made by Wój
1
Wykład 1
Podstawy metodologii w histologii, cyto- i histochemii.
Światło białe według teorii Maxwella jest elektromagnetycznym ruchem falowym. Fale świetlne różnią się od
fal radiowych tylko długością, jedne i drugie rozchodzą się z tą samą prędkością c=3x10
8
m/s. Promienie
Roentgena (X) i gamma przynależą do fal elektromagnetycznych.
Światło widziane w tym zakresie obejmując od 3800A do 7700A jest niewielkim wycinkiem. Z obu tych stron,
rozciąga się światło niewidzialne - podczerwone (IR) 7700A - 3μm i 3 - 100μm (bliska i daleka podczerwień)
i nadfioletowe (UV) 1300 - 3800A oraz 1300 - 100A (bliski i daleki nadfiolet). Podaje to w μm i A pomimo iż
podstawową jednostką w SI jest metr jednak przyjęło się określać te wielkości w μm i A. Oko ludzkie jest
najbardziej wrażliwe na długość ok. 5500A.
Soczewki i ich układy są obarczone szeregiem wad, czyli tzw. aberracjami: chromatyczna, sferyczna
i astygmatyzmem.
Tzw. szkło kronowe i flintowe zmniejsza znacznie wadę chromatyczną.
APERTURA NUMERYCZNA I ZDOLNOŚĆ ROZDZIELCZA MIKROSKOPU:
A= n * sinα
1/d = λ / 2A
d – najmniejsza odległość pomiędzy dwoma obiektami przedmiotu, które w obrazie mikroskopowym mogą być
jeszcze rozróżniane jako oddzielne.
Teoretyczna d dla mikroskopów suchych ok. 0,3 μm dla olejkowo-imersyjnych ok. 0,19 μm
POWIĘKSZENIE MIKROSKOPU:
Powiększenie okularu * powiększenie obiektywu
W badawczym mikroskopie świetlnym powstający obraz jest pozorny, powiększony, odwrócony.
MIKROSKOPY SPECJALNE:
Mikroskop polaryzacyjny
Posiada wbudowane w układ optyczny dwa pryzmaty Nikola lub siatki polaryzacyjne (polaryzator i analizator)
powodujące polaryzację światła (uporządkowanie chaotycznych drgań fal świetlnych w jednakowej
płaszczyźnie).
Obiekty przejrzyste można podzielić na izotropowe, czyli pojedynczo załamujące światło i niewidoczne w tym
mikroskopie oraz anizotropowe (podwójnie załamujące światło) i widoczne jako obiekty na ciemnym tle.
W diagnostyce histopatologicznej wykorzystywany jest do wykrywania złogów skrobiawiczych (amyloidu)
wybarwianych czerwienią Kongo, lipidów
Mikroskop fazowo-kontrastowy
Mikroskop k-f stosowany jest do badania komórek nie zabarwionych z reguły żywych oraz niekiedy do
wzmocnienia ogólnego kontrastu w preparatach zabarwionych słabo lub wybiórczo (np. w metodach
histochemicznych)
Fala świetlna przechodząc przez obiekt może ulec opóźnieniu względem fali przechodzącej obok. Powstanie
różnica faz – przesunięcie fazowe. W materiale biologicznym różnica faz między falami przechodzącymi przez
obiekt i obok obiektu wynosi około ¼ długości fali. Oko ludzkie jednak nie rejestruje tego efektu, tzn. struktury
małe, niewiele różniące się od siebie stopniem pochłaniania światła są w mikroskopie niewidoczne. Różnica ta
może się stać widoczna, jeśli efekt fazowy zostanie zamieniony na amplitudowy. Tę zmianę uzyskuje się dzięki
nałożeniu na siebie (interferencji) fali opóźnionej z nieopóźnioną.
