OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH ENZYMÓW

Zagadnienia do przygotowania:

aktywność enzymatyczna, szybkość reakcji, modele specyficzności substratowej (model Fischera, model Koschlanda)

Wielka różnorodność reakcji biochemicznych występujących w komórkach organizmów żywych możliwa jest dzięki działaniu biologicznych katalizatorów zwanych enzymami. Pod względem chemicznym należą one do białek prostych lub złożonych, aczkolwiek znane są biokatalizatory zbudowane z RNA i określane jako rybozymy.

Zasadniczą częścią cząsteczki enzymu jest centrum aktywne, do którego wiąże się substrat. Niektóre enzymy to białka proste zbudowane tylko z aminokwasów (chymotrypsyna, trypsyna), inne składają się z części białkowej i związanej z nią grupy prostetycznej. Grupa prostetyczna może ulec, w sposób odwracalny, odszczepienu od cząsteczki enzymu i wówczas część białkowa nosi nazwę apoenzymu, a grupę prostetyczną często określa się mianem koenzymu. Różnica pomiędzy grupą prostetyczną a koenzymem polega na trwałości ich wiązania z częścią białkową enzymu. Uważa się, że grupa prostetyczna jest mocniej związana z enzymem. Enzym składający się z apoenzymu i koenzymu określamy jako holoenzym zgodnie z schematem:

Holoenzym ⇔ apoenzym + koenzym

Część białkowa enzymu decyduje o wyborze substratu, czyli o specyficzności substratowej, jak również w wielu przypadkach ma wpływ na kierunek reakcji enzymatycznej. Koenzym pomaga w działaniu enzymu np. poprzez przenoszenie atomów lub grup chemicznych z donora na akceptor.

Międzynarodowa Unia Biochemiczna opracowała zasady klasyfikacji i nazewnictwa enzymów oparte na rodzaju katalizowanej reakcji:

1. oksydoreduktazy - katalizujące proces utlenienia i redukcji

2. transferazy - enzymy przenoszące grupy atomów z jednej cząsteczki na drugą

3. hydrolazy - katalizują reakcje hydrolizy różnych ugrupowań

4. liazy - katalizują reakcje niehydrolitycznego rozszczepienia substratu.

5. izomerazy - enzymy katalizujące odwracalne reakcje przekształceń strukturalnych cząsteczki substratu.

6. ligazy - enzymy odpowiedzialne za reakcję łączenia dwóch cząsteczek nowym wiązaniem z wykorzystaniem cząsteczek ATP.

W obrębie tych klas głównych wyróżnia się wiele podklas i pod-podklas charakteryzujących daną reakcję enzymatyczną, a uwzględnionych w numeracji enzymu składającej się z 4 liczb. I tak np. izomerazę triozofosforanową oznaczono następująco: EC 5.3.1., gdzie pierwsza liczba oznacza główną klasę charakteryzującą rodzaj katalizowanej reakcji, np. izomeryzację,

druga - podklasę określającą grupę substratów (typ donora, z uwzględnieniem grupy chemicznej biorącej udział w reakcji), w tym przypadku do podklasy 3 należą enzymy utleniające jedną część cząsteczki trioz, a redukujące inną część,

trzecia - pod-podklasę określającą bliżej grupę substratów (typ akceptora, z uwzględnieniem grupy funkcyjnej), pod-podklasa 1 obejmuje enzymy przeprowadzające aldozy w ketozy,

czwarta - jest to indywidualną liczbą danego enzymu, przydzieloną w zależności od czasu jego odkrycia i scharakteryzowania, izomeraza triozofosforanowa jest pierwszym enzymem w tej pod-podklasie, na ogólną liczbę 19.

Przynależność enzymu do określonej klasy i podklas znajduje odzwierciedlenie w systematycznej nazwie enzymów. Każda nazwa złożona jest z dwóch części, z których pierwsza określa typ katalizowanej reakcji, a druga wskazuje substrat, np. maltohydrolaza α- 1,4- glukonowa (β-amylaza) to enzym, który hydrolizuje wiązanie glikozydowe glukanu i wskutek tej reakcji powstają reszty maltozowe.

