BIOCHEMIA

Skrypt dla studentów medycyny

opracowany na podstawie

„Biochemii Harpera”

Michu

®

Wrocław 2008

Wersja 1.0

- -

2

- -

3

SPIS TREŚCI

Rozdział I – Aminokwasy, peptydy, białka

1.

Aminokwasy

a) budowa, b) nazewnictwo i wzory, c) klasyfikacja, d) funkcje, e) właściwości fizyczne, f) właściwości
chemiczne – reakcje aa, g) techniki rozdziału

2.

Peptydy

a) synteza i właściwości wiązania peptydowego, b) nazewnictwo, podział i funkcje peptydów,
c) przykłady peptydów aktywnych biologicznie

3.

Białka

a) klasyfikacja, b) identyfikacja, c) poziomy organizacji i fałdowanie, d) rozdział i określanie struktury
białek, e) związek budowy i funkcji białek fibrylarnych i globularnych

Rozdział II – Struktura i funkcje enzymów

1.

Ogóle właściwości enzymów

a) klasyfikacja i nazewnictwo, b) centrum katalityczne, c) koenzymy i witaminy będące ich
prekursorami, d) swoistość działania enzymów, e) aktywność enzymów, jednostki aktywności,
f) kompartmentacja komórkowa enzymów, g) izoenzymy, h) izolacja enzymów

2.

Mechanizmy działania enzymów

a) typy reakcji enzymatycznych przy dwóch substratach, b) mechanizm działania chymotrypsyny,
c) mechanizm działania fruktozo-2,6-bisfosfatazy, d) mechanizm działania transaminaz, e) kataliza
kwasowo – zasadowa (k-z), f) enzymy wymagające atomów metali

3.

Kinetyka reakcji enzymatycznych

a) ogólne zasady kinetyki reakcji chemicznych, b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki
wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej, c) wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji,
d) zjawisko kooperatywności, e) inhibicja odwracalna i nieodwracalna

4.

Regulacja aktywności enzymów

a) regulacja ilości enzymu, b) regulacja aktywności katalitycznej enzymu

5.

Znaczenie diagnostyczne pomiarów aktywności enzymów

a) enzymy indykatorowe, ekskrecyjne i sekrecyjne, b) enzymy najczęściej oznaczane w praktyce
klinicznej, c) panele enzymatyczne, d) diagnostyka enzymatyczna w onkologii

Rozdział III – Transport przez błony i utleniania biologiczne

1.

Budowa i funkcje błon biologicznych

a) skład błon, b) funkcje błon

2.

Transport przez błony biologiczne – klasy białek transportujących

a) kanały jonowe, b) przenośniki transbłonowe – translokazy, c) pompy jonowe, d) wymienniki

3.

Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne

a) klasyfikacja oksydoreduktaz, b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszące protony i elektrony

4.

Transport atomów wodoru przez błonę mitochondrialną

5.

Łańcuch oddechowy

6.

Fosforylacja oksydacyjna

7.

Reaktywne formy tlenu (RFT)

8.

Utlenianie mikrosomalne

9.

Cykl kwasów trójkarboksylowych (TCA)

a) reakcje cyklu, b) bilans energetyczny cyklu, c) powiązania z innymi szlakami – amfiboliczność
cyklu, d) regulacja cyklu

10.

Kompleks oksydazy α-ketokwasów

Rozdział IV – Węglowodany

1.

Budowa chemiczna, właściwości i funkcje cukrów prostych i złożonych

a) monosacharydy, b) disacharydy, c) polisacharydy

2.

Trawienie węglowodanów i jego zaburzenia

3.

Wchłanianie i transport węglowodanów

a) transport aktywny i bierny, białka transportujące, b) zróżnicowanie tkankowe transportu, c) rola
insuliny, d) rola fosforylacji monosacharydów

4.

Metabolizm glukozy

- -

4

a) glikoliza (szlak EMP), b) glukoneogeneza, c) szlak pentozofosforanowy (szlak WDH, PPP),
d) niektóre zaburzenie przemian glukozy

5.

Metabolizm glikogenu

a) glikogenogeneza, b) glikogenoliza, c) regulacja glikogenogenezy i glikogenolizy, d) glikogenozy

6.

Inne szlaki metabolizmu monosacharydów

a) szlak kwasu uronowego, b) metabolizm fruktozy, c) metabolizm galaktozy

7.

Metabolizm heteroglikanów

a) aminocukry – heksozoaminy, b) glikoproteiny, c) proteoglikany, d) mukopolisacharydozy

8.

Regulacja przemiany węglowodanów

a) zróżnicowanie tkankowe przemiany węglowodanowej i integracyjna rola wątroby,
b) kontrola stężenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu węglowodanów

Rozdział IV – Lipidy

1.

Budowa chemiczna, podział i rola tłuszczów prostych i złożonych

a) funkcje tłuszczów, b) podział lipidów, c) kwasy tłuszczowe, d) triglicerydy (TG), e) fosfolipidy,
f) glikolipidy, g) steroidy, h) poliprenoidy

2.

Trawienie i wchłanianie lipidów

3.

Transport lipidów w chłonce i w osoczu

a) budowa lipoprotein, b) transport lipidów w lipoproteinach osocza, c) zaburzenia transportu
lipoproteinowego, d) rola wątroby w metabolizmie lipidów

4.

Tkanka tłuszczowa – rola w metabolizmie lipidów

a) metabolizm adipocytów, b) regulacja, c) brunatna tkanka tłuszczowa

5.

Utlenianie kwasów tłuszczowych

a) lokalizacja komórkowa i tkankowa, b) aktywacja i transport KT do mitochondrium, c) β-oksydacja
nasyconych KT, d) oksydacja nienasyconych KT, e) ketogeneza, f) zaburzenia oksydacji KT

6.

Lipogeneza – synteza kwasów tłuszczowych

a) lokalizacja i transport substratów, b) przebieg lipogenezy, c) synteza nienasyconych KT,
d) metabolizm eikozanoidów

7.

Synteza trójglicerydów

a) lokalizacja tkankowa i komórkowa, b) przebieg syntezy

8.

Cholesterol

a) biosynteza cholesterolu, b) trawienie i wchłanianie cholesterolu, c) równowaga cholesterolu i
endocytoza LDL, d) wydalanie cholesterolu, e) miażdżyca

9.

Kwasy żółciowe

10.

Kalcyferole

11.

Hormony sterydowe

Rozdział VI – Przemiana azotowa: aminokwasy, nukleotydy, porfiryny

1.

Trawienie białek w przewodzie pokarmowym

a) enzymy i ich specyficzność, b) transport azotu pomiędzy tkankami

2.

Ogólna przemiana aminokwasów i metabolizm grupy aminowej

a) transaminacja, b) dezaminacja, c) transport, d) eliminacja

3.

Metabolizm poszczególnych aminokwasów

a) Asp, b) Asn, c) Glu, d) Gln, e) Ala, f) Gly, g) Ser, h) Pro, i) Hyp, j) Arg, k) Orn, l) Cys, m) Phe,
n) Tyr, o) Lys, p) Hyl, q) His, r) Thr, s) Met, t) Trp, u) Val, Leu i Ile

4.

Przemiana nukleotydów

a) trawienie kwasów nukleinowych w przewodzie pokarmowym, b) budowa nukleotydów,
c) biosynteza nukleotydów purynowych, d) degradacja puryn, e) odzysk puryn, f) synteza nukleotydów
pirymidynowych, g) degradacja pirymidyn, h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydów

5.

Metabolizm porfiryn

a) synteza hemu, b) rozkład hemu, c) zaburzenia metabolizmu porfiryn

Rozdział VII – Biochemia funkcjonalna tkanek

1.

Endogenne regulatory procesów metabolicznych

a) regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaźniki wtórne,
b) eikozanoidy – budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne

2.

Gospodarka wapniowo – fosforanowa w organizmie i jej regulacja

a) rola wapnia oraz białek wiążących wapń, b) regulacja przemiany wapniowej, c) rola fosforanu
nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powiązania z gospodarką wapniową

3.

Gospodarka żelazem w organizmie – wchłanianie, regulacja, zaburzenia przemiany

- -

5

4.

Biochemia krwi

a) białka osocza i ich rola, b) struktura i funkcja erytrocytów, c) budowa i metabolizm leukocytów na
przykładzie neutrofili, d) budowa i metabolizm trombocytów, e) hemostaza osoczowa

5.

Biochemia wątroby

a) rola tkanki wątrobowej, b) przemiana węglowodanowa, lipidowa i azotowa w wątrobie, c) wątroba
jako gruczoł zewnątrzwydzielniczy, d) procesy biotransformacji i detoksykacji

6.

Biochemia nerek

a) funkcje i regulacja, b) skład i właściwości moczu w normie i w patologii

7.

Biochemia mięśni

a) budowa i charakterystyka białek mięśni, b) mechanizm skurczu mięśnia

8.

Biochemia tkanki łącznej

a) składniki tkanki łącznej, ich budowa i funkcja, b) synteza kolagenu – reakcje i regulacja procesu,
c) biochemia kości

9.

Biochemia zmysłu wzroku

a) rola i przemiany karotenoidów w organizmie człowieka,
b) reakcje zachodzące w procesie fotorecepcji

Rozdział VIII – Kwasy nukleinowe i biosynteza białek

1.

Budowa i właściwości kwasów nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny

a) elementy składowe kwasów nukleinowych – zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy, b) budowa
przestrzenna i właściwości DNA, c) budowa, właściwości i klasyfikacja RNA, d) budowa chromatyny,
e) chromatyna aktywna i nieaktywna, f) sekwencje powtarzające; mutacje dynamiczne; konwersja genu,
g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych, h) gen i jego ekspresja; genom,
i) transpozony; geny przekształcone, j) motywy funkcjonalne białek wiążących się z DNA

2.

Replikacja i naprawa DNA; cykl komórkowy i jego regulacja

a) inicjacja, b) elongacja, c) terminacja, d) regulacja replikacji i cykl komórkowy, e) naprawa DNA

3.

Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje

a) transkrypcja u Procariota, b) różnice w transkrypcji u Eucariota, c) geny podzielone; snRNA;
składanie mRNA, d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA, e) transkrypcja genów
tRNA i rRNA

4.

Translacja – biosynteza białek

a) kod genetyczny, b) budowa tRNA i aktywacja aa, c) budowa i funkcje rybosomów, d) etapy
translacji, e) regulacja i inhibitory translacji, f) potranslacyjne modyfikacje białek

5.

Mitochondrialne DNA (mtDNA)

- -

6

- -

7

ROZDZIAŁ I – AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAŁKA

1.

Aminokwasy

a)

budowa

Aminokwasy (ang. aminoacids = aa), jak sama nazwa wskazuje, należą do dwufunkcyjnych pochodnych

węglowodorów, zawierających w cząsteczce grupę karboksylową oraz aminową. Ogólnie rzecz biorąc, względne
położenie obu tych grup może być dowolne, jednak zdecydowanie największe znaczenie posiadają α-L-
aminokwasy, ze względu na to, iż wchodzą w skład peptydów i białek. Określenie α-aminokwasy oznacza, iż
obie główne grupy funkcyjne przyłączone są do tego samego, I-rzędowego atomu węgla; wynika stąd ich wzór
ogólny postaci: H

2

N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla każdego aa i

decydującym o jego właściwościach. Aa mogą również ulegać w organizmie rozmaitym modyfikacjom, np.
hydroksylacji (4-hydroksy-Pro, 5-hydroksy-Lys), karboksylacji (γ-karboksy-Glu), metylacji, formylacji,
acetylacji (N-Ac-Glu), prenylacji, fosforylacji i innym.

b)

nazewnictwo i wzory

Każdy aa białkowy posiada nazwę systematyczną, wynikającą z jego budowy chemicznej, jak również

zwyczajową. W praktyce posługuje się wyłącznie tymi drugimi, jak również ich skrótami – trój- oraz
jednoliterowymi. Nazwy zwyczajowe aa białkowych, ich skróty oraz wzory strukturalne przedstawia poniższa
tabela.

Lp.

Nazwa zwyczajowa i skróty

Wzór strukturalny

1.

glicyna, Gly, G

2.

alanina, Ala, A

3.

walina, Val, V

4.

leucyna, Leu, L

5.

izoleucyna, Ile, I

6.

seryna, Ser, S

7.

treonina, Thr, T

8.

cysteina, Cys, C

- -

8

9.

metionina, Met, M

10.

kwas asparaginowy, Asp, D

11.

asparagina, Asn, N

12.

kwas glutaminowy, Glu, E

13.

glutamina, Gln, Q

14.

arginina, Arg, R

15.

lizyna, Lys, K

16.

histydyna, His, H

17.

fenyloalanina, Phe, F

18.

tyrozyna, Tyr, Y

19.

tryptofan, Trp, W

20.

prolina, Pro,

c)

klasyfikacja

Aa klasyfikuje się ze względu na rozmaite kryteria:

•

Ze względu na udział w syntezie peptydów wyróżnia się aa białkowe i niebiałkowe. Każdy aa białkowy
posiada co najmniej jeden kodon – kodujący go układ 3 nukleotydów w mRNA; listę 20 aa białkowych
zawiera powyższa tabela. Aa niebiałkowe nie są zawarte w informacji genetycznej, powstają zaś w
wyniku modyfikacji aa białkowych. Dalsze kryteria klasyfikacji odnoszą się wyłącznie do aa
białkowych.

- -

9

•

Ze względu na polarność rodnika (R) aa białkowe dzieli się na:

aa z R niepolarnym: G, A, V, L, I, P, F,

aa z R polarnym niejonizującym: S, T, Y, C, M, Q, N, W,

aa z R polarnym jonizującym:

kwaśne: D, E,

zasadowe: K, R, H.

•

Ze względu na budowę chemiczną R:

aa z R alifatycznym: G, A, V, L, I,

aa z R zawierającym grupę hydroksylową: S, T, Y,

aa z R zawierającym atom siarki: C, M,

aa z R zawierającym grupy kwasowe lub ich amidy: D, E, N, Q,

aa z R zawierającym grupy zasadowe: K, R, H,

aa z R zawierającym pierścień aromatyczny: F, Y, W, H,

aa o charakterze iminokwasów: P.

•

Ze względu na zdolność organizmu ludzkiego do ich syntezy, aa dzieli się na endo- i egzogenne.

Aa endogenne są syntetyzowane przez ludzkie hepatocyty i nie wymagają dostarczania ich z
pokarmem. Należą do nich: G, A, P, S, Y, D, E, N, Q.

Aa egzogenne (niezbędne, niezastąpione) nie są syntetyzowane w ludzkim ustroju, a ich obecność i
odpowiednie stężenie w białkach spożywczych decyduje o ich wartości odżywczej. Są to: V, L, I, F, T,
M, W, K, R, H (histydyna jest niezbędna dla dzieci do lat 12, ale nie jest niezbędna dla dorosłych).

•

Ze względu na produkty metabolizmu wyróżnia się: aa glikogenne, metabolizowane do prekursorów
węglowodanów oraz aa ketogenne, metabolizowane do ciał ketonowych. (patrz również punkt V-3)

d)

funkcje

Najważniejszą funkcją aa jest wzajemne łączenie się, w wyniku czego powstają cząsteczki o wyższych

poziomach organizacji – peptydy, polipeptydy oraz białka (tworzenie wiązania peptydowego omówione jest
dalej). Ponadto aa biorą udział w takich procesach fizjologicznych jak: przekaźnictwo w układzie nerwowym
(Gly, Glu, Asp, GABA), regulacja procesów wzrostu komórki (Phe i Tyr – substraty do syntezy T

3/4

), biosynteza

zasad azotowych, porfiryn i mocznika (Orn, Cyt, Arg-bursztynian) oraz transdukcja sygnałów
wewnątrzkomórkowych (odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr).

e)

właściwości fizyczne

W warunkach naturalnych aa mają postać krystalicznych ciał stałych; nie absorbują światła widzialnego,

dlatego są bezbarwne (można je wybarwić i uwidocznić specjalnymi metodami, o czym później).

Z wyjątkiem glicyny wszystkie α-aa wykazują czynność optyczna, tzn. ich roztwory skręcają płaszczyznę

świata spolaryzowanego. Wykazują również izomerię optyczną, tworząc szeregi konfiguracyjne D i L.
Składnikami białek są wyłącznie L-aa, co oznacza, iż numeracja podstawników przy chiralnym atomie węgla
(Cα) wg kryterium masy rośnie przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Choć wykazano występowanie D-aa
(Ser, Asp), w układzie nerwowym ssaków, to nie wchodzą one w skład peptydów i białek; ponadto D-aa
występują w ścianach komórkowych niektórych bakterii (Ala, Glu) oraz w antybiotykach.

Większość aa jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i tworzy roztwory, w których wykazuje charakter na

ogół obojętny. Dzięki obecności w cząsteczce zarówno grupy karboksylowej – o charakterze kwaśnym, jak i
aminowej – o charakterze zasadowym, aa mogą tworzyć wewnętrzne sole – występować w postaci jonów
obojnaczych (H

3

N

+

-CH(R)-COO

-

) i tworzyć kryształy jonowe. Tłumaczy to polarną i krystaliczną strukturę aa, z

czego wynikają wysokie temperatury topnienia (dalsze ogrzewanie prowadzi do rozkładu).

Możliwe formy jonowe aa bez bocznych grup hydrolizujących przedstawione są poniżej:

R-CH(N

(+)

H

3

)-COOH ↔K

1

↔ R-CH(N

(+)

H

3

)-COO

-

↔K

2

↔ R-CH(NH

2

)-COO

-

(I) pH < pI

(II) pI

(III) pH > pI

Krzywa miareczkowania takiego aa składa się z dwóch sigmoidalnych części, rozdzielonych punktem
izoelektrycznym:
pH =

pK

1

+ log [II]/[I] dla pH < pI

pK

2

+ log [III]/[II] dla pH < pI

Przez punkt izoelektryczny (pI) rozumiemy wartość pH, w której aa występuje niemal w całości w postaci jonu
obojnaczego, nie wędruje w polu elektrycznym i cechuje się minimalną możliwą rozpuszczalnością w wodzie. pI
to innymi słowy wartość pH w punkcie pomiędzy wartościami pK po obydwu stronach form izojonowych (jonu
obojnaczego) – stąd dla aa z R niepolarnym pI = ½ x (pK

1

+ pK

2

).

- -

10

Jeżeli chodzi o aa z rodnikiem polarnym i jonizującym, sytuacja przedstawia się odmiennie dla kwasów

oraz zasad. W przypadku kwasu najpierw tracony jest proton z własnej reszty karboksylowej, następnie z grupy
bocznej, a na samym końcu z własnej grupy aminowej; wobec tego pI oblicza się podobnie jak dla aa z R
niepolarnym, czyli: pI = ½ x (pK

1

+ pK

2

). Natomiast w przypadku zasady najpierw tracony jest proton z reszty

karboksylowej, następnie z grupy bocznej, a ostatecznie z własnej grupy aminowej; wyrażenie opisujące pI
przyjmuje zatem postać: pI = ½ x (pK

2

+ pK

3

).

f)

właściwości chemiczne – reakcje aa

Aa posiadają kilka grup funkcyjnych – α-aminową, α-karboksylową oraz reaktywne grupy w obrębie R

(niektóre aa) – dzięki czemu mogą ulegać wielu rozmaitym przemianom.

•

Reakcje grupy karboksylowej:

dysocjacja i tworzenie soli (aa + zasada):
H

2

N-CH(R)-COOH →OH

-

→ H

2

N-CH(R)-COO

-

H

2

N-CH(R)-COOH + NaOH → H

2

N-CH(R)-COONa (sól sodowa aa)

tworzenie estrów (aa + alkohol):
H

2

N-CH(R)-COOH + R

1

-OH → H

2

N-CH(R)-CO-O-R

1

tworzenie amidów

tworzenie bezwodników kwasowych

dekarboksylacja (pod wpływem ogrzewania lub enzymatycznie):
H

2

N-CH(R)-COOH →∆T, -CO

2

→ R-CH

2

-NH

2

•

Reakcje grupy aminowej:

dysocjacja i tworzenie soli:
H

2

N-CH(R)-COOH →H

+

→ H

3

N

+

-CH(R)-COOH

H

2

N-CH(R)-COOH + HCl → Cl

-

H

3

N

+

-CH(R)-COOH = HCl

.

H

2

N-CH(R)-COOH (chlorowodorek aa)

estryfikacja, acylacja, N-formylacja

dezaminacja (gł. enzymatyczna):
H

2

N-CH(R)-COOH →→ R-CO-COOH (ketokwas)

•

Grupa hydroksylowa (Ser, Thr, Tyr) – estryfikacja

•

Grupa sulfhydrylowa (Cys):

utlenianie

do cystyny: 2 Cys-SH →-2H→ Cys-S-S-Cys

do kwasu cysteinowego (przez silne utleniacze, np. kwas nadmrówkowy):
Cys →HCOOOH→ HO

2

S-CH

2

-CH(NH

2

)-COOH

alkalizacja

•

Jeżeli grupa aminowa znajduje się w dalekim położeniu w stosunku do grupy karboksylowej (tj. przy
C

4

-C

6

), wówczas w wyniku ogrzewania następuje wewnętrzna cyklizacja i powstają cykliczne amidy –

laktamy. Np. kwas 6-aminoheksanowy tworzy kaprolaktam, będący surowcem do produkcji
poliamidów.

•

Jak wcześniej wspomniano, aa mają postać bezbarwnych ciał stałych. Można jej jednak wybarwić
poprzez reakcję z ninhydryną. Jest to reakcja charakterystyczna aa, pozwalająca na ich identyfikację. Jej
produktami są aldehydy poch. od aa oraz złożony barwnik, którego anion posiada intensywnie
purpurową barwę.

•

Reakcja powstawania i charakterystyka wiązania peptydowego – patrz punkt I-2-a.

- -

11

g)

techniki rozdziału

Skład mieszaniny aa, np. pochodzącej z hydrolizy peptydu, można określić za pomocą chromatografii lub

elektroforezy.

•

Istotą chromatografii jest rozdział składników między fazą stacjonarną a ruchomą, spowodowany ich
silniejszym wiązaniem się z jedną z tych faz. Istnieje kilka rodzajów chromatografii.

•

Chromatografia bibułowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdyż nie wymaga specjalnego sprzętu.
Kroplę roztworu zawierającą aa nanosi się na pasek bibuły (stąd nazwa), który następnie umieszcza się
w szczelnym naczyniu, tak iż koniec paska styka się z rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wędruje
wzdłuż paska, „wciągany” przez higroskopijną strukturę bibuły. Po przepływie rozpuszczalnika do
końca pasek suszy się oraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny – powstają
w ten sposób purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwością
chromatograficzną, zależy od jego względnej polarności – aa z R niepolarnymi i długimi wędrują na
pasku dalej niż aa z R krótszymi lub polarnymi. Dla każdego aa można wyznaczyć jego względną
ruchliwość (R

f

), definiowaną jako stosunek odległości przebytej przez dany aa do odległości przebytej

przez czoło rozpuszczalnika.

•

Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli się na podziałową
(partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjną (adsorption TLC = ATLC).

W PTLC wykorzystuje się rozdział składników mieszaniny pomiędzy fazę stacjonarną oraz ciekłą –
ruchomą, które dodatkowo różnią się polarnością.

W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, zaś rozpuszczalnik zawiera zarówno
składniki polarne, jak i mało polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nośnikiem zmienia
się skład rozpuszczalnika, gdyż jego bardziej polarne składniki wiążą się z polarnymi grupami
hydroksylowymi celulozy – wskutek tego przesuwające się czoło rozpuszczalnika staje się
stopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC słabiej polarne składniki mieszaniny
wędrują więc dalej od polarnych podobnej wielkości.

W PTLC w fazie odwróconej polarność faz oraz szybkość wędrówki składników próby są
odwrotne niż powyżej – faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swoją
polarność. Dlatego polarne składniki mieszaniny wędrują z czołem rozpuszczalnika, a mniej
polarne pozostają z tyłu.

W ATLC wykorzystuje się adsorpcję składników próby na prażonym żelu krzemionkowym. Faza
ruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane składniki, współzawodniczące o miejsce wiązania na żelu –
składniki słabiej związane wymywane są w pierwszej kolejności.

•

Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypełnionej
ściśliwym złożem, w warunkach wykluczających stosowanie wysokich ciśnień; ogranicza to
maksymalną szybkość przepływu rozpuszczalnika, a tym samym szybkość całego procesu
chromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high
performance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej,
wypełnionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi cząsteczkami nieściśliwego wymiennika jonowego,
sita molekularnego lub złoża stosowanego w chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Bywa
również określana jako wysokociśnieniowa, gdyż wartości używanych ciśnień osiągają wartości 5 – 10
tys. psi. Do jej zalet należy znaczne skrócenie czasu rozdziału, co ogranicza dyfuzję boczną i zapewnia
lepszy rozdział składników próby. Rozdział aa metodą HPLC uwzględnia ich reakcję z odczynnikiem
umożliwiających ich identyfikację i ocenę ilościową. Reakcję tą przeprowadza się albo przed (pre-
column) albo po (post-column) właściwej chromatografii. Przy barwieniu post-column używa się
znanej już ninhydryny, która tworzy barwne związki indygowe (pochłaniające promieniowanie z
zakresu światła widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column używa się odczynnika określanego
skrótem AQC, który wykazuje zdolność fluorescencji – aa identyfikuje się więc przez oświetlenie
lampą UV.

•

Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) służy do rozdzielania
mieszanin amfolitów, czyli cząsteczek, których wypadkowy ładunek zależy od pH otoczenia.
Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Próbki nanosi się na nośnik
zwilżony buforem o odpowiednim pH i następnie umieszcza w polu elektrycznym. Wówczas kationy
wędrują do katody, a aniony do anody, przy czym szybkość wędrówki składników zależy od ich
ładunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy cząsteczkowej (odwrotnie
proporcjonalnie). Po zakończeniu rozdziału produkty uwidacznia (wybarwia) się odpowiednim
odczynnikiem.

Rozdział aa prowadzi się na bibule lub cienkowarstwowej płytce pokrytej sproszkowaną celulozą, a
wybarwia roztworem ninhydryny.

Rozdział polipeptydów i białek prowadzi się na usieciowanym żelu poliakrylamidowym (PAG).

- -

12

Do rozdziału oligomerów nukleotydowych używa się agarozy i PAG, do wybarwiania produktów służy
zaś bromek etydyny (identyfikacja w świetle UV).

2.

Peptydy

a)

synteza i właściwości wiązania peptydowego

Tworzenie wiązania peptydowego jest najistotniejszą reakcją aa z biologicznego punktu widzenia. Polega

ono na kondensacji dwóch aa, a dokładniej na reakcji grupy karboksylowej jednego aa z grupa aminową
drugiego aa, czemu towarzyszy eliminacja cząsteczki wody:

...-COOH + H

2

N-... →-H

2

O→ ...-CO-NH-...

Stała równowagi powyższej reakcji jest przesunięta na korzyść hydrolizy wiązania peptydowego. Jego

powstanie musi być zatem poprzedzone aktywacją grupy karboksylowej – laboratoryjnie osiąga się to przez
przekształcenie aa w chlorek kwasowy, zaś w organizmach żywych aa ulega kondensacji z ATP, tworząc
aktywny aminoacyloadenylan (patrz punkt VIII-4-b).

