REGULAC

JA

META

BOLI

Z

M

U

Zbiór

ć

wi

czeń

dla

studentów

III

roku kierunku

B

iologia

oraz studentów I

roku

MU na

kie

runk

u Biolog

ia (spe

c

.

BKi

O)

i na

kierunku Biot

echnologia (spe

c

.

Bio

l

.Mol

.

,

Biotech

.

lub Biot

.

Med

.

)

Zakła

d

Regulac

ji

M

eta

boliz

m

u

Instyt

ut

Biochemii

UW

2

Spis

t

reś

ci

I.

Aktywność

glikolityczna

w

homogena

ci

e

mózgu

str.

3

II.

Transport

anionów

przez

błon

ę

mito

chondri

alną

str.

7

III.

Met

abolizm

glikogenu

w

homogena

ci

e

wątroby

str.

10

IV.

Met

aboliz

m

argininy

w

mitochondri

ach

str.

13

V

.

Karboks

ylac

ja

p

irogronianu

w

mito

chondri

ach

w

ąt

roby

str.

16

VI

.

Wpływ

różnych

e

fek

torów

na

aktywność

dehydrogenazy

g

lut

aminianow

e

j

w

mito

c

hondriach

w

ątroby

lub

n

erki

str.

20

Oznaczani

e

fos

foru

m

eto

dą

Fiske

-Subbarowa

str.

23

Oznaczani

e

bia

łka

metod

ą

biuretow

ą

str.

24

3

1.

AKTYW

NOŚĆ

G

LI

KOLITYCZNA

W

HO

MOGENACIE

MÓZGU

Glikoliza

w

tk

ank

ach

zwierzęcych

pol

ega

na

przekształ

cen

iu

glukozy

w

mle

czan

w

procesi

e

obe

j

mu

ją

cym

szereg

reakc

ji

enzymatyc

z

nych,

czemu

towarzyszy

w

ytwor

zenie

2

moli

ATP

na

j

ed

en

m

ol

zużytej

glukozy.

Aktywność

glikolityczna

j

est

uw

arunk

owana

obecnoś

ci

ą

ATP

i

NAD

+

.

ATP

j

est

niezb

ędny

do

fosforyla

c

ji

glukozy

i

fruktozo

-6-fosforanu

w

reakc

j

a

ch

k

at

alizowan

ych

przez

heksokinazę

i

fo

s

fofruktokin

azę

.

NA

D

+

jest

koenzymem

dehydro

genazy

ald

ehydu

3-fos

foglic

e

rynowego.

Oznaczeni

e

ak

tywności

glikolitycznej

pol

ega

na

pomiarze

ubytku

glukoz

y

i

fosforanu

z

mieszaniny

reak

cyjn

e

j

,

oraz

n

a

oznacz

eniu

w

ytwor

zonego

mlecza

nu

.

Stężenie

glukozy

oznacza

si

ę

kolor

ymetr

ycznie

mierzą

c

produkt

j

e

j

r

eak

c

ji

z

kw

asem

dinitrosali

cylowym.

Fosforan

oznacza

si

ę

me

t

odą

Fiske

-Subbarowa

(patrz.

odp

.

rozdział

),

a

obecnoś

ć

ml

eczanu

w

mieszan

inie

re

akcyjn

e

j

wyk

r

ywa

się

sp

ektro

foto

metrycznie

n

a

podst

awie

redu

kc

j

i

NAD

+

w

reak

c

ji

k

ata

lizowane

j

przez

d

ehydrogenazę

ml

e

czanową

.

Mate

riały

i

odczynniki

1.

Homogena

t

mózgu:

mózg

s

zczur

a

lub

królika

homogenizować

przez

20

s

w

czterokrotn

e

j

obj

ętoś

ci

zimnego,

1

mM

buforu

osforanow

ego

o

pH

7,4.

Homo

genat

prz

y

gotować

bezpośrednio

p

rzed

rozpoczęc

iem

inkuba

c

ji

i

przechowywać

w

ł

aź

ni

lodo

we

j

.

2.

50

mM

glukoza

3.

0

,2

M

bu

for

fos

foran

owy

(zrobiony,

4

0

C )

4.

0

,1

M

amid

kwa

su

ni

kotynowego

5.

M

ieszan

ina

podst

awowa

o

sk

ładzi

e:

25

mM

glukoz

y,

15

mM

bu

for

f

osforanowy,

25

mM

amid

kw

asu

niko

tynowego.

Do

kolbki

mi

arowe

j

o

dmierzyć

odpowiedni

e

i

lości

od

czynników:

2,

3

,4

i

uzupe

łnić

wod

ą

do

25

ml

.

6.

80

mM

M

Mg

Cl

2

(zrobiony

,

4

0

C

)

7.

5

mM

NAD

+

8.

7

mM

zobo

j

ętniony

ATP

(zrobiony,

-20

0

C

)

9.

0

,25

M

KHCO

3

(zrobiony

,

RT)

10.

35

%

kwas

n

adch

lorowy

(PCA)

(zrobiony,

R

T

)

11.

3

M

K

2

CO

3

(zrobiony

,

RT)

12.

5

M

KOH

(zrobiony,

pod

w

y

ciągi

em)

13.

Odczynnik

i

do

ozn

a

czani

a

fos

foru

(patrz

rozdział

„Ozna

czani

e

fosfor

u”)

4

14.

Sta

nd

ardowy

roztwór

glukoz

y

(2

mg/ml)

15.

1

%

roztwór

dinitr o

s

ali

cylowego

w

0

,4

M

N

aOH

.

(zrobiony

,

RT)

16.

Buf

or

do

ozna

czani

a

ml

ecz

anu

o

skł

adzie:

0

,4

M

wodzian

lub

si

arcz

an

hydrazyn

y,

1

M

glicyna

,

5

mM

EDTA;

p

H

9.5

(pH

dopro

wadzić

za

pomoc

ą

5

M

KOH

-

zu

ży

wa

się

go

ok.

10

ml

!)

.

Nal

eży

przy

gotow

ać

50

m

l

buforu

(w

dniu

oznaczania

ml

eczanu

!

)

17.

Roztwór

NAD

(60

mg/

ml)

18.

R oztwór

dehydrogenazy

mle

czan

owe

j

(wydaj

e

pr

owadząc

y)

Wykona

nie

a.

Czynności

przy

gotowawcze

Nastawi

ć

te

mpera

turę

ł

ażni

wodne

j

na

37

0

C

.

Prz

y

gotować

4

s

erie

ponumerowanych

probówek;

- 3

prob

ówki

ok

.

10

ml

d

o

przeprowadzeni

a

inkub

ac

j

i

-

9

ponumerowanych

od

1

do

9

probówek

typu

E

ppen

dorf

zawi

era

j

ących

0,1

ml

35

%

PCA

-

9 probówek

ok

.

10

ml

do

zobo

ję

tnian

ia

prób

- 9

probówek

typu

Eppen

dorf do

prze

chowywania

prób.

b

.

Przeprowadzeni

e

inku

bac

j

i

Do

3

ponumerowanych

probówek

odmierzyć

poszczególnie

składn

iki

mi

eszaniny

reak

cyjn

e

j

wg

.

Tab

eli

(ob

j

ętoś

ci

pod

ano

w

ml)

Numer

probówki

Składniki

1

2

3

Mieszanin

a

podst

awowa

1,6

1,6

1,6

Woda

-

0,4

0,4

MgCl

2

0,4

0,4

0,4

NAD

0,4

-

0,4

ATP

0,4

0,

4

-

KHCO

3

0,4

0,4

0,4

Uwaga, do pip

etowania

homogenatu używa

ć

koń

ców

ek do pip

et s

krócon

y

ch skalp

el

em o ok

. 2

mm.

Przed

rozpo

cz

ęc

iem

reak

cji

mi

eszanin

y

r

eak

c

yjne

inkubo

wać

w

37

0

C

co

najmnie

j

3

min

.

