23.10.2011

Wykład 4

Niskocząsteczkowe związki azotowe

Azot pozabiałkowy osocza

• azot mocznika 7,1 mmol/l (45%)

• azot resztkowy (7,1 mmol/l)

• azot aminokwasów 3,6 mmol/l (20%)

• azot kwasu moczowego 0,71 mmol/l (20%)

• azot kreatyniny 0,36 mmol/l (5%)

• azot kreatyny 0,14 mmol/l (2%)

• NH₃ 0,07 mmol/l (0,2%)

• azot fenoli, bilirubiny.

Azot pozabiałkowy stanowi 1% azotu całkowitego.

Azot pozabiałkowy moczu

• azot mocznika 0,92 mmol/24h

• azot resztkowy 0,21 mmol/24h

• azot kwasu moczowego 14 mmol/24h

• azot kreatyniny 40 mmol/24h

• NH₃ 36 mmol/24h

• azot kwasu hipurowego 7 mmol/24h

Azot pozabiałkowy stanowi 16% azotu pozabiałkowego.

Stan metabolizmu azotowego

• bilans azotowy - różnica pomiędzy całkowitym spożytym azotem a całkowitym wydalonym azotem

• dodatni bilans azotowy - stan, w którym więcej spożywamy niż wydalamy - dziecko rosnące, ciąża

• w równowadze - tyle samo - człowiek dorosły

• ujemny bilans azotowy - stan, w którym więcej wydalamy niż spożywamy - stany pooperacyjne, rozsiany proces nowotworowy, niedostateczna podaż w diecie.

Metoda Kigdalha (PN-A-04018:1975/AZ3:2002)

• referencyjna metoda oznaczania białka

• wstępny etap odbiałczania - sodu wolframian w środowisku kwaśnym (wyniki zaniżone), TCA, (kwas trichlorooctowy), denaturacja alkoholowa

• etap mineralizacji - analizowaną próbkę mineralizuje się w stężonym kwasie siarkowym z dodatkiem selenu jako katalizatora, H₂O₂ jako utleniacza (C→CO₂) i siarczanu potasu służącego do wzrostu temperatury wrzenia kwasu siarkowego

• azot →kwaśny siarczan amonu

• oznaczenie NH₃

• metoda Nesslera - fotometryczna

• zawarty w roztworze kwaśnym NH­₃ utleniany zasadą i oznaczany kalorymetrycznie w środowisku odczynnika Nesslera (powstaje jodek aminooksortęciowy)

• 2K₂(HgI₄) + 3KOH + NH₄OH → OHg₂NH₂I (jodek amidooksortęciowy) + 7KI + 3H₂O

• reakcja Berthelota

• w mieszaninie destylacyjnej, dochodzi do reakcji z podchlorynem i wytwarzanie cholramaminy, z której po rekcji z fenolami powstaje indol, zmieniając barwę roztworu z błękitnego w żółty

• NH₃ + podchloryn → chloramina

• chloramina (kolor błękitny) + fenol → indofenol (kolor żółty)

• 2NH₃ + 2NaClO → 2NH₂Cl + NaOH

+ fenol → indofenol + H₂O

Aminokwasy

20-25% azotu pozabiałkowego ulega dezaminacji w wątrobie, grupa aminowa stanowi substrat do syntezy mocznika.

Oznaczanie aminokwasów:

• chromatografia cienkowarstwowa

• elektroforeza wysokonapięciowa

• HPLC

• zautomatyzowane metody immunochemiczne.

Swoiste oznaczanie aminokwasów najbardziej przydatne w rozpoznawaniu bloków metabolicznych.

Fenyloketonuria

Konkurencja o układ transportujący tryptofan z przewodu pokarmowego

• niedobór tryptofanu, upośledzenie wytwarzania serotoniny

• wtórne zaburzenie syntezy melaniny

• zaburzenia rozwoju psychoruchowego, upośledzenie umysłowe, napady drgawek, wzmożone napięcie mięśniowe

Test przesiewowy

• dodanie kilku kropli 10% roztworu chlorku żelaza - zmiana barwy moczu na kolor zielono-błękitny świadczy o obecności fenylopirogronianu

Mikrobiologiczny test inhibicji Guthriego

• posiew B.subtilis na podłożu z inhibitorem: β-2-tioenyloalaniną

• umieszczenie na płytce krążka nasyconego krwią noworodka

• szerokość strefy wzrostu wokół krążka jest zmianą stężenia fenyloalaniny

Wartości referencyjne: od 5 dnia życia = 3 mg/dl,

u chorych zazwyczaj > 20 mg/dl (1,2 mmol/l) oraz Phe/Tyr > 3.

• można wykonać na bibule z chlorkiem żelaza, nakrapiając mocz.

Amoniak

Do 0,2% azotu pozabiałkowego. Pochodzenia endo i egzogennego, powstaje z odszczepienia reszty amonowej w wyniku procesów gnilnych (w przewodzie pokarmowym) oraz wskutek ekranizacji glutaminy (w nerkach). Z krwią żyły wrotnej dostaje się do wątroby, gdzie ulega detoksykacji i sprzęganiu z CO₂ tworząc mocznik i glutaminę.