Wiązanie peptydowe może występować w formie ketonowej (-CO-NH-), bądź enolowej (-CO

(-)

=N

(+)

H-),

które wzajemnie w siebie przechodzą (zjawisko to określane jest jako tautomeria keto-enolowa). Stabilizacja
rezonansowa wiązania peptydowego nadaje mu charakter częściowo (ok. 40%) wiązania podwójnego. Ma to
daleko idące konsekwencje – wiąże się bowiem ze skróceniem długości i usztywnieniem wiązania oraz
zablokowaniem wokół niego rotacji przyległych atomów. Sprawia to, iż wszystkie 4 atomy tworzące wiązanie
(C, O, N, H) znajdują się w jednej płaszczyźnie (tzn. są koplanarne) i pozbawione są możliwości wzajemnego
ruchu. To z kolei umożliwia występowanie izomerii geometrycznej względem atomu tlenu: cis (Z) i trans (E),
przy czym fizjologicznie wyraźnie dominuje ta druga. Rotacja może odbywać się jedynie wokół wiązań C

α

-C

oraz N-C

α

. Charakter tej rotacji opisują ilościowo tzw. kąty torsyjne: φ (C

α

-C) i ψ (N-C

α

). Mają one określone

wartości dla uporządkowanych struktur II-rzędowych (por. dalej).

Wiązanie peptydowe nie posiada ładunku w żadnym istotnym fizjologicznie pH. Pomimo to peptydy są w

fizjologicznym pH obdarzone ładunkiem elektrycznym dzięki ładunkom ich grup końcowych (karboksylowej i
aminowej) oraz polarnych grup R. Wartość tego ładunku zależy od wartości pK i otoczenia grup dysocjujących
oraz od pH otoczenia. Podobnie jak każdemu aa można przyporządkować pI, tak każdemu peptydowi odpowiada
punkt izojonowy – wartość pH, przy której liczba protonów związanych z grupami zasadowymi jest równa
liczbie protonów odszczepionych przez grupy kwasowe (wyrównanie liczby ładunków). Własność ta dotyczy
czystych peptydów, a wartość jest dla danego związku stała i charakterystyczna.

Wiązanie peptydowe nie absorbuje promieniowania z zakresu widzialnego, toteż nie nadaje zawierającym

je związkom barwy. Pochłania natomiast promieniowanie UV z zakresu λ = 220-230 nm.

Obecność wiązania peptydowego, począwszy od trójpeptydów, można wykazać za pomocą reakcji

biuretowej. Nazwa ta pochodzi od biuretu (H

2

N-CO-NH-CO-NH

2

) – najprostszego związku dającego pozytywny

wynik wspomnianej reakcji. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego roztworu siarczanu miedzi
(CuSO

4

) – wynik pozytywny objawia się intensywnie fioletowym zabarwieniem.

b)

nazewnictwo, podział i funkcje peptydów

W każdym peptydzie wyróżniamy dwa końce – aminowy (N) oraz karboksylowy (C), zależnie od rodzaju

występującej na nim wolnej grupy funkcyjnej. Jeśli chodzi o nazewnictwo, obowiązuje zasada podawania
kolejności aa od N-końca do C-końca. Peptydy traktuje się jako acyloaminokwasy, więc końcówkę nazwy aa,
którego grupa karboksylowa jest podstawiona, zmienia się na „-ylo”. Jedynie aa znajdujący się na C-końcu – z
wolną grupą karboksylową – zachowuje niezmienioną nazwę. Np. Ile-Cys-Gly to izoleucylo-cysteinylo-glicyna.
Wiele naturalnych peptydów zawiera zmodyfikowane aa lub nietypowe wiązania.

Ze względu na ilość reszt aa wchodzących w skład peptydu, wyróżniamy: oligopeptydy (3-10; 3 –

trójpeptydy, 4 – tetrapeptydy itd.), polipeptydy (10-100) oraz białka (>100). Zgodnie z innym kryterium (masy)
peptydy o masie <10 kDa określane są jako polipeptydy, zaś o masach większych – jako białka.

Peptydy pełnią rozmaite funkcje biologiczne:

•

hormony, np. TRH, ADH, OT

•

neuroprzekaźniki i neuromodulatory, np. enkefaliny, endorfiny, PS, neurotensyna, somatostatyna

•

toksyny, np. mikrocystyny i nodularyny syntetyzowane przez cyjanobakterie

•

antybiotyki, np. walinomycyna, gramicydyna A i S, bleomycyna

•

antyoksydanty, np. GSH

- -

13

c)

przykłady peptydów aktywnych biologicznie

Nie tylko wielkocząsteczkowe białka o skomplikowanej i wielorzędowej strukturze, ale proste

oligopetydy, złożone ze stosunkowo niewielkiej liczby aa, mogą pełnić w organizmie ważne i niezastąpione
funkcje. Omówione zostaną wg liczby reszt aa.

•

Istotnymi biologicznie dwupeptydami są: karnozyna, homokarnozyna i anseryna.

Karnozyna, czyli N

α

-(β-alanylo)histydyna, w znacznych ilościach występuje w mięśniach

szkieletowych wyższych kręgowców i człowieka. Wzmaga aktywność ATP-azy miozynowej oraz
chelatuje jony Cu

2+

i pobudza pobieranie związków miedzi.

Homokarnozyna, czyli N

α

-(4-aminobutyrylo)histydyna, jest dwupeptydem ośrodkowego układu

nerwowego, występującym w tkance mózgowej, którego funkcja nie jest znana.

Anseryna, czyli π-metylokarnozyna lub N

α

-(3-aminopropionylo)-π-metylohistydyna, występuje w

mięśniach szkieletowych wyższych kręgowców, które odznaczają się szybką czynnością skurczową, np.
mięśnie kończyn królika lub mięśnie piersiowe ptaków. Brak anseryny w mięśniach człowieka. U
niższych kręgowców, np. u ryb kostnoszkieletowych występuje ona w znacznych ilościach, w
porównaniu ze śladową ilością karnozyny.

•

Aktywnym trójpeptydem jest tyreoliberyna (TRH) – produkowana przez podwzgórze stanowi czynnik
uwalniający tyreotropinę z przedniego płata przysadki. Jej pełna nazwa to:
piroglutamylohistydyloprolinoamid. Składa się z reszt aminokwasowych Glu, His i Pro, przy czym N-
końcowy kwas glutaminowy ulega wewnętrznej cyklizacji o kwasu piroglutaminowego, zaś C-końcowa
grupa karboksylowa proliny występuje jako amid kwasowy.

•

Innym aktywnym trójpeptydem, pełniącym rolę biologicznego układu redox, jest glutation, czyli γ-
glutamylocysteinyloglicyna. Zawiera on reszty Glu, Cys i Gly, przy czym Glu łączy się z Cys
wiązaniem nie-α-peptydowym – wiązanie peptydowe tworzy nie grupa karboksylowa przy
asymetrycznym C

1

, lecz przy C

3

. Glutation występuje w komórkach w stosunkowo dużych ilościach –

rzędu 5 mM. Obecny jest w postaci dwóch form – utlenionej i zredukowanej, przy czym tej drugiej jest
zazwyczaj około 500 razy więcej. Glutation pełni rolę buforującą stanowiąc bufor hydrosulfidowy.
Pełni również role odtruwającą, ponieważ jest przeciwutleniaczem reagującym z nadtlenkiem wodoru i
nadtlenkami organicznymi, unieszkodliwiając te uboczne i toksyczne produkty metabolizmu.

- -

14

•

Do aktywnych pięciopeptydów zaliczamy enkefalinę metioninową i leucynową. Pierwsza ma postać:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, druga zaś: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu – różnią się zatem jedynie C-końcowym
aminokwasem, uwzględnionym w nazwie. Wraz z endorfinami (α, β, γ) – grupą polipeptydów o 20-30
resztach aminokwasowych – stanowią one naturalne peptydy opioidowe, przeciwbólowe, o działaniu
podobnym do morfiny, lecz silniejszym 18-20 razy.

•

Aktywnym ośmiopeptydem jest angiotensyna II (hipertensyna), powstająca z osoczowego
angiotensynogenu pod wpływem reniny wydzielanej w nerkach, a następnie pod wpływem działania
enzymu konwertującego. Skutkiem działania reniny na angiotensynogen jest powstanie
dziesięciopepetydu – angiotensyny I, z której pod wpływem wspomnianego enzymu powstaje
angiotensyna II. Ma ona strukturę: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Angiotensyna zwęża naczynia
krwionośne i jest najsilniejszym czynnikiem podwyższającym ciśnienie krwi. Pobudza korę nadnerczy
do syntezy aldosteronu, który zwiększa resorpcję zwrotną jonu Na

+

w nerkach, przeciwdziałając ich

utracie z moczem.

•

Bradykinina to dziewięciopeptyd rozszerzający naczynia krwionośne i obniżający ciśnienie krwi, działa
zatem antagonistycznie do angiotensyny II. Odpowiedzialna jest również za uczucie bólu towarzyszące
zranieniu skory. Ma postać: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Bradykinina stanowi typowa
kininę powstającą ze specjalnych białek, kininogenów, należących do α

2

-globulin osocza pod wpływem

swoistych enzymów proteolitycznych, zwanych kalikreinami.

•

Dzięwięciopeptydami wykazującymi aktywność klasycznych hormonów są wazopresyna i oksytocyna,
produkowane w podwzgórzu, a magazynowane w tylnym płacie przysadki. Mają prawie identyczną
sekwencje aminokwasową, różnią się jedynie dwoma aminokwasami, dlatego hormony te wywołują
pewne wspólne efekty biologiczne. Wazopresyna czyli hormon antydiuretyczny (ADH) zwiększa
wchłanianie zwrotne wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobór ADH prowadzi do
moczówki prostej. Oksytocyna stymuluje skurcze mięśni gładkich macicy (przez co rozpoczyna akcję
porodową) i gruczołu sutkowego.

•

Niektóre peptydy wykazują aktywność biologiczną antybiotyków. Antybiotyki peptydowe mają bardzo
charakterystyczną cykliczna strukturę i mogą zawierać D-aminokwasy.

- -

15

•

Penicylina jest produkowana przez pleśń Penicillium, gdzie powstaje z Val i Cys, które tworzą 4-
członowy pierścień β-laktamowy i 5-członowy pierścień tiazolidynowy. Do pierwszego z nich
przyłączana jest wiązaniem peptydowym zmienna grupa kwasowa (R), która może być różna i przez to
wyróżniamy różne rodzaje penicylin. Penicylina poprzez reaktywny pierścień β-laktamowy zawierający
wiązanie peptydowe nieodwracalnie hamuje transpeptydazę glikopeptydową – kluczowy enzym w
syntezie ścian komórkowych bakterii. W praktyce najczęściej używa się penicyliny G.

Symbol

Nazwa penicyliny

Wzór R

F

pentylopenicylina

-CH

2

-CH=CH-CH

2

-CH

3

G

benzylopenicylina

-CH

2

-C

6

H

5

K

heptylopenicylina

-(CH

2

)

6

-CH

3

V

fenoksymetylopenicylna

-CH

2

-O-C

6

H

5

X

hydroksybenzylopenicylina

-CH

2

-C

6

H

4

-OH

•

Aktynomycyna D pochodzi ze szczepu Streptomyces. W swej strukturze zawiera grupę barwnikową
(kwas fenoksazonodikarboksyowy), która połączona jest wiązaniami peptydowymi z dwoma
pięciopeptydami. Końcowe grupy karboksylowe obu pięciopeptydów tworzą makrocykliczne
pierścienie laktonowe. W pięciopeptydach występuje D-Val. Aktynomycyna D jest specyficznym
inhibitorem syntezy RNA, czyli transkrypcji, zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i
eukariotycznych, dlatego często jest wykorzystywana w badaniach biochemicznych. Aktynomycyna D
wiąże się specyficznie z 2-niciowym DNA, uniemożliwiając jego użycie jako matrycy w syntezie RNA.
Obniżenie stężenia mRNA prowadzi do hamowania syntezy białka. Pierścień fenoksazonowy
aktynomycyny interkaluje, czyli wślizguje się pomiędzy pary zasad CG w 2-niciowym DNA, natomiast
cykliczne polipeptydy wystają jeden ponad, a drugi pod pierścieniem fenoksazonowym Symetria
aktynomycyny D dokładnie odpowiada symetrii specyficznej sekwencji zasad CG. Ponadto
aktynomycyna D ma działanie cytostatyczne, czyli hamuje podział komórek, w tym komórek szybko
dzielących się, dlatego znalazła zastosowanie w leczeniu niektórych nowotworów.

•

Walinomycyna ma strukturę cykliczną, utworzoną z aminokwasów i hydroksykwasów połączonych na
przemian wiązaniami estrowymi i peptydowymi. Składa się z trzykrotnie powtórzonego elementu, w
skład którego wchodzą reszty L-mleczanu (Lac), L-waliny, D-hydroksyizowalerianu (Hiv) i D-waliny.
Walinomycyna jest jonoforowym antybiotykiem nośnikowym, pod wpływem którego błony
biologiczne stają się przepuszczalne dla jonu K

+

. Organizmy znajdujące się pod wpływem

- -

16

antybiotyków jonoforowych pozbawione są możliwości kontroli nad wymianą składników z
otoczeniem. Walinomycyna koordynacyjnie wiąże jon K

+

z 6 atomami tlenu reszt walin centralnej

przestrzeni cząsteczki i jako nośnik przenosi je na drugą stronę błony.

•

Gramicydyna S jest cyklicznym dziesięciopeptydem, w strukturze którego występują 2 reszty D-
fenyloalaniny.

•

Gramicydyna A jest również polipepetydowym antybiotykiem jonoforowym, zbudowanym z 15
naprzemiennie występujących reszt L- i D-aminokwasowych, który na N-końcu posiada grupę
formylową. Przyjmuje strukturę β-helisy. Poprzez N-formylowe końce dwa takie polipeptydy łączą się,
tworząc dimeryczny, funkcjonalny kanał jonowy dla kationów jednowartościowych, np. Na

+

, lecz nie

dla dwuwartościowych. Kanał ten spontanicznie otwiera się i zamyka, przepuszczając w ciągu sekundy
ponad 10

7

kationów. Por tego kanału wyścielony jest polarnymi grupami karboksylowymi peptydu, a

hydrofobowe łańcuchy boczne ustawione są na obwodzie kanału. Ułożenie to umożliwiają zestawione
naprzemiennie reszty L i D-aminokwasowe.

3.

Białka

a)

klasyfikacja

•

Ze względu na kształt cząsteczki i rozpuszczalność w wodzie białka dzieli się na:

globularne – o współczynnikach osiowych ≤ 3-4, a więc w przybliżeniu kuliste, dobrze rozp. w wodzie,

fibrylarne – o współczynnikach osiowych > 10 (kształt wydłużony), nierozpuszczalne w wodzie.

•

Ze względu na stan skupienia dzieli się białka na: stałe (kolagen, elastyna), półpłynne
(cytoplazmatyczne) oraz płynne (białka osocza).

•

Ze względu na budowę cząsteczki – obecność dodatkowych składników – na:

białka proste (proteiny) – zbudowane wyłącznie z aa i nie posiadające dodatkowych elementów, m. in.:
albuminy, globuliny, histony, protaminy, skleroproteiny,

białka złożone (proteidy) – zawierające dodatkowe składniki niebiałkowe, np. cząsteczki
węglowodanów (glikoproteiny), lipidów (lipoproteiny), resztę kwasu fosforowego (fosfoproteiny), atom
metalu (metaloproteiny), cząsteczkę barwnika (chromoproteiny) lub związane z kwasem nukleinowym
(nukleoproteiny).

•

Ze względu na pełnione w organizmie funkcje:

enzymatyczne – np. dehydrogenaza mleczanowa (LDH), transaminaza asparaginianowa (AspAT),
cyklooksygenaza (COX),

hormonalne – np. hormony przedniego płata przysadki (GH, PRL, ACTH, TSH, FSH, LH), hormony
trzustki (insulina, glukagon), parathormon (PTH),

strukturalne – np. kolagen, elastyna, keratyna,

transportowe – np. transferryna, hemoglobina (HGB), ceruloplazmina (CER), transkobalamina (TC),

zapasowe – np. mioglobina, ferrytyna,

odpornościowe – np. immunoglobuliny, białka układu dopełniacza (C), białka ostrej fazy,

kurczliwe lub pośrednio biorące udział w ruchu – np. aktyna, miozyna, tropomiozyna, troponina,

toksyny – np. tężcowa (tetanospazmina i tetanolizyna), botulinowa, toksyna cholery.

•

Białka pokarmowe dzieli się ze względu na przydatność dla organizmu na: pełnowartościowe –
zawierające aa egzogenne oraz niepełnowartościowe – złożone z aa endogennych.

- -

17

b)

identyfikacja

Obecność białka w środowisku można wykazać za pomocą kilku reakcji:

•

Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos – żółty, proteina – białko) polega na działaniu na próbę
stężonym kwasem azotowym (HNO

3

). Jeżeli w próbie tej znajduje się białko zawierające aa

aromatyczne, to ulegną one reakcji nitrowania, dając produkty dysocjujące do żółto-pomarańczowego
anionu, np.:

Tyr + HNO

3

→∆T, -H

2

O→ 3-nitrozotyrozyna

•

Reakcja biuretowa bierze swoją nazwę od biuretu (dwumocznika: H

2

N-CO-NH-CO-NH

2

) –

najprostszego związku dającego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecności wiązania
peptydowego, począwszy od trójpeptydów wzwyż. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego
roztworu siarczanu miedzi (CuSO

4

). Jeżeli w próbie znajduje się związek zawierający dwa sąsiadujące

wiązania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) połączenie kompleksowe o intensywnie
fioletowym zabarwieniu. Należy jednak zaznaczyć, iż pozytywne miano nie potwierdza obecności w
próbie związków aminokwasowych.

•

Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie białek zawierających wiązania dwusiaczkowe (S-S).
Przeprowadza się ją w środowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli ołowiu, np. octanu.
Pod wpływem wysokiego pH następuje rozpad wspomnianych wiązań z uwolnieniem anionu
wodorosiarczkowego:

Cys-S-S-Cys + H

2

O + OH

-

→ 2 CH

3

COCOOH + 2 NH

3

↑ + HS

-

+ S ↓,

który łączy się z kationem ołowiu, prowadząc do strącenia czarnego osadu siarczku ołowiu:

Pb(CH

3

COO)

2

+ HS

-

→ CH

3

COOH + CH

3

COO

-

+ PbS ↓.

c)

poziomy organizacji i fałdowanie

Białka należą do najbardziej złożonych związków chemicznych występujących w przyrodzie. Ich budowa

wykazuje pewne poziomy organizacji, stąd dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojęcie struktury I, II, III i
IV-rzędowej. Metody laboratoryjne określania kolejnych struktur nieznanych białek opisane zostaną dalej.

•

Przez strukturę I-rzędową rozumiemy liczbę, budowę i kolejność (sekwencję) połączonych ze sobą
reszt aa tworzących dane białko, wraz ze wskazaniem miejsc występowania wiązań dwusiarczkowych
(S-S). Struktura I-rzędowa opisuje więc konfigurację peptydu. Przez konfigurację rozumiemy
powiązania geometryczne między danym zbiorem atomów, których zmiana wiąże się z zerwaniem i
ponownym uformowaniem wiązań kowalencyjnych.

•

Struktura II-rzędowa określa sposób skręcenia łańcucha polipeptydowego, czyli jego konformację.
Konformacja to trójwymiarowa architektura cząsteczki, inaczej przestrzenne powiązania między
atomami; może ona ulec zmianie przez reorganizację stabilizujących ją wiązań niekowalencyjnych
(wiązania kowalencyjne zostają zachowane – por. wyżej). Cząsteczka białka o określonej konfiguracji
(strukturze I-rz.), wobec możliwości swobodnej rotacji wokół dużej części (ok. 2/3) wiązań głównego
łańcucha polipeptydowego, może posiadać nieproporcjonalnie dużą liczbę możliwych konformacji,
choć zwykle tylko niektóre z nich umożliwiają cząsteczce pełnienie funkcji biologicznych. Liczba ta
ograniczona jest częściowo podwójnym charakterem wiązania peptydowego, jak również rodzajem i
kształtem grup bocznych (R) aa. Kąty rotacji φ i ψ muszą więc przyjmować takie kombinacje wartości,
aby wykluczyć przestrzenne konflikty między poszczególnymi atomami cząsteczki, a ich znajomość
pozwala na jednoznaczne określenie konformacji wszystkich atomów gł. łańcucha polipeptydowego.
Dozwolone wartości obejmują konformacje regularne – α-helisę, β-kartkę, zwrot β, superhelisę
kolagenu oraz nieregularne – pętle i zwoje.

Ogólnie rzecz biorąc, każda helisa (zwój) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skręcający się
równomiernie wokół każdego atomu Cα. Istnieją różne typy helis, różniące się między sobą rozmiarami
i kierunkiem skrętu. Budowę helisy opisuje się więc przez podanie: liczby reszt aa przypadających na
jeden skręt (n) oraz skoku śruby (p) lub odległości między sąsiednimi skrętami. Helisy polipeptydowe
zabudowane z aa chiralnych są również chiralne, tzn. prawo- bądź lewoskrętne, przy czym w
naturalnych białkach występują niemal wyłącznie te pierwsze. Taki kierunek skrętu zdeterminowany
jest przez fakt budowy cząsteczki z enancjomerów L: w wyniku przyciągania się atomów wiązania
peptydowego lżejsza grupa N-H zbliża się w stronę cięższej grupy C-O właśnie w prawo.
α-helisa cechuje się korzystnymi wartościami kątów rotacji oraz układem stabilizujących wiązań
wodorowych. Zawiera zazwyczaj 4 – 50 (śr. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm.
Równoważne atomy z sąsiednich reszt łańcucha głównego oddalone są o 0,15 nm (mierzone wzdłuż
osi). Grupy R skierowane są na zewnątrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. We
wnętrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dzięki maksymalnej liczbie wiązań wodorowych
jest to konformacja o najniższej energii i tym samym największej stabilności, dlatego formuje się ona

- -

18

spontanicznie. Wiązania wodorowe występują między atomem N wiązania peptydowego oraz atomem
O wchodzącym w skład czwartego kolejnego wiązania peptydowego tego samego łańcucha (wiązania
wewnątrzłańcuchowe); mają one optymalną odległość 0,28 nm. Dodatkową funkcję pełnią wiązania
van der Waalsa (por. dalej), zwłaszcza działające poprzecznie do osi helisy, pomiędzy ciasno
upakowanymi atomami jej rdzenia. Jedynie peptydowy atom N proliny nie może uformować wiązania
wodorowego, dlatego aa ten pasuje jedynie do 1. obrotu helisy – w innym miejscu wytwarza on zgięcie.
α-helisy występują zwykle na powierzchni cząsteczek białek, chociaż mogą być również częściowo lub
całkowicie schowane w ich wnętrzu. Szczególny przypadek stanowią helisy amfipatyczne, w których aa
polarne i niepolarne zmieniają się ze sobą co 3 – 4 reszty – w ten sposób mogą one kontaktować się ze
środowiskiem polarnym z jednej strony, a z niepolarnym z drugiej. Helisy amfipatyczne występują m.
in. w: lipoproteinach osocza, hormonach, toksynach, antybiotykach, glikoproteinach wirusa HIV oraz w
kinazie białkowej regulowanej kalmoduliną.

Struktura β nazywana jest inaczej β-kartką, β-harmonijką lub pofałdowanym arkuszem. Nazwy te
odnoszą się do jej kształtu, obserwowanego wzdłuż krawędzi – Cα i związane z nimi R występują
naprzemiennie nieco powyżej i poniżej płaszczyzny głównego łańcucha polipeptydowegom który jest
niemal w pełni rozciągnięty. β-kartka posiada powtarzające się co do wartości kąty φ i ψ oraz jest
stabilizowana maksymalną ilością wiązań wodorowych. Te jednak, w przeciwieństwie do α-helisy,
mają charakter międzyłańcuchowy – występują między atomami N i O wiązań peptydowych
sąsiadujących pasm łańcuchów peptydowych; w ich tworzenie zaangażowane są odcinki o długości 5 –
10 aa z różnych regionów struktury I-rz.
Struktury β mogą być równoległe lub antyrównoległe (przeciwrównoległe, przeciwbieżne); w
pierwszym przypadku sąsiednie łańcuchy peptydowe biegną w tym samym kierunku, w drugim zaś – w
przeciwnym. Z wyjątkiem pasm granicznych tworzą się wszystkie możliwe wiązania wodorowe. W
strukturze antyrównoległej pary wiązań wodorowych występują na przemian raz blisko, a raz daleko od
siebie, a zorientowane są mniej więcej prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Z kolei w strukturze
równoległej wiązania wodorowe są rozmieszczone równomiernie, ale leżą względem siebie ukośnie i w
zmiennych kierunkach. Powszechne są regiony połączenia struktur równoległych i antyrównoległych,
wiele łańcuchów może też występować w obrębie jednej kartki (chociaż struktury równoległe złożone z
< 5 łańcuchów są nieco mniej stabilne i przez to rzadko spotykane). Niemal wszystkie pasma
harmonijki β są zwinięte prawoskrętnie, tworząc centralny rdzeń wielu białek globularnych.

Zwrot β (zagięcie β, β-skręt) to układ umożliwiający zmianę kierunku przebiegu struktury β, często
łączący końce dwóch przyległych pasm antyrównoległych. Zwrot β umożliwiający zmianę kierunku
łańcucha o 180

o

składa się z 4 aa, z czego pierwszy tworzy wiązania wodorowe z czwartym. Ponadto

często zawiera glicynę – z powodu niewielkiego rozmiaru oraz prolinę – gdyż ok. 6 % jej wiązań
peptydowych posiada konfigurację cis. Jest to struktura regularna, często obecna na powierzchni białek.

W typowym białku globularnym jedynie ok. połowa aa wchodzi w skład struktur α i β, podczas gdy
reszta występuje w postaci struktur nieregularnych, tj. pętli i zwojów. Szczególnie dotyczy to obu
końców (N i C) oraz reszt R lizyny. Obszary pętli warunkują głównie właściwości powierzchni
cząsteczek białek. Bezładna struktura wiąże się z giętkością i łatwością dopasowania, przy czym wiele
obszarów bezładnych ulega organizacji pod wpływem specyficznych ligandów; z tego powodu regiony
nieregularne często występują w miejscach interakcji cząsteczek białek z innymi cząsteczkami
(ligandami), np. w centrach katalitycznych enzymów, czy na powierzchni białek odpornościowych,
gdzie kształtują obszary oddziaływania przeciwciała z antygenem. Pętle o kształcie spinki do włosów
spinają sąsiadujące antyrównoległe struktury β.

Struktury II-rz. mogą tworzyć motywy naddrugorządowe, np. klucz grecki pojedynczy i podwójny,
motyw βαβ czy β-spinkę (antyrównoległe pasma β zespolone krótką pętlą).

•

Struktura III-rz. określa przestrzenne powiązania między elementami struktury II-rz. (helisami,
kartkami, innymi), jak również wzajemne oddziaływania między domenami, sposoby fałdowania oraz
oddziaływania stabilizujące takie ułożenie.

Struktura III-rz. stabilizowana jest przez różnorodne rodzaje wiązań niekowalencyjnych:

wiązania wodorowe – wytwarzane przez polarne R aa

oddziaływania hydrofobowe – występują pomiędzy niepolarnymi R aa

oddziaływania elektrostatyczne („mostki solne”) – tworzą się między przeciwnie naładowanymi
grupami, np. końcami N i C peptydów bądź R polarnymi jonizującymi (np. Lys i Asp)

siły van der Waalsa – są bardzo słabe i działają jedynie na niewielkie odległości, równe sumie
promieni van der Waalsa atomów pomiędzy którymi występują

Białka mogą być dodatkowo stabilizowane kowalencyjnymi wiązaniami dwusiarczkowymi (S-S);
rozwiązanie takie występuje w niektórych enzymach (np. rybonukleaza), hormonach (np. insulina) czy
białkach strukturalnych (keratyna).