5

Homogenat mózgu

zamiesza

ć

.

Re

akc

j

e

rozpocząć

dodaniem

dokł

adnie 0

,8

ml

homogenatu do

probówki

nr

1.

Wła

czyć

stoper

,

zam

iesza

ć

za

wartość

probówki

i

szybko

pobrać

1

ml

mieszan

iny,

przeni

eść

ją

do

probówki

Eppendor

f

a

nr

1

z

awiera

j

ą

ce

j

PCA.

Probówk

ę

nr

1

z

mieszan

iną

re

akcy

jną

po

nownie

umieś

ci

ć

w

łażni.

Po

1

min

dodać

0,8

ml

homogenatu

do

probówki

nr

2

i

ja

k

pop

rzednio,

po

wymieszani

u

,

pobr

ać

1

ml

do

odpowie

dnie

j

probówki

Eppendorf

a

.

Po

upły

wie

kole

jne

j

minuty

rozpocząć

re

akc

j

ę

w

probówce

nr

3,

pobier

a

j

ąc

również

i

z

ni

e

j

próbę

od

powiada

j

ą

cą

czasowi

„0

min”

.

Po

i

nkubac

ji

z

probówek

1,

2

,3

pobrać

w

od

stęp

ach

1

min

po

1

ml

i

przenieś

ć

do

probówek

Eppendorf

a

(4,

5

,

6)

zawiera

j

ący

ch

PCA.

Cz

as

„30

min”

pobr

ać

odpowi

ednio

do

probówek

Eppendo

rf

a

nr

(7,

8

,

9)

.

W

t

en

sposób

o

trzymuje

się

próby

do

oznaczan

ia

f

osforu

,

gluko

zy,

i

mle

czanu

odpowiad

a

j

ąc

e

0

,

15

,

30

min

inkuba

c

ji

.

c

.

Prz

y

gotowanie

prób

d

o

ozna

czani

a

Prób

y

zawiera

j

ąc

e

wytr

ącon

e

białko

n

ależy

odwirować

w

mikrowiró

wce

przez

2

min.

Supernatanty

przenieść

do

odpo

wiednich

probówek

,

a

nast

ępn

i

e

zawar

tość

każde

j

z

nich

zoboję

tnić

za

po

moc

ą

3

M

węglanu

pot

asowego.

Wartoś

ć

pH

n

al

eży

kontrolować

za

pomo

c

ą

papierk

a

l

akmusow

ego.

Zanotować

ob

j

ętoś

ć

r

oztworu

węglanu

zuż

ytą

do

zobo

j

ętni

ania

każde

j

próby

(

do

zobojętni

ania

1

ml

sup

e

rnat

a

ntu

zuż

ywa

się

około

91

µl

wę

glanu)

.

Po

zob

oję

tnien

iu

próby

należy

przenieść

do

próbów

ek

typu

Eppendorf

i

wst

awić

na

12

-15

min

do

zamrażalnik

a

,

a

nast

ępnie

os

ad

nadch

loranu

zwirować.

Suprna

tant

przenieś

ć

do

odpowiednich

probówek

Eppendorf

a

.

P

róby

przechowuj

emy

zamrożone

.

d

.

Ozna

czani

e

glukozy

Je

dnocz

eśnie

z

oznacz

anie

m

glukoz

y

w

badanych

próbach

nal

eży

w

ykonać

krz

ywą

wzorcową.

Do

probówe

k

na

typu

Eppendorf

n

ależy

odmierzyć

w

dw

óch

powtórzeni

ach

odpowiednie

ob

j

ętoś

ci

ro

z

tworu

wzo

rcowego

tak,

by zawierały

0;

0,1;

0

,2;

0,4;

0

,6

lub

0

,8

mg

glukoz

y. O

bjętoś

ć

roztworu

w

każdej probówce n

ależy

dope

łnić wod

ą dest

ylowaną do 1

ml, a

nast

ępnie

dod

a

ć

0

,175

ml

1

%

roztworu kwasu

din

i

tr

osali

cylowego

w

0

,4

M

NAOH.

Z

ba

danych

prób

pobrać

po

0,15

ml

roztworu

i

p

r

zenieś

ć

do

ponumerowan

ych

próbówek

.

Do

każde

j

próbów

ki

dodać

0,85

ml

wody

destylow

ane

j

,

a

nast

ępni

e

0,175

ml

roztworu

kwasu

dinitrosali

cylowego.

Zawartość

wszyt

ykich

prob

ówek

wymieszać

i

wsta

wić

j

e

do

termobloku

na

100

0

C

na

10

min

.

Po

wyję

ciu

probówki

os

tud

zić

i

zmierzyć

absorp

c

ję

prób

prz

y

550

nm

wobec

pr

óby odczynnikowe

j

(bez

glukoz

y).

6

e

.

Oznaczan

ie

fos

foru

Do

9

probówek

(na

10

m

l)

odmierzyć

po

0

,05

ml

prób

badanych

,

dop

ełni

ć

wodą

do

2

,5

ml

,

a

do

probówki

10

odmie

rz

yć

2,5

ml

wody

dest

ylowanej

.

Nast

ępni

e

do

każde

j

probów

ki

odmierzyć

w

kole

jnoś

c

i

odczynnik

i

do

ozna

c

z

ania

fos

foru

wg

przepisu

w

rozdziale

„Oznaczan

ie

fos

foru

.

.

.”

.

Zawartość

fos

foru

od

czy

tać

ze

sporządzone

j

j

edn

ocześnie

z

próbam

i

badanymi

krzywej

wzorcowe

j

.

f

.

Oznacz

anie

mle

czanu

Do

kuwet

sp

ektro

fo

tom

e

tryczn

ych

odmierzyć

po

14

20

µl

buforu

do

oznac

zania

mle

czanu

,

40

µl

ro

ztworu

NAD

(60

m

g/ml)

oraz

10

µl

ro

ztwo

ru

dehydro

genaz

y

mleczan

owe

j

.

Zawartość

kuwet

wymieszać

za

pomocą

pl

astikow

e

j

szpatu

łki

i

zmierzyć

początkową

war

tość

absorp

c

ji

prz

y

340

nm

wobe

c

pró

by

zawiera

ją

c

e

j

bu

for

(

o

dczyt

zanotować

dopi

ero

po

ust

abilizowan

iu

się

wska

zań

przyrządu,

czyli

po

ok.

10

minutac

h

.

Nast

ępni

e

doda

ć

3

0

µl

prób

y

badane

j

,

roztwór

dokładnie

wymi

esza

ć

i

po

15

minutach

o

dczytać

zmian

ę

ab

sorbc

j

i

.

Obli

czyć

stężenie

mle

czan

u w bad

anych próbach wi

edzą

c

,

że mili

m

olowy

współ

cz

ynnik

absorbanc

ji

dl

a NADH

prz

y f

ali

o

długości

340

nm wynosi

6

,22

.

Opraco

wanie

wyników

Obliczyć

ile

µmoli

glukozy

,

fosforanu

i

m

le

czanu

znajdow

ało

si

ę

w

miesz

a

ninie

re

akcy

jne

j

w

poszczególnych

próbach

(µmol

/

g

móz

gu)

.

Na

podstawi

e

różnic

w

oznaczeni

ach

glukozy,

fosfor

anu

i

ml

e

czanu

obl

iczyć

:

1.

Il

e

µmoli

glukoz

y

i

fosforanu

ubyło

z

mieszani

ny

reakcyjne

j

oraz

ile

ml

eczanu

powst

ało

w

wyniku

glikoliz

y

.

2.

J

aki

j

est

stosun

ek

zuży

cia

fos

foranu

do

i

lośc

i

wykor

z

ystane

j

glukozy.

3.

J

aki

j

est

stosun

ek

iloś

c

i

wytworzonego

mle

czan

u

do

iloś

ci

zużyte

j

glukozy.