Mikroskop interferencyjno-polaryzacyjny
W mikroskopie z urządzeniem i-p można w ułamkach długości fali świetlnej mierzyć przesunięcia fazowe światła
przechodzącego przez badane struktury co umożliwia określić stężenie substancji w danych obszarach komórki
czyli podać suchą masę materii żywej, tym samym pozwala na określenie wagi komórki lub jej badanego
organella.
made by Wój
2
Mikroskop z optyką Nomarskiego
Jest to przykład mikroskopu ze specjalnym systemem optycznym, będącym modyfikacją mikroskopu
kontrastowo-fazowego i interferencyjnego.
Kontrast różnicowej interferencji Nomarskiego, pozwala na znaczne wzmocnienie kontrastu nie zabarwionych
struktur komórkowych i uzyskanie ich plastycznego, nieomal trójwymiarowego obrazu.
Mikroskop z kondensatorem ciemnego pola
Mikroskopowanie w tzw. ciemnym polu umożliwia dostrzeżenie w preparacie drobnych cząsteczek
o wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego. Wykorzystuje się tu zjawisko dyfrakcji (ugięcia)
promieni świetlnych padających na obiekt o bardzo małych wymiarach.
Obiekty w tej metodzie są widoczne jako drobne świecące punkty na ciemnym tle.
Metodę ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji mikroorganizmów obecnych w płynach ustrojowych.
W praktyce - wystarczy opuścić kondensor, który powoduje większe lub mniejsze załamanie światła.
Mikroskop fluorescencyjny
W mikroskopie tym wykorzystano własność niektórych substancji chemicznych polegającą na emitowaniu
światła widzialnego pod wpływem naświetlania promieniami ultrafioletowymi (UV).
System naświetlania preparatu:
- diailuminescencyjny (od dołu)
epiiluminescencyjny (od góry)
Fluorescencja własna (endogenna) np: lipofuscyna, porfiryny, witamina A, chlorofil,
Fluorochromy: oranż akrydyny, fluoresceina, rodamina
Znakowanie materiału metodą immunofluorescencji bezpośredniej (znajduję antygen – przeciwciało
fluorescencyjne) lub pośredniej (wykrywa całe kompleksy).
Mikroskop konfokalny
Służy do warstwowej obserwacji badanych struktur jak i również oglądania obrazów w formacie 3D. Za jego
pomocą można tworzyć obrazy kolejnych warstw o grubości 1-2um. Obserwacje można również prowadzić na
obiektach żywych.
Typy:
- skanujące laserowe mikroskopy konfokalne w których laserowy promień skanuje pole po polu, linia po linii
(d=0,1um)
- mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem
- PAM
Mikroskop elektronowy transmisyjny (TEM) i skaningowy (SEM)
W celu powiększenia obrazu w mikroskopie elektronowym używa się strumienia elektronów. Mikroskopy
elektronowe dzielimy na transmisyjne – elektrony przenikają przez badane struktury oraz skanujące – elektrony
odbijają się od powierzchni struktury, po czym są skanowane.
Elektrony emitowane są pod napięciem 20kV-2MV, przez katodę mikroskopu biegną w próżni wzdłuż soczewek
elektromagnetycznych, będących odpowiednikami soczewek świetlnych. Uzyskany obraz można fotografować
otrzymując elektronogramy.
Zdolność rozdzielcza dla TEM wynosi 0,2-1nm, dla SEM zaś 10nm.
Mikroskop elektronowy - transmisyjny
Pobieranie żywej tkanki —> pobrany fragment tkanki —> docięte fragmenty tkanki przeznaczonej do utrwalenia
—> utrwalenie np. w glutaraldehydzie —> płukanie tkanki w buforze —> kontrastowanie (barwienie) tkanki w
całości (kontrastowanie w bloku) —> odwadnianie w alkoholach o wzrastającym stężeniu —> przepojenie
tkanki niepolimeryzującą żywicą —> zatopienie w żywicy (np. w żywicy epoksydowej jak Epon lub Araldit),
polimeryzacja w 60°C —> gotowy spolimeryzowany bloczek żywicy —> bloczek żywicy w uchwycie docięty do
krojenia —> krojenie ultracienkie za pomocą nożyka szklanego lub diamentowego, nałożenie skrawków na
siateczki miedziane —> kontrastowanie dodatkowe (barwienie) nałożonych skrawków ultracienkich —> skrawki
gotowe do mikroskopowania.
