OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH 

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r. 

Prowadzący: Michał A. Olkowski 

 

Strona 1 z 6 

 

C

HARAKTERYSTYKA 

S

UBSTANCJI 

A

ZOTOWYCH W 

M

LEKU

 

Normalne mleko zawiera przeciętnie około 3,3% substancji azotowych ogółem. Pozycja ta 

obejmuje  białka  właściwe  (łącznie  z  proteozami  i  peptonami),  które  reprezentują  blisko  95% 

substancji  azotowych  ogółem  lub  ok.  3,1%  w  stosunku  do  mleka  oraz  związki  azotowe 

niebiałkowe określanie mianem azotu resztkowego, na które przypada 5% substancji azotowych 

ogółem (lub 0,2% w stosunku do mleka). Związki azotowe niebiałkowe są reprezentowane przez: 

peptydy,  wolne  aminokwasy,  mocznik,  amoniak,  nukleotydy,  kwas  orotowy  (witamina  B13), 

azotany i azotyny (substancje obce w mleku). 

Najważniejszym białkiem mleka jest kazeina. Jest najbardziej przydatnym składnikiem jako 

materiał  budulcowy  do  syntezy  hemoglobiny  i  białek  osocza  krwi.  Po  spożyciu  mleka  kazeina 

tworzy  w  żołądku  skrzep,  który  jest  bardziej  podatny  na  działanie  enzymów  trawiennych  niż, 

np.  białka  w  produktach  mięsnych.  Jej  zawartość  w  mleku  towarowym  waha  się  najczęściej  w 

granicach od 2,3 do 2,6%. Kazeina jest fosfoproteiną, tzn. w składzie elementarnym oprócz węgla 

(53%),  wodoru  (7%),  tlenu  (22%),  azotu  (15,65%)  i  siarki  (85%)  zawiera  także  fosfor  (0,85%), 

który występuje tu w postaci reszt orto- i pirofosforanowych, związanych estrowo jako monoestry 

lub dwuestry - 

w określonych miejscach cząsteczek – głównie z seryną, a także treoniną. 

K

AZEINA

 

Kazeina 

nie  jest  białkiem  jednorodnym.  Stosując  metody  elektroforetyczne,  w  jej  składzie 

wyróżniono  20  frakcji  różniących  się  zawartością  fosforu,  składem  aminokwasów,  masą 

cząsteczkową, udziałem sacharydów i właściwościami. Do głównych frakcji kazeiny należą:  

 

kazeina α  

 

kazeina β  

 

kazeina γ  

 

α

s

- 

kazeina (strąca się w obecności jonów wapnia) 

 

к-kazeina (kappa; nie strąca się w obecności jonów wapnia).  

W  mleku  kazeina  występuje  głównie  w  postaci  sferycznych,  silnie  porowatych  skupisk, 

zwanych  micelami.  Micele  kazeinowe  charakteryzują  się  znacznymi  rozmiarami  (średnica  od  25 

do  300  nm),  dlatego  w  fazie  w

odnej  mleka  tworzą  roztwór  koloidalny  (zol).  Zostają  one 

uformowane  z  podjednostek  składających  się  z  monomerów  poszczególnych  frakcji  kazeiny 

połączonych ze sobą za pomocą  mostków utworzonych przez jony  wapniowe, fosforanowe oraz 

cytrynianowe. 

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH 

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r. 

Prowadzący: Michał A. Olkowski 

 

Strona 2 z 6 

 

B

IAŁKA 

S

ERWATKOWE

 

Pozostałe  białka  mleka  określane  są  ogólnym  terminem  białek  serwatkowych,  gdyż  po 

wytrąceniu  kazeiny  w  punkcie  izoelektrycznym  (który  przypada  przy  pH  4,6)  lub  za  pomocą 

preparatu podpuszczkowego pozostają rozpuszczone w serwatce. Przeciętna zawartość tej grupy 

substancji  azotowych  w  mleku  wynosi  0,6%.  Białka  serwatkowe  reprezentowane  są  przez  trzy 

frakcje,  mianowicie  albuminy,  immunoglobuliny  oraz  proteozy  i  peptony

.  Spośród  białek 

największe  znaczenie  odżywcze  mają  albuminy,  do  których  zaliczane  są:  β-laktoglobulina, 

α-laktoalbumina i albumina serum krwi. 