Wyniki

zes

tawi

ć

w

tab

el

i.

7

II.

TRANSPORT

ANI

O

NÓW

PRZEZ

BŁ

ONĘ

MITOCH

ONDRIALNĄ

Istnieni

e

wewn

ątrzkom

órkow

ych

struktur

i

przestrzeni

ogranicz

onych

błonami

o

wyspecj

alizowanych

fun

kc

j

a

ch

bio

chem

icznych

j

est

ważnym

czynnikiem

regulacyjnym

w

met

abolizmi

e

komórki

.

Decyduj

ąc

ą

rol

ę

odgr

y

wa

tu

wybiórcza

półprzepuszczalnoś

ć

tych

błon

oraz

związ

ane

z

tym

procesy

uł

atwion

ego

i

ak

tywnego

transportu

met

aboli

tów.

Wła

ściwi

e

tylko

woda

i

rozpuszczon

e

w

nie

j

gazy

;

CO

2

,

O

2

,

NH

3

,

przenik

a

j

ą

swobodnie

przez

błonę

mito

chondrialn

ą

na

zasadzie

dyfuzj

i

.

Kwa

sy

di

-,

trikarboksylowe

,

pośredniki

cyklu

kwasów

trikarboksylowy

ch

,

mogą

być

transportowane

do

mito

chondriów

w

w

yniku

istnieni

a

swoistych

przenośników.

Wi

elu

danych

o

transporcie

m

et

aboli

tów

przez

błonę

mitochondri

aln

ą

dost

arc

zył

y

badania

szybkości

pęczni

enia

mito

chondrió

w

zawieszonych

w

izoosmotycznych

ro

ztw

orach

soli

a

monowych.

Pomiar

pę

cznieni

a

przeprowadza

się

spektrofoto

me

trycznie

pr

zy

długości

f

ali

520

n

m

.

Mate

riały

i

odczynniki

1.

Mito

chondri

a

z

w

ątro

by

lub

n

erki

szczura

lub

królika

(wydaje

pro

wadz

ący)

2

.

20

mM

bu

foru

TRIS

- HCl

pH

7

,4

3.

1

mM

roztwór

rot

eno

nu

w

e

tanolu

(wydaj

e

pro

wadząc

y)

4.

0

,2

M

roztwór

kwa

su

glutaminowego

zobo

jętn

i

ony

3 M

roztworem

NH

3

,

pH

7

,4

5

0

,2

M

roztwór

kwa

su

glutaminowego

zobo

jętn

i

ony

2 M

roztworem

KO

H,

pH

7

,4

6.

0

,

15

M

roztwór

kwa

s

u

cytryno

wego

zoboję

tni

ony

3 M

roztworem

NH

3

,

pH

7

,4

7.

60

mM

roztwór

j

abł

cz

anu

zoboj

ętniony

(

na

pa

pier

ek

la

kmusow

y

)

2

M

r

oztworem

T

ris

8

0

,2

M

roztwór

j

abł

cza

nu

zobo

ję

tniony

3

M

roztworem

NH

3

,

pH 7

,4

9

0

,3

M

roztwór

o

ctanu

amo

nowego

10

0

,3

M

roztwór

chlor

ku

pot

asowego

11

0

,6

M

roztwór

fos

foranu

pota

sowego

12

0

,6

M

roztwór

s

ach

ar

ozy

Wykonanie

a.

Czynności

przy

gotowawcze

:

Na

10

min

przed

pomiarem

wł

ączyć

spektrofo

tometr

i

ust

awić

długość

f

ali

n

a

520nm

.

Prz

y

gotować

2

kuwety.

Do

j

edn

e

j

z

ni

ch

(A)

od

mierzyć

1,

5

ml

wody

d

estylowane

j

(próba

odniesi

eni

a)

,

do

drugiej

(B)

700

µl

buforu

Tris

-HC

l

o

pH

7,4

;

700

µl

sachar

ozy

i

5

µl

rotenonu.

Kuwet

y

umieści

ć

w

spek

trofotom

etrze

.

Do

kuwet

y

B

dodać

10

µl

zawiesi

ny

mitochondriów

i

8

natychmia

st

zmi

erzyć

a

bsorbc

ję

proby.

Na

po

dstawi

e

uzyskanych

wy

ników

rozcień

czyć

zawiesin

e

mito

chondrió

w

tak,

aby

po

dodaniu

j

e

j

w

iloś

ci

10

do

kuwety

zawier

a

j

ą

ce

j

roztwór

sach

arozy

z

rotenonem

wartość

absorpc

j

i

próby

mierzona

przy

520

nm

wynosiła

około

0

,8

00-

0,9

90

.

(

Uwaga

-

mito

ch

ondria

n

ależy

rozcień

czyć

0,3

M

m

annito

lem)

.

Tak

rozcień

czone

mitochondri

a

stosow

ać

d

o d

alszych

b

adań

.

b

.

Ozna

czani

e

p

ęczni

eni

a

mito

chondriów

Do

suchych

szklanych

kuwet

spektro

fotom

etrycznych

odmierzyć

posz

czególne

składn

iki

mieszan

iny

w

ilościa

ch

podanych

w

Tabeli

w

µl.

Poszczególne

kuwety

um

ieszcza

ć

kol

e

jno

w

spektrofoto

me

trze,

s

tosu

j

ąc

j

ako

próbę

odni

esi

eni

a

wodę

des

tylowaną

.

Sz

ybkość

pęcznieni

a

mitochondriów

w

kuwec

ie

bad

ać

doda

j

ą

c

do

nie

j

10µl

upszednio

pr

z

y

got

owane

j

zawi

esiny

mitochondriów

i

mierzą

c

wartość

ab

sorbc

ji

przy

520

nm

po

15

sekundach

od

dodani

a

mitochondriów

.

Kolejn

e

trz

y

pomiary

absorpc

ji

wy

kon

ywać

co

15

se

kund

od

momentu

dodania

m

itochondriów

, a

nast

ępni

e

w

odstępa

ch 30

sekund

notuj

ą

c

zmian

y

absorpcji

przez

6

minut

.

Analogiczne

pom

i

ary

wykonać dl

a

pozo

st

ał

ych

prób.

Składniki

mieszan

iny

reak

cyjne

j

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Bufor

Tris

-HCl

700

700

700

700

700

700

700

700

700

700

Sacharoza

700

KCl

700

Glutamini

an

potasowy

700

Glutamini

an

amonowy

700

Cytr

ynian

amonowy

700

700

700

Fosforan po

tasowy

50

50

50

Jabł

czan

-Tris

50

Jabł

aczan

amonowy

700

700

Octan

amonowy

700

Rotenon

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

9

Opraco

wanie

wyników

Wyniki

uz

yskane

dla

pos

zczególnych

prób

przeds

tawić

w

post

aci

wykresu,

odkł

ada

j

ą

c

na

os

i

odcię

tych

czas

pomi

aru

pęczni

enia

m

itochondrió

w

,

a

na

osi

rzędnych

wa

rtość

absorpc

j

i

przy

520

nm.

Wy

jaśn

ić

różnicę

szybkości

pę

cznie

nia

mito

chondriów

w

obecnoś

ci

różnych

substratów.

10

III .

META

BOLIZM

G

LIKOGENU

W

HO

M

OGENACIE

WĄTRO

B

Y

Proces

degrada

c

ji

glikogenu

przebiega

w

wą

trobie

i

w

mi

ęśni

a

ch

,

kt

óre

c

e

chu

je

duża

zawartość

t

ego

wi

elo

cukr

u.

Rozkł

ad

glikogenu

j

est

k

ata

lizowany

przez

fos

f

orylazę

glikogenu

:

gliko

gen

(n

re

sz

t glukozy

)

+

fo

sforan





glikogen

(

n

-

1

re

szt

glukozy)

+

glukozo

-1-f

osforan

In

vivo

równowaga

tej

r

eak

c

ji

j

est

znaczni

e

przesuni

ęta

w

kierunku

de

gradac

ji

glikogenu.

