OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r.

Prowadzący: Michał A. Olkowski

Strona 1 z 6

C

HARAKTERYSTYKA

S

UBSTANCJI

A

ZOTOWYCH W

M

LEKU

Normalne mleko zawiera przeciętnie około 3,3% substancji azotowych ogółem. Pozycja ta

obejmuje białka właściwe (łącznie z proteozami i peptonami), które reprezentują blisko 95%

substancji azotowych ogółem lub ok. 3,1% w stosunku do mleka oraz związki azotowe

niebiałkowe określanie mianem azotu resztkowego, na które przypada 5% substancji azotowych

ogółem (lub 0,2% w stosunku do mleka). Związki azotowe niebiałkowe są reprezentowane przez:

peptydy, wolne aminokwasy, mocznik, amoniak, nukleotydy, kwas orotowy (witamina B13),

azotany i azotyny (substancje obce w mleku).

Najważniejszym białkiem mleka jest kazeina. Jest najbardziej przydatnym składnikiem jako

materiał budulcowy do syntezy hemoglobiny i białek osocza krwi. Po spożyciu mleka kazeina

tworzy w żołądku skrzep, który jest bardziej podatny na działanie enzymów trawiennych niż,

np. białka w produktach mięsnych. Jej zawartość w mleku towarowym waha się najczęściej w

granicach od 2,3 do 2,6%. Kazeina jest fosfoproteiną, tzn. w składzie elementarnym oprócz węgla

(53%), wodoru (7%), tlenu (22%), azotu (15,65%) i siarki (85%) zawiera także fosfor (0,85%),

który występuje tu w postaci reszt orto- i pirofosforanowych, związanych estrowo jako monoestry

lub dwuestry -

w określonych miejscach cząsteczek – głównie z seryną, a także treoniną.

K

AZEINA

Kazeina

nie jest białkiem jednorodnym. Stosując metody elektroforetyczne, w jej składzie

wyróżniono 20 frakcji różniących się zawartością fosforu, składem aminokwasów, masą

cząsteczkową, udziałem sacharydów i właściwościami. Do głównych frakcji kazeiny należą:



kazeina α



kazeina β



kazeina γ



α

s

-

kazeina (strąca się w obecności jonów wapnia)



к-kazeina (kappa; nie strąca się w obecności jonów wapnia).

W mleku kazeina występuje głównie w postaci sferycznych, silnie porowatych skupisk,

zwanych micelami. Micele kazeinowe charakteryzują się znacznymi rozmiarami (średnica od 25

do 300 nm), dlatego w fazie w

odnej mleka tworzą roztwór koloidalny (zol). Zostają one

uformowane z podjednostek składających się z monomerów poszczególnych frakcji kazeiny

połączonych ze sobą za pomocą mostków utworzonych przez jony wapniowe, fosforanowe oraz

cytrynianowe.

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r.

Prowadzący: Michał A. Olkowski

Strona 2 z 6

B

IAŁKA

S

ERWATKOWE

Pozostałe białka mleka określane są ogólnym terminem białek serwatkowych, gdyż po

wytrąceniu kazeiny w punkcie izoelektrycznym (który przypada przy pH 4,6) lub za pomocą

preparatu podpuszczkowego pozostają rozpuszczone w serwatce. Przeciętna zawartość tej grupy

substancji azotowych w mleku wynosi 0,6%. Białka serwatkowe reprezentowane są przez trzy

frakcje, mianowicie albuminy, immunoglobuliny oraz proteozy i peptony

. Spośród białek

największe znaczenie odżywcze mają albuminy, do których zaliczane są: β-laktoglobulina,

α-laktoalbumina i albumina serum krwi.

Białka serwatkowe są niezwykle cennym składnikiem mleka i jego przetworów.

Charakteryzują się bardzo dobrymi właściwościami funkcjonalnymi, wysoką wartością odżywczą,

a w szczególności składem aminokwasowym z przewagą aminokwasów siarkowych, lizyny

i tryptofanu w porównaniu z kazeiną. Wysoki udział cysteiny w białkach serwatkowych jest

korzystny ze względu na jej ważną funkcję regulacji stężenia glutationu, który ma kluczowe

znaczenie w ochronie kom

órek przed toksycznym działaniem wolnych rodników.

Tabela 1. Udział białek serwatkowych w serwatce.

