29.02.2012

Wykład 14

Badania cytogenetyczne w hematoonkologii

1960 chromosom Filadelfia

1970 pierwsza hybrydyazja in situ (ISH) – chromosomy metafazowe

1973 identyfikacja chromosomu Filadelfia jako t(9;22)

1981 lokalizacja pojedynczego genu metafazowego ISH (sonda znakowana izotopem)

1982 immunologiczna „kanapka”; FISH

1986 FISH interfazowe

1988 zastosowanie sond malujących

1990 wielobarwny FISH (3 kolory)

1992 CGH – comparative genomic hybridization

1996 wielobarwny FISH (SKY) – każda para chromosomów w innym kolorze

Znaczenie badań cytogenetycznych:

• diagnostyczne np. t(15;17) – OBS M3

• prognostyczne np. aberracje mnogie – złe rokowanie

• wybór sposobu leczenia, t(8;21) – rezygnacja z ASCT w pierwszy CR

• monitorowanie leczenia.

Analiza prążkowa (cytogenetyczna konwencjonalna)

• czułość badań cytogenetycznych zależna od rozdziału obrazu prążkowego chromosomów

• przy 400 prążkach w haploidalnym zestawie chromosomów wielkość najmniejszej aberracji jaka może być w badaniu cytogenetycznym rozpoznana odpowiada 7-10∙10⁶ par zasad

• prążki G (GTG-G bands by Trypsin using Giemsa)

• prążki C (CBG – C bands by barium hydroxide using Giemsa)

Określanie kariotypu (szpik, rzadko krew)

1. Namnażanie komórek z pobranego materiału w hodowli in vitro. Synchronizacja hodowli w celu zwiększenia liczby komórek w stadium profazy i wczesnej metafazy – tymidyna.

2. Zatrzymanie podziałów komórkowych w stadium metafazy – colcemid.

3. Zakończenie hodowli i sporządzenie preparatów chromosomowych.

   1. szok hipotoniczny – 0,075 M KCl – celem uzyskania odpowiedniego rozproszenia chromosomów w komórkach w stadium metafazy

   2. utrwalanie – kilkakrotne zawieszanie i inkubacja zawiesiny komórkowej w utrwalaczu: metanol + lodowaty kwas octowy (3:1)

   3. nakraplanie utrwalonej zawiesiny komórkowej na szkiełko podstawowe

4. Barwienie chromosomów przy zastosowaniu jednej lub kilku technik prążkowych.

5. Analiza chromosomów w mikroskopie świetlnym.

6. Wykonanie dokumentacji fotograficznej oraz sporządzenie kariogramu, komputerowa analiza obrazu chromosomów.

Opracowanie wyników badań cytogenetycznych zgodnie z zasadami ISCN 2009 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature)

Za aberrację klonalną uznaje się taką aberrację chromosomową, która występuje w co najmniej dwóch metafazach – w przypadku aberracji strukturalnych lub wzrostu liczby kopii chromosomu. W przypadku utraty określonego chromosomu wymagana jest obecność tej aberracji w co najmniej 3 metafazach.

Hybrydyzacja in situ (cytogenetyka molekularna)

FISH (Fluorescence in situ hybridization) – identyfikacja aberracji w chromosomach metafazalnych i w jądrach interfazalnych.

Multicolor FISH (M-FISH, SKY) – wykrywa „ukryte” aberracje chromosomowe, szczególnie w złożonych kariotypach, wymaga obecności metafaz.

CGH – Comparative Genomic Hybridization – mapowanie zmian liczby kopii określonych sekwencji DNA (genów) – wykrywanie delecji, duplikacji, amplifikacji.

Badanie cytogenetyczne w diagnostyce białaczek

1. OBS

2. PBS

3. OBL

4. PBL

Ostra białaczka szpikowa

Aberracje de novo w ostrej białaczce szpikowej
Aberracja chromosomowa	Geny i ich lokalizacja	Częstość występowania metodami
		klasycznymi	PCR i southern blotting
t(15;17)(q22;q12)	PML – 15q22 RARα – 17q12	7% (4-13%) 70-98% M3	~100% M3
t(8;21)(q22;q22)	AML1 – 21q22 ETO – 8q22	7% (5-10%) 15-20% M2	~25% M2
inv(16)(p13q22) t(16;16)(p13;q22)	MYH11 – 16p13 CBFβ – 16q22	4% (2-9%) 80% M4Eo	10% OBS
11q23	MLL	5% (2-8%) 12% M4/5	23% M4/5 u dorosłych

W OBS 50-60% chorych ma aberracje chromosomalne, najczęściej trisomię 8 lub monosomia 7. 10% chorych ma kariotyp złożony – złe rokowanie. Aberracje wymienione w tabeli dają rokowania lepsze niż kariotyp prawidłowy.

