Lipidy

Lipidy stanowią wielką klasę wielkocząsteczkowych związków organicznych o zróżnicowanej strukturze, ale zbliżonych właściwościach fizyko-chemicznych, pozwalających zdefiniować je, jako związki organiczne nie rozpuszczalne w wodzie lub tworzące w niej emulsje, ale dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach niepolarnych. W organizmach żywych tłuszcze spełniają ważne funkcje biochemiczne i fizjologiczne: 1) stanowią materiał energetyczny, 2) są materiałem budulcowym błon biologicznych, 3) wiążąc kowalencyjnie białka odpowiednio orientując je w błonach komórkowych, 4) pełnią funkcje hormonów i międzykomórkowych informatorów, 5) są nośnikami witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, 6) stanowią materiał ochronny i izolacyjny.

Lipidy dzielimy na:

1) lipidy proste - tłuszcze właściwe, woski,

2) lipidy złożone - fosfolipidy (glicerofosfolipidy, sfingolipidy), glikolipidy.

3) steroidy (sterydy), które dzielimy na sterole (np. cholesterol), hormony sterydowe, kwasy żółciowe.

Ze względu na pochodzenie naturalnych lipidów, można je podzielić na lipidy roślinne i zwierzęce. Ze względu na stan skupienia wśród lipidów wyróżniamy oleje i tłuszcze stałe. Ponieważ lipidy charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością w rozpuszczalnikach organicznych, ale słabą w wodzie, izoluje się je najczęściej z odwodnionych tkanek. Do ekstrakcji używa się rozpuszczalników typu: benzen, eter, chloroform. Stosunkowo łatwo można wyekstrahować acyloglicerole, trudniej fosfolipidy i glikolipidy, które często występują w kompleksach z białkami. Mimo podobnej rozpuszczalności, lipidy różnią się znacznie strukturą chemiczną. Choć większość z nich to estry, mogą występować jako związki acykliczne bądź pierścieniowe. Oprócz wiązania estrowego niektóre tłuszcze posiadają również wiązanie amidowe (sfingolipidy) bądź eterowe (plazmalogeny).W celu rozdzielenia tłuszczów stosuje się m.in. chromatografię gazowo-cieczową oraz cienkowarstwową.

III.1. Lipidy proste

Tłuszcze właściwe (tłuszcze obojętne)

Są głównymi magazynami energii organizmu. Źródłem tłuszczy właściwych są masło, smalec i tłuste części mięsa a także oleje, które pochodzą głównie z roślin takich jak soja, kukurydza, oliwka, słonecznik, rzepak i len. Pod względem budowy chemicznej tłuszcze właściwe to estry glicerolu (najczęściej triestry glicerolu) i wyższych kwasów tłuszczowych. Wyróżniamy dwa rodzaje triestrów glicerolu (triacylogliceroli): triestry proste, w których wszystkie trzy reszty kwasu tłuszczowego są identyczne i triestry mieszane.

Tłuszcz stały lub olej jest z reguły złożoną mieszaniną różnych triacylogliceroli. Rozkład wiązań estrowych acylogliceroli prowadzi do powstania glicerolu i mieszaniny kwasów tłuszczowych.

Najczęściej występujące nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe zestawiono w tabeli poniżej.

Tab.III.1

Nazwa zwyczajowa kw.tłuszczowego	Liczba at. C	Wzór strukturalny	Temp. topnienia [ºC]
nasycone laurynowy mirystynowy palmitynowy stearynowy arachidowy	12 14 16 18 20	CH3(CH2)10COOH CH3(CH2)12COOH CH3(CH2)14COOH CH3(CH2)16COOH CH3(CH2)18COOH	44 58 63 70 77
nienasycone oleinowy linolowy linolenowy	18 18 18	CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH (cis) CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH (cis, cis) CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH (cis, cis, cis)	13 -5 -11