RODZAJE PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH:
•
Skrawki - podstawowa forma preparatu histologicznego
•
Szlify (np. zębina, szkliwo, kość)
made by Wój
3
•
Rozmazy (np. krwi), wymazy (np. z jamy ustnej)
•
Rozgnioty (np. śledziona – poszukiwanie określonych komórek)
•
Odciski narządowe (np. skóra, oko – badanie obecności grzybów)
•
Hodowle komórkowe
TECHNIKA HISTOLOGICZNA - MIKROSKOPIA ŚWIETLNA
1.
Pobieranie materiału ok. 1cm, dla mikroskopu elektronowego ok. 1mm.
2.
Utrwalanie - szybkie uśmiercanie komórki bez zmiany struktury.
Dobry utrwalacz:
a) szybko przenika w głąb tkanki,
b) szybko koaguluje białka, jednak niezbyt gwałtownie (blokowanie enzymów przed procesami gnilnymi)
c) jest izotoniczny w stosunku do płynów tkankowych.
Utrwalacze proste:
- kwasy mineralne (azotowy HNO
3
, siarkowy H
2
SO
4
, chromowy = trójtlenek chromu Cr
2
O
3
, osmowy =
czterotlenek osmu OsO
4
),
- kwasy organiczne (mrówkowy HCOOH, octowy CH
3
COOH, trójchlorooctowy CCl
3
COOH, pikrynowy =
trójnitrofenol)
- inne (alkohol etylowy C
2
H
5
OH, metylowy CH3OH, propylowy CH
3
CH
2
CH
2
OH, aceton CH
3
COCH
3
, formalina
CH
2
O, aldehyd szczawiowy OHCCHO), sole metali ciężkich (sublimat = dwuchlorek rtęci HgCl
2
, sole ołowiu
azotan lub octan, cynku ZnCl
2
).
Utrwalacze złożone:
-utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform, kw. octowy lodowaty),
-utrwalacz Bakera (formalina, chlorek wapnia, woda destylowana),
-utrwalacz Susa (sublimat, chlorek sodu, woda destylowana),
-utrwalacz Zenkera-Helly’ego (dwuchromian potasu, sublimat, kw. octowy lodowaty),
-utrwalacz Buina (kw. pikrynowy, formalina, kw. octowy lodowaty, kw. trichlorooctowy).
3.
Odwodnienie utrwalonych tkanek: 50-100% alkohole,
4.
Zatapianie w parafinie: płyny pośrednie (np. ksylen, benzen, toluen) > parafina (w metakrylanie dla ME)
5.
Krojenie: mikrotomy saneczkowe, korbowe,
6.
Nawodnienie: 100-50% alkohole,
7.
Barwienie:
metoda progresywna (rozcieńczone barwniki i barwienie w ciągu dłuższego czasu 12-24h) - barwienie czyste
i selektywne,
metoda regresywna (stężone barwniki i krótki okres barwienia) - nierównomierne barwienie, możliwość
przebarwienia i zabarwienia nieswoistego.
hematoksylina (najczęściej stosowana hematoksylina Meyera lub Ehrlicha), wyciąg z amerykańskiego drzewa
ERYTROXYLON CAMPECHIANUM - barwienie jąder komórkowych (czyli substancji kwaśnych)
ęozyna (barwienie kwaśne, cytoplazmatyczne)
8.
Odwodnienie: 50-100% alkohole ew. płyny pośrednie
9.
Zatapianie preparatu na stałe: syropy, żele np. glicerożelatyna (glicerol + żelatyna), żywice np. balsam
kanadyjski.
ROŻNE RODZAJE BARWIENIA
Barwienie metachromatyczne
Szczególnym rodzajem barwienia jest barwienie metachromatyczne, polegające na tym, że barwione struktury
zostają zabarwione innym kolorem niż kolor barwnika użytego do barwienia. Ze zjawiskiem metachromazji ma
się do czynienia np. przy barwieniu mukopolisacharydów w chrząstce - siarczanu chondroityny, albo komórek
tucznych, których ziarnistości barwią się metachromatycznie ze względu na zawartość heparyny.
