18.10.2011

Ćwiczenie 1

Żelazo

Wśród pierwiastków śladowych żelazo jest pierwiastkiem o największym stężeniu.

Występuje we wszystkich komórkach organizmu. Występuje w wielu enzymach oraz kofaktorach cyklu Krebsa. Wchodzi w skład białek hemowych:

• hemoglobina

• mioglobina

• cytochromy

• flawoproteiny.

Dzienne zapotrzebowanie na żelazo:

• kobiety - 2-3 mg

• mężczyźni - 1,5-2 mg

• kobiety ciężarne - 2,5-3 mg

• kobiety karmiące - do 3,5 mg

• dzieci i młodzież w okresie wzrostu do 2,5 mg.

W surowicy żelazo występuje tylko w postaci związanej z białkiem apotransferryną posiadającą dwa miejsca wiążące dla jonów Fe³⁺. Kompleks apotransferryna-Fe(III) to transferryna - nośnik żelaza we krwi. Transferryna jest ujemnym białkiem ostrej fazy, w warunkach prawidłowych jest wysycona żelazem w 20-45%, a w nadmiarze żelaza - 90%.

Żelazo wchłania się najlepiej z dwunastnicy. Stężenie żelaza ulega wahaniom dobowym i z dnia na dzień. Maksymalne stężenie żelaza występuje rano (ok. 20% wyższe niż wieczorem), minimalne wieczorem. Różnice z dnia na dzień to ok. 50%. Z tygodnia na tydzień 20-100% różnicy.

Wiek Żelazo w μg/dl

15-30 dni 170

2-3 miesiące 142

4-6 miesiące 113

7 miesięcy - 3 lata 78

4-15 lat 93

Dorośli 70-180

Zasoby żelaza w ustroju to ok. 3-5 g. Zawsze w połączeniu z białkiem.

• Białka czynnościowe:

• hemoglobina 2,5 g

• mioglobina 130 mg

• enzymy (żelazo tkankowe) 8 mg

• Białka transportowe:

• transferryna 4 mg.

• Białka magazynujące (0,8-1 g):

• ferrytyna - szybkie wiązanie i uwalnianie (najwięcej w wątrobie, śledzionie, szpiku i błonach śluzowych jelita)

• hemosyderyna - żelazo uwalnia bardzo wolno - agregaty częściowo zdeproteinizowanej ferrytyny.

Ferrytyna- żelazo występuje w postaci zredukowanych jonów Fe³⁺

Hemosyderyna- w komórkach wątroby, śledziony, szpiku. Jest połączeniem częściowo pozbawionej białka ferrytyny i wodoru od niej nie raz w wodzie.

