Modyfikacje genetyczne bakterii

Michał Zdżalik

Laboratoryjne modyfikowanie mikroorganizmów przeprowadzane w celu wykreowania fenotypów przydatnych człowiekowi naśladuje naturalny proces ewolucji. Przebiega ono z uwzględnieniem dwóch kluczowych etapów - generacji nowych wariantów oraz selekcji. Wytworzone organizmy mają różnorakie wykorzystanie. Służą pomocą, jako narzędzie używane w pracach doświadczalnych, jak również niosą ratunek chorym, będąc źródłem biomolekuł, służących jako medykamenty. Zaprojektowanie wydajnego bioreaktora łączy się jednak nieodzownie z koniecznością pokonania szeregu problemów...

Naturalne różnicowanie

W przyrodzie występuje ogromna różnorodność organizmów. Niektóre są do siebie bardzo podobne, inne cechuje mniejsza liczba wspólnych cech, jeszcze inne różnią się od siebie w znacznym stopniu. Przykład mnogości grup mikroorganizmów ilustruje rycina 1.

• 
  Ryc. 1. Uniwersalne drzewo filogenetyczne utworzone na podstawie badań porównawczych sekwencji rybosomalnego RNA.

Spośród członków zamieszczonych na schemacie grup wskazać można tak znacząco różniącą się parę jak hipertermofilne Pyrolobus fumarii, zamieszkujące gorące podmorskie kominy termiczne i tolerujące temperaturę 113 C oraz psychrofilne Polaromonas vacuolata żyjące w lodzie morskim o temperaturze 0 C. Inny przykład to alkalofilne Natranobacterium gregoryi oraz kwasofilne Picrophilus oshimae. Optimum pH pierwszego z wymienionych gatunków to 10, drugiego zaś 0,7. Pomimo kontrastowych różnic wymienione jednostki pochodzą od wspólnych przodków. Osiągnięcie tak odmiennych cech możliwe było za sprawą ewolucji, która z kolei bazuje na naturalnej zmienności oraz selekcji. W przyrodzie proces tworzenia nowych organizmów zachodzi właśnie w ten sposób. Potrzebna jest spontaniczna generacja odmiennego wariantu, który później podlega drastycznej ocenie przez środowisko. Warianty gorsze skazane są na zagłądę, lepsze zaczynają dominować.

Modyfikacje laboratoryjne

Generowanie organizmów o nowych cechach

Naukowcy w laboratorium w celach badawczych naśladują naturalny proces różnicowania. Przebiega on z udziałem analogicznych jak w przypadku ewolucji etapów. W pierwszej kolejności konieczne jest wytworzenie nowego wariantu, organizmu o nowych cechach. Jednym ze sposobów jest mutageneza. Jej celem jest wywołanie błędów w uniwersalnej cząsteczce kodującej informacje, jaką jest DNA. Środki mutagenne podzielić można na dwie duże grupy. Są to mutageny chemiczne oraz fizyczne. W obrębie pierwszej grupy wyróżniamy podgrupy. Analogi zasad takie jak 5-bromouracyl, czy 2-aminopuryna tworzą pary komplementarne z naturalnie występującymi nukleotydami. Czynniki interkalujące, jak bromek etydyny zwiększają odległość między sąsiadującymi parami zasad w helisie DNA, co prowadzić może do mutacji typu mikroinsercji lub mikrodelecji. Istnieją czynniki powodujące modyfikacje cheminczne nukleotydów, takie jak alkilacja, czy deaminacja. Reaktywne formy tlenu, jak rodniki ponadtlenkowe, nadtlenek wodoru, oraz rodniki hydroksylowe powodują pęknięcia dwuniciowego DNA. Do mutagenów fizycznych zaliczamy na przykład promieniowanie jonizujące (X, gamma), które powoduje pęknięcia w obrębie nici kwasu deoksyrybonukleinowego oraz niszczenie cukrów i zasad. Działanie promieniowania ultrafioletowego, niejonizującego, również objawia się negatywnie. Pod jego wpływem powstają dimery tymidynowe oraz fotoprodukty. Czynnik fizyczny jakim jest ciepło także może doprowadzić do powstania mutacji. Podwyższona temperatura powoduje hydrolizę wiązań beta-N-glikozydowych, co generuje miejsca pozbawione zasad. Innym sposobem otrzymania zmienionych genetycznie organizmów, mniej przypadkowym, jest zastosowanie technik inżynierii genetycznej. Najnowsze osiągnięcia naukowe dostarczają bardzo wiele możliwości pozwalających na świadomą ingerencję w genom. Dla przykładu przy zastosowaniu reakcji PCR możliwe jest przeprowadzenie mutagenezy punktowej, gdzie miejsce mutacji jest ściśle określone.