Chociaż znane są wyjątki, większość kwasów tłuszczowych jest nierozgałęziona i zawiera parzystą ilość atomów węgla w cząsteczce. W kwasach tłuszczowych nienasyconych występują niesprzężone wiązania podwójne, które zazwyczaj mają konfigurację cis. Temperatury topnienia nienasyconych kwasów tłuszczowych są znacznie niższe niż nasyconych (porównaj tabela). Im więcej wiązań podwójnych w resztach acylowych, tym niższe temperatury topnienia. W całkowicie nasyconym triacyloglicerolu długie węglowodorowe łańcuchy ułożone są obok siebie regularnie, jak w krysztale. Dlatego też nasycone triestry glicerolu w temperaturze pokojowej są substancjami stałymi. Wprowadzenie jednego podwójnego wiązania o konfiguracji cis powoduje, że łańcuchy w cząsteczce nie mogą układać się ściśle obok siebie. Substancje te zatem są cieczami. Im więcej wiązań podwójnych tym struktura jest mniej uporządkowana i tym niższa temperatura topnienia. Obecność nienasyconych wiązań powoduje znaczną reaktywność kwasu.

Skład tłuszczu stałego lub oleju jest zazwyczaj określany procentową zawartością kwasów tłuszczowych (w tabeli poniżej - na 100g próbki tłuszczu).

Tab.III.2

KWASY NASYCONE [%]							KWASY NIENASYCONE [%]
	C10 i mniej	C12 laurynowy	C14 mirystynowy	C16 palmitynowy		C18 stearynowy	C18 oleinowy	C18 linolowy	C18 linolenowy
tłuszcze zwierzęce
masło łój wołowy smalec	3 - 5 ― ―	1 - 4 0,2 ―	8 -13 2 - 3 1	25 - 32 25 - 30 25 - 30		8 - 13 21 - 26 12 - 16	22 - 29 39 - 42 41 - 51	3 2 3 - 8	― ― ―
oleje roślinne
oliwka soja len	― ― ―	0 - 1 ― ―	0 - 2 0,3 0,2		7 - 20 7 - 11 5 - 9	1 - 3 2 - 5 4 - 7	53 - 86 22 - 34 9 - 29	4 - 22 50 - 60 8 - 29	― 2 - 10 45 - 67

Zwykle tłuszcze stałe i oleje zawierają w przewadze jeden lub dwa rodzaje kwasów. Np. w oliwie z oliwek znajduje się do 86% kwasu oleinowego, olej lniany zawiera do 67% kwasu linolenowego. Stan skupienia tłuszczu wynika z jego składu. Oleje zawierają znacznie większy odsetek nienasyconych kwasów tłuszczowych niż tłuszcze stałe.

Zmydlanie tłuszczów, czyli zasadowa hydroliza wiązań estrowych, prowadzi do powstania

glicerolu i soli kwasów tłuszczowych. Sodowe i potasowe sole długołańcuchowych kwasów tłuszczowych to mydła. Cząsteczka mydła składa się z długiego apolarnego łańcucha węglowodorowego z silnie polarną lub zjonizowaną grupą na końcu łańcucha. Cząsteczki mydła są amfifilowe (dwubiegunowe): łańcuch węglowy jest hydrofobowy (nie oddziałuje z

wodą ale rozpuszcza się w tłuszczach), koniec polarny jest hydrofilowy (oddziaływuje z wodą).

Mydła są związkami powierzchniowo czynnymi tzn. zmniejszającymi napięcie powierzchniowe wody. Na granicy fazy polarnej i apolarnej cząsteczki mydła, odpowiednio orientując się, tworzą charakterystyczne agregaty zwane micelami. Dzięki tej własności umożliwiają emulgację tłuszczy w roztworach wodnych, czyli rozbicie tłuszczu na drobne krople (analogicznie do kwasów żółciowych emulgujących tłuszcze podczas trawienia). Emulgacja tłuszczu pozwala na łatwiejsze odmycie tłustych zanieczyszczeń. Ze względu na tworzenie micelli, roztwory mydeł są układami koloidowymi.

