Diagnostyka drobnoustrojów stosowanych w procesach biotechnologicznych i występujących w środowiskach naturalnych: metody klasyczne identyfikacji bakterii i drożdży (stosowane pożywki, wykonanie analiz, interpretacja wyników). Identyfikacja mikroorganizmów z wykorzystaniem testów API.

Bakterie:

1. Badanie cech hodowlanych i marfologicznych

1. posiew na pożywki płynne i obserwacja makroskopowych cech wzrostu (obecność osadu, zmętnienia, błonki na powierzchni). Stosowana pożywka to bulion , pozywka APL lub MRS

2. posiew na pożywki stałe (skos) i ocena makroskopowych cech wzrostu (zwrócić uwagę na zabarwienie biomasy)

3. z pożywek płynnych wykonać bezpośrednie preparaty mikroskopowe i ocenić kształt i ugrupowania komórek, zdolność ruchu i przetrwalnikowanie

4. po uzyskaniu wzrostu na pożywce stałej wykonać barwienie metodą Grama z 24 godzinnych hodowlach na skosach.

2. Badanie cech fizjologicznych bakterii

1. wykonanie testu na obecność katalazy-pobrać 1 ezę biomasy ze skosu na szkiełko podstawowe, a następnie dodać kilka kropli roztworu H₂O_2. Bakterie katalazododatnie rozkładają H₂O₂ do O₂ (wydzielają się pęcherzyki gazu), a bakterie katalazoujemne nie rozkładają H₂O₂.

2. Badanie metabolizmu glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych w pożywce Hugh-Leifsona (H-L).

Opaloną igłę preparacyjną zanurzyć w wymieszanej hodowli bakterii w pożywce płynnej, a następnie zaszczepić pożywkę H-L przez wkłucie igły do dna probówki (wysiew wykonać w 2 powtórzeniach). W celu stworzenia warunków beztlenowych jedna z zaszczepionych pożywek zalać warstwą parafiny. Wysiewy inkubować w 30C w czasie 24-48 godz.

Na podstawie obserwacji makroskopowych (zmiana zabarwienia pożywki z zielonej na żółtą, żółta barwa pojawia się na powierzchni pożywki, lub na dnie w zalezności od metabolizmu tlenowego drobnoustrojów.

• Utlenianie glukozy bez tworzenia kwasów- w warunkach tlenowych wzrost powierzchniowy, brak zmiany indykatora pH, w warunkach beztlenowych brak wzrostu

• Utlenianie glukozy z wytworzeniem kwasów- w warunkach tlenowych wzrost powierzchniowy, zakwaszenie (zmina barwy indyktora pH od powierzchni), w warunkach beztlenowych brak wzrostu

• Fermentacja glukozy- w warunkach tlenowych i beztlenowych wzrost wzdłuż linii ukłucia, zakwszenie (zmiana barwy indykatora pH wzdłuż linii ukłucia); nieraz obserwowane jest wydzielanie gazu.

• badanie uzdolnień biochemicznych bakterii z wykorzystaniem testów API.

Testy API nie zawierają informacji dotyczącej morfologii i wytwarzania przetrwalników. Testy te są przystosowane do celów klinicznych.

Przygotowanie komory inkubacyjnej i paska testowego:

• do zagłębień w podstawce komory inkubacyjnej wprowadzić pipetą 5 cm³ wody destylowanej

• zapisać symbol identyfikowanych bakterii na wydłużonej części podstawki

• wyjąć pasek testowy z opakowania, usunąć substancję osuszającą

• umieścić pasek testowy w komorze inkubacyjnej

• komorę inkubacyjną przykryć wieczkiem

Inokulacja mikroprobówek na pasku API:

• zdjąć wieczko komory inkubacyjnej

• mikroprobówki zaszczepić zawiesiną bakterii przy użyciu sterylnej pipety\

• podstawkę komory inkubacyjnej przykryć wieczkiem

• inkubować w warunkach podanych w instrukcji

Po inkubacji zdjąć plastikowe wieczko komory inkubacyjnej i odczytać wyniki reakcji biochemicznych w mikroprobówkach paska testowego (do niektórych mikroprobówek zgodnie z instrukcją należy dodać odpowiednie odczynniki). Posługując się tabelą odczytu zinterpretować uzyskane wyniki reakcjibiochemicznych (wynik dodatni/ujemny), a następnie zestawić je w karcie wyników. Zidentyfikować gatunek badanych bakterii korzystając z tabeli identyfikacyjnej, książki kodów dla stosowanego testu API lub programu komputerowego Apilab plus.

Drożdże:

1. Badanie cech hodowlanych i morfologicznych drożdży

1. opisać makroskopowe cechy wzrostu w płynnej pożywce YPG (osad, zmętnienie, błonka na powierzchni)

2. opisać makroskopowe cechy wzrostu na skosach z pożywką YPG (zwrócić uwagę na zabarwienie biomasy)

3. wykonać bezpośrednie preparaty mikroskopowe z hodowli w pożywce płynnej (odnotować kształt, ugrupowania komórek oraz sposób rozmnażania)

2. Badanie cech fizjologicznych drożdży

1. zarodnikowanie drożdży- z płynnej hodowli drożdży w pożywce presporulacyjnej (bardzo bogata w składniki odżywcze) pobrać 1 ezę, a następnie przenieść ją na pożywkę sporulacyjną octanową (pożywka uboga, skos). Inkubować w 25C w czasie 7 dni.