Do barwienia metachromatycznego używa się błękitu toluidyny; który daje różowofioletowe zabarwienie
struktur metachromatycznych. Jest to spowodowane tym, barwnik ten układa się na zabarwionych
metachromatycznie cząsteczkach w sposób uporządkowany, w skutek czego powstają dimery inaczej
absorbujące widmo światła białego niż monomer.
made by Wój
4
Barwienie polichromatyczne
Do barwień stosowanych najczęściej w diagnostyce hematologicznej należy barwienie polichromatyczne
mieszaniną barwników zasadowych i kwaśnych. Barwienie takie dokonuje się też w diagnostyce wymazów
komórkowych z różnych błon śluzowych.
Barwienie przyżyciowe: błękit metylenowy, błękit toluidyny, błękit Nilu.
1.
Hematoksylina żelazista i Pikrofuksyna:
Jądro – brązowe
Cytoplazma – żółta
Kolagen – czerwony
2.
Azokarmin i Błękit anilinowy (Mallory)
Jądro - czerwone
Cytoplazma - szkarłatna
Kolagen - niebieski
3.
Hematoksylina i Oranż G-Erythrosyna (H and OGE)
Jądro – szkarłatne
Cytoplazma - różowa
Kolagen – pomarańczowy
4.
Hematoksylina i Eozyna (H & E)
Jądro - szkarłatne
Cytoplazma - różowa
Kolagen – różowy
SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE - MROŻENIOWA
Techniki mrożeniowe polegają na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie.
Zalety: są krótkotrwałe (gdy zależy nam na czasie), zachowują wszystkie składniki w materiale biologicznym
(tłuszcze obojętne), procedura przebiega w niskiej temperaturze co zapobiega denaturacji białek.
Materiał zamraża się:
- wciekłych gazach: azot (-196°C), hel (-269°C), freon, izopropan
- za pomocą zestalonego dwutlenku węgla - tzw. „suchy lód" (-78,5°C)
Krioprojekcja polega na przepojeniu materiału roztworem sacharozy (15-30%) lub gliceryny (15-30%) lub DMSO
(10%) w celu uniknięcia krystalizacji wody podczas zamarzania.
Materiał zamrożony kroi się w:
- mikrotomie mrożeniowym,
- kriostacie
Liofilizacja - proces suszenia zamrożonego materiału biologicznego w próżni oraz w obniżonej temperaturze na
drodze sublimacji wody. Metoda ta pozwala na zachowanie w tkance wszystkich substancji chemicznych.
BADANIE HISTOHEMICZNE
Za pomocą reakcji histochemicznych można identyfikować kwasy nukleinowe, wielocukry, tłuszczowce,
z mniejszą dokładnością białka, a także barwniki i niektóre składniki nieorganiczne.
Przed wykazaniem różnic w składzie chemicznym komórek leżących obok siebie lub zmian wywołanych
działającymi na nie czynnikami, reakcje te mogą stanowić wskaźnik stanu czynnościowego komórki.
W nielicznych tylko przypadkach reakcje histochemiczne mogą stanowić również podstawę do obliczeń ilości
badanej substancji. Obliczenia takie opierają się na prostej zależności między ilością barwnego produktu reakcji
a stężeniem badanej substancji w tkance. Ilość produktu reakcji warunkuje z kolei stopień pochłaniania
monochromatyczngo światła, o odpowiednio dobranej długości fali, przepuszczonego przez zabarwiony obszar
tkanki.
made by Wój
5
BIAŁKA I AMINOKWASY
Niestety jak dotąd nie ma pewnych i swoistych odczynników histochemicznych na poszczególne białka
i aminokwasy. Stosowana dość powszechnie (i w zasadzie jedyna) metoda bromofenolowa (z użyciem rtęci lub
bez niej) pozwala jedynie na ogólne zorientowanie się w „zawartości" białek w komórce, bez możliwości
rozróżnienia czy chodzi o białka złożone czy proste, nie mówiąc już o rozróżnieniu białka prostego (np. albuminy
czy globuliny) bądź rodzaju białka występującego w połączeniach (kompleksach) z innymi związkami (np.
glikoproteidy czy lipoproteidy).