Jednakż

e

w

określonych

warunkach

i

n

v

itro

szyb

kość

reak

c

ji

w

kierunku

przeciwnym

jes

t

3

-

krotnie

wyższa

niż

w

ki

erunku

f

iz

jologicznym

.

Fosforylaza

glikogenu

występuje

w

dwó

ch

forma

ch

aktywnej

(

fos

f

orylaza

a)

oraz

znaczni

e

mni

e

j

aktywne

j

(fos

f

orylaza

b)

,

które

j

inhibitorem

j

est

ko

f

eina

.

W

obe

cnośc

i

kinazy

fosforylazy

i

ATP

for

ma

b

może

zost

ać

przekształcon

a

w

formę

a

.

Forma

a

przechodzi

w

formę

b

przy

udziale

fo

sfa

tazy

fos

forylazy.

W

ćwi

czeniu

aktywność

fosforylazy

j

est

mi

erzona

szybkością

uwalni

ani

a

f

osfor

anu

z

glukozo

-1-fosforanu

.

Odczynni

ki

1.

0

,9

%

NaCl

2.

0

,5

M

glukozo

- 1

-

fos

f

oran

(zrobiony

,

-20

0

C

)

3.

10

%

roztwór

glikogenu

4.

1

M

Na

F

5

Roztwór

kof

einy

[10

m

g/ml]

6.

Odczynniki

do

oznac

zania

fos

foru

metod

ą

Fi

ske

-Subbarowa

(Patrz:

rozdz.

”

Ozna

czani

e

fosforu

”)

7.

0

,2

M

AMP

(zrobiony

,

-20

0

C

)

8.

35

%

kwas

n

adch

lorowy (PCA)

(zrobiony,

RT)

Przygotowanie

homoge

nat

u

wąt

roby

Pobraną

ze

zwierzęci

a

wątrobę

umi

eśc

ić

w

zle

wce

z

oziębionym

0,9

%

NaCl

.

Zważ

yć

5g

wątroby,

rozdrobnić

ją

skalpel

em

,

a

nast

ępni

e

zhom

ogenizować

w

20

ml

oziębionego

roztworu

Na

Cl

.

Homogenat

przesą

czyć

przez

2

w

arstwy gazy

opatrunkowe

j

.

11

Przepro

wadzenie

inku

b

acji

Do

12

ponumerowanych

probówek

Eppendorfa

d

odać

po

20

µl

PCA.

Do

4

probówek

(A

,

B,

C ,

D)

odmi

erzyć

skł

adni

ki

m

iesz

aniny

re

akcy

jn

e

j

wg

Tab

eli

(wartoś

ci

pod

ano

w

µl

)

.

Substrat

A

B

C

D

Glukozo

-1-

P

60

60

60

60

Glikogen

200

200

200

200

NaF

-

200

200

200

kofe

ina

-

-

10

-

AMP

-

-

-

40

Woda

240

40

30

-

Zawartość

probówek

wymiesza

ć

i

preinkubowa

ć

przez

5

min

w

łaź ni

wod

ne

j

o

t

emperaturze

37

0

C

.

R

eak

c

j

e

enzymat

yczną

rozpocząć

dodani

e

m

do

probówki

A

0,5

ml

ogr

zanego

w

łaźni

homogenatu

wą

troby

(

d

o

pipetow

ani

a

użyć

śc

ię

te

j

koń

cówki)

.

Wł

ączyć

stoper

i

za

miesz

a

ć

zawartość

probówki

.

Szy

bko

pobrać

200

µl

miesz

aniny

i

przenieść

do

pro

bówki

Eppendorfa

nr

1

zawiera

j

ąc

e

j

PCA

.

Po

upływie

1

min

dodać

0

,5

ml

homogena

t

u

do

probówki

B

,

pobiera

j

ą

c

po

200

µl

p

róby

do

probówki

Eppe

ndorfa

nr

2

.

Po

upływi

e

kole

jn

e

j

minu

ty

rozpocząć

re

akc

j

ę

w

probówce

C

,

a

nas

tępni

e

w

D,

pobi

era

j

ąc

po

200

µl

próby

do

p

robówek

Eppendorf

a

odpowiednio

nr

3

i

4.

Kolejn

e

próby

p

obiera

ć

w

10

i

20

min

z

p

robówki

A

,

w

11

i

21 min

z

probówki

B

,

w

12

i

22

m

in

z

C

,

a

w

13

i

23

min

z

D

.

Przygotowanie

prób

do

oznaczeń

Prób

y

zawiera

ją

ce

wytr

ącon

e

bi

ałko

wirowa

ć

p

rzez

1

min

w

mikrowi

rówce

.

Supern

atan

ty

przenieść

do

probówek

Eppendorf

a

i

użyć

b

ezpośrednio

do

ozn

aczeń

l

ub

przechowywać

zamrożone.

Oznaczanie

fos

fo

ru

w

badanych

próbach

i

opra

cowani

e

wyników

Do

probówek

dodać

7

5

µl

badanych

prób

i

dopełni

ć

wodą

do

2

,5

ml.

J

ednocześnie

prz

y

gotować

krzywą

wzorcową

do

ozna

czeń

f

osforu

wg

przepisu

zaw

artego

w

rozdziale

„

Oznaczan

ie

fos

foranu

metod

ą

Fiske

–Subbarowa”

,

dod

a

j

ąc

kwas

tró

jc

hlorooctowy,

kwaśny

roztwór

molibdenianu

a

monowego

i

odczynnik

r

eduku

ją

cy

również

do

pr

ób

badanych

.

Dal

e

j

postę

powa

ć

zgodnie

z

przepisem

.

Wykreślić

krz

ywe

obrazuj

ąc

e

p

rzebieg

reakc

j

i

w

12

poszczególnych

próbach

odkłada

j

ą

c

na

osi

Y

ilość

µ

moli

P/ml

mieszaniny

r

eak

cyjn

e

j

,

a

na

osi

X

-

czas

w

m

inuta

ch

.

13

IV.

M

ETABO

LIZM

ARGININY

W

MIT

OCH

ONDRIACH

Amoniak

powst

a

j

ąc

w

w

yniku

przemian

związ

ków

azotowych

jes

t

usu

wany

z

organizmów

ssaków

w

postac

i

moc

znika

dzięki

dział

ani

a

enzymów

cyklu

moczni

kowego.

Arginaza,

kata

lizu

ją

c

a

ostatn

ią

re

a

kc

ję

cyklu

,

powodu

je

ro

zkład

argininy

z

w

ytwor

zeniem

mo

cznika

i

ornityn

y.

Enz

ym

ten

w

ystęp

uj

e

we

frak

c

ji

cytolos

owe

j

wątroby

oraz

w

mitochondriach

wątroby,

n

erki

i

innych

t

kanek

.

W

mito

chondria

ch

,

w

obecnoś

ci

2-oksoglutaranu

,

ornityna

podlega

następni

e

re

akc

j

i

transam

ina

c

ji

k

at

alizowa

ne

j

przez

amino

trans

fer

a

zę

ornitynową

z u

tworzeniem

glutamin

i

anu

.

Aktywność

arginaz

y

ozn

acza

s

ię

n

a

podst

awie

po

miaru

iloś

ci

ornityny

uw

olnione

j

w

trak

ci

e

inkubac

j

i

,

aminotran

sf

e

razy

zaś

na

podstawi

e

iloś

ci

wyprodukowanego

glutaminianu

.

Aminokwasy

w

p

róbach

oznacza

si

ę

za

po

mocą

wysokociśni

enio

we

j

chroma

tografii

c

ie

czowe

j

w

układzi

e

z

odwróconymi

faz

a

mi

(RP

-HP

LC)

.