Wiele enzymów, zwłaszcza proteolitycznych, syntetyzowanych jest w formie nieaktywnej jako tzw. proenzymy, czasem zwane zymogenami, np. trypsyna produkowana jako trypsynogen czy trombina (enzym krzepnięcia krwi) powstająca z protrombiny. Aktywacja proenzymów zachodzi na skutek nieodwracalnej hydrolizy przynajmniej jednego wiązania peptydowego. Niektóre enzymy, katalizujące tę samą reakcję, występują w kilku formach różniących się własnościami fizyko-chemicznymi (masa cząsteczkowa, ładunek, stabilność, etc.), które wynikają z różnic w ich strukturze I rzędowej. Takie enzymy nazywamy izoenzymami i są one następstwem ekspresji różnych genów kodujących ten sam enzym. Izoenzymy są enzymami oligomerycznymi, czyli składającymi się kilku łańcuchów polipeptydowych jak np.dehydrogenaza mleczanowa (LDH), której cząsteczka jest tetramerem i występuje w 5 formach izoenzymowych. Oznaczanie izoenzymów ma duże znaczenie diagnostyczne w wielu jednostkach chorobowych, jak np. w stanach zawałowych serca, w których wzrasta stężenie izoenzymu LDH₁.

Kinetyka reakcji enzymatycznych.

Równania kinetyczne reakcji enzymatycznych zostały po raz pierwszy opracowane w 1913 roku przez Michaelisa i Menten. Zgodnie z ich teorią podstawowym założeniem przebiegu reakcji enzymatycznej jest fakt, że w stanie równowagi szybkość tworzenia kompleksu enzym-substrat ES równa jest szybkości jego zaniku:

gdzie S oznacza stężenie substratu,

k₊₁ - stałą szybkości tworzenia się kompleksu enzym-substrat ES,

k_-1 - stałą rozpadu kompleksu ES na E i S

k₊₂ - stałą rozpadu kompleksu na E i P

[E] - stężenie całkowite enzymu

[E_f] - stężenie wolnego enzymu równe [E]- [ES]

[S] - całkowite stężenie substratu (≈ które jest w przybliżeniu równe wolnemu stężeniu substratu - ilość S związanego z E jest bardzo mała w porównaniu z ilością wolego S, podczas początkowego etapu reakcji ilość S przekształcanego w P jest do zaniedbania - założenie to jest podstawą do wyprowadzenia równania Michaelisa-Menten).

Rozpad kompleksu enzym-substrat na enzym i produkt jest reakcją odwracalną, ale w początkowym etapie reakcji, gdy stężenie produktu(ów) jest niewielkie, reakcję odwrotną prowadząca do powstania kompleksu ES z produktu można pominąć.

Szybkość formowania kompleksu ES przedstawia równanie:

a szybkość jego rozpadu:

W stanie równowagi, gdy szybkość tworzenia i rozpadu kompleksu ES są równe:

Stała Michaelisa-Menten K_M równa jest:

czyli

Przekształcając i grupując wyrazy równania otrzymujemy:

(2)

Jeżeli początkowa szybkość reakcji równa jest

v = k₂[ES] (3)

to przekształcenie równania (2) daje:

(4)

Z równania (4) wynika, że szybkość reakcji enzymatycznej jest proporcjonalna do stężenia enzymu. W przypadku, gdy [S] jest małe i K_M ≫ [S], to wyrażenie K_M + [S] ≈ K_M. W takim przypadku szybkość v jest proporcjonalna do iloczynu stężenia enzymu i substratu.

W przypadku, gdy wartość [S] jest duża i K_M ≪ [S], to K_M + [S] ≈ [S]. Szybkość reakcji enzymatycznej jest w tym przypadku niezależna od stężenia substratu.