WĘGLOWODANY
W celu uwidocznienia umiejscowienia wielocukrów w komórkach i tkankach stosuje się metodę, w której używa
się kwas nadjodowy i odczynnik Schiffa. czyli tzw. metoda p. a. S. Ogólną podstawą tej metody jest względnie
swoiste rozrywanie wiązania miedzy atomami węgla (C-C) w cząsteczce glikogenu i utlenianiu związku z tymi
węglami grup 1,2 glikolowych (CHOH - CHOH) na grupy aldehydowe (CHO-CHO). Powstały stad dwualdehyd
łączy sie z Ieukofuksyną odczynnika Schiffa dając trwałe purpurowoczerwone zabarwienie. W związku z tym, że
tego rodzaju grupy 1,2 glikolowe występują w innych związkach, a ponadto kwas nadjodowy utlenia również do
grup aldehydowych grupy 1,2 glikoaminowe, alkiloaminowe i ketonowe innych niż wielocukry związków –
w każdym przypadku przed wykonaniem zasadniczego odczynu przeprowadza się na drugim (sąsiednim)
skrawku kontrolne trawienie enzymatyczne roztworem diastazy swoiście rozkładającej tylko glikogen.
LIPIDY
Technika parafinowa, w której stosuje się utrwalacze bądź płyny pośrednie będące „naturalnymi
rozpuszczalnikami" dla tłuszczów (alkohole, benzen, ksylen itp.) nie stosuje się prawie zupełnie. Ze stosowanych
metod histochemicznych na lipidy najczęściej używanymi w praktyce są metody oparte o tzw. barwniki
Iipidowe, do których należy Sudan (II, III, IV, Black B) i czerwień oleista (Oil Red O) barwiące przede wszystkim
lipidy zapachowe metaboliczne. Spośród innych metod histochemicznych na lipidy należy również wymienić
barwienie z użyciem Błękitu Nilu oraz barwienie czterotlenkiem osmu (OsO
4
). Metoda z czterotlenkiem osmu
jest szczególnie przydatna do orientacyjnego rozróżnienia lipidów w mikroskopie elektronowym, gdzie związek
ten jest jednocześnie często stosowanym utrwalaczem.
Specjalne techniki badawcze - Węglowodany i Lipidy:
- Reakcja p.a.S.- wykrywa obojętne wielocukry zawierające pierścień heksozowy.
W pierwszym etapie materiał poddaje się utlenianiu w kwasie nadjodowym co prowadzi do przekształcenia
grup glikolowych w aldehydowe, a następnie grupy aldehydowe uwidacznia się odczynnikiem Schiffa.
- Barwienie Sudanem III - ujawnia lipidy. Podstawą tej reakcji jest niska rozpuszczalność barwnika w wodzie
natomiast wysoka w tłuszczach. Podstawą tej reakcji są głównie właściwości fizyczne barwnika a nie chemiczne.
Specjalne techniki badawcze - Kwasy Nukleinowe:
- Reakcja Feulgena - jest to dwuetapowa reakcja służąca do wykrywania DNA. W pierwszym etapie tkanki
poddaje się hydrolizie w 1M kwasie solnym co powoduje pęknięcie pierścienia pentozowego deoksyrybozy
i wytworzenie grupy aldehydowej. W drugim etapie powstałe grupy aldehydowe uwidaczniają się odczynnikiem
Schiffa.
- Metoda Bracheta - służy do różnicowego wykrywania DNA i RNA w tym samym materiale za pomocą
mieszaniny zieleni metylenowej (DNA) i pironiny (RNA). Efektem reakcji jest zabarwienie jąderka na czerwono
i zielonofioletowa chromatyna jądrowa.
