Sekcja 10

Aleksandra Gatlik, Jan Idzik

Data wykonania ćwiczenia: 06.10.2009

Grupa Aut2

SPRAWOZDANIE

Izolacja jąder komórkowych i ekstraktów jądrowych

CEL ĆWICZENIA

Praktyczne poznanie metody izolacji jąder komórkowych i ekstraktów jądrowych, przeprowadzenie procesu lizy komórek (w celu uzyskania ekstraktów pochodzących z cytoplazmy i jąder komórkowych).

Ekstrakty zostały wykorzystane do pomiaru absorpcji światła przy użyciu spektrofotometru oraz do obliczenia stężenia białek. Ćwiczenie miało na celu również zobrazowanie procesu lizy komórek oraz możliwość obserwacji własnych preparatów mikroskopowych wykonanych na bazie ekstraktów.

WSTĘP TEORETYCZNY

Komórki są podstawową formą organizacji organizmów. By móc wyizolować z nich jakiekolwiek substancje, np. białka, DNA lub poszczególne organelle komórkowe, należy je poddać procesowi lizy.

Lizą nazywamy naruszenie integralności błony komórkowej przez różne czynniki chemiczne (m.in. detergenty, rozpuszczalniki organiczne), fizyczne (np. różnica ciśnień) jak i mechaniczne (np. rozcieranie lub wytrząsanie z kulkami szklanymi). W wyniku tego procesu otrzymuje się protoplast, z którego można wyizolować interesujące nas substancje. Liza umożliwia także obserwacje mikroskopowe wyodrębnionych struktur komórkowych, po uprzednim ich wybarwieniu np. czynnikiem Bradforda.

Oznaczenie opiera się na wiązaniu barwnika Coomassie Brilliant Blue 250 do białek. Barwnik ten, zależnie od pH roztworu, występuje w trzech formach: kationowej (czerwonej), obojętnej (zielonej) i anionowej (niebieskiej).

W warunkach kwaśnych barwnik występuje w formie kationowej, podwójnie protonowanej (Amax = 470 nm). Po związaniu z białkiem (głównie z aminokwasami zasadowymi i aromatycznymi), przechodzi w stabilną formę niebieską (Amax = 595 nm). Dlatego też stężenie białka oznaczane jest przy długości fali 595 nm.

PRZEBIEG ĆWICZENIA I WYNIKI

Wszystkie poniższe czynności, zgodnie zaleceniem zawartym w instrukcji do ćwiczenia, zostały wykonane w lodzie

• Prowadzący przekazał sekcji hodowlę komórek raka jelita grubego. HTC-116

• Komórki zawieszono w 500 μl PBS 1x, otrzymując w sumie próbkę o objętości 582 μl

• Objętość komórek obliczono jako 82 μl

• Komórki zawieszone w PBS odwirowano (10 minut, 180-186xg (RCF))

• Z odwirowanej próbki ściągnięto warstwę znad osadu, tzw. supernatant

• Zmierzono objętość osadu- otrzymano wynik 82μl

• Osad zawieszono w 410μl buforu do izolacji EC

• Całość inkubowano, co pewien czas mieszając, przez 10 minut w lodzie

• Ponownie próbkę odwirowano (10minut, 300-321xg (RCF))

• Supernatant (ekstrakt cytoplazmatyczny) zebrano i wprowadzono do osobnej próbówki oznaczonej EC. Zmierzono ilość powstałego supernatatnu, która wyszła 420μ.Obliczono, że objętość pozostałego osadu wynosi 88μl

• Osad zawieszono w 264μl buforu niskosolnego (otrzymano próbkę 352 μl)

• Odpipetowano 10 μ roztworu do nowej probówki

• Do 342μl osadu zawieszonego w buforze wprowadzono 242 μl buforu wysokosolnego „high 0.8”,otrzymano 684μ roztworu

• Próbkę wytrząsano (w temperaturze 4⁰C) przez 30 minut

• Kolejne 30 minut próbkę poddawano wirowaniu

• Po sciągnięciu supernatantu(570μ), otrzymano objętość 114 μl ekstraktu jądrowego i przeniesiono go do nowej próbówki

• Następnie przygotowano 2 próby:

• Do próbówki wprowadzono 798μl wody destylowanej, 2μl ekstraktu cytoplazmatycznego i 200μl odczynnika Bradforda

• Do próbówki wprowadzono 798μl wody destylowanej, 2μl ekstraktu jądrowego i 200μl odczynnika Bradforda

• Próba 1( zawierająca ekstrakt cytoplazmatyczny) została wymieszana i odstawiona na 5 min, po czym była gotowa do oznaczenia stężenia białek w spektrofotometrze

• Próba 2( zawierająca ekstrakt jądrowy) została wymieszana i odstawiona na 5 min, po czym była gotowa do oznaczenia stężenia białek w spektrofotometrze

• W tym czasie przez inną sekcję została przygotowana próba ślepa (zawierająca jedynie wodę destylowaną i odczynnik Bradforda)

• Ślepą próbę wprowadzono do spektrofotometru (wykalibrowano go)

• Następnie do spektrofotometru wprowadzono próbę zawierającą ekstrakt cytoplazmatyczny .Otrzymano wynik:

• A₅₉₅= 0,757

• Następnie do spektrofotometru wprowadzono próbę zawierającą ekstrakt jądrowy .Otrzymano wynik:

• A_{595 =0,388}

• Obliczono stężenie białka na podstawie wzoru:

• C [μg/μl] = A₅₉₅ x b : c

Gdzie:

b- współczynnik wyznaczany z krzywej wzorcowej (16,2)

c- ilość białka pobranego do pomiaru (2 μl)

• Otrzymano Cc=6,131 [μg/μl] i Ce=3,14[μg/μl]

• Ekstrakt cytoplazmatyczny i jądrowy umieszczono, razem z innymi preparatami, w zamrażarce

• Całkowita ilość białka w ekstrakcie cytoplazmatycznym wyliczona ze wzoru: stężenie* objętość preparatu = 502,74μg

• Całkowita ilość białka w ekstrakcie jądrowym wyliczona ze wzoru: stężenie * objętość preparatu=257,48μg

Przygotowanie i obserwacja za pomocą mikroskopu preparatu 1 :

• Z próbki odpipetowano do osobnej próbówki 10μl

• Dodano równą objętość 0.4% fioletu krystalicznego do barwienia komórek

• Wprowadzono na szkiełko podstawowe i przykryto szkiełkiem nakrywkowym

• Pod mikroskopem prowadzono obserwację preparatu:

Na obrazie mikroskopowym pierwszego preparatu zaobserwowano fragmenty błon plazmatycznych, elementy komórek i wybarwione na fioletowo niebiesko jądra komórkowe

Przygotowanie i obserwacja za pomocą mikroskopu preparatu 2 :

• Z próbki odpipetowano do osobnej próbówki 10μl

• Dodano równą objętość 0.4% fioletu krystalicznego do barwienia komórek

• Wprowadzono na szkiełko podstawowe i przykryto szkiełkiem nakrywkowym

• Pod mikroskopem prowadzono obserwację preparatu:

Obraz mikroskopowy drugiego preparatu przedstawia wyizolowane jądra komórkowe, wybarwione na ciemnofioletowo i zawierające ciemniejsze ziarnistości (skondensowana chromatyna). W tym preparacie nie widać jednak już całych, a nawet uszkodzonych komórek. Pozostałe elementy składowe komórki znajdują się w ekstrakcie cytoplazmatycznym.

WNIOSKI

Przewidywana wydajność dla EC wynosi 100 µl - 2 000μg białka, a dla 0,4 M EJ wynosi 600μl. .Na nasze 82 µl - 1640 µg białka dla EC, a otrzymałyśmy go 502,74μg, czyli wydajność procesu 30,65%. Natomiast przewidywalna wydajność dla 0,4 M EJ powinna wyjść 492 μg, nasz wynik to 257,48μg. Stąd wydajność naszej pracy wyszła 52,3%, znacznie lepiej niż w przypadku z EC. Różnice między teoretyczną a praktyczną wydajnością mogą być spowodowane niedokładnymi pomiarami objętości poszczególnych komponentów; ciepło naszych dłoni spowodowało, że mogły zacząć działać enzymy proteolityczne.

---