Białka  serwatkowe  są  niezwykle  cennym  składnikiem  mleka  i  jego  przetworów. 

Charakteryzują się  bardzo dobrymi właściwościami funkcjonalnymi, wysoką wartością odżywczą, 

a  w  szczególności  składem  aminokwasowym  z  przewagą  aminokwasów  siarkowych,  lizyny 

i  tryptofanu  w  porównaniu  z  kazeiną.  Wysoki  udział  cysteiny  w  białkach  serwatkowych  jest 

korzystny  ze  względu  na  jej  ważną  funkcję  regulacji  stężenia  glutationu,  który  ma  kluczowe 

znaczenie w ochronie kom

órek przed toksycznym działaniem wolnych rodników. 

Tabela 1. Udział białek serwatkowych w serwatce. 

Białko 

Zawartość w serwatce 

[g/dm

3

] 

Ogółem 

5.0÷7.0 

β-laktoglobulina 

2.0÷4.0 

α-laktoalbumina 

1.0÷7.0 

Albumina serum 

0.1÷1.7 

Immunoglobuliny 

0.6÷1.0 

Proteozy i peptony 

0.6÷1.8 

Białka  serwatkowe  pobudzają  do  wzrostu  oraz  zapewniają  ochronę  immunologiczną 

młodych  ssaków.  Ich  ważne  funkcje  biologiczne  są  silnie  uzależnione  od  właściwości 

fizykochemicznych i funkcjonalnych. Kazeina ma 

głównie wartość żywieniową, natomiast znacznie 

mniejsze  od  niej 

białka  serwatkowe  o  budowie  globularnej  pełnią  większą  ilość  funkcji 

w prawidłowym rozwoju noworodków oraz niemowląt. 

Głównym  białkiem  serwatki  jest  β-laktoglobulina  (β-lg).  W  białkach  serwatkowych  mleka 

krowiego  zawartość  β-lg  ogółem  wynosi  ok.  60%,  w  mleku  kobiecym  jest  jej  niewiele,  bądź  nie 

występuje  w  ogóle,  natomiast  dominują  w  nim  α-laktoalbumina  i  laktoferryna,  które  stanowią 

odpowiednio  40  i  25%  wszystkich  białek  ogółem.  Należy  ona  do  nadrodziny  lipokalin. 

U  noworodków  bierze  udział  w  wiązaniu  retinolu  pochodzącego  od  witaminy  A  oraz  dodatkowo 

przyczynia  się  do  lepszego  metabolizmu  kwasów  tłuszczowych  zawartych  w  mleku  krowim. 

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH 

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r. 

Prowadzący: Michał A. Olkowski 

 

Strona 3 z 6 

 

W temperaturach powyżej 60

o

C następuje cieplna denaturacja tego białka, w wyniku której zostają 

odsłonięte  grupy  -SH  aminokwasów  siarkowych.  W  mocniej  ogrzewanym  mleku  powstają 

połączenia dzięki tzw. mostkom disiarczkowym, pomiędzy cząsteczkami β-lg, także β-lg, κ-kazeiny 

i α-laktoalbuminy oraz także wydzielany może być siarkowodór odpowiadający za przykry zapach 

przypalonego  mleka. 

Aby  wyeliminować  alergiczne  działanie  β-laktoglobuliny  w  gotowym 

produkcie u osób nadwrażliwych, poddawana jest ona enzymatycznej hydrolizie. 

Innym,  istotnym  białkiem  serwatkowym  jest  α-laktoalbumina,  która  jest  składnikiem 

kompleksu syntetazy (ligazy) laktozy wykorzystującej glukozę i UDP-galaktozę jako substraty do 

syntezy  cukru  mlekowego  w  aparacie  Golgiego  komórki  nabłonkowej  gruczołu  mlecznego 

u ssaków.  

Strukturalnie  zbliżonym  do  α-laktoalbuminy  białkiem  jest  lizozym.  Typ-C  lizozymu  ma 

właściwości bakteriostatyczne dzięki hydrolitycznemu działaniu na wielocukry obecne w ścianach 

komórkowych  drobnoustrojów.  Dzięki  unikalnym  właściwościom  tego  białka,  podczas  karmienia 

mleko kobiece jest woln

e enteropatogenów. 