- -

19

Struktury II-rz. i motywy naddrugorzędowe, zwłaszcza w dużych białkach, mogą być zorganizowane w
połączone ze sobą fragmenty, zwane domenami. Domena to lokalna, zwarta, globularna, potencjalnie
niezależne jednostka fałdowania białka, związana z nim jednak wiązaniami kowalencyjnymi. Domena
reprezentuje zwarty genetycznie segment, np. domeny w Ig, dehydrogenazach czy globinach; ponadto
interesujące jest, iż sekwencje aa charakterystyczne dla danej domeny można spotkać w innych,
podobnych domenach tego samego białka lub w innych białkach. Domeny często nadają białkom w
których występują zdolność pełnienia specyficznych funkcji, np. wiązania swoistych ligandów
(nukleotydów, polisacharydów). Przestrzeń między domenami wyznacza często centrum aktywne
białka, a powierzchnia kontaktu między nimi jest miejscem przenoszenia mechanizmów
allosterycznych.

Zaburzenia struktury II/III-rz. białek stanowią istotę chorób prionowych (TSE) – zmiany w konformacji
białek powodują zastąpienie α-helisy przez β-kartkę oraz wystąpienie oporności na proteolizę
enzymatyczną.

•

Struktura IV-rz. określona jest w przypadku białek oligomerycznych, tj. złożonych z ≥ 2 łańcuchów
polipeptydowych – zwanych protomerami lub podjednostkami – połączonych siłami
niekowalencyjnymi. Opisuje ona sposób ułożenia w przestrzeni kilku wzajemnie ze sobą
oddziaływujących łańcuchów. Cechuje się ponadto największą złożonością, a zarazem jest najsłabiej
poznana.
Ze względu na liczbę podjednostek wyróżniamy odpowiednio di-, tri-, tetramery itd. Homooligomery
składają się z kilku identycznych podjednostek, podczas gdy heterooligomery – z różnych; różne
protomery białek heterooligomerycznych pełnią zazwyczaj specyficzne funkcje, np. katalityczne,
regulacyjne czy rozpoznające ligandy. Właściwości chemiczno-biologiczne białek podjednostkowych
zależą od przestrzennej orientacji ich podjednostek.

•

W odpowiednich warunkach można pozbawić białko struktur wyższych rzędów.

Denaturacja polega na zniszczeniu wiązań niekowalencyjnych białka, a tym samym na trwałej utracie
jego struktury II, III i IV-rz. oraz aktywności biologicznej. Do denaturacji dochodzi pod wpływem tzw.
czynników denaturujących, do których zaliczamy: wysoką temperaturę, silnie polarne (kwaśne lub
zasadowe) środowisko oraz określone substancje: alkohol, formalina, rozpuszczalne sole metali
ciężkich (głównie ołowiu, rtęci i srebra), SDS.

W przeciwieństwie do denaturacji, koagulacja (wysolenie) polega na odwracalnej utracie postaci białka
pod wpływem działania soli metali lekkich, np. NaCl, NH

4

Cl. Sole te, dzięki właściwościom

higroskopijnym, wiążą i pozbawiają białko pewnej ilości wody, wskutek czego naturalny półpłynny zol
białkowy zmienia postać na półstały żel. Dodanie do skoagulowanego białka wody powoduje
przywrócenie mu pierwotnej konsystencji, co nazywa się peptyzacją.

•

Natywne białka nie mają postaci prostych łańcuchów, lecz są w skomplikowany sposób zwinięte lub –
inaczej mówiąc – sfałdowane. Fałdowanie białek nie odbywa się na drodze prób i błędów, o czym
świadczy chociażby paradoks Levinthala – czas przypadkowego poszukiwania odpowiedniej struktury
sfałdowania nawet w przypadku niewielkiego peptydu byłby teoretycznie dłuższy niż szacowany wiek
wszechświata. Oczywiste jest zatem, iż fałdowanie białek to nieprzypadkowy i wysoce zorganizowany
proces.

Proces fałdowania składa się z kilku faz: formowania krótkich fragmentów struktury i ich wzrostu →
uformowania domen (w białkach wielodomenowych połączonych w tzw. stopioną globulę) → zmian
konformacyjnych nadających strukturę III-rz. → osiągnięcia natywnej struktury (na tym kończy się
fałdowanie białek monomerycznych) → ew. łączenia podjednostek i formowania oligomerów.

Łańcuchy polipeptydowe wielu zdenaturowanych białek spontanicznie (bez zewnętrznej interwencji,
„same z siebie”) zwijają się powtórnie w warunkach in vitro, łącznie z przywróceniem aktywności
biologicznej, choć trwa to o wiele dłużej niż w warunkach in vivo; zjawisko to określa się mianem
renaturacji.

In vivo procesy fałdowania przebiegają o wiele szybciej i są wyraźnie ukierunkowane, m. in. dzięki
obecności specyficznych enzymów:

izomeraza dwusiarczkowa białek (ang. protein disulphide isomerase – PDI) ułatwia przetasowanie
wiązań dwusiarczkowych (S-S) przez zwiększenie szybkości wzajemnej wymiany mostków S-S,

izomeraza peptydylo-prolinowa cis-trans (ang. peptidil-proline isomerase – PPI) katalizuje
izomeryzację wiązań peptydowych X-Pro z formy trans do cis (przekształceniu ulega ok. 10 %
wiązań),

chaperony (białka opiekuńcze, m. in. tzw. białka szoku cieplnego – ang. heat shock protein = Hsp)
przyspieszają proces fałdowania przez zapewnienie białku ochronnego środowiska oraz preferencje
przemian powstrzymujących niewłaściwe interakcje między powierzchniami komplementarnymi i
ułatwiających właściwe interakcje.

- -

20

d)

rozdział i określanie struktury białek

•

Aby móc badać strukturę białek, należy je wpierw wyizolować w stanie czystym, tzn. pozbawić
zanieczyszczeń i oddzielić od innych białek. Do najczęściej stosowanych technik oczyszczania i izolacji
białek należą:

Chromatografia jonowymienna i HVE – stosowane są do aa i polipeptydów; podstawą rozdziału jest
ładunek elektryczny.

Filtracja żelowa z użyciem wysokich stężeń (1-4M) kwasu mrówkowego lub octowego – stosowana do
wielkocząsteczkowych hydrofobowych peptydów; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie i
wymywanie peptydów z porów sita molekularnego (Sephadex).

HPLC w odwróconym układzie faz (niepolarny nośnik + polarny rozpuszczalnik) – stosowana j.w.,
czasem w połączeniu z poprzednio omówiona metodą – do oczyszczania złożonych mieszanin
peptydów, otrzymywanych przez częściowe trawienie białek.

HVE na sitach molekularnych (sączenie molekularne) – technicznie przeprowadza się na skrobii,
agarozie lub żelu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje się do
polipeptydów i polinukleotydów. Próbkę w buforze nanosi się na płytkę lub do rurki, rozdziela
elektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje – peptydy błękitem brylantowym Coomassie lub solami
srebra, zaś polinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje się odmianę tej metody w
warunkach denaturujących (mocznik, SDS) – łańcuch peptydowy ulega wówczas rozprostowaniu,
dodatkowo wiążąc na powierzchni ładunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkości (właściwie do
ilości wiązań peptydowych), więc rozdział elektroforetyczny opiera się tu pośrednio na masie
cząsteczkowej. Metodę PAGE-SDS stosuje się więc do określania masy cząsteczkowe białek przez
porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwościami wzorców o znanych masach.

•

Po uzyskaniu czystego białka można przystąpić do stopniowego określania jego struktury. Wiele białek
składa się z ≥ 2 łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez
mostki dwusiarczkowe, które muszą być rozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwór
badanego białka traktuje się czynnikami denaturującymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), które
rozbijają wiązania wodorowe i niektóre niekowalencyjne oraz czynnikami redukującymi lub
utleniającymi, które pozbawiają peptydy mostków dwusiarczkowych – czynniki utleniające, np. kwas
nadmrówkowy (HCOOOH), utleniają reszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SO

3

-

), natomiast

czynniki redukujące, np. 2-merkaptoetanol, redukują je do cysteiny (Cys-SH).

•

Polipeptydy wielkocząsteczkowe rozbija się, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o długości
20-60 aa. Do tego celu używa się następujących odczynników (w nawiasach podano rodzaj rozbijanego
wiązania): bromocyjan – CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X),
hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), łagodna
hydroliza kwaśna (Asp-Pro).

•

Przed rozpoczęciem sekwencjonowania białka określa się jego skład aminokwasowy poprzez poddanie
go kwaśnej hydrolizie (6M HCl, 11

oC

, 1-4 doby), a następnie rozdzielenie i identyfikację wolnych aa

metodą HPLC, chromatografii jonowymiennej bądź elektroforetyczną. Wadą takiego postępowania jest
zniszczenie struktury wielu aa przez agresywne środowisko – całkowicie niszczone są Trp i Cys,
częściowo – Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wiązania Val-Val,
Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazują oporność na ten rodzaj hydrolizy. Aby tego uniknąć, wykonuje się
kilka zabiegów:

Cys utlenia się do kwasu cysteinowego – opornego na działanie kwaśnego środowiska,

obecność Trp oznacza się po hydrolizie zasadowej (która za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys),

określa się tempo spadku poziomów Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje się do czasu 0,

obecność aa rozgałęzionych oznacza się po 96 h hydrolizy,

obecność aa kwaśnych oraz ich amidów określa się łącznie jako Glx (Glu + Gln) i Asx (Asp + Asn).

•

Po określeniu procentowego udziału poszczególnych aa w budowie badanego białka, można przystąpić
do jego sekwencjonowania, czyli określenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod:

Najstarsze metody sekwencjnowania opierają się na przeprowadzeniu N-końcowego aa peptydu w
określoną pochodną, hydrolizę peptydu oraz identyfikację powstałej pochodnej aa. Taka jest m. in. idea
metody Sangera – używa się w niej odczynnika Sangera – DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzenu), który
reaguje wyłącznie z N-końcowymi resztami aa, po czym prowadzi się hydrolizę i identyfikację.

Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikację N-końcowych
reszt aa peptydów w postaci pochodnych. Wykorzystuje się tu odczynnik Edmana –
fenyloizotiocyjanian, który reagując z końcem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy,
który w środowisku kwaśnym i obecności niehydroksylowych rozpuszczalników (np. nitrometanu)
rozpada się na fenylotiohydantoinową pochodną aa oraz peptyd skrócony o jeden N-końcowy aa. W
przeciwieństwie do metody Sangera, po usunięciu N-końcowego aa peptyd pozostaje niezmieniony.

- -

21

Pochodne aa identyfikuje się metodą HPLC, po czym opisany cykl powtarza się 30 – 80 x w jednym
ciągu operacyjnym.

Oznaczenie struktury I-rz. wszystkich peptydów otrzymanych ze wstępnej hydrolizy próbki pozostawia
do wyjaśnienia jedynie kolejność ich ułożenia. Dlatego należy otrzymać i zsekwencjonować dodatkowe
peptydy o nakładających się resztach N i C-końcowych (techniki rozrywające polipeptyd w innych
miejscach).

W celu oznaczenia położenia wiązań dwusiarczkowych rozdziela się zarówno peptydy pochodzące z
hydrolizy próbki pierwotnej, jak i zmodyfikowane metodami utleniania / redukcji – za pomocą
chromatografii dwuwymiarowej lub chromatografii i elektroforezy.

Metoda Maxima i Gilberta prezentuje inne podejście do problemu – opiera się na szybkim
sekwencjonowaniu DNA genu kodującego dane białko i określeniu sekwencji aa na podstawie tabeli
kodu genetycznego. Jej wadą jest brak ujawniania miejsc wiązań dwusiarczkowych oraz obecności
posttranslacyjnych modyfikacji aa (hydroksylacja, metylacja, fosforylacja, estryfikacja, izoprenylacja).
Stosowana jest w identyfikacji labilnych pre- lub prepropeptydów istotnych w katalizie lub w badaniu
kierowania peptydów do określonych organelli komórkowych.

Alternatywnym sposobem sekwencjonowania krótkich (do ok. 25 aa) peptydów jest szybkie
bombardowanie atomowe (FAB) ze spektroskopią masową (MS) w dwóch połączonych
spektrometrach. Szybkie bombardowanie atomami gazów szlachetnych (Ar lub Xe) daje w efekcie
kationy peptydów. W pierwszym spektrometrze oddzielane są zanieczyszczenia, po czym jony
peptydów zderzają się w komorze z atomami He, ulegając fragmentacji do wielu jonów o
zmniejszających się rozmiarach, których masy cząsteczkowe oznaczane są w drugim spektrometrze –
porównanie jonów z rosnącymi masami pozwala na identyfikację wszystkich reszt aa i ich kolejności.
Metoda FAB-MS umożliwia identyfikację aa zmodyfikowanych posttranslacyjnie oraz – w
przeciwieństwie do metody Edmana – umożliwia sekwencjonowanie peptydów z zablokowanym (np.
zacylowanym) końcem aminowym.

•

Trójwymiarową strukturę białek można badać metodami krystalografii rentgenowskiej oraz MRS.

Krystalografia rentgenowska ujawnia statyczny obraz białka krystalicznego. Wymaga dużych,
doskonale uporządkowanych kryształów białka, zawierających szereg powtarzających się regularnie
identycznych cząsteczek, silnie załamujących promienie X. Obraz powstały w wyniku załamania
wiązki promieni na krysztale białka pozwala na odtworzenie struktury pojedynczej cząsteczki.
Kryształy białek hoduje się techniką wiszącej kropli, po czym eksponuje na monochromatyczne (o
jednej, stałej i określonej długości fali) promieniowanie X i obraza w celu uzyskania wszystkich
możliwych odwzorowań dyfrakcyjnych. Promienie X są wówczas rozpraszane i tworzą obraz zależny
od gęstości elektronowej w różnych częściach białka. Maksima dyfrakcji są analizowane komputerowo,
aby na tej podstawie skonstruować mapy gęstości elektronowej (amplitudy i fazy). Reprezentują one
serię równoległych przekrojów przez białko, co z kolei pozwala na konstrukcję trójwymiarowych map
gęstości elektronowej i dalej – model fizyczny lub przybliżone dopasowanie struktury I-rz. Dokładne
wyznaczenie położeń atomów możliwe jest jedynie po zsekwencjonowaniu badanego białka.

Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (ang. magnetic resonance spectroscopy = MRS)
jest techniką dostarczającą informacji o strukturze białka w roztworze. Parametrami bezpośrednio
mierzonymi jest otoczenie chemiczne jąder atomowych wykazujących moment magnetyczny albo spin
(głównie

1

H), co dostarcza informacji o odległości atomów w cząsteczce – przesunięciach

chemicznych. Dwuwymiarowa MRS analizuje skomplikowane widma otrzymywane z białek
zmieniających się w czasie, dlatego jest wykorzystywana do badania tworzenia struktur przejściowych
w procesie zwijania łańcuchów białkowych.

•

Do metod badania struktury IV-rz. białek i oznaczania ich mas cząsteczkowych zaliczamy m. in.:

Ultrawirowanie analityczne – pomiar szybkości sedymentacji białka przy wirowaniu z przyspieszeniem
kątowym 10 tys. x większym niż przyspieszenie ziemskie.

Wirowanie w gradiencie gęstości (zwykle 5 – 20 % roztworu zbuforowanej sacharozy) – porównanie
poziomu białka w próbówce w odniesieniu do poziomów białek o znanych masach cząsteczkowych
przy wirowaniu w powyższych warunkach.

Filtracja żelowa – masę cząsteczkową nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości
elucyjnej z analogicznymi objętościami białek wzorcowych.

PAGE – rozdział białek w żelach o zmiennej porowatości i wykrywanie błękitem brylantowym lub
solami srebra. PAGE-SDS stosowane jest do określania rozmiarów podjednostek oligomerów.

Mikrofotografia elektronowa – obrazowanie kompleksów makromolekularnych – wirusów,
kompleksów enzymatycznych czy oligomerów.

- -

22

e)

związek budowy i funkcji białek fibrylarnych i globularnych

•

Białka fibrylarne cechują się m. in. wydłużonym kształtem i brakiem rozpuszczalności w wodzie.
Pełnią one funkcje białek strukturalnych w skórze, tkance łącznej oraz różnego rodzaju włóknach
(włosy, jedwab, wełna). Często zawierają atypowe sekwencje aa lub zmodyfikowane aa, co przekłada
się na strukturę II i III-rz. i konsekwentnie dalej na właściwości mechaniczne. Przykładami białek
fibrylarnych są: kolagen (patrz punkt VII-9-b), elastyna (VII-8-a), miozyna (VII-7-a), keratyna,
fibroina.

Keratyna nie jest pojedynczym białkiem, lecz całą rodziną, wśród której można wyróżnić tzw. keratyny
twarde i miękkie. Ogólnie cechują się one wysoką odpornością na czynniki fizyczne, chemiczne i
działanie proteaz oraz wysoką zawartością aa zawierających siarkę – Cys (17%) i Met
(0,5%).Wykazano istnienie ok. 10 izoform keratyn twardych, obecnych w rozmaitych wytworach
naskórka zwierząt – paznokciach, piórach, rogach, wełnie i innych. W ludzkich komórkach
nabłonkowych zidentyfikowano ok. 20 izoform cytokeratyn (40-70 kDa), należących do keratyn
miękkich. Cytokeratyny stanowią największą i najbardziej zróżnicowaną grupę filamentów pośrednich,
wchodzącą w skład cytoszkieletu komórkowego. Podjednostki keratyn zbudowane są według
wspólnego planu – wyróżniamy w nich α-helisową domenę centralną oraz globularne domeny N i C-
końcowe. Ta pierwsza posiada wysoce konserwatywny charakter i składa się z 310-315 reszt aa, zaś
domeny terminalne liczą od 15 do 30 reszt. Podjednostki keratyn, asocjując w struktury wyższego
rzędu, tworzą kolejno: dimery → protofilamenty → protofibryle → filamenty pośrednie. W
przeciwieństwie do cytokeratyn, keratyny twarde są strukturami dwufazowymi, w których włókna
keratyny są zatopione w bezpostaciowej macierzy zbudowanej z białek o dużej zawartości siarki.
Enzymy proteolityczne zdolne do hydrolizy keratyny to występujące u kręgowców kaspazy degradujące
cytokeratyny (udział w procesie apoptozy) lub syntetyzowane przez mikroorganizmy keratynazy.

Fibroina stanowi główne białko jedwabiu. 85% jej składu stanowi Gly, występująca na zmianę z Ser lub
Ala. Łańcuchy polipeptydowe formują szereg rozciągniętych antyrównoległych pasm β, tak iż grupy
boczne (R) Gly wyłaniają się z jednej powierzchni, zaś Ser lub Ala – z drugiej. W ten sposób układ
stabilizowany jest nie przez wiązania wodorowe, lecz przez oddziaływania hydrofobowe. Wtrącone co
pewien odcinek aa z dużym R (Val, Tyr) zaburzają regularną strukturę β i zwiększają giętkość całości
konstrukcji.

•

Jedną z grup globularnych białek złożonych są chromoproteiny, reprezentowane w ludzkim ustroju gł.
przez białka hemowe – nazwane tak od dołączonego do łańcucha peptydowego barwnika – hemu. Rola
białek hemowych polega na transporcie i magazynowaniu tlenu oraz transporcie elektronów. Ich
zdolność wiązania tlenu uwarunkowana jest obecnością jonu Fe

2+

, zlokalizowanego w centrum grupy

hemowej, stanowiącej grupę prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. Grupa hemowa występuje
również w wielu enzymach – cytochromach, katalazie (CT), syntazie tlenku azotu (NOS), 2,3-
dioksygenazie tryptofanowej i innych.

Hem jest cyklicznym tetrapirolem – składa się z 4 grup pirolowych połączonych 4 mostkami
metinowymi między atomami Cα (układ porfiny), zaś przy atomach Cβ obecne są charakterystyczne
podstawniki. Układ wielu sprzężonych wiązań podwójnych nadaje cząsteczce płaski kształt (pierścienie
pirolowe, atomy C mostków metinowych i jon Fe

2+

leżą praktycznie w jednej płaszczyźnie) oraz

warunkuje pochłanianie światła w niskim zakresie światła widzialnego, dzięki czemu ma ona – a przez
to również HGB i krew – barwę czerwoną. Przy atomach Cβ występują grupy: metylowe (M – w
pozycjach 1, 3, 5, 8), winylowe (V – 2 i 4) oraz propionowe (P – 6 i 7). Te ostatnie, stanowiąc jedyne
polarne łańcuchy boczne hemu, są zwrócone w stronę powierzchni hemoprotein. Jak wcześniej
wspomniano, jon żelaza zajmuje centralne miejsce w cząsteczce hemu, wiążąc się dwoma wiązaniami
kowalencyjnymi oraz dwoma koordynacyjnymi z czterema atomami N tetrapirolu. Pozostałe (5. i 6.)
wiązania koordynacyjne jonu żelaza leżą prostopadle do płaszczyzny porfiny – odpowiednio nad i pod
układem tetrapirolu.

Funkcją mioglobiny (MGB – skrót nieformalny) jest magazynowanie tlenu w mięśniach czerwonych.
Jej cząsteczka złożona jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego (masa ok. 17 kDa), złożonego ze
153 reszt aa. Zewnętrzna część cząsteczki jest polarna, zaś wewnętrzna – niepolarna, co ma związek z
rozpuszczalnością w wodzie. Wyjątkowo we wnętrzu cząsteczki znajdują się dwa aa polarne – His –
wiążące grupę hemową do części polipeptydowej. Cząsteczka mioglobiny ma kształt w przybliżeniu
kulisty, pomimo nieregularnej i niesymetrycznej budowy. Poszczególne α-helisy, struktury β i pętle
określa się za pomocą liter i cyfr. Aż ok. 75 % łańcucha występuje w formie 8 prawoskrętnych α-helis,
o długościach 7 – 20 reszt aa, oznaczonych literami od A do H, począwszy od N-końca. Fragmenty
międzyhelikalne oznacza się literami dwóch odcinków helikalnych przez nie połączonych. Pojedyncze

- -

23

reszty aa oznacza się podając literę oznaczającą helisę oraz liczbę – pozycję aa w danej helisie,
począwszy od N-końca.

Aa zajmujące odległe miejsca w strukturze I-rz. mogą w wyniku skomplikowanego fałdowania
znaleźć się blisko siebie w strukturze III-rz., np. His F8 i His E7. Informacja zawarta w strukturze
I-rz. apomioglobiny jest odpowiedzialna za prawidłowe i swoiste upakowanie białka w obecności
hemu. Grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między helisami E i F, jon żelaza wiąże się 5.
wiązaniem koordynacyjnym z pierścieniem imidazolowym His F8 (tzw. His proksymalna). Po
przeciwnej stronie płaszczyzny hemu (w stosunku do His F8) znajduje się His E7 (tzw. His
dystalna), która nie zajmuje jednak 6. pozycji koordynacyjnej Fe

2+

. W odtlenowanej MGB jon Fe

2+

jest lekko (0,03 nm) wysunięty poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8, natomiast w MGB
utlenowanej – gdy cząsteczka O

2

zajmuje 6. pozycję koordynacyjną – wysunięcie to jest 3 x

mniejsze, wynosząc 0,01 nm. Związaniu cząsteczki tlenu towarzyszy więc ruch jonu żelaza i His
F8 w stronę płaszczyzny porfiryny, co daje zmiany konformacyjne cząsteczki białka.

W utlenowanej MGB wiązanie Fe

2+

– O jest prostopadłe do płaszczyzny porfiryny, natomiast 2.

atom tlenu przyłączony jest pod pewnym kątem („skośnie”). Z kolei tlenek węgla (CO) preferuje
przyłączanie się w całości prostopadle do tej płaszczyzny – taka orientacja jest jednak możliwa
jedynie w wyizolowanym hemie, bowiem fizjologicznie w MGB His dystalna stanowi przestrzenną
zawadę dla wiązania CO pod tym kątem. Zatem otoczenie hemu w MGB zmniejsza powinowactwo
CO do żelaza hemowego, które w przypadku czystego hemu jest aż 25 tys. razy większe niż
powinowactwo O

2

do tego żelaza. Dzięki opisanemu mechanizmowi cząsteczka CO zmuszona jest

do wiązania się w mniej korzystnej konfiguracji, co obniża względne powinowactwo do ok. 200.

MGB jest białkiem magazynującym, a nie transportującym tlen. Ilość O

2

związanego przez białko

(nasycenie, saturacja) zależy od stężenia (ciśnienia) tego gazu – pO

2

. Nie jest to jednak zależność

liniowa, lecz obrazuje ją krzywa dysocjacji tlenowej. Dla MGB krzywa ta ma kształt hiperboli, co
oznacza, iż oddaje ona tlen dopiero przy znacznym spadku pO

2

, co ma miejsce przy dużym

deficycie tlenowym w warunkach wysokiej aktywności fizycznej. MGB nie mogłaby pełnić funkcji
transportu tlenu z płuc do tkanek, gdyż przy granicznych w tych warunkach wartościach pO

2

oddaje ona jedynie znikomą część zmagazynowanego O

2

.

Hemoglobina (HGB) spełnia funkcję transportu gazów oddechowych – O

2

z płuc do tkanek oraz CO

2

i

H

+

w kierunku przeciwnym.

HGB jest tetramerem złożonym z pary dwóch typów łańcuchów polipepydowych, oznaczanych α,
β, γ, δ, S itd. Łańcuchy te stanowią podjednostki HGB – posiada ona zatem strukturę IV-rz., dzięki
czemu zyskuje nowe właściwości, których nie prezentuje MGB. Łańcuch α składa się ze 141 reszt
aa, a β – ze 146, oba są kodowane przez odmienne geny. Znanych jest wiele typów HGB, jednak
do najważniejszych należą: HbA (α

2

β

2

; podstawowa fizjologiczna HGB dorosłych), HbA2 (α

2

δ

2

;

fizjologiczna HGB dorosłych, stanowi ok. 2,5 %), HbF (α

2

γ

2

; płodowa), HbS (α

2

S

2

; występuje w

sierpowatych erytocytach).

MGB i podjednostki β HbA wykazują praktycznie identyczną strukturę II i III-rz., podobna jest
również lokalizacja grup hemowej i odcinków helikalnych, choć HbA posiada ich tylko 7.

Hem każdej podjednostki HGB przyłącza 1 cząsteczkę O

2

, więc cała HGB wiąże łącznie 4

cząsteczki tlenu. Co więcej, przyłączenie O

2

do jednego hemu ułatwia wiązanie kolejnych O

2

przez

pozostałe grupy hemowe – określa się to jako kooperatywne wiązanie O

2

z HGB. Zjawisko to

pozwala na związanie maksymalnej ilości tlenu w płucach oraz uwalnianie możliwie największej
ilości tlenu w tkankach. Zjawisko kooperatywności powoduje, że krzywa dysocjacji tlenowej HGB
ma kształt sigmoidalny (wygięty jak litera S). Wniosek jest taki, iż połączenie łańcuchów
polipeptydowych w tetramer pozwala na zwiększenie wydajności transportu tlenu.

Różne typy HGB cechują się odmiennym powinowactwem do O

2

. Jego ilościową miarą jest

wskaźnik P

50

, tj. wartość pO

2

, przy której HGB jest wysycona tlenem w 50 %. P

50

dla HbA wynosi

26 mmHg, a dla HbF 20 mmHg – oznacza to, iż HbF silniej wiąże O

2

(przy danej prężności jest

wysycony w większym stopniu) – właściwość ta pozwala na przekazywanie tlenu z HbA na HbF w
obrębie łożyska. Po porodzie odsetek HbF szybko maleje, gdyż jego obecność nie jest już
uzasadniona – płuca pracują, a wysokie powinowactwo HbF do tlenu utrudnia jego oddawanie w
tkankach. Na jego miejsce syntetyzowana jest HbA. Nagły rozpad dużych ilości HbF wiąże się z
powstaniem dużych ilości bilirubiny (por. punkt VI-5-b/c), co jest przyczyną żółtaczki
noworodków.

