizy 45 różnych sekwencji w jednej reakcji
- krótki czas analizy (2 dni)
P015 MECP2  zespół Retta
- metoda z zastosowaniem gotowych zestawów
- mała ilość DNA do analizy (20 -100ng)
P064 MR1  1p36, zespół Williamsa, Smitha-Magenisa, Millera-Diekera,
- jeden protokół dla różnych oznaczeń
DiGeorgea, Alagille a, Saethre-Chotzena, Sotosa
- wysoka specyficzność i powtarzalność
P069 MR2  Zespół Wolfa-Hirschhorna, Cri du Chat, WAGR, Langer-Giedon,
Wady MLPA:
Rubinstein-Taybi
- metoda porównawcza (pacjent/kontrola)
- możliwość analizy 45 różnych sekwencji w jednej reakcji
P106 MRX  wybrane geny zlokalizowane na chromosomie X związane z
- wynik wymaga potwierdzenia inną metodą upośledzeniem umysłowym (sondy dla 14 genów: FMR1, FMR2, ARX,
TM4SF2, RPS6KA3, OPHN1, GDI1, PQBP1, SLC6A8, FACL4, DCX, PAK3,
- metoda z zastosowaniem gotowych zestawów
ARHGEF6, IL1RAP1)
- rezultat zależny od jakości DNA
- research use only
P245-A1 - mikrodelecje: 1p36, 2p16, 3q29, 9q22.3, delecja 15q24,
- niemożliwa detekcja zmian zrównoważonych
mikrodelecja 17q21, zespoły: 22q13-Phelan McDermid, Cri-du-Chat  5p15,
DiGeorge -22q11, DiGeorge region 2-10p15, Langer-Giedon, Miller-Dieker,
Koszt: 100rx  880E (3000zł) + koszty rozdziału
Około 40zł/rx
NF1, Prader-Willi/Angelman, MECP2, Rubinstein-Taybi, Smith-Magenis,
Sotos, Wagr, Williams, Wolf-Hirschhorn
Wymagania sprzętowe: termocykler, sekwenator
14telomery
8000
7000
6000
5000
Serie1
4000
Serie2
3000
2000
1000
0
9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
1 0 1 3 3 4 5 5 6 7 7 8 9 0 1 1 2 3 4 5 6 6 7 8 9 9 0 1 2 3 3 4 5 6 6 7 8 9 9 0 1 2 3 4 4 5 6 7 7
. 5 5 0 6 3 0 8 5 2 9 6 3 0 0 9 7 5 4 3 0 7 4 1 0 6 5 4 3 2 9 6 3 0 8 4 4 2 9 7 5 4 3 1 7 5 3 0 5
3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 4 5 0 7 0 8 7 6 2 3 3 3 8 9 5 9 7 3 3 7 6 9 1 2 7 9 9 7 8 6 1 5 5 8 9 7 2 6 1 9 1 7 4 2 5 3 1 3
3 5 6 4 0 6 9 6 0 0 9 6 9 7 1 2 0 8 1 2 9 1 4 0 3 4 8 6 2 2 3 0 9 1 6 8 5 0 5 6 6 9 5 4 7 6 2 5
Chromosom 18 z sygnałem dla telomerów Xq
del 18qtel
18
del 22q13.2 - 2 markery
8
Mikromacierze:
" Całogenomowe
" kliniczne
" dla chromosomu/regionu
" ekspresyjne
Kariotyp molekularny
Mikromacierze genomowe
" ArrayCGH - CNV
" Mikromacierze SNP  CNV, UPD, LOH, SNP
dup 15qtel, del 3ptel
Agilent  Skaner do mikropłytek
drukarka
SCHOTT - Product Group Nexterion� -
Microarray Solutions
Stacja do mikromacierzy:
12 szkiełkowa stacja do hybrydyzacji 250 000 zł
Perkin-Elmer - skaner
Wash system 138 000 zł
Skaner 180 000 zł
9
Mikromacierze typu SNP w
technologii APEX
Centrum Badań DNA z Poznania jest
pierwszą instytucją w Polsce
oferującą komercyjne badania
diagnostyczne chorób i
predyspozycji genetycznych przy
wykorzystaniu mikromacierzy DNA.
W testach diagnostycznych
stosowane są mikromacierze typu
SNP w technologii APEX,
umożliwiające badanie setek
fragmentów DNA i występujących w
nich mutacji w jednym
eksperymencie.
Stacja do hybrydyzacji
ZASADY PORADNICTWA I
DIAGNOSTYKI GENETYCZNEJ.
1.Pełnoletność osoby skierowanej na badania
genetyczne
2.Kieruje lekarz każdej specjalności do Onkologicznych
Poradni Genetycznych.
3.Wyjaśnienie osobie badanej możliwości i ograniczeń badań
molekularnych przez onkologa-genetyka.
4.Pisemna zgoda na wykonanie badań molekularnych,
podanie danych o krewnych odnośnie wieku i lokalizacji
zachorowań na nowotwory.
5.Wypełnienie ankiety obejmującej informacje o wszystkich
krewnych pierwszego stopnia z umiejscowieniem i wiekiem
zachorowania na nowotwory złośliwe oraz umiejscowienie i
wiek zachorowania u krewnych II i ewentualnie dalszych
stopni.
6.Wykonanie analizy DNA z dwóch niezależnych pobrań
krwi.
Mikromacierze ekspresyjne
7.Specjalistyczna konsultacja onkologa- genetyka po
uzyskaniu wyniku badania genetycznego.
P.Leszczyński Wrocław 2011
10