Szybkość maksymalna V_max występuje w przypadku, gdy całkowite stężenie enzymu biorące udział w reakcji tworzy kompleks enzym-substrat, czyli [E]= [ES]:

(5)

Podstawiając wartość k₂ z równania (5) do równania (4) otrzymujemy wyrażenie określane równaniem Michaelisa-Menten:

(6)

Z równania Michaelisa-Menten można łatwo wyznaczyć K_M:

(7)

Z równania (7) wynika, że kiedy szybkość reakcji jest równa połowie wartości szybkości maksymalnej, stała Michaelisa-Menten jest równa stężeniu substratu [S]:

W doświadczeniach gdzie wymagany jest nadmiar substratu, stosuje się zwykle stężenie substratu równe 10K_M. Stałą Michaelisa-Menten można wyznaczyć z wykresu szybkości reakcji enzymatycznej względem stężenia substratu (Rys.1). Wykres ten nazywany jest wykresem Michaelisa-Menten.

Wielkości K_M i V_max są bardzo ważnymi stałymi reakcji enzymatycznej. Stała K_M wskazuje na stabilność kompleksu [ES], a jej wartość jest odwrotnie proporcjonalna do powinowactwa enzymu do substratu. Szybkość maksymalna V_max jest proporcjonalna do stężenia enzymu i jest miarą szybkości konwersji [ES] do wolnego enzymu i produktu reakcji.

Nieliniowa zależność Mechaelisa-Menten jest niewygodna do analizy eksperymentalnych wyników reakcji enzymatycznej. W celu łatwego obliczenia stałych K_M i V_max równanie (6) można przekształcić do postaci liniowej:

Rys.1. Wykres Michaelisa-Menten.

lub

(8)

Wyrażenie (8) jest liniową postacią równania Michaelisa-Menten i znane jest jako równanie Lineweavera-Burke'a. Wykres tego równania 1/v od 1/[S] jest prostą o nachyleniu równym K_M/V_max­, a przecięcie prostej z osią 1/v następuje w punkcie równym 1/V_max, tak jak to przedstawiono na rys.2.

Rys. 2.Wykres Lineweaver-Burka.

2. Inhibitory.

Inhibitorami enzymów określamy związki, które hamują szybkość reakcji enzymatycznej. Inhibitory mogą działać na cząsteczkę enzymu swoiście lub nieswoiście. Inhibitory nieswoiste (niepecyficzne) - są to substancje lub czynniki fizyczne (temperatura, rozpuszczalniki organiczne, etc), które działając na cząsteczkę zmieniają jego natywną strukturę i prowadzą do inaktywacji enzymu.

Inhibitory swoiste (specyficzne) oddziaływujące z miejscem aktywnym enzymu - są to związki reagujące z grupami bocznymi aminokwasów znajdujących się w miejscu aktywnym enzymu i powodującym jego inaktywację. Przykładem tego rodzaju inhibitorów mogą być związki reagujące z grupami sulfhydrylowymi tworząc disiarczki lub merkaptydy. Następną grupą inhibitorów swoistych są związki reagujące z ko-faktorami. Do tej grupy zaliczyć można cyjanki reagujące z jonami żelazowymi i żelazawymi wchodzącymi w skład grupy prostetycznej oksydazy cytochromowej - reakcja ta blokuje proces oddychania komórkowego czy też reakcję fluorków z enzymami aktywowanymi jonami magnezu.

Z uwagi na mechanizm hamowania reakcji enzymatycznej inhibitory dzielimy na :

• kompetycyjne - wykazujące podobieństwa strukturalne z substratem i współzawodniczące z substratem o centrum aktywne enzymu. Inhibitory kompetycyjne należą do inhibitorów odwracalnych, zmniejszających powinowactwo do enzymu. Stała K_m rośnie, V_max nie ulega zaś zmianie. Miarą efektywności działania tych inhibitorów jest stała inhibicji K_i, która liczbowo odpowiada stałej dysocjacji kompleksu enzymu z inhibitorem, czyli im niższa wartość K_i, tym silniejsza reakcja hamowania.

• niekompetycyjne - nie wykazujące podobieństwa strukturalnego z substratem, łączące się z cząsteczką enzymu poza centrum aktywnym, tworząc kompleks enzym-inhibitor. Do tego kompleksu może (lub nie) przyłączać się substrat, ale reakcja katalizy nie zachodzi. Stała K_m nie zmienia się, a szybkość V_max­ ulega zmniejszeniu.