Przyłączeniu O

2

towarzyszy rozerwanie wiązań poprzecznych (niekowalencyjnych –

elektrostatycznych) między końcami C wszystkich podjednostek HGB, co zmienia jej strukturę II,
III i IV-rz. Jedna para podjednostek α+β wykonuje obrót o ok. 15

o

w stosunku do drugiej pary, w

wyniku czego podjednostki zbliżają się do siebie i wzrasta powinowactwo do tlenu. Struktura IV-
rz. HGB częściowo utlenowanej określana jest jako stan naprężony (T), zaś HGB całkowicie

- -

24

utlenowanej – jako stan rozluźniony (R). Podczas utlenowania HGB atomy Fe, leżące 0,06 nm
poza płaszczyzną porfiryny w HGB pozbawionej tlenu, wsuwają się bliżej tej płaszczyzny,
pociągając za sobą His F8 i sąsiadujące z nią reszty aa. Prawdopodobieństwo przejścia T→R
wzrasta wraz z przyłączaniem olejnych cząsteczek O

2

do HGB, gdyż wiązanie O

2

osłabia i rozbija

wiązania poprzeczne utrzymujące HGB w stanie T. Równowaga T↔R znajduje się pod wpływem
takich czynników jak: H

+

, CO

2

, Cl

-

, BPG, które zwiększają ilość związanego O

2

wymaganego do

przejścia T→R.

Po oddaniu O

2

HGB wiąże CO

2

, transportując go do płuc – w ten sposób przenoszonych jest ok.

15% całkowitego CO

2

transportowanego przez krew. CO

2

wchodzi w reakcję z N-końcami

łańcuchów HGB, dając karbaminiany:

HGB-NH

3

+

+ CO

2

↔ HGB-NH-COO

-

+ 2 H

+

.

Powstające w tej reakcji protony odpowiedzialne są za efekt Bohra. Zmiana ładunków N-końców
HGB umożliwia tworzenie wiązań poprzecznych pomiędzy podjednoskami tak jak w formie
nieutlenowanej. W płucach utlenowaniu HGB towarzyszy odłączenie i wydalenie CO

2

. CO

2

docierający do krwi przekształcany jest przez anhydrazę węglanową (CA) do H

2

CO

3

, który

samorzutnie dysocjuje do H

+

+ HCO

3

-

. Protony wiążą się z HGB (Hb

.

2 H

+

), zaś aniony

wodorowęglanowe stanowią główną formę transportu CO

2

przez krew. Przez efekt Bohra określa

się zmniejszenie powinowactwa tlenu do HGB wraz ze spadkiem pH – dzięki temu w tkankach
następuje bardziej efektywne oddawanie O

2

, a krzywa dysocjacji tlenowej HGB przesuwa się

przez to w prawo. Zjawisko odwrotne, tj. zwiększenie oddawania CO

2

pod wpływem wiązania O

2

nosi nazwę efektu Haldena. Efekt Bohra jest charakterystyczny dla tetramerycznej HGB, zależy
bowiem od interakcji pomiędzy grupami hemowymi, czyli kooperatywności wiązania O

2

– nie

wykazuje go zatem MGB. Dzięki zdolności wymiany protonów z otoczeniem, HGB pełni funkcję
układu buforowego krwi.

Protony odpowiedzialne za efekt Bohra powstają w wyniku rozerwania wiązań poprzecznych
podczas utlenowania formy T, pochodzą głównie z atomów N pierścieni imidazolowych C-
końcowych reszt His łańcuchów β (HC3; His 146). Z kolei odłączenie O

2

i związane z tym

tworzenie wiązań poprzecznych wymaga przyłączenia H

+

do w/w miejsc. Obecność protonów w

tkankach ułatwia więc tworzenie wiązań poprzecznych poprzez protonację C-końcowych reszt His
łańcuchów β, a odtwarzanie tych wiązań sprzyja przejściu R→T, czyli oddawaniu O

2

.

2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) powstaje w tkankach w wyniku niedoboru O

2

, jako modyfikacja

podstawowego szlaku glikolizy. BPG wiąże się z HGB w stosunku stechiometrycznym 1:1, w
miejscu pomiędzy podjednostkami – w centrum cząsteczki. Rozmiar tej wnęki – odległość
pomiędzy helisami H łańcuchów β – odpowiada BPG jedynie w formie T. BPG tworzy wiązania
poprzeczne w obrębie łańcuchów β (z N-końcem – ValNA1, Lys EF6 i His H21), przez co
stabilizuje i preferuje formę T, zwiększa zatem oddawanie O

2

przez HGB w tkankach. BPG o wiele

słabiej działa w przypadku HbF, gdyż posiada ona w pozycji H21 Ser zamiast His, w związku z
czym nie tworzy wiązań poprzecznych. Adaptacja organizmu do dużych wysokości polega m. in.
na zwiększeniu syntezy BPG, co zmniejsza P

50

, a zwiększa uwalnianie tlenu do tkanek.

Stany patologiczne związane z HGB:

Hemoglobinopatie – są to zaburzenia funkcji biologicznej HGB, będące następstwem mutacji
genów kodujących jej łańcuchy polipeptydowe (α i β). Znanych jest kilkaset hemoglobinopatii,
jednak ogromna większość występuje rzadko i ma łagodny przebieg, tak że większe znaczenie
posiada zaledwie kilka z nich.

HbM: His F8 → Tyr Mutacja taka powoduje stabilizację żelaza hemowego w formie Fe

3+

,

gdyż tworzy ono trwałe połączenie z anionem fenolanowym Tyr. Powoduje to
methemoglobinemię – podobnie jak sulfonamidy lub stany obniżenia aktywności
reduktazy methemoglobiny – i związany z tym spadek zdolności HGB do wiązania i
transportu O

2

. Przy wariantach HbM dotyczących łańcuchów α wystepuje preferencja

formy T, obniżenie powinowactwa do tlenu i zniesienie efektu Bohra; natomiast przy
wariantach dotyczących łańcuchów β przejście R↔T nie zostaje zakłócone, podobnie jak
efekt Bohra.

HbS: Glu A2(6)β → Val Mutacja powoduje powstanie na powierzchni HGB „lepkich
miejsc”, komplementarnych do odpowiednich miejsc na powierzchni nieutlenowanej
HGB (zarówno A, jak i S). Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje
polimeryzację nieutlenowanej HbS – powstają w ten sposób helikalne włókna HGB, które
wytrącają się i zniekształcają erytrocyty, które przyjmują kształt sierpowaty, posiadają
obniżoną oporność hemolityczną oraz większą tendencję do agregacji i zlepiania. Objawy
anemii sierpowatokrwinkowej pogłębiają się przy obniżeniu pO

2

– polimeryzuje przecież

forma T, czyli nieutlenowana. Barierę i zatrzymanie polimeryzacji powoduje przyłączenie

- -

25

prawidłowej HbA zarówno w formie R i T, gdyż pomimo istnienia miejsc
komplementarnych, nie posiada ona lepkich końców.

Talasemie – są to choroby, których istotą jest zmniejszona synteza łańcuchów HGB (α lub β), co
jest przyczyną anemii.

HGB glikowana (HbA

1c

) – jest to HGB poddana procesowi glikacji. Glikacja jest procesem

nieenzymatycznej glikozylacji białek – w tym przypadku HGB – zachodzącym w warunkach
podwyższonego poziomu glukozy w środowisku, np. cukrzycy. Anomeryczna grupa hydroksylowa
glukozy reaguje z grupą aminową Lys oraz aa N-końcowych. HbA i HbA

1c

można rozdzielić

stosując chromatografię jonowymienną lub elektroforezę. HbA

1c

stanowi fizjologicznie < 5 %

HGB i jest proporcjonalne do średniego stężenia glukozy we krwi w okresie 1,5 – 3 miesięcy
poprzedzających badanie (długofalowa kontrola terapii cukrzycy).

Mioglobinuria jest stanem wydalania z moczem MGB pochodzącej z rozległego uszkodzenia
mięśni szkieletowych (w mniejszym stopniu serca), przez co mocz ma barwę ciemnoczerwną. Stan
taki może prowadzić do ostrej niewydolności nerek (ONN).

- -

26

ROZDZIAŁ II – STRUKTURA I FUNKCJE ENZYMÓW

1.

Ogóle właściwości enzymów

a)

klasyfikacja i nazewnictwo

Podstawą klasyfikacji enzymów jest typ i mechanizm katalizowanej przez nie reakcji. Każdy enzym

posiada swój kod o postaci: EC xx.xx.xx.xx, gdzie litery x oznaczają cyfry arabskie. Symbol EC zaznacza, że
dalsza część kodu to numer w międzynarodowym katalogu enzymów (ang. Enzyme Commission, fr. Enzyme
Catalogue). Sam numer składa się z 4 członów:

pierwszy określa główną klasę, charakteryzującą typ katalizowanej reakcji; system zawiera 6 klas
enzymów i katalizowanych przez nie reakcji:

1 – oksydoreduktazy – katalizują reakcje utleniania i redukcji (redox; patrz punkt III-3)

2 – transferazy – katalizują reakcje przenoszenia grup funkcyjnych

3 – hydrolazy – katalizują reakcje rozpadu pod wpływem wody (hydrolizy)

4 – liazy – katalizują reakcje rozpadu bez udziału cząsteczek wody

5 – izomerazy – katalizują reakcje zmian położenia grup chemicznych z zachowaniem szkieletu

6 – ligazy – katalizują reakcje tworzenia wiązań kowalnecyjnych

drugi określa podklasę, charakteryzującą zazwyczaj rodzaj wiązania lub grupy, której dotyczy reakcja

trzeci określa podpodklasę, która może zawierać: dokładniejszą specyfikację wiązania, grupę związków
do której należy substrat, nazwę donora lub akceptora

czwarty wskazuje na określony enzym przez podanie nazwy substratu reakcji.

Nazwa enzymu jest dwuczęściowa – część pierwsza, zakończona przyrostkiem ”-aza”, określa typ

katalizowanej reakcji, druga – substrat(y) reakcji.

b)

centrum katalityczne

Enzymy posiadają zdolność przyłączania substratów i miejscowego zwiększania ich stężenia, przez co

przyspieszają przebieg katalizowanej reakcji. Zazwyczaj cząsteczka białka enzymatycznego jest wielokrotnie
większa (nawet o kilka rzędów wielkości) od cząsteczki substratu, co sugeruje istnienie ograniczonego obszaru –
centrum katalitycznego – bezpośrednio wiążącego substrat.

Model miejsca katalitycznego wg Fishera przedstawia je jako sztywną konstrukcję, a interakcję z

substratem – jako przestrzenne ułożenie dopasowanych do siebie geometrycznie (niczym klucz do zamka)
cząsteczek. Koncepcja ta wyjaśnia specyficzność połączeń E-S, nie tłumaczy jednak dynamicznych zmian
towarzyszących procesom katalitycznym.

W przeciwieństwie do w/w, model indukowanego dopasowania, zaproponowany przez Koshlanda,

zakłada iż bliskość substratu indukuje zmiany konformacyjne w cząsteczce enzymu, tak że może nastąpić
połączenie pasujących do siebie powierzchni. Z chemicznego punktu widzenia polega to na przyjęciu
odpowiedniej konformacji przez grupy funkcyjne cząsteczki enzymu, co umożliwia interakcję z cząsteczką
substratu i właściwą katalizę. Reszty aa znajdujące się w miejscu katalitycznym mogą być od siebie znacznie
oddalone w strukturze I-rzędowej, lecz przestrzennie zbliżone w strukturze III-rzędowej.

Miejsca aktywne (katalityczne) enzymów złożonych z pojedynczej podjednostki są często zlokalizowane

w bruzdach cząsteczki enzymu, natomiast w oligomerach znajdują się zazwyczaj przy powierzchniach między
podjednostkami. Wykazano, iż w skład miejsca katalitycznego wchodzi wiele reszt aa, a główną rolę w katalizie
odgrywają pewne określone reszty – w szczególności aa z boczną grupą sulfhydrylową (Cys) lub hydroksylową
(Ser, Thr, Tyr) oraz kwaśne (Asp, Glu) i zasadowe (Lys, His, Arg), ponieważ ich łańcuchy boczne stanowią
czynniki nukleofilowe – katalizatory kwaśne lub zasadowe bądź akceptory grupy ulegającej przeniesieniu.
Wszystkie formy enzymu, katalizujące określoną reakcję (lub typ reakcji), posiadają jednakowy i uniwersalny
mechanizm, występujący w całej przyrodzie. Związany jest z tym fakt, iż reszty aa istotne w procesie
katalitycznym, jak również ich najbliższe otoczenie w cząsteczce enzymu, wykazują wysoką konserwatywność,
zachowaną i utrwaloną w procesie ewolucji. Ponieważ jednak dany motyw struktury III-rz. może być utworzony
przez różne kombinacje struktur I-rz., toteż ta pierwsza wykazuje zdecydowanie większą konserwatywność.

c)

koenzymy i witaminy będące ich prekursorami

Wiele enzymów do przeprowadzenia reakcji wymaga, poza substratem, obecności dodatkowej substancji

niebiałkowej, określanej jako koenzym. Wówczas samą białkową część enzymu nazywamy apoenzymem, a
połączenie apoenzym z koenzymem – holoenzymem. Koenzymy zwiększają możliwości katalityczne enzymów

- -

27

poza te wynikające z obecności grup funkcyjnych reszt aa. Koenzymy ściśle związane z enzymami określa się
mianem grup prostetycznych. Obecności koenzymów wymagają generalnie enzymy katalizujące reakcje redox,
przenoszenia grup, izomeryzacji i tworzenia wiązań kowalencyjnych (klasy EC 1, 2, 5 i 6), nie potrzebują ich
natomiast enzymy lityczne – hydrolazy i liazy (EC 3 i 4). Często koenzym bywa rozpatrywany jako kolejny
substrat reakcji – po pierwsze ponieważ zmienia się wraz z podstawowym substratem, po drugie – gdyż często to
właśnie jego przemiany są fizjologicznie istotne. Prekursorami wielu koenzymów są witaminy, gł. z grupy B
(por. niżej). W zależności od przenoszonej grupy, koenzymy dzieli się na:

przenoszące protony: NAD(P)

+

, FMN, FAD, CoQ, kwas liponowy,

przenoszące inne grupy: fosforany sacharydów, CoA, DPT, PLP, koenzymy folianowe, biotyna,
koenzymy kobalaminowe, kwas liponowy.

W tabeli poniżej przedstawiono najważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, witaminy będące ich

prekursorami oraz przykłady zawierających je enzymów.

koenzym

Lp.

grupa

skrót(y)

pełna nazwa

witaminy

przykład enzymu

odnośniki

1.

NAD

+

,

NADH

dinukleotyd

nikotynamidoadeninowy

dehydrogenaza

mleczanowa

2.

nukleotydy

adeninowe

NADP

+

,

NADPH

fosforan dinukleotydu

nikotynamidoadeninowego

PP

dehydrogenaza

glukozo-6-

fosforanow

3.

FMN

mononukleotyd flawinowy

dehydrogenaza

NADH

4.

nukleotydy

flawinowe

FAD

dinukleotyd

flawinoadeninowy

B

2

(ryboflawina)

oksydaza α-

aminokwasów

III-3

5.

-

-

kwas liponowy

(lipoinowy)

-

oksydaza α-

ketokwasów

III-10

6.

-

CoA

1

koenzym A

kwas

pantotenowy

syntetaza kwasów

tłuszczowych

III-9 i 10,

V-5 i 6

7.

-

CoQ

koenzym Q, ubichinon

-

-

2

III-5

8.

cytochromy

b, c, c

1

,

a, a

3

cytochrom

-

-

3

III-3, III-5

9.

-

-

biotyna

H

karboksylaza

pirogronianowa

IV-4-b

10.

-

DPT

difosfotiamina

B

1

(tiamina)

dekarboksylaza

pirogronianowa

III-10

11.

-

PLP

fosforan pirydoksalu

B

6

(pirydoksal)

transaminaza

alaninowa

VI-2-a

12.

-

THF,

FH

4

tetrahydrofolian

kwas foliowy

hydroksymetylo-

transferaza

serynowa

VI-4-h

13.

-

-

kobalamina

B

12

(kobalamina)

mutaza

metylomalonylo-

CoA

IV-4-b

1

– CoA = {P} + ryboza + adenina + 2 {P} + kwas pantotenowy + merkaptoetanoloamina

kwas pantotenowy = kwas pantoinowy + β-alanina

2

– CoQ pełni funkcję przenośnika elektronów między metaloflawoproteinami a cytochromami w łańcuchu

oddechowym

3

– cytochromy są przenośnikami elektronów w łańcuchu oddechowym

d)

swoistość działania enzymów

•

W przeciwieństwie do katalizatorów nieorganicznych czy prostych katalizatorów organicznych,
enzymy charakteryzuje wysoka swoistość substratowa i aktywność katalityczna, będące wynikiem
wykształcenia miejsc katalitycznych dostosowanych do szybkiej i selektywnej katalizy indywidualnych
reakcji.

•

Jedną z najważniejszych cech enzymów jest ich zdolność do swoistej katalizy tylko jednej reakcji (ew.
jednego typu reakcji), dzięki czemu szybkość procesów metabolicznych może być regulowana przez
modyfikacją aktywności odpowiednich enzymów (por. punkt II-4).

- -

28

•

Enzymy są stereoswoistymi katalizatorami; większość substratów tworzy z nimi ≥ 3 wiązania, przez co
cząsteczki symetryczne pod względem budowy chemicznej mogą nabywać cech asymetrii (por. punkt
V-1-d – kwasy tłuszczowe w pozycjach 1 i 3 glicerolu).

•

Enzymy wykazują absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej jednej cząsteczki substratu – głównie
dla form D węglowodanów i form L aa. Wyjątkiem są epimerazy – racemazy.

•

Enzymy (poza pewnymi wyjątkami) wykazują również swoistość wobec określonego koenzymu, nawet
jeśli przenoszenie danej grupy może się odbywać z udziałem innego (por. wyżej).

e)

aktywność enzymów, jednostki aktywności

Z powodu zazwyczaj bardzo małej ilości enzymów w materiale biologicznym często określa się nie ilość

samego białka enzymatycznego, lecz jego aktywność katalityczną. Zakłada się przy tym, że w warunkach
badania szybkość reakcji katalizowanej przez enzym zależy proporcjonalnie od ilości tego enzymu. Wobec tego
ilość enzymu w próbce można określić na podstawie tempa ubytku substratów lub pojawiania się produktów w
środowisku reakcji. Wyniki podaje się odpowiednich jednostkach:

•

IU – międzynarodowa jednostka aktywności enzymu, oznaczająca taką jego ilość, która przemienia
1 µmol reagentu w ciągu 1 min.

•

Katal (kat) – jednostka SI aktywności enzymów i innych katalizatorów, oznacza ilość konwertującą
1 mol reagentu w czasie 1 s. Związek między katalem a IU przestawia się następująco: 1 kat = 60 mln
U). Katal jest zatem jednostką względnie dużą, dlatego w praktyce używa się µkat i nkat.

•

Liczba obrotów enzymu – ilość cząsteczek substratu, które mogą zostać przekształcone przez enzym w
produkt w ciągu 1 sekundy. Zwykle wynosi ona od kilku tysięcy do kilku milionów.

•

Aktywność specyficzna – jest to wyrażenie aktywności enzymu, jaką posiada jednostkowa masa białka
enzymatycznego, np. 1 U/mg oznacza, że 1 mg białka posiada aktywność 1 IU.

•

Aktywność całkowita – jest to wyrażenie aktywności enzymu, jaką posiada jednostkowa masa lub
objętość materiału biologicznego, z którego ten enzym jest izolowany, np. 1 U/ml oznacza, że 1 ml
płynu ustrojowego posiada daną aktywność enzymatyczną o wartości 1 IU.

Wyjątkowo w przypadku pewnych enzymów oznacza się ich bezwzględną ilość metodami

immunochemicznymi (por. punkt II-5-c – CK-MB mass).

f)

kompartmentacja komórkowa enzymów

Enzymy, ich substraty i koenzymy nie występują zazwyczaj jednorodnie w obrębie komórki, lecz w jej

określonych przestrzeniach, zwanych kompartmentami. Rozmieszczenie to można badać metodami
histochemicznymi. Kompartmetacja komórki umożliwia wzajemną izolację jej przedziałów i zachodzenie w nich
przeciwstawnych procesów biochemicznych, np. syntezy i degradacji tej samej grupy związków.

Rozmieszczanie w komórce przykładowych, kluczowych dla jej funkcjonowania, enzymów:

•

cytoplazma: aldolaza, izomeraza fosfoheksozowa, dehydrogenza mleczanowa, aminotransferaza
alaninowa, dehydrogenaza sorbitolowa,

•

mitochondria: enzymy cyklu Krebsa, oksydazy, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza
asparaginianowa,

•

ER: esterazy, reduktazy, acetylazy, GGTP,

•

rybosomy: enzymy syntezy białek, ceruloplazmina, cholinesteraza,

•

lizosomy: proteazy, fosfatazy, kolagenazy

g)

izoenzymy

Izoenzymy (izozymy) są to fizycznie odmienne formy tej samej aktywności katalitycznej, innymi słowy –

białka o odmiennej strukturze, lecz katalizujące przebieg tej samej reakcji. Poszczególne izoenzymy pojedynczej
aktywności mogą występować w różnych kompartmentach subkomórkowych lub nawet w odmiennych typach
komórek (tkankach – stąd też często pochodzą ich nazwy), różniąc się dodatkowo powinowactwem do
substratów (por. punkt IV-4-a – aldolaza A i B).

Izoenzymy są produktami ekspresji blisko spokrewnionych genów. Enzymy oligomeryczne z różnymi

protomerami mogą występować w kilku postaciach, ponadto jedna tkanka może produkować jeden rodzaj
protomeru, druga zaś inny. Jeśli protomery mogą łączyć się w różny sposób, aby utworzyć aktywny enzym,
tworzą się wówczas tzw. izoenzymy rzekome danej aktywności. Określa się je jako rzekome, gdyż są to
produkty asocjacji mniejszej liczby rodzajów protomerów. Np. dla LDH z 2 produktów translacji (posiadających
odmienne mRNA) powstaje 5 izoenzymów rzekomych (patrz punkt II-5-b). Izoenzymy prawdziwe różnią się
natomiast tym, że każdy z nich jest produktem translacji innego mRNA.

- -

29

Znane są izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, transaminaz, fosfataz i proteaz. Rozdział i

identyfikacja izoenzymów określonych aktywności ma istotne znaczenie diagnostyczne (por. punkt II-5).

h)

izolacja enzymów

Enzymy mogą być otrzymywane przez oczyszczanie z komórek żywych organizmów, w których

naturalnie występują, bądź metodami rekombinacji DNA – z komórek, gdzie fizjologicznie ich brak. Ze względu
na szybki wzrost używa się do tych celów komórek drożdży i bakterii. Ponadto techniki ukierunkowanej
mutagenezy pozwalają na manipulację składem aa rekombinowanego enzymu, np. w celu określenia roli
strukturalno – funkcjonalnej pewnych jego regionów (czy nawet pojedynczych reszt aa).

Do technik oczyszczania enzymów z materiału biologicznego zaliczamy: strącanie solami o różnych

stężeniach ((NH

4

)

2

SO

4

, Na

2

SO

4

) lub rozpuszczalnikami (aceton, etanol), różnicową denaturację cieplną,

denaturację spowodowaną zmianami pH, wirowanie różnicowe, elektroforezę, filtrację żelową, chromatografię
jonowymienną (jonity: A – DEAE/C, K – CMC), sączenie na sitach molekularnych oraz chromatografię
powinowactwa (z użyciem substratów, pochodnych koenzymów lub barwników organicznych, ligandów
hydrofobowych). Homogenność białka (tu – enzymu) potwierdza się techniką PAGE ± SDS lub elektroforezą
dwuwymiarową.

Technologii rekombinacji DNA składa się z kilku etapów: sklonowanie genu kodującego enzym →

zsekwencjonowanie genu → wprowadzenie do wektorów plazmidowych lub fagowych → umieszczenie w
docelowym genomie. Ostatecznie gen enzymu powinien znaleźć się pod kontrolą silnego promotora, najlepiej z
możliwością jego kontroli przez specyficznie chemicznie induktor – wówczas podanie tego ostatniego do
pożywki wzrostowej spowoduje produkcje enzymu w ilościach wielokrotnie większych niż naturalnie.
Technologia ta może być stosowana do otrzymywania zmodyfikowanych – tzw. fuzyjnych – białek. W tym celu
do oryginalnego genu dołącza się taką sekwencję, aby powstały białkowy produkt był odpowiednim ligandem
dla specyficznego nośnika w chromatografii powinowactwa, po czym po rozdzieleniu usuwa się dodany
fragment (tzw. domenę fuzyjną).

2.

Mechanizmy działania enzymów

a)

typy reakcji enzymatycznych przy dwóch substratach

Choć rozważania dotyczące reakcji enzymatycznych najprościej jest przedstawić i zrozumieć w sytuacji

pojedynczy substrat : pojedynczy produkt, to w rzeczywistości większość reakcji obejmuje dwa lub więcej
substratów i produktów. Ich liczbę określa się terminami: uni-, bi-, ter-, quad- itd., zaś rodzaj reakcji ze względu
na liczbę reagentów – przez podanie terminów określających ilość substratów i produktów. Bardzo często
spotykane są reakcje typu BiBi, tzn. posiadające 2 S i 2 P. Mogą one zachodzić na kilka sposobów:

•

reakcje ciągłe – wszystkie substraty muszą połączyć się z enzymem, aby uwolniony został produkt;
inaczej określa się je jako reakcje pojedynczego zastąpienia, gdyż grupa ulegająca przeniesieniu
przechodzi bezpośrednio z donora (substratu) na akceptor (produkt)

reakcje przypadkowego przyłączenia – nie ma znaczenia, w jakiej kolejności substraty połączą się z
enzymem; w ten sposób funkcjonują pewne dehydrogenazy i kinazy

E + S1/2 → E-S1/2 + S2/1 → E-S1-S2 → E-P1-P2 → E-P1/2 + P2/1 → E + P 1/2

reakcje uporządkowanego (sekwencyjnego) przyłączenia – tylko jeden z substratów może połączyć się
z enzymem, drugi natomiast łączy się z powstałym kompleksem; przyłączenie pierwszego substratu
indukuje w cząsteczce enzymu zmiany konformacyjne, umożliwiające przyłączenie drugiego substraty
dzięki adekwatnemu ustawieniu grup aktywnych; jako przykład można podać wiele oksydoreduktaz
zależnych od NAD(P)

+

E + S1 → E-S1 + S2 → E-S1-S2 → E-P1-P2 → E-P1 + P2 → E + P1

•

reakcje typu „ping-pong” – jeden lub więcej produktów uwalnia się od enzymu, zanim jeszcze zostaną
przyłączone wszystkie substraty; są to inaczej reakcje podwójnego zastąpienia, ponieważ przenoszona
grupa ulega wpierw przeniesieniu na enzym (często na koenzym), następnie odłącza się pierwszy
produkt, wtedy dopiero przyłącza się drugi substrat i po dołączeniu doń przenoszonej grupy powstaje i
uwalniany jest drugi produkt; taki mechanizm występuje m. in. w transaminazach i chymotrypsynie

E + S1 → E-S1 → E*-P1 → E* + P1 → E* + S2 → E*-S2 → E-P2 → E + P2

b)

mechanizm działania chymotrypsyny

Chymotrypsyna (CT) jest dobrym przykładem enzymu do opisania ogólnych cech katalizy

enzymatycznej, ponieważ cechuje się stosunkowo prostą budową, a także nie wymaga obecności koenzymu,
grupy prostetycznej ani atomu metalu.