BADANIE CYTOENZYMOLOGICZNE
Reakcje histochemiczne przeprowadza się na skrawkach kriostatowych lub parafinowych, rzadziej na
niewielkich fragmentach tkanek (głównie w technice cytochemicznej i do mikroskopowania elektronowego),
skrawki poddaje się inkubacji w środowisku zawierającym odczynnik reagujący wybiórczo z poszukiwaną
substancją. Ostateczny produkt reakcji, w celu uwidocznienia go w tkance, musi być nierozpuszczalny i barwny,
lub elektronowo gęsty, w przypadku oglądania materiału w mikroskopie elektronowym.
Reakcja histoenzymatyczna prosta:
substrat»»enzym»»produkt barwny
Reakcja enzymatyczna złożona (metoda jonowymienników chemicznych):
substrat»»enzym»»produkt»»reakcja wiązania»»barwnik
made by Wój
6
Reakcja histoenzymatyczna powinna:
- Być reakcją szybką aby uniknąć błędów wywołanych dyfuzją produktów.
- Dawać - jako produkt niekrystaliczny - drobnoziarnisty strąt.
Wytworzony strąt nie powinien rozpuszczać się w płynie inkubacyjnym oraz wykazywać możliwie duży molowy
współczynnik ekstynkcji aby zapewnić wysokie nasilone barwy. Ilość powstającego strątu powinna być możliwie
ściśle skorelowana z aktywnością badanego enzymu.
SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE - REAKCJA GOMORIEGO
Reakcja Gomoriego (reakcja precypitacji z kationami metali), służy do wykrywania hydrolaz.
1.
Reakcja polega na wstępnym rozszczepieniu substratu przez wykrywany w tkankach enzym.
2.
Następnie po wytrąceniu jednej ze składowych rozszczepionego substratu jonami metali (Ca
2+
, Pb
2+
, Cu
2+
,
Ba
2+
, Co
2+
)
3.
Powstaje nierozpuszczalna sól.
4.
Większość z tych soli jest widoczna w mikroskopie elektronowym, natomiast do celów mikroskopii
świetlnej czasami należy przeprowadzić dodatkową reakcje barwną.
Fosfataza zasadowa Fosfataza kwaśna
Tkanka (enzym) + substrat (glicerofosforan)
Bufor weronalowy Bufor octanowy
pH 9,2 – 9,4 pH 5,0 – 5,3
Ca
2+
Pb
2+
Mg
2+
(aktywator)
Hydroliza
CaHP0
4
- Strąty niewidoczne - PbHP0
4
Co
2+
(sole
kobaltu)
CoHP0
4
----- (NH
4
)
2
S
x
-----
(wielosiarczek amonu)
CoS PbS
(czarne) ------------ barwne strąty --------------- (brązowe)
w miejscach aktywności
odpowiedniego enzymu
SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE – TPP-AZA, DB, FK
1.
Tiaminowa pirofosfataza (marker struktury Golgiego) - odczyn „kontrastuje" układ cystern i wakuoli, który
jest intensywny w komórkach wydzielniczych i nerwowych. W miejscu lokalizacji enzymu stwierdza się
intensywne czarne strąty siarczku ołowiu.
2.
Dehydrogenaza burszvnianowa - marker wewnętrznej błony mitochondrialnej. DB odcina od substratu (soli
sodowej kwasu bursztynowego) atomy wodoru, które następnie łączą się z solą tetrazolową Nitro TB dając
barwne złogi formazanu.
3.
Fosfataza kwaśna - marker lizosomów. W komórkach wątroby lizosomy układają się głównie w biegunach
żółciowych.
made by Wój
7
SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE: IMMUNOHISTOCHEMIA
Jest to metoda badawcza polegająca na wykrywaniu w komórkach i tkankach substancji o charakterze
antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał.
Antygen - jest to substancja zdolna do wywołania produkcji swoistych przeciwciał przez system immunologiczny
organizmu (immunogenność) i zdolna do swoistego wiązania wytworzonych przeciwciał i tworzenia z nimi
kompleksów (antygenowość).