Straty żelaza Miejsce mg/dobę

z przewodu pokarmowego: ze stolcem 0,4

z żółcią 0,24

ze złuszczającymi się komórkami błony śluzowej przewodu pokarmowego 0,1

z moczem 0,1

z potem, z komórkami błon śluzowych i skóry 1-2,3

z krwią miesiączkową 30-70 mg w czasie każdej miesiączki

1. Przyczyny niedoboru żelaza Niedostateczna podaż Zwiększone zapotrzebowanie Zwiększona utrata krwi

• Niewłaściwe odżywianie

• nadmiar fosforanów

• brak mięsa, wegetarianizm

• odżywianie się głównie mlekiem

• Zaburzenia wchłaniania

• resekcja żołądka, jelita cienkiego

• przedłużająca się biegunka

• choroby zapalne jelit

• zwiększone zapotrzebowanie

a) zespoły złego wchłaniania

b) okres wzrostu, niemowlęctwo, wiek szkolny, dojrzewanie

c) utrata żelaza w hemoglobinurii

d) ciąża, zwłaszcza liczne

• zwiększona utrata krwi

• intensywne treningi

• długotrwałe krwawienia z nosa, krwioplucie

• krwawienie z żylaków, żylaków odbytu, uchyłków przełyku

• nadmierne miesiączki

• krwawienia z dróg rodnych u kobiet

Niedobór żelaza

• Zmiany biochemiczne

Objawy

• anemia niedobarwliwa mikrocytowa

• niskie stężenie hemoglobiny i mioglobiny

• niskie stężenie cytochromów

• spadek glikolizy tlenowej

• upośledzenie odnowy nabłonkówniepokój, ogólne osłabienie i zmęczenie

• zwiększona drażliwość

• zachcianki w ciąży

• apetyt na zimne potrawy

• zaburzenia połykania

• zajady

• pieczenie języka i błon śluzowych jelita cienkiego

• zaburzenia funkcji leukocytów

• spadek odpowiedzi komórkowej

• bóle i zawroty głowy

• zaburzenia pamięci

• upośledzenie funkcji mózgu

• zaburzenia funkcji poznawczych

Kryteria rozpoznawania niedoboru żelaza

Populacja pacjentów Stężenie hemoglobiny

Mężczyźni <130 g/l13 g/dl

Kobiety <120 g/l12 g/dl

Kobiety ciężarne <110 g/l11 g/dl

Dzieci do 6 roku życia <110 g/l11 g/dl

Dzieci między 6-14 rokiem życia <120 g/l12 g/dlMCV < 60 μm³ (spadek objętości krwinek - mikrocytoza) oraz spadek MCHC (średnie stężenie hemoglobiny w krwince) sugeruje niedobór żelaza.

Anizocytoza RDW > 15% - niedobór żelaza.

Spadek stężenia ferrytyny oznaczana w erytrocytach może, ale nie musi świadczyć o zubożeniu zapasów żelaza.

Niedobór żelaza Erytropoeza Manifestacje kliniczne

Utajony Stopień I niskie zapasy żelaza w ustroju, brak zaburzeń erytropoezy

brak

Stopień II bardzo niskie zapasy, początek zaburzeń erytropoezy, wzrost RDW

brak lub nieznaczne

Jawny Stopień III erytropoeza w warunkach braku żelaza w komórkach, spadek hemoglobiny, MCV, wzrost anizocytozy niedokrwistość

Stężenie żelaza w surowicy

Jako samodzielny wskaźnik jest mało wiarygodnym testem. Tylko wartości skrajnie niskie <25 μg/dl mogą sugerować niedobór niedobór żelaza.

Metody oznaczania

Stężenie żelaza w surowicy lub osoczu heparynowym oznacza się głównie metodami kolorymetrycznymi.

Zasada

W środowisku kwaśnym Fe³⁺ uwalniane z połączenia z transferryną są redukowane do Fe²⁺, które w połączeniu z chromogenem (ferrozyna, batofenantralina, feren S) tworzą barwny kompleks. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia żelaza.

Metody kolorymetryczne zalecane przez:

ICSH (International Committee for Standarization in Haematology)

MKSH (Międzynarodowy Komitet Standaryzacji w Hematologii)

NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)

SAA - spektrofotometria atomowo-absorpcyjna jest niezalecana.

Metoda MKSH (ICSH)Metoda RamsayaMetoda bezpośrednia

Zasada: odbiałczanie surowicy, redukcja Fe3+ do Fe2+ i połączenie z dwupirydylemodbiałczanie surowicy, redukcja Fe3+ do Fe2+ i połączenie z batofenantroliną - zachodzą jednocześniedodanie chromogenu ze związkiem redukującym żelazo w surowicy, nie wymaga odbiałczania

Dokładność i powtarzalność zależą od:

• sposobu odbiałczania

• rodzaju i czułości chromogenu

• pH próbki

• czystości szkła, wody i odczynników

• sposobu pobierania i przechowywania krwi

• hemolizy próbki.

TIBC (Total Iron Binding Capacity) - CZWŻ (Całkowita Zdolność Wiązania Żelaza)

Oznaczanie całkowitej ilości żelaza, która jest związana z transferryną, po jej wcześniejszym wysyceniu. TIBC odzwierciedla poziom transferryny w surowicy. Dla oznaczenia TIBC lub utajonej IBC do próbki dodaje się Fe³⁺ w nadmiarze, w celu wysycenia transferryny, następnie usuwa się niezwiązane jony (przez adsorpcje na MgCO₃) i oznacza się żelazo. Intensywność zabarwienia powstałego kompleksu jest proporcjonalna do zawartości jonów żelazowych w badanej próbie.