Przed

przeprowadzenie

m

chromatograf

ii

aminokw

asy

przeprowadza

się

w

pochodne

DABSYLo

we,

co

u

możliwia

pomiar

st

ężeni

a

w

z

akres

ie

świ

atł

a

widzialn

ego

(maksimu

m

absorp

c

ji

436

nm)

Aminokwas

(NH

2

) +

DABS

(SO

2

C l)



Am

inokwas

(NHSO

2

)

DABS

Rozdziału

a

minokwasów

dokonuj

e

s

ię

na

ko

lumn

ie

Spherogel

®

C

1

8

.

Fazą

ruchomą

s

ą

:

bufor

octanowy

pH

3,5

oraz

ac

etonitryl

.

Chrom

atografi

ę

rozwij

a

się

w

gr

adien

ci

e

liniowym

zaczynaj

ąc

od

20%

ac

eto

nitrylu i

zwiększa

j

ąc

j

ego

st

ężeni

e

do

70%

w

ci

ągu

25

min

.

Odczynni

ki

1.

Mito

chondri

a

izolowa

ne

z w

ątroby

lub

nerki

kr

ólika

(wydaje

p

rowadzą

c

y)

2.

Mi

eszanin

a

podst

awowa

o

składzie

:

0

,24

M

m

annitol

.

,

20

mM

bu

for

fo

sforanowy;

pH

7,4

(przygotować

w

dniu

in

k

ubacji)

3.

0

,1

M

roztwór

kwasu

amin

ooksyoctowego

(AOA)

zobojętn

iony

za

pomocą

3M

KOH

(zrobiony,

-

20

0

C

)

4.

0

,1

M

zobo

ję

tniony

ro

ztwór

kwasu

2-

ok

soglutarowego

(na pap

ier

ek

la

kmusowy

)

5.

0

,2

M

roztwór

argininy

zoboję

tniony

za

pomo

c

ą

HCl

(na

papier

e

k

la

kmusowy

)

6.

0

,1

M

zobo

ję

tniony

ro

ztwór

kwasu

j

abłkowego

(na

papie

re

k

la

kmusowy

)

7.

M

et

anolowy

roztwór

rotenonu

(0,2

mg/

ml

)

(wy

daje

prowadzą

cy)

8.

8

mM

roztwór

chlorku

d

absylu

w

a

ce

toni

e

(wydaje

prowadzą

cy)

14

9.

0

.4

M

bu

for

w

ęglanowy

pH

9

,0

(wydaje

pro

wa

dzący)

10.

35

%

roztwór

kwasu

nadchlorow

ego

(zrobiony

,

RT)

11.

3

M

roztwór

K

2

CO

(z

robiony

,

RT)

12.

Odczynnik

biur

etowy

do

ozna

czani

a

bi

ałk

a

(zr

obiony

,

RT)

13.

10

%

roztwór

dezoks

ycholanu

sodow

ego

(zrobiony

,

RT)

14.

70%

et

anol

(wydaj

e

p

rowadząc

y)

Wykona

nie

Do

naczynek

inkubacyjnych

odmi

erzyć

składn

iki

mieszan

iny

reakc

yjne

j

w

i

lości

a

ch

podanych

w

t

abe

li

(µ

l

):

Składniki

1

2

3

4

5

Mieszanin

a

podst.

1000

1000

1000

1000

1000

Ar

ginina

50

50

50

50

50

2-OG

-

40

40

40

40

Jabł

czan

-

-

20

-

20

AOA

-

-

-

40

40

Rotenon

20

20

20

20

20

Woda

830

790

770

750

730

Naczynka

preinkubow

ać

w

t

emper

aturze

30

0

C

p

rzez

5

minut

,

a

nas

tępni

e

rozpocząć

re

akc

j

e

enzymatyczne

poprzez

d

odanie

po

100

µl

zawiesiny

mitochondriów

do

k

ażdego

naczynka

w

odstęp

ach

1-minutowych.

Po

40

minutach

ink

ubac

j

e

przerwać

pobi

era

ją

c

1

ml

próby

do

probówek

Eppendorf

a

z

awier

a

ją

cych

po

100

µl

35%

PCA

.

Próby

w

y

miesza

ć

i

sch

łodzić

przez

10

min

w

za

mrażalniku

.

Nast

ępni

e

pr

óby

zwiro

wać

,

przeni

e

ść

sup

ernat

ant

y

do

odpowiednio

ozna

czonych

probówek

i

zobo

ję

tni

ć

j

e

za

pomo

cą

3

M

w

ęglanu

pot

asowego

(nal

eży

uż

yć

około

100

µl

węglanu

na

1

m

l

su

pernat

antu)

.

Zoboj

ętnion

e

p

róby

ponownie

schłodzić

,

a

n

ast

ępni

e

ci

ecze

znad

os

adów

przenieś

ć

do

probówek

Eppen

dorfa

i

odwirow

a

ć

pozostałośc

i

osad

u

.

Nie

zapo

mnieć

o

oznaczeniu

białka

mitoch

ondrialnego

(wg

prze

pisu

w

rozdziale

„Oznaczanie białka metodą

biuretową

”)

.

15

Przygotowanie

prób

do

chromatografii

(

dabsyl

acja

)

Wszystkie

czynności

należy

wykonywać

pod

kierunkiem

prowadzących.

Do

podpis

anych

kalibrowanych

probówe

k

Eppendorf

a

dod

ać

p

o

50

µl

buforu

w

ęgla

nowego

pH

9,0

,

a

nast

ępnie

–

50

µl

zobo

j

ętnion

e

j

próby

oraz

200

µl

roztworu

DABS

w

ac

etoni

e

.

Zawartość

probówek

wymieszać

zg

odnie

ze

wskazówkami

otrzyman

ymi

od

prowad

zących.

N

astępn

ie

probówki

umieśc

ić

n

a

10

min

w

ciep

lar

ce

rozgrza

ne

j

do

t

emper

atury

70

0

C.

Po

upływie

tego

czasu

probówki

wyjąć

z

ciep

larki

,

d

elik

atni

e

wy

miesza

ć

i

ch

zawartoś

ć

i

z

powrotem

wstawić

do

ciepl

arki

na

dalszych

10

min.

Po

zakończeniu

dabsylac

ji

próby

u

zup

ełni

ć

do

0,5

ml

z

a

pomocą

70

%

etano

lu

i

wymieszać

za

pomoc

ą

mieszad

ła

e

lektrycznego.

Tak

pr

z

y

gotowane

próby

mo

żna

przechowywać

zamrożone.

Chro

matografi

czny

rozd

ział

aminokwasów

j

est

wykon

ywan

y przez prowadzących

.

Studen

ci

int

er

pretu

ją

o

trzymane

chrom

atogramy.

Opraco

wanie

wyników

Obliczyć

ilo

ść

ornityny

i

glutaminianu

w

próba

ch

.

Wyniki

wyrazić

w

n

mol/

mg

białk

a

.

16

V.

KARBOKSYL

A

CJA PIROGRONIANU

W

MITOCHONDRIA

CH

WĄTROBY

Pierwsz

y

etap

glukoneogen

e

zy

-

karboksylac

ja

pirogronianu

z

w

ytworzeniem

szczawiooct

anu

,

kat

al

izowana

przez

karboksylazę

pirog

ronianową

(lig

azę

pirogronian

:

CO

2

;

E

C 6

.

4

.

1

.

1)

,

z

a

chodzi

w

mitochondri

ach

zgodnie

z

nas

tępu

j

ą

cym

równani

e

m:

Acet

y

l

o

C

o

A

,

Me

+2

P

irogronian

+ ATP

+

H

CO

3

-

------

---

----

---

---

---



szcz

awiooct

an

+

ADP +

fo

sfor

an

Stwierdzono,

że

szybkość

k

arboksylac

ji

p

irogro

nianu

może

być

regulowana

przez

kwasy

tłus

zczowe

.