Przeciwciało - białko należące do klasy immunoglobulin wytwarzane przez system immunologiczny i mające
zdolność do swoistego wiązania antygenu. Przeciwciała mogą być poliklonalne i monoklonalne. Przeciwciało
znakuje się fluorochromami enzymatycznie, ferrytyną lub złotem koloidalnym.
Podstawowe typy reakcji immunohistochemicznych:
- bezpośrednia (antygen-znakowane przeciwciało),
-pośrednia (antygen- nie znakowane przeciwciało - znakowana antyglobulina)
-z mostkami immunoglobulinowymi i kompleksami enzym - antyenzym (antygen – przeciwciało – antyglobulina
- kompleks enzym/antyenzym).
SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE: AUTORADIOGRAFIA
Autoradiografia jest metodą badawczą umożliwiającą lokalizację izotopów promieniotwórczych lub
znakowanych nimi substancji w komórkach lub tkankach. Podana In vivo substancje promieniotwórcze (
3
H,
14
C,
82
P,
131
J) zostają włączone w normalny ciąg procesów metabolicznych. Po przygotowaniu preparatu
mikroskopowego w sposób typowy pokrywa się je żelem zawierającym AgBr. Promieniowanie powoduje rozpad
tej soli i pojawienie się metalicznego srebra, które po wywołaniu i utrwaleniu można obserwować
w mikroskopie.
Metoda ta pozwala na śledzenie dynamiki procesów metabolicznych w komórkach i tkankach.
SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE: CYTOFOTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Jest to technika pomiarów właściwości fizycznych i chemicznych komórek z zastosowaniem przyrządu, który
w krótkim czasie (paru minut) może przebadać dużą populację komórek, liczoną w milionach. Badane komórki
muszą być zawieszone w płynnym środowisku jako zawiesina oddzielnych komórek. Komórki używane do tych
badań są uprzednio zabarwione, barwnikami fluorescencyjnymi. Istnieje cała grupa odczynników
fluorescencyjnych, które swoiście wiążą się z takimi składnikami komórki jak DNA czy RNA, czy powierzchnia
komórki.
W chwili przepływu przez rejon pomiaru komórka przechodzi przez wąski promień światła (zazwyczaj lasera
argonowego), który:
- ulega rozproszeniu zależnemu od wielkości, kształtu lub właściwości optycznych komórki,
- wzbudza fluorescencję substancji chemicznych, którymi komórka była uprzednio znakowana.
Odczyty w każdej komórce są następnie liczone i analizowane statystycznie przez komputer.
Metoda ta pozwala na przebadanie w krótkim czasie wielu parametrów, bada duża liczbę komórek.
MIKROCHIRURGIA
Zabiegi mikrochirurgiczne polegają na wykonaniu zabiegów na pojedynczych komórkach pod kontrolą
mikroskopu. Narzędziami są mikroigły, mikroskalpele i mikropipety wykonywane w mikrokuźni. Przyrządy te
poruszane są za pomocą mikromanipulatora, który tak redukuje zakres ruchów ręki, że narzędzia można
prowadzić w polu widzenia mikroskopu.
Dzięki zastosowaniu tej techniki można usuwać z komórki jądra, można też wprowadzić w miejsce usuniętego
jądra komórkowego inne, pochodzące z innej komórki. Przekonano się tą metodą, że jądro zróżnicowanej
komórki nabłonka jelita wprowadzone do komórki jajowej, po pobudzeniu jej do rozwoju, może dać początek
całemu normalnemu organizmowi.
Mikromanipulatorem można wprowadzać substancje wstrzykując je bezpośrednio do komórki i omijając ich
działanie na receptory błonowe komórki.
Narzędziem mikromanipulatora może być skoncentrowana wiązka promieniowania UV lub promieniowania
laserowego. Za pomocą wiązek światła można selektywnie niszczyć w komórce wybrane obszary komórki lub jej
narządy.