Selekcja

Za pomocą wyżej wymienionych środków możliwe jest w laboratorium tworzenie nowych wariantów organizmów. Na etapie następującym po zadziałaniu mutagenem otrzymamy jednak bliżej nie scharakteryzowaną mieszaninę organizmów o różnych cechach. Tak jak i w naturze konieczne jest wplecenie drugiego z kluczowych elementów ewolucji - selekcji. W przypadku bakterii po zadziałaniu mutagenem lub ingerencji w genom przy użyciu technik inżynierii genetycznej komórki należy posiać na płytkę z pożywką. W celu wyodrębnienia oczekiwanego fenotypu przeprowadzić można screening. Pod uwagę brać należy cechy, którymi wyróżniać się miał kreowany mutant. Dla przykładu może to być szybkie tempo wzrostu, poziom wytwarzanego produktu, brak produktów ubocznych syntezy, czy auksotrofia. W przypadku planowej mutagenezy, na przykład na drodze klonowania, selekcja jest jeszcze prostsza. Wektor, który służy do wprowadzania genu do obcego organizmu posiada zwykle gen markerowy. Może to być gen oporności na dany antybiotyk. W takim przypadku pożywkę, na którą siejemy zmutowane komórki wzbogacamy w tenże antybiotyk. Bakterie, które nie przyjęły wektora nie są zdolne do wzrostu. Inny przykład systemu markerowego to alfa komplementacja. Komórki akceptorowe zawierają część genu lacZ, wektor drugą część. Jego produkt, beta-galaktozydaza, powstanie zatem tylko w bakteriach biorcach. Pożywka wzbogacana jest w X-Gal - substrat beta-galaktozydazy, dający barwny, niebieski produkt. Selekcja zachodzi na podstawie barwy kolonii. Jeszcze prostsza sytuacja jest w przypadku użycia popularnego w biologii molekularnej, fluoryzującego białka GFP. Chcąc wykryć kolonie, które produkują GFP należy jedynie wzbudzić fluorescencję światłem UV. Najbardziej skomplikowanym układem, pozwalającym jednak na bardzo szybką selekcję jest insercyjna inaktywacja. W tym przypadku wektor posiada gen oporności antybiotykwej oraz kompletny gen lacZ. W jego obrębie znajduje się polilinker, a więc obszar, w którym umieszczone jest wiele miejsc cięcia rozpoznawanych przez restryktazy. Klonowany gen umieszcza się zatem w obrębie genu lacZ. Efekt klonowania może być trojaki. Po pierwsze komórka akceptorowa może nie przyjąć wektora. Wówczas nie będzie ona w stanie przeżyć na pożywce zawierającej antybiotyk i X-Gal. Może się zdarzyć, że bakteria przyjmie wektor, który nie zawiera wstawki. Organizm taki zawierał będzie gen lacZ w formie nienaruszonej, czego konsekwencją będzie niebieskie zabarwienie kolonii. Ostatni wariant jest taki, że komórka przyjęła wektor ze wstawką. Wyrośnie ona na płytce, a fenotyp będzie identyczny z fenotypem formy dzikiej.

Bakterie jako żywe fabryki

Ingerencja w genom bakteryjny ma różnorakie cele. Przeważająca część eksperymentów posiada podłoże badawcze. Istotna grupa doświadczeń koncentruje się jednak na tworzeniu organizmów, które produkować będą konkretną substancję na użytek człowieka. Swoiste żywe fabryki niosą ratunek w szerokiej gamie przypadków. Wykorzystywać je można przy produkcji biomolekuł niemożliwych do zsyntezowania drogami chemicznymi, a służących jako lekarstwa w stanach chorobowych. Sztandarowym przykładem jest tu produkcja rekombinantowej insuliny z wykorzystaniem zmodyfikowanych genetycznie bakterii Escherichia coli. Mniej spektakularna, ale bardzo praktyczna, podnosząca wielokrotnie szybkość przebiegu doświadczeń rola rekombinantowych bakterii polega na użyciu ich jako producentów białek przeznaczonych do badań. Wielokrotnie standardowe metody oczyszczania protein z organizmów naturalnie je wytwarzających zawodzą chociażby ze względu na zbyt niskie stężenie białka w homogenacie tkankowym, czy pożywce hodowlanej w przypadku białek pozakomórkowych. W takiej sytuacji mniej trudu zajmie wklonowanie genu odpowiedzialnego za powstanie pożądanego białka do organizmu bakteryjnego i wzbudzenie ekspresji. Do produkcji używa się nie tylko organizmów rekombinantowych. Nie zapominajmy o szeregu bakterii, które w naturalny sposób syntezują przydatną człowiekowi substancję. Jako przykład podać można cała gamę antybiotyków otrzymywanych z naturalnych producentów, jakimi są bakterie.