Związki

t

e

są

wykorz

yst

ywane

mitochondri

ach

j

ako

su

bstraty

odde

chowe

,

utleni

eniu

których

to

warzys

z

y

w

ytwarzanie

ac

etylo

-CoA,

aktywatora

karboksylazy

pirogronianowej

.

Ponadt

o

długołań

cuchow

e

kwas

y

tłuszczowe

hamu

j

ą

tra

nsport

nukleotydów

adeninowych

przez

błon

ę

mi

tochondri

aln

ą

,

zaś

n

iena

sycone

kwa

sy

tłuszc

zowe

są

zn

ane

j

ako

związki

rozpr

zęgają

c

e

oksydacyjną

fos

forylac

j

ę

.

Różny

wpł

yw

kwasów

tłuszczowych

na

szybkość

procesu

k

arboksylac

ji

pirogronianu

j

e

st

uwarunkowany

międz

y

innymi

rodzajem

kwasu

tłusz

c zowego

oraz

stan

em

me

tabol

i

cznym

mitochondriów

.

W

warunka

ch

fiz

jologicznych

powsta

j

ący

szczawiooc

tan

ul

e

ga

redukc

ji

do

j

abł

cza

nu

,

pod

wpływem

dehydro

genazy

jabł

czan

owe

j

,

lub

je

st

przekszta

łcany

w

cytrynian

w

re

akc

j

i

kat

alizowan

e

j

przez

syn

ta

zę

cytr

ynianową

.

Sz

ybkość

karb

oksylac

ji

pirogronianu

można

zmierzyć

enzymatycznie,

ozna

cza

j

ąc

zaw

artość

j

abł

czanu

i

cytr

ynianu

w

mitochon

driach

,

bądź

t

eż ,

po

podaniu

znakow

anego

H

14

CO

3

-

,

iloś

ci

ą

r

adioak

tywnego

dwutlenku

węgla

włączon

ego

do

produktów

karboksylac

j

i

.

Mate

riał

i

odczynniki

1.

Mito

chondri

a

wątrob

y

królika

(1

ml

zawiesiny

zawiera

ją

ce

j

w

przybliżeniu

60

mg

białk

a/m

l

)

(wydaje

pro

w

adzący)

2.

1

M

roztwór

chlorku

p

otasowego

(zrobiony

,

4

0

C )

3.

0,1

M

chlorku

magnez

owego

(zrobiony,

4

0

C )

4.

0,2

M

bu

for

fos

forano

wy (

K

2

HP

O

4

/KH

2

PO

4

),

pH

7

,4

(zrobiony,

4

0

C )

5.

0,2

M

bu

for

Tris

- HCl

,

pH

7

,4

(zrobiony,

4

0

C )

6.

0,1

M

roztwór

EDT

A

(zrobiony,

4

0

C )

17

7.

M

iesz

anina

podst

awowa

o

n

ast

ępu

ją

cym

skła

dzie:

30

mM

KC

l

,

4

m

M

EDTA,

10

mM

MgCl

2

,

20

mM

bu

for

f

osforanowy

pH

7,4

,

0

,1

M

bu

for

Tris

-HCl

pH

7,4

.

Miesz

aninę

o

ostat

eczn

e

j

ob

jętoś

ci

50

ml

sporządzić

poprzez

z

mieszan

ie

w

kolbie

mi

ar

owe

j

odpowiedni

ch

ilości

od

czynników

2

,3

,4

,5

i

6

.

Uzupełn

ić

ob

j

ętoś

ć

wodą

.

(przygotowa

ć

w

d

niu in

kuba

cji)

8.

0,2

M

roztwór

kwa

su

pirogrono

wego zoboję

tn

i

ony

Na

OH

(na

papie

re

k

l

akmusowy

)

lub 0

,2

M

roztwór

pirogronianu

sodowego

9.

1

M

roztwór

kwa

śnego

węglanu

pot

asowego

z

awier

a

ją

cy

Na

H

14

CO

3

(6

0

μ

Ci

/m

l )

(wydaj

e

prowadząc

y)

10.

50

mM

roztwór

kw

as

u

p

almitynowego

w

et

an

olu

(wydaj

e

prowadzą

cy)

11.

50

mM

roztwór

kw

as

u

k

aprylowego

w

et

anolu

(wydaje

pro

wadząc

y)

12.

0

,2

M

zobo

jętn

iony

roztwór

burszt

ynianu

(na

papier

ek

lakmuso

wy

)

lub

0

,2

M

roztwór

bursztynianu

sodowego

13.

0,1

M

roztwór

ATP

z

oboj

ętniony

Tris

(zrobiony

,

-20

0

C

)

14.

1

mM

roztwór

rot

eno

nu

w

e

tanolu

(zro

biony

,

-20

0

C

)

15.

Oligomycyna

,

roztwór

e

tanolowy

(1

mg/ml)

(wydaj

e

prowadzą

cy)

16.

10

mM

roztwór

2,4

-dinitrof

enolu

(DNP

)

w

etanolu

lub

1

mM

et

anol

owy

roztwó

r

FCCP

(wydaje pro

wadząc

y)

17.

Mi

eszanin

a

s

cyntylacyjna

(wydaje

pro

wadząc

y

)

18.

Odczynniki

do

ozn

a

c

zania

bi

ałk

a

m

etodą

b

iuretową

(zrobion

e

,

RT)

19.

35%

kwas

n

adch

lorowy

(zrobiony,

RT)

20.

3

M

roztwór

węglanu

pot

asu

(zrobiony

,

RT)

Wykona

nie

a.

Czynności

przy

gotowawcze

Wszystkie

czynności

wymaga

jące

pracy

z

izotopem

14

C

przeprowadzać

pod

kierun

kiem

prow

adzących

i

bezwzg

lędnie stoso

wa

ć

si

ę

do

r

egulami

nu.

Włą

czyć

termost

at

utrzymuj

ą

cy

stałą

temp

era

turę

(30

0

C )

w

na

czynkach

inkubacy

jnych.

Do

probówek

typu

Eppendorf

podpisanych

A1

,

A2

,

B1,

B2,

C1

,

C2

lub

w

in

ne

j

kombin

a

c

ji

(wg

decyzji

prowadz

ących)

odmierzyć

po

0,1

ml

35%

PCA.

Do

wskazanych

przez

prowadzących

naczynek

inkuba

cyjnyc

h

(np.

A

,

B

,

C)

odm

ierzyć

poszczególne

sk

ładniki

mi

eszaniny

reak

cyjne

j

w

iloś

cia

ch

podanych

w

tabeli

(μl)

.

Nad

naczynkami

inkubacyjnymi

umie

ści

ć

zamocowan

e

w

korkach

szklane

rurki

z

kapilara

mi

podłączonymi

do

butli

z

mieszaniną

tl

enu

i

dwutl

enku

węgla

(k

arbogenem)

.

18

Składniki

A

B

C

D

E

F

G

Mieszanin

a

podstawowa

1500

1500

1500

1500

1500

1500

1500

Na

H

14

CO

3

w

K

HCO

3

50

50

50

50

50

50

50

Piro

gronian

50

50

50

50

50

50

50

Kapr

ylan

-

20

-

-

-

-

-

Palmitynian

-

-

20

-

-

-

-

Bursztynian

-

-

-

-

150

-

-

ATP

-

-

-

-

-

10

10

Oligom

ycyna

-

-

-

-

-

10

10

Rotenon

-

-

-

10

10

10

10

DNP lub

FCCP

-

-

-

-

-

-

10*

Woda

1400

1380

1380

1390

1240

1370

1360

*UWAGA

W

przypadku

próby

G,

do

na

czynka

inkuba

cyjn

ego

doda

je

my

wsz

ystkie

składnik

i

wed

ług

tabe

li

,

z

wyjątki

em

DNP

lub

FCCP.