- -

30

Chymotrypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których część karboksylowa pochodzi od aa

aromatycznego (Phe, Tyr, Trp) bądź posiadającego duży niepolarny łańcuch boczny (Met). Ponadto katalizuje
hydrolizę niektórych estrów, co nie ma wprawdzie znaczenia biologicznego, lecz pozwala na prowadzenie nad
nią badań. Używanym w eksperymentach substratem jest octan p-nitrofenylu (PNPA), hydrolizowany przez CT
do kwasu octowego i p-nitrofenolu – ten drugi w zasadowym pH dysocjuje do anionu p-nitrofenolanowego,
którego poziom może być oznaczany kolorymetrycznie.

Uwalnianie anionu p-nitrofenolanowego jest dwufazowe – najpierw ma miejsce faza szybka, a następnie

powolna, co jest konsekwencją mechanizmu katalizy. W pierwszym etapie CT łączy się z PNPA w kompleks, z
którego jako pierwszy odłącza się anion PNP

-

, zaś reszta octanowa pozostaje związana z enzymem. Oba te etapy

zachodzą stosunkowo szybko, natomiast hydroliza kompleksu CT-Ac przebiega o wiele wolniej. Szybka faza
uwalniania PNP

-

odpowiada więc przekształceniu całej dostępnej CT w kompleks CT-Ac z równoczesnym

maksymalnym uwolnieniem PNP

-

, natomiast faza wolna zależy od powolnego rozpadu kompleksu CT-Ac –

regeneracji wolnej CT, która odzyskuje zdolność reagowania z PNPA. Szybkość reakcji w pierwszej fazie jest
uwarunkowana i proporcjonalna do liczby moli CT w momencie rozpoczęcia reakcji.

Główną rolę w omawianej katalizie odgrywa reszta Ser 195 – z nią właśnie połączona jest grupa

acetylowa w kompleksie CT-Ac. Chociaż CT zawiera aż 28 reszt Ser, to jedynie ta w pozycji 195 cechuje się tak
wysoką reaktywnością i szczególną funkcją. Świadczy o tym m. in. wynik reakcji z
diizopropylofluorofosforanem (DIPP) – reszt Ser 195 zostaje wówczas zablokowana, co pozbawia całą
cząsteczkę CT aktywności enzymatycznej. Ze względu na szczególną rolę właśnie reszty Ser w katalizie, CT
zaliczana jest do grupy proteaz serynowych.

W reakcji o której mowa szczególne znaczenie mają 3 reszty aa, znajdujące się we wzajemnej bliskości w

sensie przestrzennym, choć zajmują odległe pozycje w strukturze I-rz. Są to: Asp 102, His 57 i wspomniana
Ser 195. Znajdują się one w otoczeniu niepolarnego wnętrza cząsteczki CT. Podczas reakcji Ser 195 ulega
acetylacji: zbliżenie Ac

-

do grupy hydroksylowej Ser 195 powoduje przeniesienie protonu z Ser 195, poprzez

His 57 na Asp 102 – przejście to zwiększa aktywność atomu tlenu grupy hydroksylowej Ser, co konsekwentnie
zwiększa szybkość reakcji. Z kolei podczas rozpadu CT-Ac protony przekazywane są w przeciwnym kierunku,
co pozwala na uwolnienie Ac

-

i odtworzenie pierwotnej postaci Ser 195. Podobna sekwencja zdarzeń zachodzi

podczas hydrolizy peptydów, stanowiących fizjologiczny substrat CT – patrz poniższy rysunek.

Chymomypsyna, podobnie jak wiele innych enzymów, syntetyzowana jest w postaci nieaktywnego

prekursora (proenzymu, zymogenu). Przekształcenie do formy aktywnej następuje przez kilkustopniową
proteolizę, w trakcie której powstaje miejsce katalityczne oraz układ przekazywania protonu (por. punkt VI-1-a).

- -

31

c)

mechanizm działania fruktozo-2,6-bisfosfatazy

W przypadku fruktozo-2,6-bisfosfatazy (grupa fosfohydrolaz) występuje nieco bardziej skomplikowany

układ. Miejsce katalityczne obejmuje tu 7 reszt aa – triada katalityczna składa się z: His 258, His 392 i Glu 327,
natomiast zasadowe (dodatnio naładowane) reszty Arg 257, Arg 307, Arg 352 i Lys 356 stabilizują ujemnie
naładowany substrat. Etapy katalizy:

•

Poczwórny ujemny ładunek związanego substratu stabilizowany jest przez oddziaływania
elektrostatyczne z czterem dodatnio naładowanymi w/w resztami aa. Reszta Glu 327 stabilizuje dodatni
ładunek reszty His 392.

•

Nukleofilowa reszta His 392 atakuje wiązanie C

2

-{P} – reszta fosforanowa zostaje przeniesiona na

His 258, fosforylując enzym oraz powstaje fruktozo-6-fosforan.

•

Cząsteczka H

2

O, z pomocą Glu 327, przeprowadza nukleofilowy atak, rozbijając wiązanie pomiędzy

resztą fosforanową a enzymem, w wyniku czego uwalnia się fosforan nieorganiczny (P

i

), oddziałujący

elektrostatycznie z Arg 257 i Arg 307, a ostatecznie uwalniany.

d)

mechanizm działania transaminaz

Transaminazy (aminotransferazy = AT) to enzymy katalizujące przeniesienie grup α-aminowych aa na

grupy α-ketonowe α-ketokwasów (pirogronowego, szczawiooctowego lub α-ketoglutarowego). Reakcja
katalizowana przez AT ma charakter ping-pong, podobnie jak wiele innych reakcji przebiegających z udziałem
enzymu zawierającego koenzym (w tym konkretnym przypadku jest to PLP). Dokładny mechanizm – patrz
punkt VI-2-a.

e)

kataliza kwasowo – zasadowa (k-z)

Gdy substrat zwiąże się z miejscem katalitycznym, naładowane lub zdolne do naładowania grupy

funkcyjne łańcuchów bocznych aa znajdujących się blisko substratu mogą brać udział w katalizie, działając jako
katalizatory kwasowo – zasadowe. Rozróżnia się katalizę k-z swoistą i ogólną; różnią się one m. in. kolejnością
przebiegu szybkiego i powolnego etapu reakcji:

•

Swoista kataliza enzymatyczna k-z cechuje się zależnością szybkości reakcji od stężenia H

+

, a brakiem

zależności od stężenia innych kwasów lub zasad w roztworze. Jeżeli przy stałym stężeniu buforu
szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą pH, to jest to reakcja swoiście katalizowana przez kwas
(pH < 7) lub zasadę (pH > 7). Równanie opisujące szybkość reakcji swoistej katalizy k-z zawiera
wyłącznie wartości stężenia substratu oraz – odpowiednio – [H

+

] lub [OH

-

].

•

Ogólna kataliza enzymatyczna k-z cechuje się zależnością szybkości reakcji od stężeń wszystkich
kwasów i zasad w roztworze. Jeżeli przy stałym pH szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą
stężenia buforu, to jest to ogólna kataliza kwasowa (pH < 7) lub zasadowa (pH > 7).

f)

enzymy wymagające atomów metali

Wiele (ok. 25 %) enzymów zawiera związany atom metalu, niezbędny do ich aktywności. Wyróżniamy

dwa rodzaje połączeń enzymu z metalem:

•

metaloenzymy – zawierają określoną liczbę funkcyjnych atomów metalu, nie usuwanych w procesie
oczyszczania,

•

enzymy aktywowane przez metale – słabiej wiążą atomy metalu.

Jednak bez względu na powinowactwo metalu i enzymu, atomy metali pełnią podobne funkcje. W

katalizie enzymatycznej funkcjonują trójskładnikowe kompleksy miejsce katalityczne – metal – substrat, które
mogą być połączone w różnoraki sposób:

•

liniowo

z mostkiem przez substrat (E-S-M) – w wyniku wyparcia cząsteczki wody ze strefy koordynacyjnej
metalu przez substrat może dojść do połączenia z enzymem; w przenoszeniu reszty fosforanowej metal
pełni rolę aktywatora atomu fosforu (tego rodzaju połączenia tworzy m. in. większość kinaz)

z mostkiem przez enzym (M-E-S) – metal odgrywa rolę strukturalną: utrzymuje aktywną konformację
(np. syntetaza Glu) lub tworzy mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa – tu też dodatkowo
aktywuje jeden z substratów)

z mostkiem przez metal (E-M-S) – np. transfosfatazy pirogronianu i PEP, inne enzymy działające na
PEP, karboksylazy

•

cyklicznie przez metal (-E-M-S-)

Enzymy aktywowane przez metale tworzą kompleksy wszystkich czterech w/w typów, natomiast

metaloenzymy – wszystkie z wyjątkiem E-S-M, gdyż już wyjściowo obecny jest silnie zespolony kompleks

- -

32

enzymu z metalem, który nie może być rozdzielony przez substrat. Dany enzym może tworzyć różne typy
kompleksów, w zależności od substratu. W wielu białkach resztą aa wiążącą metal jest His, np.
karboksypeptydaza A, fosfataza zasadowa (ALP), kinaza białkowa C (PKC), rubredoksyna, hemoproteiny.

Metale mogą pełnić bardzo różnorodne funkcje w katalizie oraz brać udział we wszystkich

mechanizmach zwiększania szybkości reakcji, tj.: ogólnej katalizie kwasowo – zasadowej, katalizie
kowalencyjnej, zbliżeniu reagujących cząstek oraz indukcji zmian strukturalnym w obrębie enzymu lub
substratu. Do najczęściej związanych z katalizą metali należą: żelazo, magnez, kobalt (w postaci kobalaminy)
oraz mangan. Zwłaszcza żelazo i mangan mogą występować na różnych stopniach utlenienia i brać udział w
katalizie reakcji redox; zazwyczaj występują wówczas w specyficznych grupach prostetycznych, jak np. hem
(patrz punkt I-3-e) czy centra żelazo-siarkowe (patrz punkt III-5). Odnośnie różnorodnej funkcji atomów metali
w katalizie – mogą one:

uczestniczyć w tworzeniu pary elektronowej wiązania σ,

gromadzić i zbliżać substraty, służyć jako trójwymiarowa matryca do ustawiania grup zasadowych
enzymu lub substratów w określonej pozycji,

aktywować grupy elektro- lub nukleofilowe (ogólna kataliza k-z), same funkcjonować jako nukleofile,
maskować grupy nukleofilowe i przez to kierować reakcję na właściwy tor,

indukować zmiany konformacyjne w obrębie enzymu lub substratu.

3.

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Wiele informacji dotyczących kinetyki reakcji katalizowanych przez enzymy jest prawdziwych i

wywodzi się z zasad kinetyki reakcji nieenzymatycznych, dlatego najpierw przypomniane i omówione zostaną
ogólne reguły kinetyki chemicznej, a następnie pewne wyjątkowe i charakterystyczne dla przemian z udziałem
enzymów.

a)

ogólne zasady kinetyki reakcji chemicznych

Reakcje chemiczne możemy ogólnie podzielić na nieodwracalne i odwracalne. Do pierwszej grupy

zaliczymy te, podczas których w środowisku powstają wyłącznie produkty. Przyjmuje się, że tego typu reakcje
zachodzą do końca. Jako przykład podać można reakcje zobojętniania oraz te, w wyniku których wytrąca się
nierozpuszczalny osad, wydziela się gaz lub powstaje słaby elektrolit. Reakcje odwracalne to takie, podczas
których gromadzące się w środowisku produkty reagują ze sobą i odtwarzają substraty. W środowisku reakcji
oprócz produktów występują nieprzereagowane substraty. Reakcje tego typu nie zachodzą do końca. Jako
przykład podać można dysocjację słabych elektrolitów lub hydrolizę soli.

Większość obserwowanych w przyrodzie reakcji należy do grupy odwracalnych. Oznacza to, iż mówimy

w ich przypadku o występowaniu pewnego stanu równowagi. Ogólnie pod pojęciem równowagi rozumiemy
ustalony stan jakiegoś zjawiska. Wyróżniamy równowagę statyczną i dynamiczną. Pierwsza występuje w
sytuacji, gdy żadne procesy w środowisku nie zachodzą, a stężenia reagentów nie zmieniają się w czasie.
Równowaga dynamiczna to stan, w którym przemiany chemiczne co prawda zachodzą, jednak tyle samo
substratów przechodzi w produkty co produktów w substraty. W stanie równowagi dynamicznej szybkość danej
reakcji oraz reakcji do niej odwrotnej są sobie równe, a stężenia reagentów ustalają się na stały poziomie.
Procesy biologiczne występują w stanie równowagi dynamicznej – wciąż istnieje konkurencja przemiany danej i
do niej odwrotnej, miedzy którymi ustala się dynamiczna równowaga.

Jak wspomniano, reakcje odwracalne mogą teoretycznie przebiegać w dwie strony. O tym zaś, w którą

stronę reakcja rzeczywiście przebiega, decyduje wartość wielości zwanej energią swobodną (G) danej reakcji.
Innymi słowy energia swobodna określa samorzutność przebiegu oraz stan równowagi reakcji. Energia
swobodna jest funkcja stanu, co oznacza, iż nie zależy ona od sposobu, w jaki przemiana zachodzi, lecz jedynie
od początkowego i końcowego stanu układu. Oznacza to tym samym, iż nie zależy ona od ilości i jakości
występujących w przebiegu reakcji stanów pośrednich, co będzie miało istotne znaczenie przy katalizie
enzymatycznej.

Energia swobodna powiązana jest z innymi funkcjami stanu charakteryzującymi reakcję chemiczną, tj. z

entalpią i entropią.

•

Entalpią reakcji (H) nazywamy jej efekt cieplny, zachodzący pod stałym ciśnieniem. Na podstawie I
zasady termodynamiki wyraża się ona następująco: ∆H=∆U+p∆V, gdzie ∆U oznacza zmianę energii
wewnętrznej, p∆V zaś pracę objętościową (zmiana ilości gazu o 1 mol jest równoznaczna z
wykonaniem pracy ok. 2,6 kJ). Pojęcie entalpii tłumaczy zachodzenie procesów ezgoergicznych.

•

Z kolei entropia (S) jest miarą rozkładu energii w układzie. Wszystkie układy dążą do zapewnienia
możliwie największej różnorodności sposobów podziału energii między drobiny oraz poszczególne
rodzaje form jej gromadzenia. Pojęcie entropii tłumaczy zachodzenie procesów endoergicznych,
zachodzenie reakcji w układach izolowanych oraz samorzutne mieszanie się gazów.

- -

33

Zmiany funkcji stanu w wyniku przebiegu reakcji chemicznej łączy ze sobą równanie Gibbsa-

Helmholtza: ∆G=∆H-T∆S. Układy biologiczne dążą do zmniejszenia energii wewnętrznej (∆H<0) oraz wzrostu
wewnętrznego nieuporządkowania (∆S>0), co w efekcie daje ∆G<0 – stan taki oznacza reakcję samorzutną.
Przez analogię ∆G=0 oznacza ustalenie się stanu równowagi w układzie, zaś 4G>0 – zachodzenie reakcji
wymuszonej.

Wartości i znaki funkcji stanu opisują samorzutność reakcji, nie mówią jednak nic o szybkości jej

przebiegu. Miarą szybkości reakcji jest szybkość pojawiania się produktów i jednoczesnego ubytku substratów
w środowisku: v=dc/dt. Szybkość zależy od początkowego stężenia substratu: v~c

0

. Po wprowadzeniu

współczynnika proporcjonalności: v=kc

0

(współczynnik k nazywamy stałą szybkości reakcji). Z porównania

powyższych zależności wynika, iż szybkość reakcji maleje wykładniczo – jest największa na początku i
stopniowo, zrównując się z szybkością reakcji odwrotnej, co ma miejsce w chwili osiągnięcia stanu równowagi.
Dla większej ilości reagentów wyrażenia opisujące szybkość reakcji powiększają się o iloczyn odpowiednich
stężeń:

A ↔ B

v = k[A]

A + A ↔ B

v = k[A][A]=k[A]

2

a A ↔ B

v = k[A]

a

Ogólnie dla modelowej reakcji odwracalnej: aA + bB ↔ cC + dD wyrażenia opisujące szybkości reakcji

przyjmują postać: v

1

=k

1

[A]

a

[B]

b

i v

2

=k

2

[C]

c

[D]

d.

Ponieważ w stanie równowagi szybkość reakcji danej i

przeciwnej jest równa (v

1

=v

2

), zatem: k

1

/k

2

= [C]

c

[D]

d

/[A]

a

[B]

b

= const. Wynik tego przekształcenia interpretuje

prawo działania mas Guldberga-Waagego: w stanie równowagi chemicznej iloczyn stężeń (ciśnień) reagentów w
wykładnikach potęgowych ich współczynników stechiometrycznych jest wielkością stałą dla danej reakcji i w
określonej temperaturze i nazywaną stałą równowagi reakcji (stężeniową – K

c

lub ciśnieniową – K

p

, przy czym

w praktyce częściej posługujemy się tą pierwszą). Pomiędzy stałymi równowagi tej samej reakcji zachodzi
zależność: K

p

=K

c

(RT)

∆n

, gdzie: R – stała gazowa, T – temperatura bezwzględna, ∆n – przyrost liczby moli

produktów gazowych w czasie reakcji. Stała równowagi jest wielkością chemiczną charakteryzującą ilościowo
stan równowagi dynamicznej reakcji odwracalnej. Jej wielkość nie zależy od stężeń reagentów, a jedynie od
temperatury, zmieniając się w sposób zależny od efektu energetycznego reakcji.

Energia swobodna reakcji związana jest z jej stałą równowagi zależnością: ∆G = -RTlnK

c

. Jeżeli więc

reakcja jest samorzutna, czyli ∆G<0, to K

c

>1 – równowaga przesunięta jest w stronę produktów. Analogicznie

dla ∆G=0 K

c

=1, zaś dla ∆G>0 K

c

<1, czyli równowaga przesunięta jest w stronę substratów (reakcja przebiega

odwrotnie). Powyższe równanie jest uniwersalne; w przypadku układów redox pozwala ono na wyprowadzenie
równania Nernsta.

b)

kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej

Udział enzymów w reakcji chemicznej dostarcza jej alternatywnych stanów pośrednich. Inaczej mówiąc

enzymy obniżają barierę energetyczną reakcji. Nie wpływają one jednak na energię swobodną, która zależy
przecież tylko od stanu początkowego i końcowego. Enzymy, ani też inne katalizatory, nie są w stanie wpłynąć
na kierunek ani zmienić stałej równowagi reakcji. Widać to wyraźnie po rozpisaniu równań na stałe równowagi:
bez enzymu: A + B ↔ C + D, K

c1

=[C][D]/[A][B],

z enzymem: A + B + Enz ↔ ... ↔ C + D + Enz, K

c2

=[C][D][Enz]/[A][B][Enz]=[C][D]/[A][B]=K

c1

.

Szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie zależna jest od wielu czynników. Należą do nich:

temperatura, odczyn środowiska (pH), stężenie enzymu, stężenie substratu oraz brak lub obecność inhibitorów.

•

Wraz ze wzrostem temperatury wzrasta szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie, ale tylko w
ściśle ograniczonym zakresie temperatury. Szybkość reakcji początkowo się zwiększa, wraz ze
wzrostem temperatury, z powodu zwiększania energii kinetycznych reagujących cząsteczek.
Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barierę energetyczną słabych wiązań
wodorowych i hydrofobowych, które utrzymują jego strukturę II- i III-rzędową. W tej temperaturze
denaturacji dominuje towarzysząca strąceniu białka utrata aktywności katalitycznej enzymu. Zakres
temperatury, w którym enzym utrzymuje stabilną katalitycznie kompetentną konformację zależy
zazwyczaj od temperatury komórek, w których występuje i umiarkowanie ją przekracza. Enzymy
organizmu ludzkiego, którego temperatura wynosi ok. 37

oC

, zachowują zazwyczaj stabilność do

temperatury 45-55

oC

.

•

Gdy aktywność enzymu zmierzy się w kilku wartościach pH, obserwuje się, że optymalna aktywność
mieści się na ogół między wartościami pH 5-9, niemniej kilka enzymów, np. pepsyna, jest aktywnych
przy wartościach pH wyraźnie wykraczających poza ten zakres. Kształt krzywych wyrażających
zależność aktywności od pH określają czynniki takie jak: denaturacja enzymu przy małych i dużych

- -

34

wartościach pH oraz zmiany ładunku enzymu i / lub substratów. W przypadku enzymu odczyn może
wpływać na jego aktywność przez zmianę struktury lub przez zmianę ładunku reszty aa, biorącej udział
w przyłączeniu substratu lub w katalizie. Aby to zilustrować należy wziąć od uwagę ujemnie
naładowany enzym E

-

reagujący z dodatnio naładowanym substratem SH

+

: E

-

+ SH

+

→ ESH. Przy

niskim pH enzym dąży do przyłączenia protonu i traci swój ładunek ujemny: E

-

+ H

+

→ EH. Przy

wysokim pH substrat jonizuje i traci swój ładunek dodatni: SH

+

→ S + H

+

. Ponieważ jedynymi

formami, które mogą wchodzić w interakcje są SH

+

i E

-

, krańcowe wartości pH będą zmniejszały

skutecznie stężenie E

-

i SH

+

, zmniejszając w ten sposób szybkość reakcji.

•

Szybkość początkowa jest proporcjonalna do stężenia enzymu. Szybkość początkowa reakcji jest to
szybkość mierzona przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu, pozwalającej na zachodzenie
reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna
do stężenia enzymu. Należy jednak podkreślić, iż stwierdzenie to odnosi się tylko do szybkości
początkowej.

c)

wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji

Jeżeli zwiększa się stężenie substratu ([S]), a wszystkie inne warunki pozostają niezmienione, to

mierzona szybkość początkowa v zwiększa się do wartości maksymalnej v

m

i nie przekracza jej. Szybkość

reakcji zwiększa się wraz ze zwiększaniem stężenia substratu aż do momentu, gdy enzym jest nasycony
substratem. Mierzona szybkość początkowa osiągnie wartość maksymalną i nie ma na nią wpływu dalsze
zwiększanie substratu, ponieważ substrat występuje w dużym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu.

Stężenie substratu, które powoduje osiągnięcie połowy szybkości maksymalnej, zwane jest stałą

Michaelisa (K

m

). Można ją oznaczyć doświadczalnie przez graficzne przedstawienie zależności V od [S]

(rysunek poniżej). K

m

ma wymiar stężenia molowego.

Powyższa krzywa jest wykresem tzw. równania Michaelisa-Menten, które ma postać:

Opisuje ono zachowanie się wielu enzymów przy zmieniającym się stężeniu substratu. Na jego podstawie

zależność początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od K

m

można przedstawić

następująco:

•

gdy [S] « K

m

– dodanie [S] do K

m

w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego wartość, tak że

wyrażenie [S] można w mianowniku pominąć; ponieważ v

m

i K

m

są stałe, można ich stosunek zastąpić

nową stała K:

Innymi słowy, jeżeli stężenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania

połowy szybkości maksymalnej, to szybkość początkowa zależy od stężenia substratu.

- -

35

•

gdy [S] = K

m

:

Oznacza to, iż jeżeli stężenie substratu jest równe wartości K

m

, to szybkość początkowa równa się

połowie szybkości maksymalnej. Wskazuje to także jak oznaczyć K

m

, a mianowicie trzeba określić

doświadczalnie stężenie substratu, przy którym początkowa szybkość stanowi połowę wartości maksymalnej.

•

gdy [S] » K

m

– dodanie K

m

do [S] w mianowniku zmienia jego wartość bardzo niewiele, tak że

wyrażenie K

m

można w mianowniku pominąć:

Oznacza to, że jeżeli stężenie substratu znacznie przewyższa wartość K

m

, to szybkość początkowa jest

szybkością maksymalną.

Bezpośredni pomiar liczbowej wartości v

m

i obliczenie K

m

często wymaga trudnych do uzyskania w

praktyce wysokich stężeń substratu, aby w laboratorium osiągnąć warunki nasycenia. Aby ominąć tę przeszkodę,
stosuje się liniową formę równania Michaelisa-Menten, która pozwala łatwo ekstrapolować v

m

i K

m

z szybkości

reakcji mierzonych przy mniejszych niż nasycające stężeniach substratu. Równanie M-M przekształcić można
następująco:

Jest to równanie prostej y=ax+b, gdzie y=1/v, zaś x=1/[S]. Jeżeli y lub 1/v jest wykreślony jako funkcja x lub
1/[S], to b=1/v

m

na osi y, a kąt nachylenia a=K

m

/v

m

. Ujemny odcinek na osi x można określić przez przyjęcie

y=0. Wtedy: x=-b/a=-1/K

m

.

Wykres taki nazywamy wykresem podwójnych odwrotności lub wykresem Lineweavera-Burka. Z jego pomocą
można określić K

m

wykorzystując albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y albo odcinek na ujemnej części osi

x. Technika podwójnych odwrotności wymaga stosunkowo niewielu punktów dla określenia K

m

i jest metodą

najczęściej używaną do wyznaczania K

m

.

Innym podejściem do doświadczalnego wyznaczenia K

m

i v

m

jest podejście Eadie i Hofstee. Równanie

M-M może być przekształcone w następujący sposób:

Aby wyznaczyć K

m

i v

m

, wykreśla się v/[S] (oś y) wobec v (oś x). Miejsce przecięcia osi y wyznacza wówczas

v

m

/K

m

, a miejsce przecięcia osi x – v

m

. Nachylenie wynosi –1/K

m

.

- -

36

d)

zjawisko kooperatywności

Pewne enzymy i inne białka przyłączające ligandy, takie jak hemoglobina, nie działają zgodnie z

klasyczną kinetyką nasycenia M-M. Jeżeli prędkość wykreśli się względem stężenia substratu, to krzywa
nasycenia ma kształt sigmoidalny (jak rozciągnięta litera S) – rysunek niżej.

Ogólnie wskazuje to na kooperatywne przyłączenie substratu do licznych miejsc. Przyłączenie w jednym
miejscu wpływa na przyłączenie w innych miejscach. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu
substratem omówione powyżej metody graficznej oceny stężenia substratu, które powoduje osiągnięcie połowy
szybkości maksymalnej, są bezużyteczne z powodu braku linii prostych. Aby ocenić taką kinetykę nasycenia,
można wykorzystać graficzne przedstawienie równania Hilla – wyprowadzonego pierwotnie, aby opisać
kooperatywne przyłączenie O

2

do Hb. W formie linii prostej ma ono postać następującą:

,

gdzie k jest stała złożoną. Z równania wynika, że gdy [S] « k, to szybkość reakcji zwiększa się jak n-ta potęga
[S].

Na kolejnym rysunku przedstawiono wykres Hilla danych kinetycznych dla enzymu z kinetyką wiązania

kooperatywnego. Wykres v / (v

m

– v) względem log [S] daje linię prostą o nachyleniu n, gdzie n jest parametrem

empirycznym, którego wartość zależy od liczby miejsc wiążących substrat oraz liczby i typu interakcji między
nimi. Gdy n=1, miejsca wiązania działają niezależnie jedno od drugiego. Jeżeli n>1, to miejsca są kooperatywne
i przy większej wartości n kooperatywność jest silniejsza, a wówczas kinetyki nasycenia są bardziej
sigmoidalne. Jeżeli n<1, wówczas miejsca wykazują negatywna kooperatywność. W połowie szybkości
maksymalnej: v=v

m

/2, więc: v / (v

m

– v) = 1, czyli: log v / (v

m

-v) = 0. Aby zatem wyznaczyć S

50

(stężenie

substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej) należy wykreślić linię
prostopadłą do osi x z punktu, w którym log v / (v

m

– v) = 0.

e)

inhibicja odwracalna i nieodwracalna

Do czynników modyfikujących szybkość zachodzenia reakcji enzymatycznej należy również obecność

inhibitora. Inhibitory dzielimy ze względu na to, czy hamowanie ustępuje czy nie w wyniku zwiększenia
stężenia substratu, na kompetycyjne i niekompetycyjne. Podział ten jest o tyle utrudniony, o ile wiele
inhibitorów nie wykazuje idealnych właściwości czysto nie- lub kompetycyjnych. Innym sposobem
klasyfikowania inhibitorów jest podział według ich miejsca działania. Niektóre z nich wiążą się z enzymem w

- -

37

tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne), inne zaś łączą się z dla od miejsca katalitycznego
(miejsca allosteryczne).