2. Fermentacja glukozy

Pobrac ze skosu niewielką ilość drożdży ze skosu (pożywka YPG), a następnie przenieść do 5 cm³ fizjologicznego roztworu soli. Tak przygotowaną zawiesina w ilości 0,1 cm³ zaszczepić wodę drożdżową z 2% dodakiem glukozy ( pożywce umieszczono rurki Durham, gaz w rurce świadczy o tym że drożdże fermentują glukozę). Próby inkubować w 30C w czasie 24-48 h.

3. asymilacja etanolu

przygotować zawiesinę drożdży w fizjologicznym roztworze soli (jak wyżej), a następnie zaszczepić pożywkę mineralną z 1% dodatkiem etanolu jako jedynym źródłem węgla. Równolegle tą samą ilością zawiesiny zaszczepić pożywke mineralną z 1% dodatkiem glukozy (próba kontrolna). Próby inkubować w temperaturze 30C, w czasie 24-48 godzin.

4. asymilacja KNO₃

Przygotować zawiesinę drożdży w fizjologicznym roztworze soli, a nastepnie zaszczepić pożywkę mineralną z 0,078% dodatkiem KNO₃ jako jedynym źródłem azotu. Równolegle tą samą ilością zawiesiny zaszczepić pożywkę mineralną z 0,1% dodatkiem (NH₄)₂SO₄ (próba kontrolna). Próby inkubowąć w 30 C w czasie 24-48godzin.

Ocena cech fizjologicznych drożdży:

• zarodnikowanie- wykonać bezpośredni preparat z hodowli drożdży na pożywce sporulacyjnej. Określić obecność lub brak zarodników.

• Fermentacja glukozy- odnotować obecność lub brak gazu w rurce Durham, o fermentacji glukozy świadczy obecność gazu w co najmniej 1/3 objetości rurki

• Asymilacja etanolu- odnotować występowanie lub brak wzrostu w pożywce mineralnej z etanolem (porównać z próbą kontrolną)

• Asymilacja KNO₃-odnotować występowanie/ brak wzrostu w pożywce mineralnej z KNO₃ (porównać z próbą kontrolną)

5. badanie uzdolnień asymilacyjnych drożdży z wykorzystaniem testu API 20 C AUX.

Przygotowanie zawiesiny drożdży:

• sterylną ezą pobrać biomasę drożdży ze skosu (pożywka YPG), a następnie przenieść do 5 cm³ jałowego fizjologicznego roztworu soli

• zawiesinę dokładnie wymieszać

• pobrać 100μl przygotowanej zawiesiny i wprowadzić do 7 cm³ medium C, a następnie dokładnie wymieszać

Przygotowanie komory inkubacyjnej i paska testowego:

• do zagłębień w podstawce komory inkubacyjnej wprowadzić pipetą 5 cm³ wody destylowanej

• wyjąć pasek testowy z opakowania, usunąć substancję osuszającą

• umieścić pasek testowy w komorze inkubacyjnej

• podstawkę komory inkubacyjnej przykryć wieczkiem

Inokulacja mikroprobówek na pasku API:

• zdjąć wieczko komory inkubacyjnej

• mikroprobówki sterylnie zaszczepić 100μl zawiesiny drożdży w medium C o objętości ok.100μl

• podstawkę komory inkubacyjnej przykryć wieczkiem

• inkubować w 30C, w czasie 48-72 godzin

Po inkubacji zdjąć plastikowe wieczko komory inkubacyjnej, a następnie ocenić wzrost drożdży w mikroprobówkach paska testowego. Próbą pozytywną (asymilacja badanego związku węgla) jest wyraźne zmętnienie w mikroprobówce w porównaniu z próbą kontrolną. Uzyskane wyniki zestawić w karcie wyników. Zidentyfikować gatunek badanych drożdży korzystając z tabeli identyfikacyjnej i programu komputerowego Apilab plus.

Wyniki:

BAKTERIE

B1- Lactobacillus lactis, ziarniaki, G+, katalazo (-), fermentują glukozę z wytworzeniem kwasu, względne beztlenowce

B2- Pseudomonas fluorescens, tlenowiec rośnie na powierzchni, utlenia glukozę z wytworzeniem kwasu, nie fermentuje glukozy, na skosie żółty pigment, który pod wpływem promieni UV swieci

B3- Bacillus , laseczki przetrwalnikujące, G+, tlenowce lub względne beztlenowce, utleniają glukozę z wytworzeniem kwasu, nie fermentują glukozy, katalazo (+)

B4- E. coli, pałeczki, G+, katalazo+, fermentują glukozę

DROŻDŻE

D1- Saccharomyces, rozmnażają się przez pączkowanie, zarodnikujące (zarodniki w workach), nie fermentują glukozy, asymilują etanol i KNO₃

D2- Schizosaccharomyces pombe, kształt cylindryczny, rozmnażają się przez podział, zarodnikują (zarodniki w workach)fermentują glukozę, nie asymilują etanolu, ale asymilują KNO₃

D3- Candida, rozmnażają się przez pączkowanie, nie zarodnikują, fermentują glukozę, asymilują etanol, ale nie asymilują KNO₃

D4-Rhodotorula, kształt owalne, rozmnażają się przez pączkowanie, nie zarodnikują, produkują różowy pigment, nie fermentują glukozy, asymilują etanol i KNO₃

---