Woski

Woski zawierają jedno wiązanie estrowe łączące jednowodorotlenowy alkohol z kwasem tłuszczowym. Zarówno kwas, jak i alkohol w cząsteczce wosku mają długie nasycone łańcuchy węglowe. Niektóre woski roślinne są prostymi, długołańcuchowymi, nasyconymi węglowodorami. Woski są bardziej kruche i twardsze niż tłuszcze właściwe. Woski, w przeciwieństwie do tłuszczy właściwych i złożonych należą do lipidów niepolarnych. Zwykle są ciałami stałymi, choć występują także w postaci płynnej (np. olej olbrotowy). Na powierzchni cieczy tworzą nierozpływające się monowarstwy (soczewki). Właściwość ta powoduje, że w przyrodzie woski pełnią funkcje ochronne i izolacyjne. W świecie roślin okrywają powierzchnię liści i łodyg, chroniąc rośliny przed nadmiernym parowaniem wody. Najbardziej znani przedstawiciele tej grupy lipidów to: lanolina (wosk wełny owczej), wosk pszczeli i olbrot.

III.2. Lipidy złożone

W skład lipidów złożonych wchodzą fosfolipidy i glikolipidy.

Fosfolipidy

Ze względu na rodzaj alkoholu dzielą się na glicero- i sfingofosfolipidy.

Glicerofosfolipidy strukturą przypominają tłuszcze właściwe z tym, że jedna z pierwszorzędowych grup hydroksylowych glicerolu jest zestryfikowana resztą kwasu fosforowego dając kwas fosfatydowy. Kwas ten może tworzyć wiązanie estrowe z: etanoloaminą, seryną, choliną bądź inozytolem (sześciowodorotlenowym alkoholem cyklicznym). W ten sposób powstają odpowiednio: fosfatydyloetanolamina (kefalina) , fosfatydyloseryna, fosfatydylocholina (lecytyna) i fosfatydyloinozytol. Innym przykładem glicerofosfolipidów są kardiolipiny, w których dwie reszty kwasu fosfatydowego połączone są ze sobą przez reszty glicerolu (difosfatydyloglicerol).

Pozostałe dwie grupy -OH glicerolu w glicerofosfolipidach są zestryfikowane resztami wyższych kwasów tłuszczowych, z których jeden jest zazwyczaj kwasem nienasyconym.

Sfingofosfolipidy - to grupa fosfolipidów, których struktura oparta jest na długołańcuchowym aminoalkoholu - sfingozynie, połączonej z wyższym kwasem tłuszczowym wiązaniem amidowym. W ten sposób powstaje N-acylosfingozyna (ceramid), będący prekursorem dla tej grupy fosfolipidów. W sfingomielinie (fosfolipid osłonek nerwowych) cząsteczka ceramidu przy C₁ sfingozyny zostaje zestryfikowana resztą kwasu fosforowego, który z drugiej strony także tworzy wiązanie estrowe - z choliną (tak jak w fosfatydylocholinie).

Jakkolwiek istnieją duże różnice strukturalne między poszczególnymi rodzajami fosfolipidów, to w większości tych związków można wyróżnić przestrzennie wyodrębnione apolarne, hydrofobowe łańcuchy kwasów tłuszczowych. Z drugiej strony cząsteczki te mają polarną „główkę”, na którą składa się zjonizowana reszta kwasu fosforowego i grupy aminowe. Związki takie zwane są amfipatycznymi (amfofilowymi): posiadają właściwości zarówno hydrofobowe jak i hydrofilowe.

Glikolipidy

To grupa tłuszczy złożonych zawierających w swej budowie cząsteczkę (cząsteczki) cukru. Analogicznie do fosfolipidów, w zależności od rodzaju alkoholu, glikolipidy dzielą się na glicero- i sfingoglikolipidy. W obrębie tej grupy wyróżniamy również sulfolipidy zawierające reszty glikozylowe zestryfikowane kwasem siarkowym.

Sfingoglikolipidy są bardziej rozpowszechnione od gliceroglikolipidów. Podstawowym elementem ich budowy jest ceramid połączony pierwszorzędową grupą hydroksylową C₁ z resztą galaktozy lub glukozy (cerebrozydy). Do tej grupy glikozylowej mogą być przyłączone następne grupy glikozylowe tworząc oligosacharydowe łańcuchy.