Najsilniej  zróżnicowaną  grupą  białek  serwatkowych  są  immunoglobuliny.  Laktoferyna 

i  transferyna  są  białkami  glikoproteinowymi,  które  wiążąc  żelazo  ograniczają  wzrost  bakterii 

poprzez transport i absorpcję tego pierwiastka w  jelicie. Zawartość obu białek jest zróżnicowana 

u  wielu  gatunków  ssaków.  Bakteriostatyczne  działanie  laktoferyny  w  ochronie  przeciw 

drobnoustrojom  obecnym  w  gruczole  mlecznym  i  powierzchniach  śluzówkowych  polega  na 

indukcji  stanu  zapalnego,  dzięki  któremu  hamowany  jest  rozwój  bakterii  G(+)  i  G(-).  Również 

laktoperoksydaza  wykazuje  właściwości  antyseptyczne,  a  jej  działanie  polega  na  katalizowaniu 

reakcji  utleniania  w  obecności  nadtlenku  wodoru  tiocyjanianów  do  związków  o  szkodliwym 

działaniu na drobnoustroje.  

Opisywane 

białka,  przeważnie  immunoglobuliny,  stanowią  istotną  grupę  związków 

wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym, które są komercyjnie dostępne. 

 

 

 

 

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH 

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r. 

Prowadzący: Michał A. Olkowski 

 

Strona 4 z 6 

 

O

ZNACZENIA 

N

A 

P

RZYKŁADZIE 

S

ERA

 

!!! WSZYSTKIE ODCZYNNIKI DODAJEMY POD DYGESTORIUM 

W OBECNOŚCI PROWADZĄCEGO ĆWICZENIA !!! 

W pierwszej kolejności próbki  należy doprowadzić do temperatury pokojowej, a następnie 

przygotować  próbę  reprezentowaną  poprzez  utarcie  sera  bezpośrednio  przed  wykonaniem 
oznaczeń. 

 

1. 

Substancje azotowe ogółem

 

 

Zasada  metody  polega  na  zmineralizowaniu  próbki  na  mokro  przy  użyciu  kwasu  siarkowego, 

katalizatora  (CuSO

4

  x  5  H

2

O

)  i  substancji  podwyższającej  temperaturę  wrzenia  (K

2

SO

4

).  Proces 

mineralizacji przyspiesza się dodając ok. 30% H

2

O

2

. 

1. 

Utlenianie białek (i innych związków organicznych): 

2H

2

SO

4

 



 2SO

2

 + 2H

2

O + O

2

 

-

-

OOC-R-NH

3

+

 + O

2

 



 xCO

2

 + yH

2

O + zNH

3

 

2. 

Wiązanie wydzielonego amoniaku przez kwas siarkowy: 

2NH

3

+H

2

SO

4

 



 (NH

4

)

2

SO

4 

3. 

Ilość amoniaku oznacza się metodą miareczkową: 

Po całkowitym zmineralizowaniu próbkę alkalizuje się stężonym roztworem NaOH: 

(NH

4

)

2

SO

4

 + 2NaOH 



 Na

2

SO

4

 + 2H

2

O + 2NH

3  

 

(alkalizacja) 

NH

3

 + H

3

BO

3

 



 NH

4

H

2

BO

3

 

 

(

wiązanie amoniaku przez kwas borowy) 

Ilość  związanego  amoniaku  oznacza  się  przez  miareczkowanie  destylatu  przez  

0,1 N HCl wobec np. oranżu metylowego lub wskaźnika Tashiro (0,2 g czerwieni metylowej i 0,1 g 

błękitu metylenowego rozpuszczone w 100 cm

3

 96% etanolu): 

NH

4

H

2

BO

3

 + HCl 



 NH

4

Cl + H

3

BO

3 

Oznaczoną zawartość azotu przelicza się na białko w mleku stosując współczynnik przeliczeniowy 

6,38. Wynika on stąd, że główne białko mleka – kazeina zawiera przeciętnie 15,68% azotu. 