Białko

Zawartość w serwatce

[g/dm

3

]

Ogółem

5.0÷7.0

β-laktoglobulina

2.0÷4.0

α-laktoalbumina

1.0÷7.0

Albumina serum

0.1÷1.7

Immunoglobuliny

0.6÷1.0

Proteozy i peptony

0.6÷1.8

Białka serwatkowe pobudzają do wzrostu oraz zapewniają ochronę immunologiczną

młodych ssaków. Ich ważne funkcje biologiczne są silnie uzależnione od właściwości

fizykochemicznych i funkcjonalnych. Kazeina ma

głównie wartość żywieniową, natomiast znacznie

mniejsze od niej

białka serwatkowe o budowie globularnej pełnią większą ilość funkcji

w prawidłowym rozwoju noworodków oraz niemowląt.

Głównym białkiem serwatki jest β-laktoglobulina (β-lg). W białkach serwatkowych mleka

krowiego zawartość β-lg ogółem wynosi ok. 60%, w mleku kobiecym jest jej niewiele, bądź nie

występuje w ogóle, natomiast dominują w nim α-laktoalbumina i laktoferryna, które stanowią

odpowiednio 40 i 25% wszystkich białek ogółem. Należy ona do nadrodziny lipokalin.

U noworodków bierze udział w wiązaniu retinolu pochodzącego od witaminy A oraz dodatkowo

przyczynia się do lepszego metabolizmu kwasów tłuszczowych zawartych w mleku krowim.

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r.

Prowadzący: Michał A. Olkowski

Strona 3 z 6

W temperaturach powyżej 60

o

C następuje cieplna denaturacja tego białka, w wyniku której zostają

odsłonięte grupy -SH aminokwasów siarkowych. W mocniej ogrzewanym mleku powstają

połączenia dzięki tzw. mostkom disiarczkowym, pomiędzy cząsteczkami β-lg, także β-lg, κ-kazeiny

i α-laktoalbuminy oraz także wydzielany może być siarkowodór odpowiadający za przykry zapach

przypalonego mleka.

Aby wyeliminować alergiczne działanie β-laktoglobuliny w gotowym

produkcie u osób nadwrażliwych, poddawana jest ona enzymatycznej hydrolizie.

Innym, istotnym białkiem serwatkowym jest α-laktoalbumina, która jest składnikiem

kompleksu syntetazy (ligazy) laktozy wykorzystującej glukozę i UDP-galaktozę jako substraty do

syntezy cukru mlekowego w aparacie Golgiego komórki nabłonkowej gruczołu mlecznego

u ssaków.

Strukturalnie zbliżonym do α-laktoalbuminy białkiem jest lizozym. Typ-C lizozymu ma

właściwości bakteriostatyczne dzięki hydrolitycznemu działaniu na wielocukry obecne w ścianach

komórkowych drobnoustrojów. Dzięki unikalnym właściwościom tego białka, podczas karmienia

mleko kobiece jest woln

e enteropatogenów.

Najsilniej zróżnicowaną grupą białek serwatkowych są immunoglobuliny. Laktoferyna

i transferyna są białkami glikoproteinowymi, które wiążąc żelazo ograniczają wzrost bakterii

poprzez transport i absorpcję tego pierwiastka w jelicie. Zawartość obu białek jest zróżnicowana

u wielu gatunków ssaków. Bakteriostatyczne działanie laktoferyny w ochronie przeciw

drobnoustrojom obecnym w gruczole mlecznym i powierzchniach śluzówkowych polega na

indukcji stanu zapalnego, dzięki któremu hamowany jest rozwój bakterii G(+) i G(-). Również

laktoperoksydaza wykazuje właściwości antyseptyczne, a jej działanie polega na katalizowaniu

reakcji utleniania w obecności nadtlenku wodoru tiocyjanianów do związków o szkodliwym

działaniu na drobnoustroje.

Opisywane

białka, przeważnie immunoglobuliny, stanowią istotną grupę związków

wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym, które są komercyjnie dostępne.

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r.

Prowadzący: Michał A. Olkowski

Strona 4 z 6

O

ZNACZENIA

N

A

P

RZYKŁADZIE

S

ERA

!!! WSZYSTKIE ODCZYNNIKI DODAJEMY POD DYGESTORIUM

W OBECNOŚCI PROWADZĄCEGO ĆWICZENIA !!!

W pierwszej kolejności próbki należy doprowadzić do temperatury pokojowej, a następnie

przygotować próbę reprezentowaną poprzez utarcie sera bezpośrednio przed wykonaniem
oznaczeń.

1.

Substancje azotowe ogółem

Zasada metody polega na zmineralizowaniu próbki na mokro przy użyciu kwasu siarkowego,

katalizatora (CuSO

4

x 5 H

2

O

) i substancji podwyższającej temperaturę wrzenia (K

2

SO

4

). Proces

mineralizacji przyspiesza się dodając ok. 30% H

2

O

2

.

1.