HODOWLA CYTO-, HISTO- I ORGANOTYPOWA
Hodowla jest to utrzymanie oddzielonych od organizmu komórek, tkanek a nawet narządów w warunkach
sztucznych (In vitro) przez okres dłuższy niż 24 godziny.
made by Wój
8
Inkubacja - jw. poniżej 24 godzin.
Hodowlę prowadzi się na pożywkach (naturalnych lub sztucznych). Komórkę lub tkankę można hodować albo
przez zanurzenie całkowite w pożywce albo przez jej powierzchni.
Wyróżniamy:
- hodowlę komórek (nie wytwarzających wyżej zorganizowanych struktur): w kilkunastu przypadkach na świecie
prowadzi się hodowle komórek jajowych kobiet – doprowadza In vitro do zapłodnienia, hoduje się zarodek
ludzki ok. 43 godziny i po uzyskaniu stadium poprzedzającego wszczepienie zarodka do błony śluzowej
(endometrium) wprowadza się do macicy. Zabiegi te wykonywane są ze wskazań lekarskich i powtarzane, aż do
uzyskania ciąży.
- hodowlę tkanek
- hodowlę organotypową (zarówno embrionalnych zawiązków narządów lub całych bądź fragmentów narządów
pobranych z dojrzałego organizmu.
ILOŚCIOWA ANALIZA OBRAZÓW MIKROSKOPOWYCH:
Jest to zobiektywizowany opis obrazów mikroskopowych zarówno z mikroskopów świetlnych jak
i elektronowych czyli techniki pomiarowe, które pozwalają na numeryczny opis obrazów mikroskopowych,
a następnie na ocenę tych pomiarów metodami statystycznymi.
LIZOSOMY
Oznacznikami (markerami) enzymatycznymi dla lizosomów (zaliczanych do organelli komórkowych) są
następujące enzymy: fosfataza kwaśna, rybonukleaza, dezoksyrybonukleaza II, katepsyny i beta – glikuronidaza
Wszystkie te enzymy wykrywane są w lizosomach tak metodami biochemicznymi jak i histochemicznymi.
APARAT GOLGIEGO
Enzymatycznym markerem dla aparatu Golgiego jest tiaminowa pirofosfataza. Wykrywanie odczynu
histochemicznego na ten enzym tak dokładnie „konturuje” układ beleczek i wakuoli aparatu Golgiego, że
z powodzeniem zastąpić może dotychczas stosowane wybarwienie tej organelli metodami histologicznymi
opartymi na srebrzeniu.
CHONDRIOM KOMÓRKOWY
Enzymatycznym markerem dla chondriomu komórkowego biorącego (ze względu właśnie na enzymy w nim
zawarte) bezpośredni udział w procesach oksydoredukcyjnych i w tlenowej fosforylacji są odpowiednio
dehydrogenaza kwasu bursztynowego i adenozynotrójfosfataza mitochondrialna.
Teoretycznie, oznacznikami enzymatycznymi dla tej organelli mogą być prawie wszystkie enzymy biorące udział
w tych przemianach (m.in. prawie wszystkie enzymy wchodzące w tzw. cykl Krebsa), praktycznie metodami
histochemicznymi wykrywane jest kilkanaście, a wśród nich najczęściej w tym celu stosowane są właśnie
metody na wyżej wymienione enzymy.
Podstawa odczynu histochemicznego metody Nachlasa i współpracownika na dehydrogenazę kwasu
bursztynowego jest odłączenie przez enzym (dehydrogenazę) z substratu (sól sodowa kwasu bursztynowego)
dwóch atomów wodoru, które łączą się z solą tetrazolową Nitro BT dają produkt końcowy w postaci barwnych
złogów formazanu w miejscach występowania (aktywności) tego enzymu.
„Konturowanie" chondriomu komórkowego przez dehydrogenazę jest wyjątkowo precyzyjne ze względu na
umiejscowienie enzymu na błonach bądź w samych błonach tej organelli.
Istnieją tez możliwości barwienia mitochondriów zielenią Janusową lub hematoksyliną żelazistą.