Fosfo- i glikolipidy tworzą dwuwarstwowe układy z dwoma węglowodorowymi „ogonami” skierowanymi do wnętrza i polarnymi „główkami” skierownymi na zewnątrz. Fosfo- i glikolipidy wraz z białkami budują błony komórkowe. Struktury te odgrywają kluczową rolę w kierowaniu transportem związków do i na zewnątrz komórek.

III.3. Pozostałe związki lipidowe

Cholesterol

Jest najlepiej poznanym steroidem. W swej budowie posiada cykliczny 4 pierścieniowy układ steranu. Jest syntezowany ze skwalenu poprzez lanosterol w szeregu reakcji. Cholesterol powszechnie występuje w błonach komórkowych komórek zwierzęcych oraz w organach takich jak mózg i nadnercza. Jest prekursorem kwasów żółciowych, witaminy D₃ i hormonów sterydowych. Posiada zdolność do znacznego rozmywania przedziału temperatur topnienia lipidów błonowych, co czyni go ważnym regulatorem płynności błon komórkowych. Obecność cholesterolu sprawia, że organizmy łatwiej przystosowują się do zmian temperatury otoczenia. W świecie roślin podobne do cholesterolu funkcje pełnią inne steroidy jak β-sistosterol i stigmasterol, a u grzybów ergosterol.

Tokoferole (witaminy E)

Posiadają w swej budowie pierścień hydroksyfenylowy połączony z łańcuchem tetraizopentenylowym. Jedna reszta izopentenylowa tworzy wraz z wymienionym pierścieniem heterocykliczny układ hydroksychromanu. Zróżnicowanie tokoferoli opiera się na różnej ilości i położeniu grup metylowych przyłączonych do pierścienia hydroksyfenylowego. Najbardziej aktywny biologicznie jest α-tokoferol. Tokoferole należą do antyoksydantów, chronią wielonienasycone kwasy tłuszczowe przed utlenianiem. W dużych ilościach występują w olejach roślinnych.

Prostaglandyny i leukotrieny

Ze względu nas swoją nietrwałość zwane są lokalnymi hormonami.Są one pochodnymi nienasyconych kwasów tłuszczowych, posiadają 20 atomów węgla. Są syntetyzowane w komórce przez utlenianie i cyklizację 20-węglowego nienasyconego kwasu arachidonowego. Wywierają zróżnicowane efekty, m.in. regulują liczbę skurczów serca, ciśnienie krwi a także indukują sen. Związki te regulują również odpowiedzi komórkowe istotne w zapaleniu i reakcji immunologicznej.

III.4. Izolowanie i oznaczanie tłuszczów

Izolacja lipidów prostych z tkanki roślinnej bądź zwierzęcej polega na ekstrakcji tych związków rozpuszczalnikami organicznymi (benzen, eter naftowy, eter etylowy, aceton, chloroform).Ważnym elementem jest stopień odwodnienia tkanki, ponieważ zawartość wody w badanym materiale utrudnia kontakt polarnego ekstrahenta z lipidami, jak również może powodować przechodzenie do roztworu rozpuszczalnych w wodzie polarnych związków. Często więc wyosabnianie lipidów przeprowadza się na uprzednio wysuszonym materiale. Tłuszcze można też izolować acetonem, który równocześnie odwadnia tkankę, wymywając z niej lipidy proste, sterole i ich pochodne, nie rozpuszczając lipidów złożonych. Mieszanina chloroform : metanol (3:1) pozwala wyosobnić mieszaninę wszystkich (także złożonych) lipidów. Jednak całkowite wyekstrahowanie tłuszczów złożonych z tkanek jest praktycznie bardzo trudne i wymaga stosowania różnych mieszanin rozpuszczalników oraz długiego czasu. Frakcjonowanie poszczególnych grup lipidów złożonych zależy od wzajemnego stosunku części polarnych do apolarnych w ich cząsteczce.