Wzmożona produkcja

uporczywe zaparcia- nasilenie procesów gnilnych

uszkodzenie funkcji wątroby alkalizacja krwi

oksydacyjna dezaminacja puryn i pirymidyn

nasilone przekształcanie NH3 w formę zjonizowaną

przenikanie bariery krew-mózg

Encefalopatia

Zakres wartości należnych

• osocze

• noworodki < 70 μg/dl

• dorośli < 150 μg/dl

• mocz

• noworodki - ślad

• <6 m-ca 70-140 μg/dl

• 6-12 m-cy 100-190 μg/dl

• dorośli 600-1000 μg/dl

μg/dl ∙ 0,5872 = μmol/l

Wskazania do oznaczenia:

• encefalopatia wątrobowa - rozpoznanie i monitorowanie

• napady drgawkowe - diagnostyka różnicowa

• śpiączki - diagnostyka różnicowa, szczególnie we wczesnym dzieciństwie (defekty enzymatyczne cyklu mocznikowego)

• zespół Rey'a - pojawiają się wymioty i apatia po infekcji wirusowej (zwłaszcza u dzieci leczeniu aspirynę)

Stany ↑ stężenia NH₃

• niewydolność wątroby i marskość, stany zapalne, zatrucia

• śpiączka i stany przedśpiączkowe

• defekty enzymatyczne cyklu mocznikowego

• pozawątrobowe czynniki

• obciążenie białkiem przewodu pokarmowego (masywne zmiany żołądkowo-jelitowe)

• alkohol

• leki moczopędne, barbiturany, narkotyki

• zasadowica metaboliczna

• upośledzone wydalanie nerkowe (ludzie starsi).

Wzmożone wydalanie z moczem

• kwasica cukrzycowa

• stany odwodnienia (wymioty, biegunki)

• uszkodzenie wątroby

• zakażenie dróg moczowych (produkcja bakteryjna)

• stany hipokaliemii i hiponatremii

• pierwotny aldosteronizm.

Obniżone wydalanie

• zasadowica oddechowa i metaboliczna

• kanalikowa kwasica nerkowa

• niedoczynność nadnerczy

• samoistna kamica nerkowa (niedobór glutaminazy w komórkach kanalików nerkowych).

Materiał do badań

• osocze heparynizowane z dodatkiem EDTA

• dobowa zbiórka moczu

• pobrana w warunkach beztlenowych

• transport na lodzie

• wykonanie w ciągu 20 minut

• mocz przechowywany w lodówce z dodatkiem tymolu.

I etapem oznaczenia NH₃ jest przekształcenie NH₄⁺ i oznaczanie formy gazowej.

Metoda enzymatyczna z użyciem dehydrogenazy glutaminianowej.

NH₃+α-ketoglutaran → glutaminian

NADH→NAD⁺ 340 nm

Wysoka czułość i swoistość.

Metoda z użyciem NH₄⁺ czułej elektrody (test optyczny).

Czy oznaczenie amoniaku może służyć do rozpoznawania i oceny przebiegu zatrucia amoniakiem. Zatrucia amoniakiem nie są monitorowane poziomem w osoczu.

Kwas moczowy

a) pierwotna

• zaburzenia przemiany purynowej z upośledzeniem wydalania kwasu moczowego przez nerki (98% przypadków)

• nadmierne wytwarzanie endogennego kwasu moczowego (2% najczęściej niedobór enzymatyczny)

b) wtórna

• choroby ze ↑ obrotem metabolicznym (nowotwory, szczególnie hematologiczne)

• leczenie cytostatykami i promieniowaniem jonizującym

• choroby endokrynologiczne (nadczynność tarczycy, przytarczyc, akromegalia)

• niewydolność nerek

• alkohol, głodówki

• leki (zwłaszcza kardiologiczne), dożylne zamienniki cukrowe

Hipourykemia

• niewydolność wątroby

• idiopatyczne tubulopatie (↑ wydalania nerkowego)

• leki (salicylany, estrogeny)

• radiologiczne środki kontrastowe

Surowica K 2,5-6,0 mg/dl

M 3,3-3,7 mg/dl

Mocz: zwykła dieta <0,9g/24

ubogopurynowa <0,45g/24

Stężenie w surowicy >9mg/dl - wdrożenie farmakoterapii

Wskazania do oznaczenia:

• pierwotna i wtórna dna moczanowa (diagnoza i przebieg)

• diagnostyka różnicowa kamicy nerkowej

• choroby hematologiczne (chłoniaki, szpiczaki, białaczki)

• leczenie cytostatykami

• nadwaga, cukrzyca, zaburzenia gospodarki lipidowej, nadciśnienie (choroby, którym towarzyszy hiperurykemia)

Pomocniczo:

• różnicowanie hiperurykemii (upośledzone wydalanie vs nadmierna produkcja)

• ocena ryzyka wystąpienia kamicy nerkowej, wyjaśnienie etiologii kamicy

• niewyjaśniona przyczyna

Metody bezpośrednie

wykorzystują wartość redukcyjne kwasu moczowego (redukcja kwasu fosforowolframowego w środowisku zasadowym z wytworzeniem niebieskiego produktu, 700nm)

Interferencja wszystkich substancji o właściwościach redukujących

• witamina C, glutation, cysteina, kofeina, teofilina

• wytrącanie moczanów w postaci soli (Ag, Mg, Cu)

• wytrącanie białek i analiza przesączu

• adsorpcja moczanów na żywicach jonowymiennych oraz elucja

Enzymatyczna z oksydazą moczanową

rozkład kwasu moczowego

Metoda pośrednia (oparte o pomiar H₂O₂)

z oksydazą moczanową (sprzężona z układem reakcji katalizowanych przez katalazę i dehydrogenazę aldehydową)

oksydaza moczanowa

kwas moczowy + H₂O + O₂ → alantoina + CO₂ + H₂O₂

Katalaza

H₂O₂ + C₂H₅OH → CH₃CHO + 2H₂O

dehydrogenaza aldehydowa

CH₃CHO + H₂O → CH₃COOH

NADP⁺ NADPH + H⁺ 340nm

Reakcja Kageyama- rozkład H₂O₂ pod wpływem katalazy z utlenieniem metanolu do aldehydu mrówkowego, tworzącego w reakcji żółty związek, 405nm

5

---