Wykonanie 

Odwa

żyć  po  0,5  g  przygotowanego  uprzednio  sera  z  dokładnością  do  0,001  g  na  papierze 

pergaminowym, a następnie przenieść ilościowo do kolby Kjeldahla, po czym dodać przygotowaną 

uprzednio  mieszanin

ę  do  spalania  (5  g  K

2

SO

4

,  0,3  g  CuSO

4

  x  5  H

2

O) 

oraz  ostrożnie  pod 

wyciągiem:  10  cm

3

  H

2

SO

4

  (d=1,84  g/cm

3

)  i  2  cm

3

  perhydrolu  (30%  H

2

O

2

).  Po  dodaniu 

odczynników  przeprowadzić  mineralizację  próbek  w  zestawie  umieszczonym  pod  dygestorium, 

zwracając  uwagę  na  poprawność  podłączenia  mechanicznego  wyciągu  powietrza.  Spalanie 

prowadzić przez 40 minut w temperaturze 280

o

C, a następnie przez 2,5 h w temperaturze 480

o

C. 

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH 

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r. 

Prowadzący: Michał A. Olkowski 

 

Strona 5 z 6 

 

Kiedy  próbka  zostanie  całkowicie  zmineralizowana  i  zawartość  kolby  stanie  się  zupełnie 

przezroczysta, ogrzewanie powinno prowadzone być przez ok. 30 minut. Zmineralizowane próbki 

w  kolbach  Kjeldahla  po  ochłodzeniu  należy  spłukać  50  cm

3

 

chłodnej  wody  destylowanej. 

Nas

tępnie  kolbę  należy  umieścić  w  aparacie  do  destylacji  KJELTEC  2100  firmy  FOSS,  gdzie 

zostanie oddestylowany amoniak

. Do kolby stożkowej o pojemności 200 cm

3

 

dodać około 40 cm

3

 

4%  kwasu  borowego  (z  dodatkiem  odczynnika  Tashiro)    i  umieścić  w  odbieralniku  aparatu. 

Otrzymany  destylat  miareczkowa

ć  0,1  N  HCl  wobec  2%  roztworu  fenoloftaleiny,  do  uzyskania 

barwy  jasnoróżowej.  W  taki  sam  sposób  wykonano  próbę  ślepą,  stosując  do  spalania  zamiast 

próbki wodę destylowaną. 

Procentow

ą zawartość substancji azotowych ogółem w serze obliczano wg wzoru: 

gdzie: 

𝑥 =

 𝑉

1

− 𝑉

2

  ∙ 1,4 ∙ 6,38 ∙ 100

𝑚 ∙ 1000

 

V

1

 

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie właściwej [cm

3

], 

V

2 

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie odczynnikowej [cm

3

], 

m 

– naważka sera [g], 

6,38 

– współczynnik przeliczeniowy azotu na białko. 

2. 

Azot Amoniakalny

 

Zasada  metody  polega  na  oznaczeniu  przez  destylacj

ę  wodnego  wyciągu  sera  po  łagodnym 

zalkalizowaniu  przez dodanie  MgO i  zmiareczkowanie  otrzymanego  destylatu.  Azot  amoniakalny 

występuje w serach w postaci związków amonowych i częściowo wolnego amoniaku.  

Wykonanie 

Odwa

żyć po 12,5 g sera z dokładnością do 0,01 g, a następnie rozetrzeć w moździerzu, dodając 

stopniowo  ok.  50  cm

3

 

wody  destylowanej  o  temperaturze  40°C.  Otrzymaną  emulsję  przenieść 

ilo

ściowo  do  kolby  miarowej  o  pojemności  250  cm

3

,  pop

łukując  moździerz  porcjami  wody 

destylowanej.  Doda

ć  około  3-4  krople  40%  roztworu  formaliny  (w  celu  zahamowania  dalszej 

proteolizy bia

łek) i zawartość kolby dokładnie wymieszać, po czym schłodzić do temperatury 20°C 

i  dope

łnić  wodą  destylowaną  do  kreski i  wytrząsać  przez  około  5  minut. Wytrząsanie  powtarzać 

w odstępach co 10 min. Przez 1 godzinę. Po tym zabiegu do kolb włożyć spiralnie zwinięty drucik 

i na oko

ło 1,5 godziny wstawić kolby do lodówki (lub do wody z lodem). Po 1,5 godzinie inkubacji 

za  pomoc

ą drucika usunąć całkowicie zestalony w szyjce kolb korek tłuszczu. 50 cm

3

  wcze

śniej 

przefiltrowanego przes

ączu, odmierzyć do kolby destylacyjnej aparatu Kjeldahla, dodać 1 g MgO 

i destylowa

ć do 25 cm

3

 4 % H

3

BO

3 

(z dodatkiem odczynnika Tashiro). Destylat miareczkowa

ć do 

zmiany barwy za pomoc

ą 0,1 M HCl. 