I. Badanie rozpuszczalności tłuszczów w różnych rozpuszczalnikach

Zasada:

Tłuszcze są nierozpuszczalne w wodzie, ze względu na obecność 16-18 węglowych kwasów o długich, apolarnych łańcuchach. Dobrze natomiast rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych.

Wykonanie:

1. Przygotować cztery suche probówki i umieścić w nich kilka kropel oleju

2. Do pierwszej probówki dodać ok. 2 ml wody destylowanej i zawartość wymieszać.

3. Do drugiej około 2 ml etanolu i zawartość wymieszać.

4. Do trzeciej około 2 ml acetonu i zawartość wymieszać.

5. Do czwartej około 2 ml chloroformu i zawartość wymieszać.

6. Porównać rozpuszczalność oleju w różnych rozpuszczalnikach.

II. Badanie składu tłuszczów właściwych

II. 1. Wykrywanie glicerolu

II.1.1. Próba akroleinowa

Zasada:

Akroleina, czyli aldehyd kwasu akrylowego, powstaje w wyniku odwodnienia glicerolu w wysokiej temperaturze i w obecności czynników odciągających wodę. Reakcja daje pozytywny wynik dla lipidów prostych oraz lipidów złożonych zwierających glicerol.

Wykonanie:

1. Przygotować dwie suche probówki.

2. W jednej z nich umieścić około 1 ml glicerolu, szczyptę krystalicznego KHSO₄ (środek odwadniający) i ogrzewać.

3. W drugiej 1 ml oleju, szczyptę krystalicznego KHSO₄ (środek odwadniający) i ogrzewać.

4. Porównać zapach powstałych w obu probówkach substancji.

Glicerol wchodzący w skład tłuszczów właściwych ulega odwodnieniu i przekształca się w toksyczną akroleinę o charakterystycznym zapachu.

II.1.2. Reakcja z wodorotlenkiem miedzi

Zasada:

Ze względu na obecność grup hydroksylowych, glicerol łączy się z Cu(OH)₂, tworząc kompleks o intensywnym, niebieskim zabarwieniu.

Wykonanie:

Wodorotlenek miedzi (II) powstaje w wyniku reakcji NaOH z CuSO₄. 2M roztwór NaOH dodawać kroplami do 0,5ml nasyconego roztworu CuSO_4, aż do momentu pojawienia się niebieskiego osadu Cu(OH)₂. Następnie odmierzyć kilka kropli glicerolu - osad rozpuszcza się, a roztwór przyjmuje intensywną niebieską barwę. Równolegle wykonać próbę ślepą z wodą.

II. 2. Reakcja na obecność wyższych kwasów tłuszczowych

Zasada:

Wyższe kwasy tłuszczowe tworzą sole zwane mydłami (patrz rozdział III.1.).

Wykonanie:

1. W zlewce zagotować około 25 ml wody destylowanej.

2. W parowniczce umieścić grudkę smalcu wielkości orzecha laskowego.

3. Parowniczkę z tłuszczem umieścić na siatce ceramicznej i ogrzewać na niewielkim płomieniu aż do roztopienia tłuszczu.

4. Do parowniczki dodać około 5 ml roztworu NaOH i kilka kropel etanolu.

5. Mieszając bagietką ogrzewać na niewielkim ogniu aż do wytworzenia mydła.

6. Otrzymane mydło rozpuścić w zagotowanej wcześniej wodzie.

III. Właściwości mydeł

Zasada:

Mydła obniżają napięcie powierzchniowe wody i ułatwiają rozpuszczanie w niej tłuszczów, dzięki czemu usuwają brud.

1. Przygotować dwie probówki.

2. Do obu probówek dodać po około 4 ml wody destylowanej i kilka kropel oleju.

3. Zawartość probówek wytrząsnąć i zaobserwować wynik.

4. Do jednej z probówek dodać około 1 ml otrzymanego wcześniej roztworu mydła.

5, Zawartość probówek wytrząsnąć i zaobserwować wynik.