Klasyczne hamowanie kompetencyjne zachodzi w miejscu wiązania substratu (katalitycznym).

Chemiczna struktura inhibitora, analogu substratu (I), ogólnie przypomina budowę substratu. Łączy się on zatem
odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-inhibitor (EI), a nie kompleks ES. Gdy jest obecny zarówno
substrat, jak i ten typ inhibitora, wówczas współzawodniczą one ze sobą o te same miejsca wiązania w enzymie.
Klasycznym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para malonian (I) i bursztynian (S) w stosunku do
dehydrogenazy busztynianowej. Enzym ten katalizuje tworzenie fumaranu przez usunięcie po jednym atomie
wodoru z każdego atomu α-węgla bursztynianu. Malonian może łączyć się z dehydrogenazą, tworząc kompleks
EI. Nie może on ulec odwodornieniu, gdyż nie ma żadnego sposobu, aby usunąć nawet jeden atom wodoru z
pojedynczego atomu węgla α bez utworzenia pięciowartościowego atomu węgla. Jedyną reakcją, której może
podlegać kompleks EI jest powtórny rozpad na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji rozpadu określić można
równowagi K

i

=[E][I]/[EI]. Inhibitory kompetycyjne nie zmieniają szybkości reakcji enzymatycznej, wpływają

natomiast na stałą K

m

. Wykresy L-B dla tej samej reakcji bez inhibitora oraz z inhibitorem kompetycyjnym będą

przecinały oś y w tym samym miejscu, różny natomiast będzie odcinek po ujemnej stronie osi x. To ostatnie ma
wartość: 1/x=K

m

(1+[I]/K

i

), gdzie K

i

jest obliczoną wcześniej stałą szybkości hamowanej reakcji.

W hamowaniu niekompetycyjnym nie występuje konkurencja między S a I. Inhibitor zazwyczaj nie

wykazuje żadnego albo małe podobieństwo wobec substratu i można przyjąć, że wiąże się z inna domeną
enzymu. Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają szybkość maksymalną, osiągalną przy danej ilości
enzymu, ale zazwyczaj nie wpływają na K

m

. Ponieważ I i S mogą się łączyć w różnych miejscach, jest możliwe

tworzenie zarówno kompleksów EI, jak i EIS. Ponieważ EIS może się rozpaść, tworząc produkt z mniejszą
szybkością niż ES, reakcja może być spowolniona, ale nie zatrzymana. Wykresy L-B dla tej samej reakcji bez
inhibitora oraz z inhibitorem niekompetycyjnym będą miały taki sam odcinek po ujemnej stronie osi x,
natomiast będą przecinały oś y w różnych miejscach – zależnie od powinowactwa S względem E oraz EI.

Aktywność enzymatyczną całkowicie blokują działające na enzymy „trucizny”, np. jodoacetamid, jony

metali ciężkich (Ag

+

, Hg

2+

), czynniki utleniające itd. Te inhibitory zazwyczaj powodują chemiczną modyfikację

aminokwasów w enzymie, co odgrywa istotną rolę w katalizie. Proces ten nie jest łatwo odwracalny ani poprzez
usunięcie pozostałości wolnego inhibitora, ani przez wzrost stężenia substratu. Inhibitory takie często nie
wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu. Niemniej, kiedy miejsce ataku chemicznego znajduje się w
obrębie miejsca katalitycznego, obecność substratu lub produktu często wywiera ochronny wpływ przez
blokowanie lub spowalnianie dostępu inhibitora do odpowiedniego aminokwasu.

- -

38

4.

Regulacja aktywności enzymów

Aktywność katalityczna enzymu zależy od dwóch czynników, tj. od ilości tego enzymu oraz od jego

sprawności katalitycznej.

a)

Ilość enzymu determinowana jest równowagą pomiędzy jego syntezą a rozkładem. Oba te procesy
zachodzą różnymi drogami oraz podlegają odmiennej i niezależnej regulacji (por. dalej). Modyfikacja
syntezy i/lub degradacji jest powolną metodą regulacji, ze względu na złożoność i wieloetapowość
procesu syntezy białka.

•

Synteza enzymu jest reakcją na obecność swoistych drobnocząsteczkowych induktorów – na ogół, choć
nie zawsze, są to substraty enzymów podlegających indukcji, mogą to być również związki
przypominające budową substrat – tzw. induktory gratisowe. Enzymy podlegające tej formie kontroli
określa się jako indukowalne, zaś te posiadające stałą i niezmienną aktywność – jako konstytucyjne.
Jeden enzym (aktywność katalityczna) może posiadać zarówno izoenzymy indukowalne, jak i
konstytutywne. Do grupy enzymów indukowalnych należą m. in.: 2,3-dioksygenaza tryptofanowa,
dehydrataza treoninowa, transaminaza tyrozyna : α-ketoglutaran, β-D-fruktofuranozydaza, enzymy
cyklu mocznikowego, reduktaza HMG-CoA, cytochrom P

450

(CYP), syntaza tlenku azotu – izoenzym i

(iNOS).

•

Synteza enzymów może być hamowana – ulegać represji – przez obecność w środowisku reakcji jej
produktu. Zarówno indukcja, jak i represja, przebiega przy udziale elementów cis, tj. specyficznych
sekwencji DNA obecnych po stronie 5’ genu kodującego dany enzym oraz białek regulujących, tj.
czynników trans. Ponadto określone metabolity mogą stanowić korepresory lub koinduktory, które
przez wiązanie a czynnikami trans mogą modulować ich oddziaływanie z elementami cis. Duże
wewnątrzkomórkowe stężenie niektórych metabolitów (np. aa, zasady azotowe) blokuje syntezę
elementów biorących udział w ich własnej biosyntezie. Po obniżeniu tego stężenia enzym powraca do
pierwotnej aktywności – ulega odblokowaniu, czyli derepresji. Powyższy mechanizm odnosi się do
represji na zasadzie sprzężenia zwrotnego za pomocą produktu (por. operon tryptofanowy u bakterii).
Innym modelem regulacji jest represja za pomocą katabolitu, polegająca na represji syntezy enzymów
katalizujących reakcje kataboliczne pod wpływem związków pośrednich, powstających w tych
reakcjach (por. operon galaktozowy u bakterii).

•

Degradacja enzymów, podobnie jak synteza, jest swoiście regulowana – wrażliwość białek
enzymatycznych na proteolizę zależy m. in. od obecności substratów, koenzymów lub jonów metali.
Np. synteza arginazy nasila się po spożyciu posiłku, a degradacja maleje w trakcie głodzenia
(wypadkowo ilość enzymu rośnie w obu przypadkach, choć są to inne mechanizmy regulacji). Podobnie
jest w przypadku 2,3-dioksygenazy (pirolazy) tryptofanowej – kortykosteroidy zwiększają jej syntezę,
zaś Trp spowalnia jej degradację przez obniżenie wrażliwości na proteolizę.

b)

Aktywność katalityczna enzymu może być regulowana w różny sposób – poprzez odwracalne wiązanie
ligandów (regulacje allosteryczne) lub zmianę wiązań kowalencyjnych (modyfikacje kowalencyjne).
Jest to o wiele szybszy sposób regulacji w porównaniu z wpływem na syntezę / rozkład enzymu.

•

Aktywność enzymów regulacyjnych, tj. kluczowych dla danego szlaku metabolicznego, jest
modulowana za pomocą małocząsteczkowych efektorów allosterycznych, na ogół niepodobnych ani do
substratów ani koenzymów danego enzymu. Hamowanie aktywności enzymu szlaku biosyntezy przez
końcowy produkt tego szlaku to tzw. hamowanie przez sprzężenie zwrotne, a ten produkt – to ujemny
efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny. Wiąże się on zwykle z miejscem allostercznym enzymu,
które nie pokrywa się z miejscem katalitycznym. Kinetyka hamowania przez sprzężenie zwrotne może
mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Mechanizm ten
występuje najczęściej jako regulacja szlaków biosyntezy, a inhibitorem zwrotnym jest ostatni związek
drobnocząsteczkowy szlaku, stanowiący substrat do syntezy związków wielkocząsteczkowych (np. aa i
synteza białek, nukleotydy i synteza kwasów nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzężenie
zwrotne dotyczy etapu kontrolującego (limitującego), charakterystycznego wyłącznie dla danego szlaku
biosyntezy.

•

W przypadku szlaków rozgałęzionych – czyli gdy początkowe reagenty służą do syntezy kilku
związków ostatecznych – enzymy tego szlaku znajdują się pod złożonym wpływem zarówno
metabolitów pośrednich, jak i ostatecznych, zaś same mechanizm regulacji potrafią być bardzo
skomplikowane. Hamowanie przez sprzężenie zwrotne może mieć w szlakach rozgałęzionych
charakter:

- -

39

kumulatywny – gdy hamujący wpływ ≥ 2 produktów końcowych jest sumą skutków wywoływanych
przez każdy z tych produktów niezależnie,

zgodny czyli wielowartościowy – jeśli całkowite zahamowanie aktywności enzymu występuje tylko
wtedy, gdy jednocześnie ≥ 2 produkty końcowe występują w nadmiarze,

kooperatywny – gdy pojedynczy produkt końcowy hamuje enzym regulujący, zaś efekt inhibicji przez
≥ 2 nadmiarowe produkty przewyższa sumę efektów niezależnego działania każdego z nich.

•

Brak podobieństwa w budowie substratów i regulatorów allosterycznych sugeruje, iż substancje te
wiążą się z różnymi miejscami enzymu – odpowiednio z katalitycznymi i allosterycznymi. Z tego
powodu enzymy takie określamy jako enzymy allosteryczne. O niezależności miejsc wiązania świadczy
m. in. fakt, iż utrata wrażliwości na efektory allosteryczne nie musi być jednoznaczna z utratą
aktywności katalitycznej. Ponadto efektory allosteryczne potrafią chronić miejsce katalityczne przed
denaturacją skuteczniej od samych substratów, co trudno byłoby wyjaśnić, gdyby przyjąć ich wspólne
miejsce wiązania. W pewnych enzymach miejsca katalityczne i allosteryczne zlokalizowane są na
różnych podjednostkach białka oligomerycznego. Enzymy katalizujące tę samą reakcję (lub typ reakcji)
potrafią posiadać różne efektory allosteryczne w różnych komórkach.

•

Enzymy allosteryczne dzieli się na grupy – tzw. serię K i V. Te pierwsze cechują się kompetycyjną
kinetyką nasycenia substratem – wzrasta K

M

, a V

m

pozostaje bez zmian. W przypadku drugiej grupy

efektor allosteryczny zmniejsza V

m

, nie wpływając na K

M

. Zmiany obydwu parametrów wynikają

prawdopodobnie ze zmian konformacyjnych w miejscu katalitycznym – dla serii K może to
spowodować osłabienie wiązania z substratem, dla V – zmianę przestrzennej orientacji lub ładunków
reszt aa centrum katalitycznego.

•

Aktywność enzymów podlega nadrzędnej regulacji hormonalnej i nerwowej (tzw. przekaźników I
rzędu), które to bodźce mogą pobudzać syntezę lub uwolnienie gotowych już efektorów allosterycznych
(tzw. przekaźników II rzędu).

•

Regulacja aktywności enzymów przez kowalencyjne modyfikacje ich cząsteczek może mieć charakter
odwracalny lub nie – w pierwszym przypadku mówimy o odwracalnej fosforylacji, w drugim zaś – o
swoistej ograniczonej proteolizie (jest to metoda nieodwracalna, gdyż nie ma możliwości ponownej
resyntezy raz zhydrolizowanych wiązań peptydowych).

Wiele białek syntetyzowanych jest w formie nieaktywnych prekursorów – probiałek; w przypadku
enzymów są to proenzymy (inaczej zymogeny). Nadanie im właściwej postaci, w której mogą
wykazywać swą aktywność, odbywa się drogą swoistej hydrolizy pewnych wiązań peptydowych
(proteolizy). W procesie tym łańcuch polipeptydowy może tracić swą ciągłość – produkty proteolizy
mogą zostać na stałe rozdzielone, bądź utrzymywane w całości dzięki istnieniu wiązań
dwusiarczkowych. Również nie wszystkie reszty aa obecne w probiałku muszą znaleźć się w jego
formie ostatecznej – niektóre z powstałych peptydów mogą ulec odrzuceniu jako nieaktywne
biologicznie. Mogą one mieć jednak dużą wartość diagnostyczną, gdyż ich poziom koreluje z ilością
synetyzowanego endogennie probiałka – np. oznaczanie peptydu C w cukrzycy czy NT-proBNP w
niewydolności krążenia. Podstawową konsekwencją swoistej proteolizy jest uzyskanie przez białko
nowej konformacji, co w przypadku enzymów oznacza odsłonięcie miejsca katalitycznego. Synteza
probiałek ma istotne znaczenie fizjologiczne – w takiej formie syntetyzowane są białka
wykorzystywane przez organizm jedynie czasowo – w razie potrzeby; wówczas jednak są one
potrzebne natychmiast, wobec czego synteza de novo z aa trwałaby zbyt długo – do tego czasu albo
minęłoby zapotrzebowanie na dane białko, albo doszłoby do uszkodzenia komórek i synteza okazałaby
się spóźniona. Ponadto pewne reakcje zachodzące z udziałem białek wymagają precyzyjnej koordynacji
czasowej. Inną przyczyną syntezy proenzymów jest ochrona syntetyzującej je tkanki przed
samostrawieniem (np. przedwczesna aktywacja zymogenów hydrolaz trzustkowych jest elementem
patogenezy ostrego zapalenia tego narządu). Do białek syntetyzowanych w formie prekursorów zalicza
się: insulinę, pepsynę i proteazy trzustkowe – trypsynę, chymotrypsynę, elastazę, karboksypeptydazę
(patrz punkt VI-1-a), kolagen (patrz punkt VII-8-b) oraz niektóre czynniki krzepnięcia krwi (patrz punkt
VII-4-e).

Cząsteczki białek mogą podlegać różnorodnym modyfikacjom kowalencyjnym – czy to w celu zmiany
ich struktury (glikozylacja, hydroksylacja, acylacja), czy też regulacji ich aktywności (metylacja, ADP-
rybozylacja, fosforylacja). Najczęściej spotykanym mechanizmem jest tu odwracalna fosforylacja.
Reakcje fosforylacji białek katalizowane są przez enzymy – kinazy białek (białkowe), które przenoszą
grupę γ-fosforanową z ATP na reszty aa zawierające grupy hydroksylowe, tj. Ser, Thr lub Tyr; bardzo
rzadko w przyrodzie modyfikacji tej podlegają reszty His, Lys, Arg czy Asp. Zasadniczo reakcje
dotyczą reszt aa odległych o miejsca katalitycznego, stąd miejsca fosforylacji mogą być uznawane za
pewną formę miejsc allosterycznych. Reszta fosforanowa może zostać odłączona w wyniku hydrolizy,
katalizowanej przez fosfatazy białek. Typowa komórka ludzka posiada tysiące białek podlegających

- -

40

regulacji przez odwracalną fosforylację oraz kilkaset odpowiednich kinaz i fosfataz – świadczy to o
prostocie i użyteczności tego mechanizmu, stąd też jest on najczęściej spotykanym. Reszty fosforanowe
są bardzo skutecznymi modyfikatorami struktury III-rzędowej i funkcji białek, m. in. dzięki obecności
ładunku elektrycznego (-2 w fizjologicznym pH) oraz tworzeniu wiązań jonowych w resztami Arg.
Fosforylacja może zmieniać sprawność katalityczną, powinowactwo do substratu, lokalizację
wewnątrzkomórkową lub wrażliwość na efektory allosteryczne. Jedne białka wykazują większą
aktywność w formie ufosforylowanej, podczas gdy inne w zdefosforylowanej.
Nie wszystkie białka podlegają odwracalnej fosforylacji; podobnie w białkach fosforylowanych nie
ulegają tej reakcji wszystkie dostępne grupy hydroksylowe. Ogólnie białka mogą być fosforylowane w
różnych miejscach i przez różne kinazy (por. regulacja syntazy glikogenowej – punkt IV-5-c), z kolei
poszczególne kinazy i fosfatazy modyfikują zazwyczaj więcej niż jedno białko, same podlegając
regulacji przez przekaźniki II rzędu lub również odwracalną fosforylację. W ten sposób mogą powstać
regulacyjne kaskady kinaz / fosfataz, w których jedne enzymy uaktywniają lub pozbawiają aktywności
kolejne, podczas gdy ostatni modyfikuje aktywność właściwego białka o aktywności enzymatycznej
(por. regulacja reduktazy HMG-CoA – punkt V-8-a; jeszcze lepiej jest to widoczne na przykładzie
kinaz aktywowanych mitogenami – MAPK). Pewne kinazy, same modyfikowane przez odwracalną
fosforylację, posiadają zdolność fosforylacji własnych miejsc allosterycznych (tzw. autofosforylacji) i
zmiany swojej aktywności (np. kinaza tyrozynowa receptora insulinowego – patrz punkt IV-8-b).
W opisany wyżej sposób powstają złożone systemy przekaźników I i II rzędu, kinaz i fosfataz, miejsc
fosforylacji i modyfikacji allosterycznych oraz ostatecznie efektów fosforylacji odpowiednich białek,
umożliwiające szybką i precyzyjną regulację czynności komórek, a przez to adekwatną odpowiedź
ustroju na działanie czynników zewnętrznych. Odwracalne fosforylacje regulują przepływ metabolitów
w organizmie, kierując substraty w kierunku szlaków syntezy związków aktualnie najbardziej
potrzebnych oraz synchronizując anabolim i katabolizm określonych grup substancji.
Uproszczona klasyfikacja kinaz białkowych:

rodzina kinaz serynowo-treoninowych

kinaza białkowa A (PKA) – zależna od cAMP

kinaza białkowa G (PKG) – zależna od cGMP

kinaza białkowa C (PKC) – zależna od Ca

2+

i DAG

kinaza białkowa CaM – zależna od Ca

2+

/kalmoduliny

kinazy zależne od cyklin (CDK)

kinazy aktywowane mitogenami (MAPK)

inne: kinaza białkowa B (PKB, Akt1), kinaza zal. od AMP (AMPK), kinazy syntazy
glikogenowej (GSK)

rodzina kinaz tyrozynowych

receptorowe kinazy Tyr, stanowiące integralną część receptorów katalitycznych, np.
receptora insulinowego czy dla czynników wzrostowych (PDGF, EGF, IGF-1)

cytoplazmatyczne kinazy Tyr (Abl, src)

kinazy mieszane – tzw. o podwójnej specyficzności

5.

Znaczenie diagnostyczne pomiarów aktywności enzymów

Diagnostyka enzymatyczna ma praktyczne zastosowanie w chorobach wątroby, serca, trzustki, mięśni,

krwi, kości oraz w schorzeniach nowotworowych. Każda tkanka jest wyposażona w swoisty dla siebie zestaw
enzymów – w przypadku uszkodzenia lub zaburzenia funkcji danego narządu enzymy w nim występujące
uwalniane są do krwiobiegu. Stopień zwiększenia aktywności enzymatycznych i czas ich utrzymania się w
surowicy zależy od: nasilenia procesów patologicznych, rozległości uszkodzeń tkankowych oraz szybkości
katabolizmu i eliminacji enzymów z osocza. Na tej podstawie często możliwe jest określenie pochodzenia i
stopnia zaawansowania patologii. Dokładniejsze określenie rodzaju uszkodzonego narządu jest możliwe na
podstawie obrazu izoenzymów w surowicy; istotnymi diagnostycznie enzymami występującymi w postaci
izoenzymów są m. in.: CK, ALP oraz LDH.

a)

Ze względu na podstawową lokalizację enzymu oraz wydzielanie go do płynów ustrojowych, wyróżnia
się 3 grupy enzymów:

•

Enzymy wskaźnikowe (indykatorowe) to takie, które po zsyntezowaniu pozostają w obrębie komórki.
Przenikają w bardzo niewielkich ilościach do krwi, co jest wyrazem powolnego, fizjologicznego
obumierania produkujących je komórek. Przez analogię – ich obecność we krwi w stężeniach
przekraczających normę świadczy o nasilonym obumieraniu lub nagłym uszkodzeniu tych komórek.
Niestety większość enzymów indykatorowych jest niespecyficzna tkankowo, dlatego lokalizacja

- -

41

uszkodzenia opiera się na poszukiwaniu enzymu, którego poziom najbardziej przekroczył normę. Do
enzymów wskaźnikowych należą m.in.: aminotransferaza asparaginowa (AspAT), aminotransferaza
alaninowa (AlAT), dehydrogenaza mleczanowa (LDH) oraz kinaza kreatynowa (CK).

•

Enzymy ekskrecyjne syntetyzowane są w komórkach, a następnie wydzielane do przewodów
wyprowadzających (żółć, trzustka, prostata). Enzymy te, podobnie jak wcześniej omówione
wskaźnikowe, nie występują fizjologicznie we krwi w znacznych stężeniach. Gdy jednak taki fakt
nastąpi, świadczy o utrudnieniu w odpływie wydzieliny, najprawdopodobniej spowodowanym
niedrożnością odpowiedniego przewodu wyprowadzającego. Niedrożność może być z kolei
spowodowana blokadą wewnątrz przewodu (np. przez kamień lub guz), uciskiem na przewód z
zewnątrz bądź znacznym poszerzeniem ścian przewodu (np. w wyniku stanu zapalnego). Do enzymów
ekskrecyjnych należą m.in.: fosfataza alkaliczna (ALP), γ-glutamylotranspeptydaza (GGTP) i 5’-
nukleotydaza (5’-NT), określane wspólnie jako markery cholestazy (zastoju żółci), gdyż znaczny
wzrost ich aktywności we krwi towarzyszy niedrożności dróg żółciowych.

•

Enzymy sekrecyjne po zsyntetyzowaniu wydzielane są do krwi, więc występują w niej fizjologicznie w
znaczących ilościach. Stanem patologicznym jest natomiast obniżenie ich aktywności w surowicy,
mogące świadczyć o niewydolności produkującego je narządu. Niektóre z enzymów sekrecyjnych są
specyficzne tkankowo, zatem obniżenie ich poziomu świadczy o uszkodzeniu jednego konkretnego
narządu. Np. pseudocholinosteraza (butyrylocholinoesteraza = BChE) jest swoista dla hepatocytów,
stąd jej niski poziom sugeruje uszkodzenie miąższu wątroby.

•

Enzymy sekrecyjne, występujące we krwi w większych stężeniach niż w tkankach i pełniące w niej
funkcje fizjologiczne, określa się jako funkcjonalne enzymy osocza. Enzymy ekskrecyjne i
wskaźnikowe, występujące we krwi w o wiele mniejszych stężeniach niż w tkankach i nie pełniące w
niej żadnej istotnej roli (poza diagnostyczną), określa się jako niefunkcjonalne enzymy osocza.

b)

enzymy najczęściej oznaczane w praktyce klinicznej

Ogólnie w materiale biologicznym pobranym z ludzkiego organizmu istnieje możliwość oznaczenia

aktywności kilkudziesięciu enzymów. Większość z nich oznacza się jednak rzadko i przy specjalnych
potrzebach, zaś w rutynowej diagnostyce używa się ok. 10 z nich. Są to:

AST, AspAT – aminotransferaza asparaginianowa,

ALT, AlAT – aminotransferaza alaninowa,

LDH – dehydrogenaza mleczanowa,

HBD – dehydrogenaza hydroksymaślanowa,

CK – kinaza kreatynowa,

GGTP – γ-glutamylotranspeptydaza,

ALP – fosfataza alkaliczna,

ACP – fosfataza kwaśna,

AMS – α-amylaza,

LP – lipaza trzustkowa

ChE – esteraza cholinowa, cholinoesteraza

•

dehydrogenaza mleczanowa (LDH)

LDH jest enzymem przekształcającym pirogronian w mleczan lub odwrotnie (patrz punkt IV-4-a).

Aktywność ta nie jest przypisana pojedynczej cząsteczce – LDH posiada 5 izoenzymów, numerowanych kolejno
od 1 do 5. Są to jednak tzw. izoenzymy rzekome, bowiem syntetyzowane są tylko dwa odmienne (różnią się one
strukturą IV-rzędową) łańcuchy polipeptydowe – sercowy (H) oraz mięśniowy (M). Z nich następnie formowane
jest aktywne białko tetrameryczne, w którym oba rodzaje podjednostek mogą występować w dowolnym
składzie. Ponieważ istnieje 5 możliwych kombinacji (HHHH, HHHM, HHMM, HMMM, MMMM), stąd
wyróżnia się 5 izoenzymów rzekomych. Warto zwrócić uwagę, iż LDH wykazuje aktywność jedynie w postaci
tetramerycznej, a pojedyncze podjednostki nie są zdolne do katalizy. Izoenzymy LDH różnią się lokalizacją
tkankową:

LDH

1

– serce, nerki, mózg, erytrocyty,

LDH

2

– mózg, nerki, serce, erytrocyty

LDH

3

– trzustka, płuca, mm. szkieletowe,

LDH

4

– trzustka, nerki, mm. szkieletowe,

LDH

5

– wątroba, mm., skóra

Dwa pierwsze – LDH

1

i LDH

2

– odpowiadają łącznie za ok. 50% aktywności w surowicy. Izoezymy LDH różnią

się również okresem półtrwania – dla LDH

1

wynosi on ok. 100 h, podczas gdy dla LDH

5

– tylko ok. 10 h.

Znaczenie diagnostyczne:

- -

42

Duży wzrost aktywności w surowicy z przewagą izoenzymów 1 i 2 może świadczyć o zawale mięśnia
sercowego. Ze względu na długie T

1/2

tych izoenzymów, zalicza się je do późnych markerów zawału.

Powyższy wynik może również wystąpić w przypadku anemii megaloblastycznej, w przebiegu ostrych
białaczek lub towarzyszyć ciężkim uszkodzeniom nerek.

Duży wzrost aktywności, jednak w przewagą LDH

5

, może występować w chorobach wątroby i/lub mm.

szkieletowych.

Umiarkowany wzrost aktywności jest symptomem nieswoistym – może być obecny przy zawale serca,
WZW lub procesach nowotworowych.

Równoległy wzrost aktywności izoenzomów 1 i 2 oraz narastaniem aktywności 5 przemawiają za
zawałem serca oraz dodatkowym rozwoju zastoju w krążeniu wątrobowym (tym samym rozwoju
niewydolności krążenia) i jest złym objawem prognostycznym.