Norma 250-400 μg/dl

TIBC jest wyższa w stanach rzeczywistego niedoboru żelaza.

Z uwagi na różne metody badania i czynniki (zapalenia, zakażenia, choroby wątroby i nerek) - test mało wiarygodny przy samodzielnym stosowaniu (oznaczenie metodą biochemiczną CCV bliski 30%).

Do badania pobiera się krew do probówki na skrzep.

UZWŻ - utajona zdolność wiązania żelaza

Oznaczona ilość żelaza, które może związać się z transferryną.

Najlepsza metoda oznaczania:

Oznaczanie izotopowe, do którego używa się żelaza radioaktywnego (⁵⁹Fe), ocenia się ilość żelaza znakowanego, które uległo związaniu, poprzez pomiar radioaktywności w liczniku γ-scyntylacyjnym.

Zmiany w stężeniu żelaza w surowicy i TIBC

Rodzaj zmiany Najczęstsze przyczyny spadek żelaza

spadek TIBC przewlekłe choroby infekcyjne, marskość wątroby, RZS, guzy nowotworowe niekrwotoczne, anemia spadek żelaza

wzrost TIBC anemia z niedoboru żelaza, trzeci trymestr ciąży, okres karmienia piersią wzrost żelaza

wzrost TIBC zażywanie estrogenów, ostre zapalenie wątroby, podawanie soli żelaza

Stężenie transferryny (Tf) w surowicy

Norma

Noworodki: 130-270 mg/dl

Dorośli: 200-400 mg/dl

Zasada metody

• najczęściej jest metoda immunoturbidymetryczna

• transferryna obecna w materiale tworzy kompleksy immunologiczne z przeciwciałami przeciw transferrynie

• powstające kompleksy antygen-przeciwciało wywołują zmętnienie, które proporcjonalnie do stężenia transferryny jest mierzone turbidymetrycznie

• wyliczanie: Tf(mg/dl)=0,7?TIBC (μg/dl)

• wartości wyliczone mogą być o 16% wyższe, ponieważ nie uwzględniają faktu, że gdy transferryna jest w połowie wysycona, pewna część żelaza wiąże się z innymi białkami, głównie albuminami.

Podwyższone stężenie transferryny

• niedobór żelaza

• w ciąży i terapii estrogenowej

Obniżone stężenie transferryny

• przeładowanie ustroju żelazem

• niedożywienie - monitorowanie terapii żywieniowej

• stany ostrej fazy

Stopień wysycenia transferryny

Jest miarą zawartości żelaza w transferrynie krążącej:

• wartości <20% (lub nawet <16%) - wskazują na niewystarczające dostarczanie żelaza do szpiku kostnego i erytropoezę przy niedoborze żelaza, a <10% jako pewny dowód niedoboru żelaza

• wysycenie transferryny jest stosunkowo czułym (90%), lecz mało swoistym (może być zredukowane w wielu innych chorobach) wskaźnikiem wykrywania niedoboru żelaza

• wskaźnik wysycenia transferryny wynosi prawidłowo 20-45%, średnio ok. 30%.

Stężenie ferrytyny w surowicy

• ferrytyna - białko składające się z 24 podjednostek

• w jednostce może być zmagazynowane aż 4000 cząsteczek żelaza

• stężenie we krwi 100 μg/l odpowiada ok. 1 g żelaza

• jest swoistym markerem dla żelaza zmagazynowanego w układzie siateczkowo-śródbłonowym

• spadek stężenia ferrytyny we krwi <15 μg/l lub 15 ng/ml (w innych źródeł <10-12 μg/l) jest najlepszym wskaźnikiem bezwzględnego niedoboru żelaza w ustroju (o ile nie istnieje niedobór witaminy C, niedoczynność tarczycy)

• oznaczane metodą ELISA

Norma

Mężczyźni 30-300 μg/l

Kobiety 30-100 μg/l

• ferrytyna jest białkiem ostrej fazy

• wzrost stężenia ferrytyny występuje u pacjentów z chorobami wątroby, w przebiegu zakażeń, RZS, zespołach mielodysplastycznych, w trakcie leczenia żelazem oraz w stanach przeładowania organizmu żelazem (hemosyderoza - nagromadzenie się konglomeratów białka i żelaza, hemochromatoza - nadmierne gromadzenie żelaza w organizmie).