• mieszane - są to inhibitory, które obniżają powinowactwo enzymu do substratu zwiększając K_m i jednocześnie obniżają szybkość maksymalną V_max.

Na szybkość reakcji enzymatycznej, obok inhibitorów, wpływają również aktywatory- substancje zwiększające szybkość reakcji enzymatycznej lub zwiększające powinowactwo enzymu do substratu. Istnieją różne aktywatory.

• w przypadku nieczynnych enzymów, tzw. proenzymów aktywatorem może być inny enzym lub inna substancja powodująca przekształcenie nieaktywnej formy proenzymu w aktywny enzym. Przykładem takiej aktywacji jest proces aktywacji pepsynogenu w żołądku polegający na odszczepienie fragmentu peptydu maskującego centrum aktywne przez HCl lub inną już aktywną cząsteczkę pepsyny.

• do aktywacji niektórych enzymów wymagana jest obecność wolnych grup SH, które mogą powstawać w warunkach beztlenowych. W przypadku proteaz tkankowych (katepsyn), ich aktywacja następuje po śmierci organizmu w wyniku redukcji grup SH i enzymy te rozpoczynają autotrawienie tkanki.

• wiele enzymów ulega aktywacji poprzez przyłączenie jonów magnezu i/lub potasu, wapnia i innych.

• istnieje duża grupa enzymów wymagająca przyłączenia jonów fosforanowych do grup hydroksylowych bocznych aminokwasów takich jak seryna, treonina czy tyrozyna tworząc aktywne formy enzymów, tzw.fosforoenzymy. Inne enzymy natomiast, aby przejść do formy aktywnej, muszą przeciwnie ulec defosforylacji.

Część praktyczna

1. Badanie specyficzności substratowej enzymów: inwertazy drożdży (EC. 3.2.1.26, fruktohydrolazy-β-D-fruktofuranozydów) I AMYLAZY ŚLINY (α-amylazy, EC. 3.2.1.1, glukanohydrolazy-1,4-α-D-glukanów).

Zasada ogólna:

Oba badane enzymy należą do hydrolaz rozkładających wiązanie O-glikozydowe. Inwertaza powoduje rozkład wiązania 1,2-O-glikozydowego, a amylaza wiązania α-1,4 O-glikozydowego. Inwertaza rozkłada więc sacharozę, a nie rozkłada skrobi. Natomiast amylaza rozkłada skrobię, a nie rozkłada sacharozy. Zarówno sacharoza, jak i skrobia to cukry nieredukujące. Hydroliza obu tych cukrowców prowadzi do powstania cukrów redukujących. Sprawdzając właściwości redukujące cukrowców w analizowanej mieszaninie można więc łatwo badać przebieg reakcji.

Odczynniki:

Preparat inwertazy z drożdży, (należy rozcieńczyć 150 razy buforem octanowym i przechowywać w lodzie), bufor octanowy pH=4,8, 1% roztwory skrobi i sacharozy (świeżo sporządzony), odczyniki Fehlinga I i II.

Sprzęt: mikropipety, łaźnia wodna

Przygotowanie roztworu amylazy śliny:

Przepłukać usta 3-4-krotnie wodą destylowaną (10-20 ml) podgrzaną do temperatury 40°C, zawartość wypluć do zlewki. W ten sposób uzyskujemy roztwór śliny do badań aktywności amylolitycznej.