•

kinaza kreatynowa (CK), kinaza fosfokreatynowa (CPK)

Jest to enzym katalizujący przeniesienie reszty fosforanowej z ATP na kreatynę, dając ADP i

fosfokreatynę oraz reakcję odwrotną (patrz punkt VI-3). CK bierze więc udział w procesach energetycznych –
regeneracji ATP z ADP poprzez wykorzystanie innego związku wysokoenergetycznego, jakim jest
fosfokreatyna, bowiem wiązanie pomiędzy kreatyną a resztą {P} należy do wysokoenergetycznych. Aktywność
CK, podobnie jest obecność kreatyny, są największe w tkance mięśniowej, w tym również w mięśniu sercowym.
CK nie jest jednorodną cząsteczką – posiada 3 izoenzymy: BB – występujący w mózgu, płucach i jelitach oraz
MM i MB – występujące w mm. szkieletowych (gł. MM) i sercu (gł. MB). Fizjologicznie u dorosłych występuje
przede wszystkim CK-MM, stanowiący niemal 100% ogólnej aktywności; u dzieci obecna jest niewielka ilość
CK-MB.

Aktywność CK w surowicy wzrasta po dużych wysiłkach fizycznych – stąd często podwyższony poziom

u sportowców – oraz w szeregu stanów patologicznych:

znaczny (> 5x) wzrost może towarzyszyć stanom takim jak: zawał lub zapalenie mięśnia sercowego,
wstrząs lub niewydolność krążenia oraz dystrofia mm. szkieletowych,

umiarkowany (< 5x) wzrost może świadczyć o: uszkodzeniach mięśni (również w wyniku iniekcji lub
operacji), rozległych uszkodzeniach tkanki nerwowej, chorobie nowotworowej lub alkoholizmie.

Największe znaczenie pomiarom aktywności CK przypisuje się w diagnostyce zawału serca.

Podwyższenie całkowitej aktywności CK pojawia się w ciągu I doby od incydentu ostrego niedokrwienia serca,
a izoenzym CK-MB stanowi jeden z tzw. wczesnych markerów niedokrwienia. Już po 6h trwania zawału
wartość CK-MB wzrasta 10x, po czym wraca do normy ok. 3 dobach; utrzymywanie się podwyższonej
aktywności powyżej 72 h stanowi zły czynnik rokowniczy.

•

aminotrasferazy, transaminazy:
asparaginanowa (AspAT) = Serum Glutamat-Oxalazetat Transaminase (SGOT)
alaninowa (AlAT) = Serum Glutamat-Pyruvat Transaminase (SGPT)

Aminotransferazy katalizują reakcje przeniesienia grupy aminowej – w tym przypadku pomiędzy α-

aminokwasami a α-ketokwasmi (patrz punkt VI-2-a). Należą do enzymów wskaźnikowych (indykatorowych).
Pod względem lokalizacji komórkowej AspAT jest enzymem mitochondrialnym, zaś AlAT – cytozolowym. Ma
to istotne znaczenie diagnostyczne, bowiem przy nieznacznym uszkodzeniu komórek do surowicy przenikają
głównie enzymy cytoplazmatyczne, natomiast przy postępującej destrukcji dołączają do nich również enzymy
mitochondrialne. Transaminazy występują głównie (AlAT wyłącznie) w wątrobie, a pomiar ich aktywności
służy do oceny stopnia uszkodzenia (stan zapalny, marskość) tego narządu. AspAT obecny jest również w
mięśniu sercowym, dlatego jego poziom rośnie wskutek niedokrwienia lub niewydolności serca. Różne możliwe
przyczyny wzrostu aktywności transaminaz osocza przedstawia poniższa tabela.

AspAT

AlAT

duży wzrost aktywności

zawał serca

1

, WZW

2

, toksyczne

uszkodzenie wątroby, ciężka
niewydolność krążenia, hemoliza

WZW, choroby miąższu wątroby,
ciężka niewydolność krążenia

wzrost umiarkowany, nieswoisty

choroby mm. szkieletowych,
cholestaza, niewydolność krążenia
bez zawału, nowotwory wątroby

choroby mm. szkieletowych,
marskość wątroby, żółtaczka
zastoinowa

1

W zawale serca wzrost aktywności transanimaz powyżej 250U świadczy o istnieniu dodatkowych czynników

zwiększających jej poziom np. uszkodzeniu wątroby wywołanego niedotlenieniem.

2

W WZW aktywność transaminaz zaczyna wzrastać na 7-14 dni przed wystąpieniem żółtaczki, zaś szczyt

przypada w okresie żółtaczkowym.

- -

43

•

γ-glutamylotranspeptydaza (GGTP)

GGTP katalizuje tworzenie wiązania peptydowego przez kwas glutaminowy, jednak nie z udziałem jego

grupy α, lecz γ-karboksylowej – w ten sposób uczestniczy w syntezie glutationu (patrz punkty: I-2-c, VII-6-a).
GGTP występuje na ER hepatocytów, w błonie kanalików nerkowych, obecna jest w trzustce i gruczole
krokowym – stanowi nieswoisty enzym wskaźnikowy. Ponadto stanowi enzym ekskrecyjny żółci; w przypadku
niedrożności dróg żółciowych GGTP przenika w zwiększonych ilościach do krwi, dlatego stanowi jeden z tzw.
markerów cholestazy. Osoczowa aktywność GGTP wzrasta w bardzo wielu stanach patologicznych, do których
zaliczamy: zastoinowe choroby wątroby, ch. dróg żółciowych, ch. nowotworowe wątroby i trzustki oraz stany
zapalne trzustki. Enzym ten indukowany jest przez estrogeny, barbiturany (leki uspokajająco-nasenne) oraz
alkohol. Jego poziom podwyższa się w przewlekłym alkoholizmie, zaś wraca do normy po 2 – 5 tyg.
abstynencji, stąd GGTP służy do monitorowania terapii odwykowej uzależnienia od alkoholu.

•

dehydrogenaza glutaminianowa (GLD)

GLD katalizuje reakcję deaminacji kwasu glutaminowego (patrz punkt VI-2-b). Jest enzymem swoistym

dla hepatocytów – oznaczenie aktywności w surowicy, wraz z transaminazami, pomaga w diagnostyce
różnicowej chorób wątroby. Wysoki wzrost aktywności może towarzyszyć śpiączce wątrobowej, chorobom
miąższowym wątroby (np. przewlekłemu stanowi zapalnemu) lub żółtaczce zastoinowej. Umiarkowany wzrost
świadczy często o nowotworze wątroby – pierwotnym bądź przerzucie.

•

fosfataza zasadowa = alkaliczna (ALP)

ALP posiada kilka izoenzymów: kostny (B), wątrobowy (L), jelitowy (J) i łożyskowy (P). U dorosłych

dominuje ALP-L, stanowiący ok. 50 % ogólnej aktywności ALP w surowicy, u dzieci znaczny udział ma ALP-B
(ze względu na szybki wzrost i aktywność metaboliczną kości), zaś u ciężarnych ok. 48 % aktywności ALP
przypada na izoenzym P – z jego powodu w III trymestrze ciąży wzrasta całkowita aktywność ALP. Jest
enzymem wskaźnikowym chorób narządów, od których biorą nazwy izoenzymy, a także nerek i śledziony. Jest
również enzymem ekskrecyjnym żółci i – podobnie jak GGTP – stanowi marker cholestazy.

Aktywność ALP wzrasta w dwojakiego rodzaju patologiach. Pierwsze z nich to zaburzenia funkcji

wątroby – wówczas wzrost pochodzi od izoenzymu L, a dodatkowo rośnie GGTP; mogą to być: WZW, ostre lub
przewlekłe uszkodzenie toksyczne bądź przerzuty nowotworowe. Druga grupa obejmuje choroby kości,
zwłaszcza przebiegające z zahamowaniem ich wzrostu – wówczas wzrost ALP pochodzi od izoenzymu B, zaś
aktywność GGTP nie odbiega od normy. Zaliczmy tu: krzywicę, chorobę Pageta, przerzuty nowotworowe do
kości oraz demineralizację tkanki kostnej w przebiegu nadczynności przytarczyc.

•

fosfataza kwaśna (ACP)

ACP należy do enzymów indykatorowych takich narządów jak: wątroba, nerki, śledziona, trzustka, jelita,

kości, erytrocyty i trombocyty; ponadto jest enzymem ekskrecyjnym, obecnym w wydzielinie gruczołu
krokowego. U dorosłych mężczyzn ok. 30 % aktywności APC stanowi właśnie izoenzym sterczowy. U dzieci w
okresie pokwitania, ze względu na szybki wzrost, aktywność ACP jest kilkukrotnie (2 – 5 x) większa niż u
dorosłych. Podstawową rolę diagnostyczną ACP pełni w diagnostyce schorzeń prostaty – przerostu, zapalenia
czy nowotwory; w tym ostatnim przypadku obserwuje się wzrost całkowitej aktywności ACP, jak również
izoenzymu sterczowego – PAP. Aktywność ACP może również przekraczać normę w takich stanach jak:
choroby kości (osteoporoza, ch. Pageta, przerzuty nowotworowe, nadczynność przytarczyc), nowotwory sutka
lub jelit oraz nadmierny rozpad elementów krwi: hemoliza, anemia megaloblastyczna czy trombopatie.

•

α-amylaza (AMS), diastaza

AMS katalizuje hydrolizę wiązań 1,4-glikozydowych w polisacharydach (patrz punkt IV-2). Jest

enzymem ekskrecyjnym, wydzielanym do śliny (izoenzym S), soku trzustkowego (izoenzym P) oraz jelitowego.
Pomiary aktywności osoczowej AMS wykorzystywane są gł. w diagnostyce zaburzeń przewodu pokarmowego,
a zwłaszcza chorób trzustki. Znaczny wzrost aktywności AMS obserwuje się w przebiegu ostrego zapalenia
trzustki (OZT) bądź zaostrzenia przewlekłego stanu zapalnego tego narządu (PZT). Ponadto wysoki poziom
AMS stwierdza się w makroamylazemii oraz ciężkiej niewydolności nerek. α-amylaza jest białkiem
małocząsteczkowym, dlatego jako jedyny z enzymów fizjologicznie ulega przesączaniu kłębuszkowemu,
utrzymując się w moczu dłużej niż we krwi, co poszerza możliwości diagnostyczne. Nieswoisty wzrost
aktywności AMS towarzyszy wielu patologiom przewodu pokarmowego, m. in.: urazom jamy brzusznej,

- -

44

marskości wątroby, ostremu zapaleniu pęcherzyka żółciowego, perforacji wrzodu trawiennego, zapaleniu
otrzewnej, a także chorobom ślinianek (np. nagminnemu zapaleniu przyusznic – tzw. śwince).

•

lipaza trzustkowa (LP)

LP katalizuje hydrolizę tłuszczów pokarmowych – odszczepia kwasy tłuszczowe z cząsteczek

trójacylogliceroli (TAG) (patrz punkt V-2). Jest to enzym ekskrecyjny, podobnie jak AMS występujący w soku
trzustkowym, lecz w odróżnieniu od niej tylko w nim. LP stanowi zatem bardziej swoisty marker OZT niż AMS.
Aktywność LP w surowicy wzrasta w przebiegu stanów zapalnych i nowotworów trzustki, cholestazy
pozawątrobowej z zajęciem trzustki, chorobach z objawami „ostrego brzucha” (np. ostra niedrożność jelit),
niewydolności nerek (rzadko) oraz w wyniku farmakoterapii hepatyną (lek obniżający krzepliwość krwi) lub
lekami p/bólowymi (analgetykami).

•

esteraza cholinowa, cholinoesteraza (ChE)

Cholinoesteraza syntetyzowana jest w wątrobie, po czym uwalniana do łożyska naczyniowego (enzym

sekrecyjny). Występuje w dwóch formach: pierwszą jest swoista ChE – acetylocholinoesteraza (AChE), obecna
na błonach postsynapycznych synaps cholinergicznych, zakończeniu neuronów cholinergicznych oraz na
powierzchni erytrocytów, gdzie hydrolizuje rozkład acetylocholiny (ACh) uwalnianej z neuronów
cholinergicznych. Drugą jest nieswoista ChE – psuchocholinoestreraza, butyrylocholinoesteraza (BChE),
występująca w mózgu, wątrobie, skórze, mięśniówce gładkiej przewodu pokarmowego oraz w surowicy, gdzie
katalizuje rozkład wielu substancji, m. in. kilku leków – w tym suksametonium (sukcynylocholiny).

Pomiar aktywności ChE w osoczu służy ocenie zdolności wątroby do syntezy tego enzymu. Aktywność

ChE zmniejsza się w chorobach miąższu wątroby (np. zapaleniu) oraz w zatruciu związkami
fosforoorganicznymi (pestycydy, gazy bojowe), które blokują zdolność katalityczną enzymu. Znane są
przypadki wrodzonego niedoboru aktywności ChE – dotknięta tym zaburzeniem osoba zazwyczaj nie ma o nim
pojęcia, gdyż brak enzymu nie jest na co dzień uciążliwy, jednak istnieje wówczas ryzyko ciężkiego zatrucia
pewną grupą leków zwiotczających – gł. wspomnianą sukcynylocholiną. Przy normalnej aktywności ChE
działanie zwiotczające tego leku utrzymuje się przez czas rzędu minut, podczas gdy przy braku ChE efekt może
utrzymywać się przez wiele tygodni.

Wzrost aktywności ChE występuje w zespole nerczycowym, nadczynności tarczycy (hipertyreozie) oraz

w okresach rekonwalescencji po uszkodzeniach wątroby.

•

lipaza lipoproteinowa (LPL)

LPL katalizuje hydrolizę TAG do kwasów tłuszczowych i glicerolu. Jest to enzym sekrecyjny, którego

pomiary są przydatne w różnicowaniu zaburzeń gospodarki lipidowej (lipoproteinowej).

•

enolaza

Enolaza należy do enzymów szlaku glikolizy – katalizuje dehydratację 3-{P}-glicerynianu do {P}-

enolopirogronianu (PEP) (patrz punkt IV-4-a). Występuje w postaci trzech izoenzymów: α jest pospolity –
występuje we wątrobie, nerkach i płucach, β – w mm. szkieletowcyh, zaś γ – w neuronach (ang. neuron-specyfic
enolase = NSE). Ten ostatni ma szczególne znaczenie w diagnostyce onkologicznej, stanowi bowiem marker
raka drobnokomórkowego płuc oraz neuroblastoma.

c)

panele enzymatyczne

Jak widać na powyższych przykładach, enzymy i narządy ludzkiego ciała nie są do siebie swoiście

dopasowane – każdy z organów posiada cały zestaw enzymatyczny, zaś poszczególne enzymy produkowane są
przez różnorodne tkanki. Aby zatem móc lepiej ocenić stan pojedynczego narządu, oznacza się aktywność nie
jednego, lecz kilku enzymów wytwarzanych i uwalnianych przez ten narząd. Odnosi się to zwłaszcza do wątroby
i mięśni (szkieletowych oraz sercowego). Powstają w ten sposób zestawienia, określane jako narządowe panele
lub profile enzymatyczne. Proporcje zmian aktywności enzymów są niezwykle pomocnymi informacjami
diagnostycznymi, przyjmują bowiem określone wartości w szeregu patologii.

- -

45

•

panel enzymów wątrobowych

AST

ALT

GLD

GGTP

ALP

ChE

ostre zapalenie

↑↑↑

↑↑↑

↑↑

↑↑

↑↑

0

przewlekle zapalenie

↑↑

↑↑

↑

↑↑↑

↑

↓

cholestaza

↑

↑

↑↑

↑↑↑↑

↑↑↑↑

0

marskość

↑↑↑

↑

0

↑↑

↑

↑↑

nowotwór

↑

↑

↑↑

↑↑↑↑

↑

↓ / 0

•

panel enzymów mięśni szkieletowych

CK-MM

LDH

5

ALT, AST

dystrofia Duchenne'a (DMD)

↑↑↑

↑↑↑

↑

miopatia

↑

↑↑↑

↑↑

neurogenne zapalenie mięśni

0

↑↑↑

↑

•

panel enzymów sercowych*

CK

AST

ALT

LDH

1

wczesny okres zawału

↑↑

↑

↑

0

późny okres zawału

↑

↑

↑

↑↑

niewydolność krążenia (bez zawału)

0

↑

↑

↑

* – Przedstawiony panel jest już przestarzały – obecnie w diagnostyce zawału mięśnia sercowego oznacza się we
krwi poziomy markerów wczesnych: sercowej troponiny I (cTpI; patrz punkt VII-7), CK-MB metodą „mass”
(pomiar stężenia enzymu, a nie jego aktywności) oraz mioglobiny (nie zawsze). Natomiast w niewydolności
krążenia oznacza się we krwi stężenie N-końcowego fragmentu prekursora mózgowego peptydu
natriuretycznego (NT-proBNP).

d)

Pomiary aktywności enzymów są również wykorzystywane jako narzędzie diagnostyczne w onkologii:

enzym

nowotwór

uwagi

ALP-B

nowotwory kości pierwotne i przerzuty do kości

↑ Ca

2+

i Pro-OH w moczu

ALP-L

pierwotny nowotwór wątroby, przerzuty do wątroby, ucisk

guza na przewody żółciowe

mała specyficzność diagnostyczna

ALP-P

rak jajnika

ACP

1

zaaw. rak prostaty z przerzutami (tkanki miękkie, kości)

powtórny wzrost po terapii –

wznowa

5'-NT

przerzuty do wątroby

pojawia się wcześniej niż ↑ ALP i

inne objawy kliniczne

GGTP

pierwotne nowotwory wątroby lub przewodu

pokarmowego, rak jajnika

AMS, LP

rak trzustki

AMS

2

surowiczy rak jajnika

PSA

3

rak prostaty

czułość diagnostyczna 99%

1

– izoenzym sterczowy

2

– izoenzym śliniankowy

3

– PSA = prostate-specyfic antigene (proteaza serynowa produkowana wyłącznie przez nabłonek kanalików

nasiennych)

- -

46

ROZDZIAŁ III – TRANSPORT PRZEZ BŁONY

I UTLENIANIA BIOLOGICZNE

1.

Budowa i funkcje błon biologicznych

a)

skład błon

Składnikami błon biologicznych są: lipidy, białka i węglowodany.

Wśród lipidów błonowych wyróżniamy:

•

fosfolipidy – związki tłuszczowe zawierające dołączoną resztę fosforanową; dzielą się one dalej na:

fosfoglicerydy, złożone z glicerolu, do którego dołączone są (do C

1

i C

2

) dwie reszty kwasów

tłuszczowych długości 16 – 18 atomów C oraz reszta fosforanowa (do C

3

), a do niej – alkohol;

alkohole występujące w fosfolipidach to: etanoloamina, cholina, seryna (Ser), glicerol i inozytol
(patrz również punkt V-1-e)

sfingomieliny, złożone z ceramidu, reszty fosforanowej i choliny; sam ceramid składa się ze
sfingozyny i reszty KT

•

glikosfingolipidy – lipidy zawierające sfingozynę oraz fragment węglowodanowy; wyróżniamy 3 ich
podgrupy:

cerebrozydy – sfingozyna, z dołączoną resztą KT, łączy się ponadto z cząsteczką heksozy
(monosacharyd C6)

globozydy – j. w., ale zamiast czystej reszty cukrowej występuje cząsteczka aminocukru (patrz
punkt IV-7-a)

gangliozydy – jak cerebrozydy, z tym że nie z pojedynczą cząsteczką cukru, a z całym łańcuchem
heksoz, wśród których może występować kwas sialowy (SA; por. punkt IV-1-c)

•

sterole, przy czym gł. cholesterol

Zjawisko poprzecznej asymetrii lipidowej błon polega na różnicy składu lipidów warstwy zewnętrznej i

wewnętrznej błony. W warstwie zewnętrznej występuje cholesterol oraz fosfolipidy zawierające cholinę –
sfingomielina (Sph) i fosfatydylocholina (PC), natomiast w wewnętrznej – fosfolipidy posiadające grupę
aminową – fosfatydyloseryna (PS) oraz fosfatydyloetanoloamina (PE).

Dojrzałość płuc wcześniaków ocenia się na podstawie stosunku stężenia lecytyny do sfingomieliny w

płynie owodniowym.

Białka błon komórkowych mogą być rozmaicie zlokalizowane i pełnić różnorakie funkcje. Problem

odpychania się wiązań peptydowych – o charakterze hydrofilowym – oraz dwuwarstwy lipidowej
(hydrofobowej) rozwiązywany jest przez zwinięcie łańcucha w strukturę α (α-helisę; por. punkt I-3-c). Białka
błonowe mogą pełnić m. in. funkcje: strukturalne, transportujące, enzymatyczne, receptorowe i antygenowe.

Białka mogą być połączone z błoną na dwa sposoby. Białka peryferyjne są związane z błoną w sposób

nietrwały; często łączą się z białkami integralnymi. Te ostatnie są bowiem trwale związane z błonami, gdyż
przechodzą przez dwuwarstwę lipidową (stąd określenie: przezbłonowe). Białka integralne klasyfikuje się ze
względu na ilość razy i sposób przekraczania błony:

•

jednokrotnie przechodzące przez błonę, z N-końcem na zewnątrz, np. receptor LDL (por. punkt V-3-b)

•

jednokrotnie przechodzące przez błonę, z C-końcem na zewnątrz, np. receptor asjaloglikoproteinowy
(por. punkt IV-7-b)

•

wielokrotnie przechodzące przez błonę, np. błonowy przenośnik glukozy (GLUT; por. punkt IV-3-a)

Niektóre białka enzymatyczne zlokalizowane są wyłącznie w niektórych błonach, stanowiąc ich markery.

Markerami błony plazmatycznej są: 5’NT, AC i Na

+

/K

+

-ATPaza, ER – glukozo-6-fosfataza, wewnętrznej błony

mitochondrialnej – syntaza ATP, aparatu Golgiego (odpowiednio: cis, środkowego, trans i TGN) – transferazy:
GlcNAc I, Golgi mannozydaza II, Gal i SA.

Związki węglowodanowe są jedynym składnikiem błony, którego skład zależy nie od samej komórki,

lecz od jej otoczenia. Cukry związane są głównie z białkami błonowymi, tworząc N- lub O-glikoproteiny.

- -

47

b)

funkcje błon

Dzięki istnieniu błon komórkowych możliwe jest oddzielenie od siebie poszczególnych komórek

organizmu (ich indywidualizacja), a tym samym stworzenie bariery pomiędzy wnętrzem a zewnętrzem każdej z
nich. To ostatnie pozwala m. in. na utrzymywanie różnic stężeń substancji we wnętrzu i na zewnątrz komórek,
co wiąże się z ich pobudliwością i regulacją aktywności. Błony istniejące w obrębie komórki wydzielają w niej
sektory, w których mogą zachodzić wzajemnie przeciwstawne procesy biochemiczne (kompartmentacja – por.
punkt II-1-f). Obłonione organella komórkowe mogą sprawniej regulować transport substancji przezeń
zużywanych lub produkowanych. Błony nie służą jednak wyłącznie celom podziału środowiska na mniejsze
części – umożliwiają one wymianę substancji między komórkami (złącza szczelinowe) oraz percepcję sygnałów
docierających do komórki (receptory)

2.

Transport przez błony biologiczne – klasy białek transportujących

Transport przez błony biologiczne można generalnie podzielić na bierny i aktywny. Kryterium tego

podziału stanowi kierunek transportu oraz niezbędność energii chemicznej. Transport bierny nie wymaga
nakładu energii i zachodzi zgodnie z gradientem stężeń substancji, natomiast transport aktywny nie może
odbywać się bez dostarczania energii i transportuje związki chemiczne w kierunku przeciwnym do ich gradientu
po obu stronach błony. Transport bierny – dyfuzja przez błony – może odbywać się na dwa sposoby: jako
dyfuzja prosta lub ułatwiona.

Dyfuzja prosta może z kolei polegać albo na bezpośrednim przenikaniu substancji przez błonę albo na

przechodzeniu przez specyficzne białka błonowe – kanały. Zdolność do bezpośredniego przenikania przez błony
posiadają cząsteczki obojętne chemicznie – woda, obojętne gazy oddechowe oraz związki lipofilne – steroidy.
Możliwości takiej pozbawione są cząstki naładowane – jony – które ze względu na swój ładunek nie mogą
przeniknąć w dowolnym miejscu przez hydrofobową błonę, a jedynie przejść przez specyficzne kanały. Z uwagi
na fakt, że kanały służą głównie do transportu jonów, używa się pojęcia: kanały jonowe.

a)

kanały jonowe

Zgodnie z ideą transportu biernego, kanały umożliwiają jonom przepływ w kierunku zgodnym z ich

gradientem (tzn. z tej strony błony, gdzie odpowiednich jonów jest więcej, na stronę, gdzie jest ich mniej).
Prędkość przepływu jest relatywnie wysoka – zbliżona do dyfuzji i osiąga nawet 10

6

-10

7

jonów na sekundę (są

to wartości 10

3

x większe niż w przypadku innych białek transportowych – wymienników i pomp – por. dalej).

Pomimo tego kanały cechuje zazwyczaj wysoka wybiórczość – zazwyczaj przepuszczają one tylko jeden
określony rodzaj jonu, toteż często klasyfikuje się je na podstawie rodzaju transportowanych jonów (istnieją tu
wyjątki, np. kanały kationowe).

Kanały potrafią do pewnego stopnia kontrolować swoją pracę – mianowicie mają możliwość

występowania w różnych stanach konformacyjnych: otwartym, zamkniętym i gotowości. Wyjściowo kanał
znajduje się w stanie gotowości do otwarcia (nie przepuszcza jonów). Pod wpływem pewnych czynników może
on przejść w stan otwarty – wówczas jony mogą przez niego swobodnie przepływać. Po pewnym czasie,
indywidualnym dla danego typu kanału, stan otwarty spontanicznie przechodzi w stan zamknięty. Ten ostatni
różni się od stanu gotowości brakiem wrażliwości na bodźce otwierające. Ostatecznie kanał przechodzi ze stanu
zamkniętego w stan gotowości, zamykając cykl pracy. Wspomniane czynniki pobudzające kanały do otwarcia są
podstawą ich klasyfikacji na: bramkowane napięciem (potencjałem) na błonie, bramkowane ligandem oraz
bramkowane naprężeniem mechanicznym.

Kanały zbudowane są z kilku przezbłonowych podjednostek białkowych, z których każda może posiadać

kilka przezbłonowych domen. Kanały bramkowane ligandem mogą funkcjonować jako receptory
neuroprzekaźników – wówczas receptory takie określa się jako jonotropowe. Przykładem tego ostatniego jest
receptor acetylocholinowy typu N. Ma on budowę pentameru, złożonego z czterech rodzajów podjednostek
transbłonowych, występujących w stosunku stechiometrycznym α

2

βγδ. Każda podjednostka składa się z kilku

segmentów; szczególne znaczenie mają segmenty m

2

podjednostek, budujące właściwą część kanału. Ligand –

ACh – przyłączany jest jednocześnie do miejsc złączy α-γ i α-δ (do otwarcia kanału potrzebne jest związanie
dwóch cząsteczek ACh). Indukuje to zmiany konformacyjne, których efektem jest otwarcie kanału dla jonów
Na

+

i Ca

2+

. Natychmiastowy napływ kationów do wnętrza komórki powoduje jej szybką depolaryzację – tzw.

szybki pobudzający potencjał postsynaptyczny (fEPSP). Fizjologicznie powoduje to: skurcz mm. szkieletowych,
pobudzenie neuronu zazwojowego (przekaźnictwo zwojowe) oraz uwalnianie amin katecholowych z rdzenia
nadnerczy.

W odróżnieniu od w/w, kanały Na

+

i K

+

błony są bramkowane napięciem na błonie, czyli różnicą

potencjałów elektrycznych po obu jej stronach. W stanie wyjściowym błona komórkowa jest spolaryzowana
(posiada tzw. potencjał spoczynkowy), a kanały są wówczas zamknięte. Odpowiedniego stopnia depolaryzacja

- -

48

błony, np. pod wpływem impulsu nerwowego, powoduje otwarcie tych kanałów i przepływ jonów zgodnie z
kierunkiem wyznaczonym przez gradient. Zjawisko to jest podstawą powstawania potencjału czynnościowego w
komórkach pobudliwych (tj. nerwowych, mięśniowych i gruczołowych).