Następni

e

doda

jemy

zawiesin

ę

m

itochondriów

i

po

minuci

e

rozpoczynamy inkubac

j

ę

przez

dodani

e

DNP lub FCCP.

b.

przeprowadz

enie

inku

bac

j

i

Poprosić

prowad

zących

o

odkręc

enie

dop

ływu

k

arbogenu

do

naczynek

i

nkubacyjnych

.

Do

naczynka

A

doda

ć

0

,15

ml

zawies

iny

mitochond

riów

i

włączyć

stoper

.

N

atychmia

st

pobra

ć

1

ml

mieszan

iny

i

przenieść

do

probówki

Eppendorfa

A1

zawier

a

ją

c

e

j

0

,1

ml

35%

PCA

.

Po

1

min

doda

ć

0,15

ml

za

wiesiny

mitoc

hondriów

do

naczynka

B

i

podob

nie

j

ak

poprzednio

natychmia

st

pobra

ć

próbę

zerową

do

probówki

Eppendorf

a

B1

zawi

era

ją

c

e

j

0

,1

ml

35

%

PCA.

Podobnie

post

ępo

wać

z

kol

e

jnymi

próba

mi

,

zachowu

j

ą

c

j

ednomi

nutowe

przerwy.

Po

10

minuta

ch

od

momen

tu

dodania

m

itochondr

ió

w

do

pierwszego

nacz

y

nka

inkuba

cyjn

ego

pobrać

po

1

ml

mieszani

ny

inkubacyjne

j

z

kole

jn

ych

naczynek

i

pr

zenieść

(z

zachowanie

m

te

j

sam

e

j

kol

e

jnoś

ci

i

j

ed

nominutowych

przerw

j

ak

pod

czas

rozpoczynania

inkuba

c

ji

)

do

probówek

Eppendorfa

zawiera

j

ą

cych

0,1

ml

35

PCA,

podpisanych

A2,

B2

,

C2

itd

.

(O

czy

wiście

n

aczynka

podpisuj

emy

A,

B

,

C

,

j

eże

li

to

akurat

t

en

zest

aw

doświadcz

alny

został

wyb

rany

przez

prowadzą

cych

.

)

19

Probówki

Eppendorfa

z

awier

a

ją

c

e

wytrącon

e

b

iałko

wstawi

ć

do

lodó

wki

na

10

min

,

a

nast

ępnie

odwirowa

ć

w

mikrowirówce

.

Supernatan

ty

(dokładnie

po

0

,

8

ml)

przenieś

ć

do

odpowiednio

podpis

anyc

h

probówek

i

w

stawi

ć

n

a

30

minut

do

wytrząsarki

(po

ki

erunkiem

prowadzących)

,

a

n

ast

ę

pnie

zneu

tralizowa

ć

3

M

węglanem

pot

asowy

m

.

Po

odwirowaniu

osadu

nadch

loranu

po

tasowe

go

przenieść

p

o

0,5

ml

każde

j

próby

do

naczynek

scyntylacyjnych,

doda

ć

po

5

ml

mi

eszaniny

scyntylacyjne

j

i

zmierzyć

radioak

tywność

prób

(pod

kierunkiem

prowad

zących)

.

Ni

e

zapom

nieć

o

oznaczeniu

białka

mitocho

n

drialnego

(wg prz

episu

w

rozdziale

„Oznaczanie

białka metodą biuretową”)

.

c

.

Opracow

ani

e

wynikó

w

Otrz

ymane

wyniki

w

y

r

azić

li

czbą

impulsów

(cpm

)

radio

aktywnego

dwutlenku

węgl

a

włączonego

w

ci

ągu

min

uty

na

mil

igram

bi

ałk

a

m

itochondri

alnego.

20

V

I

.

WP

ŁYW

RÓŻNYCH

EFEKT

ORÓW

N

A

AKTYWNOŚĆ

DEHYDROGENAZY

GLUTAMI

NIANOWE

J

W

MITOCHONDRI

ACH

WĄTROBY

LUB

KORY

NERKI

Dehydro

genaza

L

glutaminianow

a

k

ata

lizu

je

re

akc

j

ę

r

edukcyjn

e

j

am

ina

c

ji

2-oksoglutaranu

oraz

re

akc

j

ę

oksyda

cyjne

j

d

ezamin

a

c

ji

glutam

inia

nu;

2-Oksoglutaran

+ NH

4

+

+

NAD(P)

H

+

H

+

↔

L

–glutaminian

+

NAD(P)

+

+

H

2

O

Dehydro

genaza

glutamin

ianowa

(GD

H)

j

est

w

ażnym

ogniwem

wiążącym

met

abolizm

b

iał

ek

i

cukrowców,

dost

arcza

j

ąc

w

zależnośc

i

od

stanu

fizjologicznego

komórki

2

-okso

glutaranu

lub

glutam

inianu

.

Utleni

enie

glutam

inianu

prowadzi

do

uwolnienia

jonu

amonow

eg

o

or

az

wytwo

rzenia

2

-

oksoglutaranu,

który

może

być

wykor

z

ystany

w

reak

c

ja

ch

tr

ansa

mina

c

ji

lub

włą

czony

w

przemiany

cyklu

Krebs

a

.

Wytworzony

w

reakc

ja

ch

cyklu

kwasów

trikarboksylow

ych

szczawiooct

an

je

st

z

kolei

substrat

em

k

arboksykinazy

fosfo

en

olopirogroni

anowej

.

,

kluczowego

enzymu

szlaku

glukoneogenezy

lub

syntezy

cytr

ynianowe

j

,

uważ

ane

j

za

regulatorowy

enzym

cyklu

Krebsa

.

W

wątrobie

amoni

ak

u

wolniony

w

reakc

ji

k

at

alizowan

e

j

przez

GDH

j

est

zużywan

y

do

syntezy

mocznika

,

a

w

nerc

e

bi

erze

udzi

ał

w

k

ontroli

równowagi

kwasowo

-zasadowe

j

.

W

warunkach

zwiększone

j

zawartości

jonów

amon

owych

w

komórce

GDH

katalizu

j

e

reak

c

j

ę

wytwarzania

glutam

inian

u.

Mat

eriały

i

od

czynniki

1.

Mito

chondria

wątroby

(ok.

2

mg

bi

ałk

a

n

a

m

l)

lub

n

erki

królik

a

(20

m

g

białka

na

ml)

lub

s

zczura

(wydaj

e

prowadz

ący)

2.

.

0,2

M

Bu

for

Tris

-

H

Cl

,

pH 7

.4

3.

1

M

KCl

4.

0

,1

M

EGTA,

pH

7

,4

(

2

ml)

5.

Mi

eszanin

a

podstawo

wa;

40

mM

Bufor

Tris

-

HCL,

240mM

KCL,

6

m

M

EGTA.

Do

kolby

miarowe

j

o

po

je

mności

25

ml

odmi

erzyć

odpowiednie

iliś

ci

skł

adnikó

w

2,

3

,4

,

i

ob

j

ętoś

ć

uzupełnić

wod

ą

do

kresk

i.

(Przygotowa

ć

w

dniu

o

znaczen

ia)

6.

1

M

NH

4

Cl

7.

10

%

Triton

X

- 100

(zrobiony

,

RT)

21

8.

1

mM

rot

enon

w

me

ta

nolu

(wydaj

e

prowadzą

c

y)

9.

10

mM

NADH

(przyg

otować

b

ezpośr

ednio

prz

ed

uży

ci

em)

10.

0

,2

M

2-oksoglutaran

,

pH

7

,4

(przygotować

b

ezpośredn

io

przed

u

ży

ci

e

m

)

11.

0

,1

M

ADP,

pH

7

.4

(

wydaj

e

prowadzą

cy)

12.

0

,1

M

Leucyna

(wydaje

prowadzą

cy)

14.