Wykonanie:

1. Przygotować 6 probówek;

2. W pierwszych trzech umieścić 1 ml roztworu skrobi.

3. W trzech pozostałych 1 ml roztworu sacharozy.

4. Do pierwszej pary probówek zawierającej skrobię i sacharozę dodać po 200 μl roztworu śliny.

5. Do drugiej pary probówek ze skrobią i sacharozą dodać po 200 μl inwertazy.

6. Do trzeciej pary probówek ze skrobią i sacharozą dodać po 200 μl wody destylowanej (próby ślepe).

7. Zawartość wszystkich probówek wymieszać i pozostawić na co najmniej godzinę w temperaturze 37 ˚C.

8. Po tym czasie z wszystkimi próbami wykonać reakcję Fehlinga.

9. Otrzymane wyniki zestawić w tabeli:

	sacharoza	skrobia
Inwertaza
Amylaza
Próba ślepa

„+” - obecność cukrów redukujących; „-„ - brak obecności cukrów redukujących

2. Przygotowanie wyciągu ziemniaczanego:

Umyć, obrać i na tarce utrzeć ziemniaka; miazgę ziemniaczaną otoczyć gaza i zanurzyć w zlewce zawierającej około 200 ml wody destylowanej; przetrzymać w wodzie przez chwilę łagodnie mieszając; po wyciągnięciu miazgi odczekać chwilę w celu opadnięcia osadu; płyn znad osadu zdekantować

3. Wykrywanie katalazy

Podstawa teoretyczna:

Katalaza należy do enzymów hemoproteinowych i rozkłada nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem chemicznym reakcji:

H₂O₂ + H₂O₂ → 2 H₂O + O₂↑

Powoduje, więc ona rozkład toksycznego nadtlenku wodoru do wody i tlenu. Można to zaobserwować polewając wodą utlenioną (3 % wodny roztwór nadtlenku wodoru) zranione miejsca. Wówczas obserwuje się pienienie wody utlenionej spowodowane gwałtownym wydzielaniem tlenu powstającym w wyniku rozkładu nadtlenku wodoru katalizowanego przez enzym zwany katalizą. Jest to enzym występujący zarówno u zwierząt, jak i roślin.

Odczynniki: wyciąg ziemniaczany, 3% r-r H₂O₂

Wykonanie:

Przygotować dwie probówki. W obu umieścić po około 2 ml wyciągu ziemniaczanego. Do jednej dodać około 1 ml 3% r-ru H₂O₂ i zaobserwować wynik.

Zawartość drugiej probówki ogrzać do wrzenia i po ochłodzeniu dodać 1 ml 3% r-ru H₂O₂. Zaobserwować wyniki i porównać z wynikiem uzyskanym dla probówki pierwszej. Wyjaśnić różnicę.

4. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę

Podstawa teoretyczna:

Skrobia to cukier złożony z wielu cząsteczek glukozy. Ma więc budowę łańcuchową. Skrobia tworzy z jodem barwne połączenia. W takich połączeniach jedna cząsteczka jodu przypada na 6 reszt glukozy. Amylaza to enzym należący do hydrolaz. Występuje np. w ślinie. Powoduje on rozrywanie wiązań łączących cząsteczki glukozy. Dzięki obecności jodu można obserwować tą reakcję, gdyż im krótszy łańcuch reszt glukozy tym barwa mniej intensywna. Od fioletowej przechodzi poprzez niebieskofiołkową do czerwonej, a kiedy w roztworze są już tylko dwucukry i monocukry roztwór staje się bezbarwny.

Odczynniki: świeżo sporządzonego 1% roztworu skrobi, 0,002% r-ru jodu w jodku potasu,

Przygotowanie roztworu amylazy śliny: przepłukać usta ciepłą wodą, następnie pobrać łyk wody do ust i po kilku minutach wypluć do zlewki, czynność tę powtórzyć kilkakrotnie aż uzyska się powyżej 10 ml roztworu amylazy.

Wykonanie:

Do probówki odmierzyć 7 ml świeżo przyrządzonego roztworu skrobi i 7 ml otrzymanego roztworu amylazy śliny. Dokładnie wymieszać, a następnie probówkę umieścić w łaźni wodnej w temepraturze 40 °C na około 5 minut. W tym czasie przygotować pipetę na 1ml i 10 probówek. W każdej probówce umieścić po 2 ml r-ru jodu w jodku potasu. Po upływie 5 minut z probówki zawierającej skrobię i enzym pobierać co pół minuty 1 ml roztworu i umieszczać w kolejnych wcześniej przygotowanych probówkach. Obserwować zabarwienie.