Czynniki ograniczające produkcję

Przeprowadzenie doświadczenia prowadzącego do integracji genu jednego organizmu z genomem akceptora to jednak nie wszystko. Problemy pojawiają się na etapie wzbudzania ekspresji. Dotyczą one w głównej mierze produktu, gdyż organizm został tak dobrany, by nie stwarzać przeszkód. Również w przypadku gatunków naturalnie wytwarzających cenny dla człowieka związek pojawiają się problemy z otrzymywaniem go na dużą skalę. Tutaj kłopot dotyczy mechanizmów kontrolnych działających w samym organiźmie. Mogą one ograniczać produkcję, gdyż zapobiegają nadekspresji w warunkach naturalnych.

Czynniki związane z produktem

Po pierwsze może się zdarzyć, że przy pomocy bakterii, będących prokariontami, chcemy wyprodukować białko eukariotyczne. W tym przypadku ewentualne problemy mogą mieć podłoże w różnicach w ekspresji genów, jako że prokarionty i eukarionty to grupy bardzo odległe ewolucyjnie. Sytuację można próbować rozwiązać przez wklonowanie wstawki w region genu prokariotycznego umieszczonego w wektorze. Idea opiera się na tym, że transkrypcja zapoczątkowana zostanie w obrębie genu bakteryjnego i obejmie również gen wklonowany. Inny przypadek to Słaby wzrost komórek zawierających konstrukt. W takim wypadku pozostaje kompromis pomiędzy poziomem ekspresji a tempem wzrostu. Zastosować należy system ulegający represji. Ilość produkowanego białka zostanie obniżona, jednak pozwoli to na wydajny wzrost komórek i korzyść będzie płynęła z podwyższenia gęstości hodowli.

Czynniki związane z organizmem

W przypadku organizmów, które w naturalny sposób wytwarzają interesujący nas produkt problem może stanowić chęć produkcji na dużą skalę. Z reguły komórki syntezują substancje na poziomie wystarczającym do spełniania swojej roli i nie większym. Pragnąc podnieść poziom ekspresji, a co za tym idzie liczbę cząsteczek wytwarzanego związku warto podłączyć gen pod mocny promotor. Jeżeli taka operacja nie przyniesie korzyści, należy dopatrywać się przyczyn w systemach kontroli ekspresji, takich jak operony. System taki ma na celu takie pokierowanie metabolizmu komórki, aby ta efektywnie wykorzystywała surowce, ale jednocześnie nie nadprodukowała jakiejś substancji bez wyraźnej potrzeby. Przykładem może być operon tryptofanowy E. coli (Ryc. 2).

• 
  Ryc. 2. Operon tryptofanowy E. coli.

Zawiera on pięć genów (E,D,B,C,A). Kodują one enzymy, które używane są do syntezy tryptofanu. Mamy również do czynienia z cząsteczką represorową. Może ona istnieć w dwóch konformacjach. Jedna powoduje łączenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji, druga zaś konformacja nie łączy się z operatorem, co umożliwia skuteczną ekspresję genów E,D,B,C,A. W obecności tryptofanu cząsteczka ta wiąże się z nim. Przyjmuje wtedy strukturę pozwalającą na połączenie z DNA i blokuje transkrypcję. Dzięki temu w obecności aminokwasu w otoczeniu jest on pobierany, bez zbędnego wydatku energii na syntezę. Działania podjęte w przypadku negatywnego wpływu podobnego systemu kontrolnego na wydajność produkcji interesującego nas białka polegać muszą na przykład na wprowadzeniu mutacji w obręb genu kodującego represor. Kolejny mechanizm kontrolujący ilość syntezowanego białka, który może być przeszkodą przy produkcji z użyciem nie modyfikowanych bakterii to inhibicja allosteryczna w układzie sprzężenia zwrotnego ujemnego. Produkt pewnej reakcji leżącej na szlaku syntezy interesującego nas związku może być jednocześnie jej inhibitorem. W takim wypadku próby otrzymania odpowiednio zmodyfikowanego organizmu polegają na stosowaniu mutacji empirycznych, a następnie selekcji przy użyciu antymetabolitów. Są to analogi metabolitów, które przypominają je jedynie strukturalnie, nie pełniąc ich funkcji metabolicznych. selekcję przejdą jedynie szczepy zmodyfikowane w ten sposób, aby pomimo obecności w podłożu analoga inhibitora nadal syntezowały produkt. Problem mogą stanowić również odgałęzienia szlaku głównego syntezy. W takim wypadku część metabolitów pośrednich zużywana jest na boczną reakcję. Aby uporać się z problemem należy wyeliminować szlak poboczny. Można zastosować mutacje empiryczne i selekcje typu screening opierając się na auksotrofii oczekiwanego mutanta.

---