Stężenie komórkowych rozpuszczalnych receptorów transferryny w surowicy - sTfR

• błony komórkowe prekursorów erytrocytów (erytroblastów) w szpiku są bogate w receptory wiążące kompleksy transferryna - żelazo

• stężenie wolnych receptorów w surowicy jest wysokie we wczesnym okresie niedoboru żelaza

• wraz ze wskaźnikami żelaza zapasowego może być wiarygodnym testem oceniającym niedobór żelaza

<100 prawidłowy zapas żelaza

~500 wyczerpania magazynów żelaza

>2000 zaburzenie puli czynnościowej

• oznaczanie sTfR pozwala na rozróżnienie niedokrwistości z niedoboru żelaza (? sTfR) od niedokrwistości chorób przewlekłych (? sTfR)

• wzrost sTfR w przypadku niedokrwistości, której przyczyną jest choroba przewlekła, sugeruje równoczesne wystąpienie niedoboru żelaza

• w przeciwieństwie do stężenia transferryny, sTfR nie jest białkiem ostrej fazy i jest wiarygodny w diagnostyce u pacjentów z chorobami przewlekłymi i infekcjami

• nie wzrasta w infekcjach, zapaleniach i przewlekłych chorobach wątroby

• wzrost sTfR u sportowców i kobiet w ciąży sugeruje występowanie znacznego niedoboru żelaza.

Średnia zawartość hemoglobiny w retykulocytach (CHr)

• najnowszy marker anemii z niedoboru żelaza w rutynowym oznaczaniu retykulocytów

• szybki i wiarygodny test wykrywający niedobory żelaza związane ze zbyt małą podażą żelaza do retykulocytów

• CHr - idealny marker do wstępnej oceny stanu pacjenta i późniejszego monitorowania leczenia preparatami żelaza i EPO

• wartości prawidłowe > 26 pg (wg innych źródeł >29 pg)

• wartości CHr < 26 pg są pierwszym wskaźnikiem czynnościowego niedoboru żelaza i pozwalają wykryć go już w pierwszych dniach od jego wystąpienia

• wartość CHr jest niezależna od zawartości wody w retikulocytach ani reakcji ostrej fazy

• obok sTfR najczulszy wskaźnik niedoboru żelaza u pacjentów dializowanych (czułość bliska 100%)

• szczególnie zalecany do diagnostyki niedoboru żelaza u pacjentów hematologicznych, onkologicznych, nefrologicznych i pediatrycznych

• badanie dostępne jest rutynowo w analizatorach hematologicznych najnowszej generacji i wykonywane z tej samej próbki co morfologia krwi.

Glikohemoglobina

Wartość HbA1c jest zwiększona w niedokrwistości z niedoboru żelaza, a zmniejszona w hemolitycznej. U pacjentów z cukrzycą przed wykorzystaniem wartości HbA1c do diagnozowania cukrzycy, należy wyleczyć niedokrwistość z niedoboru żelaza.

Badanie Opis stężenie żelaza w surowicy lub osoczu

duża zmienność biologiczna, problemy metodyczne, wpływ reakcji ostrej fazy

TIBC/UIBC problemy metodyczne

stężenie transferryny oznaczanie wystandaryzowane, wpływ reakcji ostrej fazy i niedożywienia, nieswoisty wzrost stężenia w ciąży

wysycenie transferryny<16% przemawia za niedoborem żelaza

stężenie ferrytyny<15 μg/l przemawia za niedoborem żelaza, wybitny ostrej fazy

sTfR wzrost stężenia jest wiarygodnym wskaźnikiem niedoboru żelaza oraz aktywności erytropoetycznej szpiku, niezależne od ostrej fazy, przydatny w ocenie odpowiedzi na leczenie

zawartość hemoglobiny w retikulocytach nowy parametr, wskaźnik niedoboru żelaza i aktywności erytropoetycznej szpiku, niezależny od ostrej fazy, przydatny do szybkiej oceny odpowiedzi na leczenie

8

---