Utlenianie białek (i innych związków organicznych):

2H

2

SO

4



2SO

2

+ 2H

2

O + O

2

-

-

OOC-R-NH

3

+

+ O

2



xCO

2

+ yH

2

O + zNH

3

2.

Wiązanie wydzielonego amoniaku przez kwas siarkowy:

2NH

3

+H

2

SO

4



(NH

4

)

2

SO

4

3.

Ilość amoniaku oznacza się metodą miareczkową:

Po całkowitym zmineralizowaniu próbkę alkalizuje się stężonym roztworem NaOH:

(NH

4

)

2

SO

4

+ 2NaOH



Na

2

SO

4

+ 2H

2

O + 2NH

3

(alkalizacja)

NH

3

+ H

3

BO

3



NH

4

H

2

BO

3

(

wiązanie amoniaku przez kwas borowy)

Ilość związanego amoniaku oznacza się przez miareczkowanie destylatu przez

0,1 N HCl wobec np. oranżu metylowego lub wskaźnika Tashiro (0,2 g czerwieni metylowej i 0,1 g

błękitu metylenowego rozpuszczone w 100 cm

3

96% etanolu):

NH

4

H

2

BO

3

+ HCl



NH

4

Cl + H

3

BO

3

Oznaczoną zawartość azotu przelicza się na białko w mleku stosując współczynnik przeliczeniowy

6,38. Wynika on stąd, że główne białko mleka – kazeina zawiera przeciętnie 15,68% azotu.

Wykonanie

Odwa

żyć po 0,5 g przygotowanego uprzednio sera z dokładnością do 0,001 g na papierze

pergaminowym, a następnie przenieść ilościowo do kolby Kjeldahla, po czym dodać przygotowaną

uprzednio mieszanin

ę do spalania (5 g K

2

SO

4

, 0,3 g CuSO

4

x 5 H

2

O)

oraz ostrożnie pod

wyciągiem: 10 cm

3

H

2

SO

4

(d=1,84 g/cm

3

) i 2 cm

3

perhydrolu (30% H

2

O

2

). Po dodaniu

odczynników przeprowadzić mineralizację próbek w zestawie umieszczonym pod dygestorium,

zwracając uwagę na poprawność podłączenia mechanicznego wyciągu powietrza. Spalanie

prowadzić przez 40 minut w temperaturze 280

o

C, a następnie przez 2,5 h w temperaturze 480

o

C.

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r.

Prowadzący: Michał A. Olkowski

Strona 5 z 6

Kiedy próbka zostanie całkowicie zmineralizowana i zawartość kolby stanie się zupełnie

przezroczysta, ogrzewanie powinno prowadzone być przez ok. 30 minut. Zmineralizowane próbki

w kolbach Kjeldahla po ochłodzeniu należy spłukać 50 cm

3

chłodnej wody destylowanej.

Nas

tępnie kolbę należy umieścić w aparacie do destylacji KJELTEC 2100 firmy FOSS, gdzie

zostanie oddestylowany amoniak

. Do kolby stożkowej o pojemności 200 cm

3

dodać około 40 cm

3

4% kwasu borowego (z dodatkiem odczynnika Tashiro) i umieścić w odbieralniku aparatu.

Otrzymany destylat miareczkowa

ć 0,1 N HCl wobec 2% roztworu fenoloftaleiny, do uzyskania

barwy jasnoróżowej. W taki sam sposób wykonano próbę ślepą, stosując do spalania zamiast

próbki wodę destylowaną.

Procentow

ą zawartość substancji azotowych ogółem w serze obliczano wg wzoru:

gdzie:

𝑥 =

𝑉

1

− 𝑉

2

∙ 1,4 ∙ 6,38 ∙ 100

𝑚 ∙ 1000

V

1

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie właściwej [cm

3

],

V

2

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie odczynnikowej [cm

3

],

m

– naważka sera [g],

6,38

– współczynnik przeliczeniowy azotu na białko.

2.

Azot Amoniakalny

Zasada metody polega na oznaczeniu przez destylacj

ę wodnego wyciągu sera po łagodnym

zalkalizowaniu przez dodanie MgO i zmiareczkowanie otrzymanego destylatu. Azot amoniakalny

występuje w serach w postaci związków amonowych i częściowo wolnego amoniaku.