W OBS aberracje wtórne to głównie delecja chromosomu X lub Y.

Ostra białaczka szpikowa z t(8;21)

1. Cechy morfologiczne

   • zwiększony odsetek pro mielocytów w szpiku, częściowo zachowane dojrzewanie w układzie granulocytarnym

   • pałeczki Auera

   • obniżony wskaźnik N/C blastów

   • duże ziarnistości w zasadochłonnej cytoplazmie, niekiedy typu Pseudo-Chediak

   • wodniczki

   • eozynofilia

   • cechy dysgranulopoezy

   • zwiększona aktywność mieloperoksydazy

2. Immunofenotyp

   • CD34+

   • często CD19+, CD15+, CD56+, CD33-

   • niekiedy CD7+

3. Cechy kliniczne

   • skłonność do powstawania pozaszpikowych guzów białaczkowych, głównie ziarniniaków kwasochłonnych w obrębie OUN.

Mutacje 11q23 występują w:

• ALL t(4;11) – złe rokowanie, del (11), t(11;19)(p13.3) – złe rokowanie

• AML t(9;11) – lepsze rokowanie, del (11), t (11;19)(p13.1) – złe rokowanie

• MDS

Klasyfikacja WHO dzieli ostre białaczki szpikowe na:

• AML z powtarzalnymi aberracjami genetycznymi

• AML ze zmianami związanymi z mielodysplazją.

Klasyfikacja cytogenetyczna AML
Rokowanie	Aberracje cytogenetyczne
	SWOG	MRC
Korzystne	t(15;17)(q22;q21) inv(16)/t(16;16)(p13;q22)/del(16q) t(8;21)(q22;q22)bez del(9q)	t(15;17)(q22;q21) inv(16)/t(16;16)(p13;q22) t(8;21)(q22;q22)
Pośrednie	kariotyp prawidłowy +8, -Y, +6, del(12p)	kariotyp prawidłowy +8, -Y, +6, del(12p) inne, niewymienione w pozostałych grupach
Niekorzystne	-5/del(5q), -7/del(7q) t(6;9)(p23;q34) t(9;22)(q34;q11) nieprawidłowe 3q, 9q, 11q, 17p, 20q, 21q kariotyp złożony (>3 niezależnych aberracji)	-5/del(5q), -7/del(7q) t(6;9)(p23;q34) t(9;22)(q34;q11) nieprawidłowe 3q, 9q, 11q, 17p, 20q, 21q kariotyp złożony (>4 niezależnych aberracji)
Nieznane	Inne

Leczenie musi być dostosowane do czynników ryzyka.

Przewlekła białaczka szpikowa

t(9;22)(q34;q11) – fuzja genów BCR/ABL – chromosom 22 translokacją – chromosom Filadelfia.

Chromosom Filadelfia
Białaczka	Częstość występowania	Złamanie w genie BCR
CML	95%	M-bcr, sporadycznie m-bcr
ALL dorosłych	25-30%	m-bcr (50%), M-bcr (50%)
ALL dzieci	3-5%	m-bcr
AML	1-3%	M-bcr (większość), m-bcr (M4, M5)

Translokacja wariantowa – t(9;22;19)(q34;q11;p13)

Najczęstsze wtórne aberracje w fazie blastycznej przewlekłej białaczki szpikowej
Zmiana	Częstość
+8	50%
i(17q) i inne aberracje 17p	35%
+Ph	30%
+19	15%

Kryteria odpowiedzi cytogenetycznej
Odpowiedź	Odsetek komórek Ph w szpiku
całkowita	0%
większa	1-35%
mniejsza	36-95%
brak	>95%

Ostra białaczka limfoblastyczna - aberracje występują u 70% chorych

Aberracje	Typ	Częstość
hiperdiploidia (>50 chromosomów)	B,T	7%
hipodiploidia (<46 chromosomów)	B,T	8%
t(9;22)(q34;q11)	B, czasem T	28%
del/t(9p)	B,T	13%
11q23 t(4;11)(q21;q23) t(11;19)(q23;p13.3)		7%
	prepreB	5%
	B,T	u niemowląt
del/t(12p) t(12;21)(p13;q22)	B,T	5%
	common, pre-B	2%
t(14q11)	T	5%
del(6q)	B,T	4%
t(14q32) t(8;14)(q24;q32)	B	4%
	B(L3)	3%
t(1;19)(q23;p13)	pre-B	2%