5. Oznaczanie aktywności katalazy (oksydoreduktazy nadtlenek: wodoru : nadtlenek wodoru EC. 1.11.1.6) i wyznaczanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej.

Zasada ogólna:

Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru zgodnie z równaniem chemicznym reakcji:

H₂O₂ + H₂O₂ → 2 H₂O + O₂↑

Inhibitorem tej reakcji jest np. kwas siarkowy(VI). Jest on wykorzystywany do hamowania reakcji.

Oznaczenie aktywności tego enzymu można przeprowadzić m.in. metodą miareczkowania manganometrycznego próbek pobranych z mieszaniny reakcyjnej, wykorzystując poniższe równanie chemiczne reakcji:

2 KMnO₄ + 5 H₂O₂ + 3 H₂SO₄ → 2 MnSO₄ + 5 O₂ + K₂SO₄ + 8 H₂O.

Z równania tego wynika, że 1 ml 0,01 mol/dm³ KMnO₄ odpowiada 25 μmol H₂O₂. Źródłem H₂O₂ w mieszaninie reakcyjnej jest nadboran sodu. Ktalizatorem tej reakcji jest MnSO₄.

Szybkość początkowa reakcji, która jest miarą aktywności enzymu można wyznaczyć z wykresu zależności ilości rozłożonego H₂O₂ (tj. ubytku substratu) od czasu. W tym celu należy przeprowadzić styczną do uzyskanej z powyższej zależności krzywej w punkcie t = 0 i zmierzyć tangens kąta jaki tworzy ona z osią odciętych. Tangens tego kąta jest miarą szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez katalazę.

Odczynniki:

hemolizat krwi wołowej (katalaza) odpowiednio rozcieńczony; 0,1 mol/dm³ bufor fosforanowy pH = 7,4; 0,1 mol/dm³ r-r nadboranu sodu; 1 mol/dm³ r-r H₂SO₄ z 1% MnSO₄; 0,01mol/dm³ KMnO₄.

Sprzęt:

zlewki na 25 ml, biurety, pipety na 5 ml, mikropipety

Enzym rozcieńczyć 200 razy buforem fosforanowym (na całą grupę) i przechowywać w lodzie

Wykonanie:

1. Przygotować 4 zlewki na 25 ml każda, ponumerować i umieścić w nich po 2 ml kwasu siarkowego(VI) z 1% MnSO₄.

2. Biuretę napełnić roztworem KMnO₄.

3. Przygotować pipetę na 5 ml i zegarek.

(UWAGA! PUNKT 4 WYKONAĆ GDY PRZYGOTOWANO WSZYSTKO CO PODANO WYŻEJ.) Jako czas zerowy potraktować wykonanie punktu 4. Natychmiast po jego wykonaniu należy wykonać punkt 5.

4. W erlenmajerce na 50 ml umieścić 2 ml odpowiednio rozcieńczonego hemolizatu, 20 ml buforu fosforanowego o pH 7,4 (ogrzanego do temperatury pokojowej) i 20 ml nadboranu sodu.

5. Zawartość erlenmajerki szybko wymieszać i natychmiast pobrać 5 ml i przenieść do pierwszej zlewki zawierającej uprzednio dodany kwas siarkowy(VI) z 1% r-rem MnSO₄ i wymieszać. Czynność powtarzać co 3 minuty od czasu zerowego za każdym razem pobierając 5 ml i przenosząc do kolejnych uprzednio przygotowanych zlewek z kwasem siarkowym(VI) i 1% r-rem MnSO₄.

6. Zawartość zlewek miareczkować KMnO₄. Ze zużytych objętości r-ru KMnO₄ obliczyć liczbę μmoli przekształconego substratu (H₂O₂) i sporządzić wykres zależności ilości przekształconego substratu od czasu.

7. Jako miarę aktywności enzymu podać szybkość początkową reakcji katalizowanej przez katalazę.

Czas [min]	objętość zużytego r-ru KMnO4 [ml]	μmole H2O2	μmole rozłożonego H2O2

---