Wykonanie

Odwa

żyć po 12,5 g sera z dokładnością do 0,01 g, a następnie rozetrzeć w moździerzu, dodając

stopniowo ok. 50 cm

3

wody destylowanej o temperaturze 40°C. Otrzymaną emulsję przenieść

ilo

ściowo do kolby miarowej o pojemności 250 cm

3

, pop

łukując moździerz porcjami wody

destylowanej. Doda

ć około 3-4 krople 40% roztworu formaliny (w celu zahamowania dalszej

proteolizy bia

łek) i zawartość kolby dokładnie wymieszać, po czym schłodzić do temperatury 20°C

i dope

łnić wodą destylowaną do kreski i wytrząsać przez około 5 minut. Wytrząsanie powtarzać

w odstępach co 10 min. Przez 1 godzinę. Po tym zabiegu do kolb włożyć spiralnie zwinięty drucik

i na oko

ło 1,5 godziny wstawić kolby do lodówki (lub do wody z lodem). Po 1,5 godzinie inkubacji

za pomoc

ą drucika usunąć całkowicie zestalony w szyjce kolb korek tłuszczu. 50 cm

3

wcze

śniej

przefiltrowanego przes

ączu, odmierzyć do kolby destylacyjnej aparatu Kjeldahla, dodać 1 g MgO

i destylowa

ć do 25 cm

3

4 % H

3

BO

3

(z dodatkiem odczynnika Tashiro). Destylat miareczkowa

ć do

zmiany barwy za pomoc

ą 0,1 M HCl.

Procentow

ą zawartość azotu amoniakalnego obliczano wg wzoru:

OZNACZANIE SUBSTANCJI AZOTOWYCH W WYBRANYCH PRODUKTACH MLECZNYCH

Tech. spec. – 5, 7 maja 2010 r.

Prowadzący: Michał A. Olkowski

Strona 6 z 6

𝑥 =

𝑉 ∙ 1,4 ∙ 5 ∙ 6,38 ∙ 100

𝑚 ∙ 1000

gdzie:

V- ilo

ść 0,1 N HCl zużyta do miareczkowania [cm

3

],

m

– naważka sera [g].

3.

Azot Rozpuszczalny

Substancje azotowe sera rozpuszczalne

w wodzie postają z nierozpuszczalnego w wodzie

parakazeinianu

wapnia podczas dojrzewania sera. Są one reprezentowane przez różne związki

wielkocząsteczkowe, jak: albumozy, peptony i polipeptydy oraz związki prostsze, jak proste

peptydy, aminokwasy i amoniak

(związki w postaci soli amonowych). Oznacza się je w wodnym

wyciągu metodą Kjeldahla.

Wykonanie

Odwa

żyć po 12,5 g sera z dokładnością do 0,01 g, a następnie rozetrzeć w moździerzu, dodając

stopniowo ok. 50 cm

3

wody destylowanej o temperaturze 40°C. Otrzymaną emulsję przenieść

ilo

ściowo do kolby miarowej o pojemności 250 cm

3

, pop

łukując moździerz porcjami wody

destylowanej. Doda

ć około 3-4 krople 40% roztworu formaliny (w celu zahamowania dalszej

proteolizy bia

łek) i zawartość kolby dokładnie wymieszać, po czym schłodzić do temperatury 20°C

i dope

łnić wodą destylowaną do kreski i wytrząsać przez około 5 minut. Wytrząsanie powtarzać

w odstępach co 10 min. Przez 1 godzinę. Po tym zabiegu do kolb włożyć spiralnie zwinięty drucik

i na oko

ło 1,5 godziny wstawić kolby do lodówki (lub do wody z lodem). Po 1,5 godzinnej inkubacji

za pomoc

ą drucika usunąć całkowicie zestalony w szyjce kolb korek tłuszczu i pobrać pipetą znad

osadu około 100 cm

3

roztworu, który następnie należy przefiltrować przez sączek z bibuły.

Dalszą część oznaczenia przeprowadzić identycznie jak w punkcie 1 wykorzystując 25 cm

3

filtratu.

Procentow

ą zawartość substancji azotowych rozpuszczalnych w serze obliczyć wg wzoru:

𝑥 =

𝑉

1

− 𝑉

2

∙ 1,4 ∙ 6,38 ∙ 100 ∙ 10

𝑚 ∙ 1000

gdzie:
V

1

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie właściwej [cm

3

],

V

2

– ilość 0,1 N HCl zużyta w próbie odczynnikowej [cm

3

],

m

– naważka sera [g],

6,38

– współczynnik przeliczeniowy azotu na białko.

L

ITERATURA

1. Bylund G. 1995: Dairy Handbook; Tetra Pak Processing Systems AB S-221 86 Lund, Sweden
2. Pijanowski E. 1984: Zarys chemii i technologii mleczarstwa. Tomy 1, 2 i 3

., Państwowe

Wydawnictwo Naukowe, Warszawa

3.

Zmarlicki (red.) 1981: Ćwiczenia z analizy mleka i produktów mlecznych, Skrypty SGGW-AR
w Warszawie, wydanie II, 40-51.