IV. Liczby tłuszczowe

IV.1. Liczba kwasowa

Zasada:

Liczba kwasowa to ilość mg KOH potrzebna do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych zawartych w 1g tłuszczu. Oznacza się ją w celu scharakteryzowania jakości spożywczej tłuszczu. W wyniku niekorzystnych warunków fizycznych podczas przechowywania tłuszczów dochodzi do hydrolizy wiązań estrowych w lipidach. Powoduje to wzrost liczby wolnych kwasów tłuszczowych. Dlatego też tłuszcze nieświeże posiadają wysokie liczby kwasowe.

Wykonanie:

Do suchej kolby odważyć 3 g tłuszczu, ostrożnie ogrzać, aż do stopienia tłuszczu, a następnie rozpuścić w 15ml mieszaniny etanol:toluen (2:1) (ewentualnie lekko ogrzać). Następnie ostudzić dodać kilka kropel fenoloftaleiny i miareczkować 0,1M roztworem KOH do słabo różowego zabarwienia utrzymującego się przez minutę. Równolegle wykonać próbę kontrolną dla ustalenia, ile cm³ 0,1 molwego roztworu KOH zużywa się na miareczkowanie rozpuszczalnika.

Obliczenie wyniku:

Gdzie: a - ilość ml 0.1M KOH zużyta na zmiareczkowanie próby badanej,

b - ilość ml 0.1M KOH zużyta na zmiareczkowanie próby ślepej,

c - ilość gramów tłuszczu.

IV. 3. Liczba jodowa

Zasada:

Liczba jodowa jest to ilość gramów jodu przyłączonego przez nienasycone kwasy tłuszczowe, zawarte w 100g tłuszczu. Przyłączenie chlorowca zachodzi do atomu węgla posiadającego wiązanie podwójne. Stąd wartość liczby koreluje z ilością związków nienasyconych w tłuszczu. Wysokie liczby jodowe posiadają oleje roślinne, które zawierają dużą ilość nienasyconych kwasów tłuszczowych. Niskie liczby jodowe cechują tłuszcze stałe, o małej ilości wiązań nienasyconych w cząsteczkach kwasów tłuszczowych. W trakcie ćwiczenia próbkę tłuszczu najpierw rozpuszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym. Następnie dodaje się nadmiar mianowanego roztworu IBr. Chlorowce przyłączają się w miejsce podwójnych wiązań (reakcja 1). Dalej dodaje się roztworu KI, który wchodzi w reakcję z nie związanym IBr (reakcja 2). Wydziela się wolny jod, w ilości równoważnej do ilości IBr (niezwiązanego w pierwszej reakcji). Jod, w obecności wskaźnika skrobiowego miareczkuje się mianowanym roztworem Na₂S₂O₃ (reakcja 3).

1.

2.

3.

Wykonanie:

Do kolby miarowej z doszlifowanym korkiem, o pojemności 200-300ml, odważyć 0,1 - 0,2 g. Tłuszcz odważyć w naczyńku wagowym. Tłuszcz rozpuścić w 20 ml chloroformu, dodać 25 ml odczynnika Rosenmunda. Kolbę zamknąć korkiem i odstawić w ciemne miejsce na 15min, mieszając od czasu do czasu. Równolegle przygotować próbę ślepą zawierającą 20 ml chloroformu, 25 ml odczynnika Rosenmunda i również pozostawić w ciemnym miejscu na 15 minut. Po tym czasie dodać 10ml 3% wodnego roztworu KI, spłukując szyjkę kolby i korek. Dobrze wymieszać i miareczkować 0,1M roztworem Na₂S₂O₃ (do lekko różowej barwy) w obecności skrobi jako wskaźnika.

Obliczenie wyniku:

Gdzie: a - liczba ml 0,1M Na₂S₂O₃ zużyta na zmiareczkowanie próby ślepej,

b - liczba ml 0,1M Na₂S₂O₃ zużyta na zmiareczkowanie próby badanej,

c - ilość gramów tłuszczu.

---