Procentow

ą zawartość azotu amoniakalnego obliczano wg wzoru: 

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH 

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r. 

Prowadzący: Michał A. Olkowski 

 

Strona 6 z 6 

 

𝑥 =

𝑉 ∙ 1,4 ∙ 5 ∙ 6,38 ∙ 100

𝑚 ∙ 1000

 

gdzie: 

V- ilo

ść 0,1 N HCl zużyta do miareczkowania [cm

3

], 

m 

– naważka sera [g]. 

3. 

Azot Rozpuszczalny

 

Substancje  azotowe  sera  rozpuszczalne 

w  wodzie  postają  z  nierozpuszczalnego  w  wodzie 

parakazeinianu 

wapnia  podczas  dojrzewania  sera.  Są  one  reprezentowane  przez  różne  związki 

wielkocząsteczkowe,  jak:  albumozy,  peptony  i  polipeptydy  oraz  związki  prostsze,  jak  proste 

peptydy,  aminokwasy  i  amoniak 

(związki w postaci soli amonowych). Oznacza się je w  wodnym 

wyciągu metodą Kjeldahla. 

Wykonanie 

Odwa

żyć po 12,5 g sera z dokładnością do 0,01 g, a następnie rozetrzeć w moździerzu, dodając 

stopniowo  ok.  50  cm

3

 

wody  destylowanej  o  temperaturze  40°C.  Otrzymaną  emulsję  przenieść 

ilo

ściowo  do  kolby  miarowej  o  pojemności  250  cm

3

,  pop

łukując  moździerz  porcjami  wody 

destylowanej.  Doda

ć  około  3-4  krople  40%  roztworu  formaliny  (w  celu  zahamowania  dalszej 

proteolizy bia

łek) i zawartość kolby dokładnie wymieszać, po czym schłodzić do temperatury 20°C 

i  dope

łnić  wodą  destylowaną  do  kreski i  wytrząsać  przez  około  5  minut. Wytrząsanie  powtarzać 

w odstępach co 10 min. Przez 1 godzinę. Po tym zabiegu do kolb włożyć spiralnie zwinięty drucik 

i na oko

ło 1,5 godziny wstawić kolby do lodówki (lub do wody z lodem). Po 1,5 godzinnej inkubacji 

za pomoc

ą drucika usunąć całkowicie zestalony w szyjce kolb korek tłuszczu i pobrać pipetą znad 

osadu około 100 cm

3

 

roztworu, który następnie należy przefiltrować przez sączek z bibuły. 

Dalszą część oznaczenia przeprowadzić identycznie jak w punkcie 1 wykorzystując 25 cm

3

 filtratu. 

Procentow

ą zawartość substancji azotowych rozpuszczalnych w serze obliczyć wg wzoru: 

𝑥 =

 𝑉

1

− 𝑉

2

  ∙ 1,4 ∙ 6,38 ∙ 100 ∙ 10

𝑚 ∙ 1000

 

gdzie: 
V

1

 

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie właściwej [cm

3

], 

V

2 

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie odczynnikowej [cm

3

], 

m 

– naważka sera [g], 

6,38 

– współczynnik przeliczeniowy azotu na białko. 

L

ITERATURA

 

1.  Bylund G. 1995: Dairy Handbook; Tetra Pak Processing Systems AB S-221 86 Lund, Sweden 
2.  Pijanowski  E.  1984:  Zarys  chemii  i  technologii  mleczarstwa.  Tomy  1,  2  i  3

.,  Państwowe 

Wydawnictwo Naukowe, Warszawa 

3. 

Zmarlicki (red.) 1981: Ćwiczenia z analizy mleka i produktów mlecznych, Skrypty SGGW-AR 
w Warszawie, wydanie II, 40-51.