Przewlekła białaczka limfatyczna
Rodzaj aberracji	Geny	Częstość	Charakterystyka
del(13)(q14) w skojarzeniu	? +/- RB1	40-55%	typowa morfologia
del(13)(q14) izolowana	? +/- RB1	36%	typowa morfologia
del(11)(q22)	ATM	18-23%	masywna limfadenopatia, zaawansowane stadium kliniczne, młodszy wiek chorych, szybka progresja
+12	?	11-12%	atypowa morfologia
del(17)(p13)	p53	7-12%	atypowa morfologia, oporność na leki
del(6)(q21)	MYB	6%	masywna limfadenopatia

Zespół „5q-” (q13-33)

• 5q33 – common deleted band

• kobiety w średnim i starszym wieku

• brak lub umiarkowane leukopenie

• anemia makrocytowa

• płytki krwi w normie lub podwyższone

• blasty we krwi obwodowej <5%

• blasty w szpiku <5%, bez pałeczek Auera

• liczba megakariocytów w normie lub podwyższone, małe megakariocyty z hiposegmentowanym jądrem

• szpik zwykle hiperplastyczny

• cechy dysplazji w erytroblastach, zmniejszony ich odsetek

• rzadko progresja do AML (ok.10%)

• długi czas przeżycia.

Najczęstsze aberracje w MDS

• +8

• -5/del(5q)

• -7/del(7q)

• del(20q)

• -Y

• i(17q) lub t(17p)

• -13/del(13q)

• del(11q)

• del(12p) lub t(12p)

• del(9q)

• i dic(X)(q13)

Rokowanie	Kariotyp	Mediana przeżycia	25% progresji do AML (lata)
Korzystne	kariotyp prawidłowy del(5q) del(20q) -Y	3,8	5,6
Pośrednie	inne	2,4	1,6
Niekorzystne	-7 del(7q) kariotyp złożony	0,8	0,9

Zapis

• 46,XY, t(8;21)(q22;q22)[5]/45,sl,-Y[20]
  46 chromosomów z XY, translokacja między chromosomami 8 a 21 z ramion q, miejsca 22 w 5 ocenianych komórkach/ 45 chromosomów, translokacja między chromosomami 8 a 21 z ramion q, miejsca 22 oraz delecja chromosomu Y w 20 ocenianych komórkach

• 45,XX, inv(3)(q21q26),-7 [15]/ 46, XX [10]
  45 chromosomów z XX, inwersja w chrosomie 3 od miejsca 21 do 26 ramienia q i delecja chromosomu 7 w 15 ocenianych komórkach/46 chromosomów z XX w 10 ocenianych komórkach

• 46, XY, del(5)(q13q31)[10]/46,sl,der(7)del(7)(q21)t(7;12)(p12;q13)[15]/47,sdl1,+r(?)[3]
  46 chromosomów z XY, delecja odcinka od 13 do 31 ramienia q chromosomu 5 w 10 ocenianych komórkach/46 chromosomów, delecja odcinka od 13 do 31 ramienia q chromosomu 5, nieprawidłowy chromosom 7 powstały w wyniku delecji odcinka od q 21 chromosomu 7 i translokacji między chromosomem 7 i 12 w miejscach p12, q13 w 15 ocenianych komórkach/47 chromosomów, delecja odcinka od 13 do 31 ramienia q chromosomu 5, dodatkowy chromosom pierścieniowy o nieznanym pochodzeniu w trzech komórkach

• 46, XY, t(9;22)(q34;q11)[16]/47,sl,+der(22)t(9;22)[14]/46,XY[5]
  46 chrosomów z XY, translokacja między chromosomem 9 a 22 w miejscah q34, q11 w 16 ocenianych komórkach/47 chromosomów, translokacja między chromosomem 9 a 22 w miejscah q34, q11, dodatkowy nieprawidłowy chromosom 22 powstały w wyniku translokacji między chromosomem 9 a 22 (ch. Filadelfia) w 14 ocenianych komórkach/ 46 chromosomów z XY w 5 ocenianych komórkach.