0

,2

M

genta

mycyna

15.

2

mM

chloroch

ina

Wykona

nie

A

.

Czynności

przy

gotow

awcze

Nastawi

ć

termom

etr

kon

taktowy

termost

atu

30

0

C

podł

ączyć

t

ermost

atyz

owaną

przystawkę

do

spekola

i

włą

czyć

ogr

zewanie

.

Do

termos

tatu

wstawić

w

kolba

ch

stożkowych

mieszaninę

podstawową

i

wodę

.

Wł

ączyć

spekol

.

Ust

awić

d

ługość

fal

i

na

340nm

.

.

Prz

y

gotować

probę

odniesi

eni

a

zawier

a

j

ąc

ą

1

ml

mie

szaniny

podst

awowe

j

i

1

ml

wody

.

B

.

Przeprowadzeni

e

re

ak

c

ji

enzymatycznej

Do

kuwety

od

mierzyć

sk

ładniki

m

iesz

aniny

re

akc

yjne

j

A

B

C

D

E

F

G

Mieszanin

a

podst

awowa

1000

1000

1000

1000

1000

1000

1000

Woda

875

835

835

825

825

775

775

NH

4

Cl

50

50

50

50

50

50

50

Roteno

n

5

5

5

5

5

5

5

Triton X

-100

10

10

10

10

10

10

10

ADP

-

40

-

-

-

-

-

Leucyna

-

-

40

-

-

40

40

Gentamycyna

-

-

-

50

-

50

-

Chlorochin

a

-

-

-

-

50

-

50

Po

zamieszaniu

zawartoś

ci

kuw

ety

zmierzyć

wartość

absorpc

ji

mi

eszaniny,

Dod

ać

tak

ą

iloś

ć

koenzymu

b

y

wartość

ab

sorpc

ji

zawiera

ła

si

ę

w

g

ranic

ach

0

,7

-0

,9

(ok.

30

µl

)

Następnie

doda

ć

10µl

mitochondriów

,

z

ami

esza

ć

i

włą

czyć

sto

per.

Po

minu

cie

rozpoc

ząć

po

miary

zmian

absorpc

ji

wywołane

utl

e

nieni

em

NADH.

Notow

ać

zmi

any

absorpc

j

i

co

15

sekund

przez

2

22

minuty.

Nas

tępn

ie

dod

ać

20

µl

roztworu

2–oksoglutaranu

w

celu

rozpoczęci

a

r

eak

c

ji

.

Zawartość

kuwety

zmieszać

i

notowa

ć

zmiany

absorpc

ji

co

15

sekund

przez

3

minuty.

Jeżeli

zmiany

absorbc

j

i

w

czasi

e

przekra

cza

j

ą

0

,12

/

min

do

po

miaru

dodaw

ać

mni

e

jsze

iloś

ci

mitocho

ndriów

.

Po

zak

ończeniu

po

miaru

z

awa

rtość

kuwe

ty

wylać,

a

kuwet

ę

dokł

adnie

wypłukać.

B

ia

łko

mito

c

hondrialne

ozn

aczyć

met

odą

biuretow

ą

.

C.

Opracow

ani

e

wyników

Obliczyć

aktywność

enzymu

w

każdej

próbie

,

oblicza

j

ąc

zmi

an

y

absorbc

ji

w

czasi

e

.

D

o

obliczen

uwzg

lędnić

szy

bkość

pocz

ątkową

r

eak

c

ji

a

także

s

zybkość

utle

niani

a

NADH

pod

nie

obe

cnoś

ć

substratu

(

2-okso

glutaranu)

.

Wyniki

podać

w

nmola

ch

x

min

-

1

x

m

g

-

1

białka

mitochondri

aln

ego

na

m

i

nutę

.

Mil

imolowy

współ

czynnik

absorbc

j

i

NADH

wynosi

6

,22

.

23

OZNAC

ZANIE

FOSF

ORU

M

ETODĄ

FISKE

-

SUBBAROWA

Podstawą

m

etody

jes

t

r

eak

c

j

a

jonów

orto

fos

foranowych

z

molibd

enian

em

amonowym

w

środowisku

kwaśnym.

Powsta

j

ąc

ą

sól

amonow

ą

o

żółtym

zabarwieniu

p

odda

je

si

ę

re

akc

j

i

z

odczynnikiem

reduku

ją

c

ym

(Eiokono

gen),

w

ktrórej

wyniku

molibd

en

związany

w

soli

kompleksowe

j

ul

ega red

ukc

ji

do

niższych t

lenkó

w molibd

enu

d

a

ją

c

tzw

b

łekit

mo

libdenowy.

Odczynni

ki

1.

Roztwór

fos

foranu

z

a

wiera

j

ący

1

mg

fos

fo

ru

/ml

2.

Roztwór

wzorcowy

fosforanu

o

st

ężeniu

10

µ

g

fosforu/

m

l

.

(

Przygot

ować

odpo

wiedn

io

rozc

i

eńczają

c

rozt

wór

1)

3.

10

%

kwas

tró

j

chloroo

ctowy

(TCA)

(zrobiony

,

pod w

y

ciągi

em)

4.

25

%

molibd

eni

an

a

m

onu

w

2

,5

M

kwas

ie

si

ar

kowym

(zrobiony,

pod

w

yciąg

iem)

5.

Odczynnik

reduku

j

ą

cy

(

Eikonogen

) )

(zrobiony,

RT)

(prz

y

gotowanie krzywej

wzorcowej

)

Wykonan

ie

Do

próbówek

na

10

ml

o

dmierzyć

wg sch

em

atu

(

w ml):

Nr probówki

Roztwór

wzorcow

y

fosfor

anu

Woda

Fosfor w

próbie

(µ

g)

1

-

2,5

0

2,3

0,5

2,0

5

4,5

1,0

1,5

10

6,7

1,5

1,0

15

8,9

2,0

0,5

20

Do

każde

j

probówki

od

mierzyć

wg

kolejnoś

ci;

1,5

ml

roztworu

TCA,

0

,5

ml

roztworu

molibdeni

anu

i

0

,2

ml

roztw.

Eikonogenu.

Próby

wymieszać

i

po

10

min

zmierzyć

absorbcj

ę

prób

przy

660

nm

wob

ec

próby

odnie

sien

ia

.

24

OZNAC

ZANIE

BIAŁ

KA

METODĄ

BIURE

TOWĄ

Metod

a

pol

ega

na

pomi

arze

st

ężeni

a

b

arwnego

kompleksu

pows

tał

eg

o

między

wiązani

ami

peptydowymi

i

jon

ami

m

iedziowymi

w

środowisku

alka

licznym.

Odczynniki

1.

Odczynnik

biur

etowy

(gotow

y

)

2.

10

%

roztwór

dezoksycholanu

sodowego

(gotowy

)

Wykonanie

Prz

y

gotować

3

czyste

probówki.

Do

probówki

nr

1

odpipetować

0

,9

ml

wody

i

0,1

ml

dezoksycholanu;

do

prob

ówek

2

i 3;

50

zawi

esiny

mitochondriów

,

0

,1

ml

d

ezoksycholanu

i

0

,

85

ml

wod

y

destylowa

ne

j

.

Nast

ępnie

do

wszy

stkich

probówek

dodać

4

ml

odcz

ynnika

biuretowego

,

z

awartoś

ć

wymieszać

i

po

30

mi

n

zmierzyć

absorbanc

j

ę

prób

prz

y

540

nm

wobec

próby

odniesi

eni

a

(nr

1)

.

Zawartość

bia

ł

ka

obli

czyć

posługują

c

się

pod

anym

przez

prowadząc

ego

ćwiczeni

a

współczynnikiem

[F

]

,

w

yznaczonym

wcześni

e

j

dla

od

czynnika

biuretowego.

F

x

Absorb

.

=

[

mg

b

ia

łka

w

próbie

kolorymetrycznej

]

.