Kanał Na

+

jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym o masie 260 kDa; jego końce N i C znajdują się

w środku komórki, a pętle wystają z obu stron błony. Składa się z 4 powtarzających się podjednostek, z których
każda złożona jest z 6 α-helikalnych przezbłonowych domen. Por kanału zlokalizowany jest między helisami 5 i
6, ma szerokość 5 – 8 nm i od strony światła zawiera kwasowe (naładowane ujemnie) reszty aa.

Kanał K

+

jest teramerem zbudowanym analogicznie jak kanał Na

+

. Podjednostki kanału tworzą por w

kształcie stożka, biegnącego przez środek i zwężającego się od strony wewnętrznej; por i jego ujście wypełnione
są cząsteczkami wody. W najwęższym (0,3 nm) punkcie kanału jon K

+

ma możliwość przeciśnięcia się tylko pod

warunkiem pozbycia się otoczki hydratacyjnej; odcinek ten, utworzony przez 5 reszt aa (Thr-Val-Gly-Tyr-Gly),
pełni rolę filtra selektywności kanału, preferując właśnie K

+

, tak iż przepuszczalność dla Na

+

(który ma przecież

mniejszą średnicą) jest 100 x mniejsza. Okazuje się, że względnie niewielkie rozmiary jonu Na

+

uniemożliwiają

mu swobodne interakcje z obecnymi we filtrze atomami tlenu, które są tak ułożone przestrzennie, że uwalniają
jon K

+

z otoczki wodnej, ale nie mogą zrobić tego samego z Na

+

. Jon Na

+

pozostaje więc uwodniony i – jako

zbyt szeroki – nie przechodzi przez kanał. Jon K

+

, po przejściu przez filtr selektywności, wchodzi w drugie

miejsce wiązania, cechujące się nieco większym powinowactwem. Jednak energia wiązania tego miejsca
unieruchamia jon, zamykając go w pułapce. Dopiero, gdy kolejny jon K

+

zostanie związany z pierwszym

miejscem, następuje ich elektrostatyczne odpychanie i pierwszy z jonów zostaje uwolniony na drugą stronę
błony. Inaktywacja kanału K

+

zachodzi przez zamknięcie jego poru (obrazuje to tzw. model kuli na łańcuchu).

Niektóre drobnoustroje posiadają zdolność syntezy jonoforów – substancji bezpośrednio przenoszących

jony przez błonę lub tworzących w niej kanały jonowe. Związki takie, wbudowując się w obręb błon i
zaburzając ich wybiórczość transportową, mogą prowadzić do śmierci komórek. Z tego powodu stosowane są
jako antybiotyki – np. walinomycyna czy gramicydyna A i S (patrz punkt I-2-c).

b)

przenośniki transbłonowe – translokazy

Drugim rodzajem transportu biernego jest dyfuzja ułatwiona. Podobnie jak wcześniej opisana dyfuzja

prosta, tak też dyfuzja ułatwiona zachodzi z udziałem specyficznych transbłonowych białek transportowych – tu
określanych jako przenośniki (translokazy; biorą one udział również w transporcie aktywnym). Przenośniki służą
generalnie do transportu związków większych niż jony pojedynczych atomów – np. reszt fosforanowych,
kwasów karboksylowych, aminokwasów, węglowodanów, kwasów tłuszczowych i nukleotydów. Wnika z tego,
iż pełnią one rolę m. in. w transporcie cząsteczek podstawowych składników pokarmowych.

Mechanizm dyfuzji ułatwionej wykazuje pewne podobieństwa z interakcją enzymu i substratu:

istnieje swoiste miejsce wiązania przenoszonej cząsteczki,

przy pewnym stężeniu substratu białko transportowe ulega wysyceniu (v

max

),

istnieje określona stała wiązania (K

M

),

transport może ulec zahamowaniu przez inhibitory kompetycyjne.

Między tymi procesami występują również pewne różnice – np. dyfuzja ułatwiona odbywa się bez

interakcji kowalencyjnej białka transportującego z przenoszoną cząstką. Translokazy występują w dwóch
podstawowych stanach konformacyjnych – gotowości do związania oraz uwalniania przeniesionego związku, a
cykl ich pracy polega na ciągłym przeskakiwaniu między nimi – przypomina to nieco mechanizm reakcji ping-
pong. Szybkość transportu przez przenośnik zależy od gradientu stężenia przenoszonej substancji po obu
stronach błony. Aktywność transporterów może podlegać regulacjom hormonalnym, np. przenośnik glukozy
GLUT-4 ulega przeniesieniu do błony, gdzie może pełnić swą funkcję, pod wpływem insuliny (patrz punkt IV-
8-b).

Ze względu na ilość cząsteczek transportowanych przez przenośnik w jednym cyklu wyróżniamy 2

rodzaje transportu z udziałem przenośnika: unitransport – gdy na raz przenoszona jest tylko jedna cząstka oraz
kotransport – gdy przenoszone są na raz dwie. Jeżeli obie cząstki przenoszone na zasadzie kotransportu
docelowo znajdują się po jednej stronie błony, to określa się to jako symport, jeżeli zaś po stronach przeciwnych,
to jest to antyport. Przykładem symportu jest przenoszenie glukozy lub aa jednocześnie z kationem Na

+

(por.

punkty IV-3-a i VI-1-a), natomiast antyportu – pompa Na

+

/K

+

(por. dalej).

Szczególną obfitość rodzajów przenośników zawiera błona mitochondrialna. Wszystkie translokazy

mitochondrialne są podobnie zbudowane, tj. z ustawionych szeregowo trzech powtórzeń tandemowych modułu
100 reszt aa; każde z powtórzeń posiada prawdopodobnie 2 elementy transbłonowe. Opis przenośników zawiera
poniższa tabela.

- -

49

Lp.

nazwa przenośnika

rodzaj

kotransportu

wymieniane związki

uwagi i odnośniki

1.

fosforanowy

antyport

H

2

PO

4

-

/ OH

-

2.

pirogronianowy

symport

pirogronian

-

/ H

+

3.

anionów dwukarboksylowych

antyport

jabłczan

2-

lub bursztynian

2-

lub fumaran

2-

/ HPO

4

2-

4.

anionów trójkarboksylowych

antyport

jabłczan

2-

/ cytrynian

3-

+ H

+

5.

α-ketoglutaranowy

antyport

jabłczan

2-

/ ketoglutaran

2-

6.

nukleotydów adeninowych

antyport

ADP

3-

/ ATP

4- *

blokowany przez

atraktylozyd

7.

glutaminowo – asparaginianowy

antyport

glutaminian

2-

/ asparaginian

2-

8.

karnitynowo – acylokarnitynowy

patrz punkt V-5-b

9.

ornitynowy

patrz punkt VI-2-d

10.

aa obojętnych

11.

glutaminowy

*

– Przenośnik ten współdziała z przenośnikiem fosforanowym w elektroobojętnym transporcie substratów do

fosforylacji oksydacyjnej. Tłumaczy to, dlaczego synteza 1 cząsteczki ATP wymaga transportu 4 H

+

– ponieważ

1 z nich zużywany jest na symport z fosforanem nieorganicznym, a 3 – na właściwą fosforylację oksydacyjną, tj.
do pracy syntazy ATP (por. dalej).

c)

pompy jonowe

Transport aktywny różni się od biernego przede wszystkim tym, że aby zachodzić wymaga nakładu

energii swobodnej (na tę formę transportu zużywanych jest 30 – 40 % energii produkowanej przez komórkę).
Jako proces niekorzystny energetycznie wymaga sprzężenia z innym, bardziej korzystnym procesem (procesy
endoergiczne zachodzą wyłącznie wtedy, jeśli są sprzężone z procesami egzoergicznymi) – tym ostatnim może
być hydroliza ATP, ruch elektronów lub światło (u roślin).

Transport aktywny wykazuje pewne podobieństwa z dyfuzją ułatwioną:

oba przebiegają z udziałem białek transportowych, występujących w dwóch stanach konformacyjnych
(w przypadku transportu aktywnego nie są to translokazy, lecz pompy – por. dalej),

wykazują swoistość względem jonów, aa i węglowodanów,

wykazują cechy reakcji enzymatycznej, choć bez interakcji kowalencyjnych (por. wyżej).

Główne różnice pomiędzy nimi polegają na tym, że transport aktywny jest jednokierunkowy (a dyfuzja

ułatwiona – dwukierunkowa) oraz że zachodzi on zawsze przeciwnie do kierunku wyznaczonego przez gradient
stężeń (właśnie do jego przełamania wymagana jest energia).

Jak wspomniano, białkami aktywnie transportującymi cząsteczki przez błonę są pompy. Wyróżnia się

dwa rodzaje pomp wykorzystujących ATP – ATP-azy typu P oraz białka ABC – pompy posiadające kasetę
wiążącą ATP (ang. ATP binding cassette = ABC). Te pierwsze ulegają fosforylacji w miejscu specyficznej
reszty Asp i mogą podlegać zmianom konformacyjnym; cykl ich pracy przedstawia się następująco:

pompa w wyjściowym stanie konformacyjnym wiąże cząsteczki: ATP oraz substancji przenoszonej –
np. jonu,

ATP ulega rozszczepieniu, a jego grupa γ-fosforanowa – przeniesieniu na specyficzną resztę Asp,

powyższa fosforylacja przesuwa równowagę w kierunku drugiego stanu konformacyjnego, co
powoduje wyeksponowanie miejsca wiązania po drugiej stronie błony, pozwalając przenoszonej cząstce
na odłączenie się,

niższe powinowactwo pompy do jonu w drugim stanie konformacyjnym powoduje ich dysocjację,

wraz z uwolnieniem jonu uwalniana jest również grupa fosforanowa,

zdefosforylowana pompa powraca do pierwotnego stanu konformacyjnego.

Do pomp typu ATPazy typu P należą m. in.:

Na

+

/K

+

-ATPaza – integralne białko błonowe obecne w większości komórek organizmu, zwłaszcza w

komórkach pobudliwych. Wymaga do pracy obecności fosfolipidów. Posiada miejsca wiążące dla
wszystkich trzech składników, tj. ATP, Na

+

i K

+

. Hydroliza ATP (i praca pompy) zachodzi tylko w

sytuacji, gdy obydwa jony są związane. Podczas jednego cyklu pracy 3 jony Na

+

transportowane są na

zewnątrz komórki, a 2 jony K

+

do jej wnętrza. Pompa sodowo-potasowa jest elektrogenna, tzn. ma

pewien (ok. 10 %) wkład w utrzymywanie błony w stanie spolaryzowanym (utrzymywanie potencjału
spoczynkowego). Pracę Na

+

/K

+

-ATPazy hamują inhibitory – glikozydy nasercowe: ouabaina

(strofantyna – glikozyd skrętnika) oraz digoksyna i digitoksyna (glikozydy naparstnicy), stosowane
jako leki zwiększające kurczliwość mięśnia sercowego, wskazane gł. w stanach jego niewydolności.

- -

50

Ca

2+

-ATPaza – występuje gł. w retikulum sarkoplazmatycznym miocytów. Jej praca polega na

transporcie jonów wapniowych do wnętrza ER, co pozwala na rozkurcz mięśnia. Pod względem
budowy stanowi ona pojedynczy polipeptyd. Posiada 3 domeny cytoplazmayczne pełniące odmienne
funkcje: wiązanie ATP (domena N), przyjmowanie grupy fosforanowej (domena P) oraz regulacja
domeny N (domena A). W czasie pracy następuje zbliżenie domen N i P.

H

+

/K

+

-ATPaza – pompa protonowa obecna w komórkach okładzinowych żołądka. Poprzez transport

protonów do jego światła utrzymuje silnie kwaśny odczyn, pozwalając na aktywację enzymów i
niszcząc bakterie. Jej funkcja jest regulowana przez ACh (receptor M

1

) i histaminę (receptor H

2

).

H

+

-ATPaza – syntaza ATP ma zdolność do hydrolizy ATP i transportu protonów (por. punkt III-6 –

fosforylacja oksydacyjna).

I

-

– pompa jodkowa – występuje w tarczycy, gdzie transportuje aniony jodu do komórek nabłonka

pęcherzyków tarczycowych, umożliwiając ich przenoszenie na aa i syntezę hormonów tarczycy (patrz
punkt VI-3).

Do pomp posiadających kasetę wiążącą ATP należą m. in. białko oporności wielolekowej (ang.

multidrug resistance = MDR) oraz przezbłonowe białko regulacyjne zwłóknienia torbielowatego tj.
mukowiscydozy (ang. cystic fibrosis transmembrane regulator = CFTR). Każde z nich składa się z 4 domen –
dwóch kaset wiążących ATP (ABC) oraz dwóch domen łączących z błoną.

d)

wymienniki

Oprócz opisanych białek transportowych wyróżnia się jeszcze tzw. wymienniki, czyli białka

transportujące II rzędu. Ich wyjątkowość polega na sprzęganiu transportu wbrew gradientowi stężeń jednej
substancji z transportem zgodnym z gradientem innej substancji. Przykładem jest wymiennik Na

+

/Ca

2+

,

wykorzystujący gradient jonów Na

+

do odkomórkowego transportu jonów Ca

2+

(w stosunku stechiometrycznym

3 Na

+

: 1 Ca

2+

). Cechuje się on imponującą wydajnością, może bowiem transportować z prędkością do

2000 jonów/s, podczas gdy Ca

2+

-ATPaza – jedynie 30 jonów/s. Niezbędny do pracy przenośnika gradient jonów

Na

+

utrzymywany jest przez Na

+

/K

+

-ATPazę.

3.

Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne

a)

klasyfikacja oksydoreduktaz

Oksydoreduktazy (EC 1) to enzymy katalizujące reakcje typu redox. Wyróżnia się wśród nich 4 klasy:

oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy.

•

Oksydazy katalizują oderwanie od substratu atomów wodoru i przeniesienie ich na atom tlenu:

AH

2

+ ½ O

2

→ A + H

2

O

AH

2

+ ½ O

2

→ A + H

2

O

2

Przykładem oksydazy jest oksydaza cytochromowa. Oksydazy są metaloflawoproteinami, gdyż
wymagają do katalizy atomów metali (Fe, Cu) oraz grup prostetycznych w postaci nukleotydów
flawinowych.

•

Dehydrogenazy, w przeciwieństwie do oksydaz, nie mogą używać tlenu jako akceptora atomów
wodoru, przenoszą je natomiast z jednego substratu na drugi:

AH

2

+ B → A + BH

2

Przykładem dehydrogenaz są cytochromy: b, c

1

, c i a; zawierają one atom Fe, a ich funkcją jest

transport elektronów pomiędzy flawoproteinami a oksydazą cytochromową. Niektóre z dehydrogenaz
posiadają flawinowe grupy prostetyczne, inne zaś wymagają obecności koenzymów
nikotynamidowych.

•

Peroksydazy – rozkładają nadtlenki, przez co chronią ustrój przed skutkami stresu oksydacyjnego (por.
punkt III-7 – ochrona przed RFT).

Klasyczne peroksydazy utleniają pewien substrat, w celu uzyskania atomów wodoru do redukcji atomu
tlenu w cząsteczce nadtlenku wodoru:

H

2

O

2

+ AH

2

→ A + 2 H

2

O.

Tak działa np. peroksydaza glutationowa.

Katalaza (CT) – zawiera 4 grupy hemowe; katalizuje reakcję dysproporcjonowania nadtlenku wodoru i
nie wymaga dodatkowych substratów:

2 H

2

O

2

→ 2 H

2

O + O

2

- -

51

•

Oksygenazy – katalizują bezpośrednie przeniesienie i przyłączenie tlenu do cząsteczki substratu;
uczestniczą w reakcjach syntezy lub degradacji metabolitów.

Dioksygenazy przyłączają oba atomy tlenu do cząsteczki substratu:

A + O

2

→ AO

2

.

Przykładem jest dioksygenaza homogentyzynowa (enzym biorący udział w szlaku katabolizmu aa Tyr –
patrz punkt VI-3).

Monooksygenazy przyłączają jeden z atomów tlenu do cząsteczki substratu, tworząc grupę
hydroksylową (stąd inna nazwa – hydroksylazy), zaś drugi atom tlenu znajduje się ostatecznie w
cząsteczce wody:

AH + O

2

+ Z-H

2

→ AOH + H

2

O + Z.

Do monooksygenaz należy m. in. cytochrom b

5

(patrz punkt VII-4-b – ochrona erytrocytów przed RFT,

redukcja methemoglobiny) oraz cytochrom P

450

(CYP) (patrz punkt III-8 – utlenianie mikrosomalne).

b)

kofaktory i grupy prostetyczne przenoszące protony i elektrony

•

Do nukleotydów flawinowych należą FMN i FAD. Ich prekursorem jest ryboflawina (witamina B

2

),

składająca się z flawiny, zawierającej pierścień izoalloksazynowy oraz z D-rybitolu.

FMN – mononukleotyd flawinowy – powstaje z ryboflawiny przez jej fosforylację z udziałem kinazy
ryboflawinowej (flawokinazy):

ryboflawina + ATP →flawokinaza→ FMN + ADP

FMN może przyłączać 2 atomy wodoru (2 H

+

+ 2 e

-

), przechodząc z formy utlenionej (FMN) przez

pośrednią – semichinonową (FMNH

*

) w zredukowaną (FMNH

2

). Miejscem wiązania atomów wodoru

jest fragment izoalloksazynowy:

FMN jest silniejszym czynnikiem utleniającym niż NAD

+

(por. dalej). Pełni on funkcję grupy

prostetycznej m. in. w oksydazie α-aminokwasów.

FAD – dinukleotyd flawinoadeninowy – składa się z FMN oraz AMP. W sposób analogiczny do FMN
ma zdolność przyłączania 2 atomów wodoru, czemu towarzyszy redukcja do FADH

2

. W tej

zredukowanej formie FAD może funkcjonować jako substrat fosforylacji oksydacyjnej (por. dalej).
Stanowi on grupę prostetyczną np. dehydrogenazy aldehydowej.

- -

52

•

Koenzymami nikotynamidowmi są NAD

+

oraz NADP

+

. Ich prekursorem jest witamina PP (niacyna,

kwas nikotynowy i jego amid kwasowy).

NAD

+

– dinukleotyd nikotynamidoadeninowy – składa się z nukleotydu niacynowego (nikotynamid +

ryboza + {P}) oraz AMP. Może on związać jeden proton i dwa elektrony (H

+

+ 2 e

-

; jest to wynikiem

zgromadzenia na atomie azotu ładunku dodatniego – por. rys.), przechodząc z formy utlenionej (NAD

+

)

w zredukowaną (NADH). Jeżeli dostarczane są 2 protony, to wiązaniu ulega tylko jeden z nich, a
pozostaje w środowisku reakcji, dlatego też formę zredukowaną zapisuje się: NADH + H

+

. Miejscem

wiązania protonu i elektronów jest pierścień nikotynamidowy:

Forma zredukowana (NADH + H

+

) może stanowić substrat fosforylacji oksydacyjnej. NAD

+

jest

koenzymem enzymów biorących udział w oksydacyjnych szlakach metabolicznych (katabolicznych).

NADP

+

– fosforan NAD

+

– różni się od NAD

+

obecnością reszty {P}, połączonej z C2’ rybozy

nukleotydu adeninowego. Przyłączanie protonu i dwóch elektronów zachodzi identycznie jak w
przypadku NAD

+

. Różnica polega na tym, że NADPH + H

+

nigdy nie stanowi bezpośredniego substratu

fosforylacji oksydacyjnej. Pełni on natomiast rolę koenzymu enzymów uczestniczących w syntezach
redukcyjnych, np. dehydrogenaz PPP czy enzymów steroidogenezy (szlaki anaboliczne).

•

Koenzym Q, ubichinon, (CoQ, UQ, Q) – składa się z pierścienia p-benzochinonu, do którego wolnych
atomów węgla przełączone zostały grupy boczne – jedna metylowa, dwie zmetylowane hydroksylowe
(metoksy-) oraz jeden boczny łańcuch poliizoprenowy. Ten ostatni składa się ze zmiennej (6-10) liczby
reszt izoprenowych (-CH

2

-CH=C(CH

3

)-CH

2

-), wskutek czego przedstawicieli rodziny CoQ opisuje się

podając właśnie ilość tych reszt. Znane są cząsteczki Q

6

– Q

10

, przy czym w ludzkich mitochondriach

dominuje ta ostatnia.

- -

53

Dzięki obecności pierścienia benzochinonowego cząsteczka CoQ może przyłączać i transportować 2 H

+

i 2 e

-

. Redukcja formy utlenionej – ubichinonu do formy zredukowanej – ubichinolu zachodzi

dwustopniowo: wpierw przyłącza się jedna para H

+

+ e

-

, w wyniku czego powstaje rodnikowa forma

semichinonowa („pół-chinonowa”), a następnie druga para H

+

+ e

-

, dając zredukowany ubichinol. Ten z

kolei może oddać protony i elektrony, powracając do formy utlenionej. Fizjologicznie CoQ podlega
ciągłym cyklicznym przemianom: Q → QH

*

→ QH

2

→ Q itd. Ze względu na znaczną mobilność,

koenzym Q pełni funkcję przenośnika elektronów między nieruchomymi – bo wbudowanymi w
wewnętrzną błonę mitochondrialną – kompleksami łańcucha oddechowego. Ubichinon zbiera
równoważniki redukujące z kompleksów I i II, po czym przekazuje je na kompleks III (por. dalej).

•

Centra żelazo-siarkowe (Fe:S) – są to ugrupowania atomów Fe i S, mające zdolność odwracalnego
wiązania elektronów, stanowiące grupy protetyczne pewnych białek – z tego powodu również
określanych jako żelazo-siarkowe. Ponieważ atomy żelaza wchodzące w skład centrów nie są
składnikami cząsteczek hemu, ale biorą udział w katalizie, określa się jako żelaza niehemowe. Centra
związane są z białkami poprzez wiązania tworzące się między atomami Fe niehemowego, a atomami
siarki reszt Cys lub azotu reszt His (por rys.). Atomy siarki występujące między atomami żelaza w
obrębie centrów wykazują wrażliwość na działanie niskich wartości pH. Znanych jest kilka rodzajów
centrów Fe:S, różniących się ilością i składem atomów, przy czym najistotniejszymi są Fe

2

S

2

i Fe

4

S

4

.

Struktura centrów Fe:S cechuje się regularnością i symetrią (por. rysunki). Ich zdolność do wiązania i
oddawania elektronów wynika z możliwości występowania atomów żelaza na różnych stopniach
utlenienia – II i III. Podczas wiązania e

-

atom żelaza ulega redukcji do Fe

2+

, zaś podczas oddawania e

-

żelazo utlenia się do Fe

3+

. Fizjologicznie centra te stanowią jednoelektronowe pomosty, transportujące

elektrony z flawoprotein na koenzym Q oraz z koenzymu Q na cytochrom c

1

.

4.

Transport atomów wodoru przez błonę mitochondrialną

Mitochondria są organellami komórkowymi, których główną funkcją jest produkcja energii. Energia ta

gromadzona jest w wysokoenergetycznych wiązaniach ATP. Proces syntezy ATP nazywa się fosforylacją
oksydacyjną; fosforylacja wykorzystuje energię różnicy stężeń (gradientu) protonów po obu stronach
wewnętrznej błony mitochondrialnej. Gradient ten wytarzany jest z kolei przez układ białek błonowych, zwany
łańcuchem oddechowym, który wymaga obecności zredukowanego substratu, od którego mógłby odebrać atomy
wodoru i wykorzystać ich energię, aby ostatecznie przekazać je na tlen. Substratami łańcucha oddechowego są
głównie zredukowane formy nukleotydów – NADH oraz FADH

2

; inne związki wykorzystywane są w ten

sposób, że ulegają utlenieniu, przekazując swoje atomy wodoru na NAD

+

lub FAD, które są przez to

redukowane. Źródła przenośników redukujących dzieli się na wewnątrz- i pozamitochondrialne.

- -

54

•

Źródłem pochodzącym z samych mitochondriów jest NADPH, który może przekazać atomy wodoru na
NAD

+

dzięki aktywności transhydrogenazy:

NADPH + H

+

+ NAD

+

→transhydrogenaza→ NADP

+

+ NADH + H

+

.

•

Przenośniki pozamitochondrialne, aby móc zostać wykorzystane do pozyskania energii, muszą wpierw
znaleźć się wewnątrz mitochondriów. Nie mogą jednak swobodnie pokonać bariery w postaci
podwójnej błony mitochondrialnej, dlatego też są przez nią przenoszone za pośrednictwem par
substratów sprzężonych odpowiednimi dehydrogenazami. Istnieją dwa takie układy transportujące:

Układ glicerolo-3-fosforanowy – utworzony jest przez glicerolo-3-{P} (forma zredukowana) oraz {P}-
dihydroksyaceton (forma utleniona). Występuje on w mózgu, brunatnej tkance tłuszczowej, białej
tkance mięśniowej oraz w wątrobie. Transport z jego udziałem obarczony jest stratami energii, gdyż
zredukowana forma NADH, z której może powstać maks. 2,5 cząsteczki ATP (patrz punkt III-8),
wymieniana jest na zredukowaną formę FADH

2

, z której może powstać jedynie 1,5 cząsteczki ATP.

Układ szczawiooctan – jabłczan – asparaginian jest bezstratnym sposobem transporty. Jest to układ
uniwersalny, powszechnie występujący w organizmie:

OA – szczawiooctan, M – jabłczan, Asp – asparaginian, Glu – glutaminian, αKG – α-ketoglutaran
MDH – dehydrogenaza jabłczanowa, AT – aminotransferaza (transaminaza)
1 – przenośnik α-ketoglutaranowy, 2 – przenośnik glutaminianowo – asparaginianowy

5.

Łańcuch oddechowy

Łańcuch oddechowy jest to złożony układ wielu białek, zlokalizowany na wewnętrznej błonie

mitochondrialnej, którego funkcją jest utlenianie równoważników redukujących. Substratami łańcucha są
zredukowane formy nukleotydów nikotynamidowych (NADH) i flawinoadeninowych (FADH

2

). Praca łańcucha

polega na odebraniu im protonów i elektronów (ich utlenieniu), a następnie na kontrolowanym przepływie tych
cząstek (H

+

+ e

-

) przez kolejne ogniwa łańcucha o wzrastającym potencjale redox. Przepływowi temu

towarzyszy stopniowe uwalnianie energii tych cząstek. Wielkość uwolnionej energii jest proporcjonalna do
różnicy potencjałów oksydoredukcyjnych układów wymieniających między sobą elektrony (∆G = -n

.

F

.

∆V; G –

energia swobodna, n – liczba elektronów, F – stała Faradaya – 96500 C/mol, V – potencjał redox). Przenoszenie
elektronów pomiędzy ogniwami katalizowane jest przez odpowiednie dehydrogenazy. Wyjątkiem jest ostatnia
reakcja, polegająca na przeniesieniu protonów na tlen i utworzeniu w ten sposób cząsteczki wody, katalizowana

- -

55

przez oksydazę. Powstająca energia zużywana jest przez pompy protonowe samego łańcucha do transportu
protonów (H

+

) z macierzy (matrix) mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej. W ten sposób po obu

stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej tworzy się różnica stężeń protonów – innymi słowy powstaje
przezbłonowy gradient stężenia protonów, a dodatkowo – ponieważ od [H

+

] zależne jest pH – gradient pH.

Powstała różnica stężeń wykorzystywana jest do syntezy związku wysokoenergetycznego – ATP – w procesie
oksydacyjnej fosforylacji.

Jak wspomniano, w skład łańcucha oddechowego wchodzi bardzo wiele cząsteczek białkowych. Nie są

one jednak ani bezładnie rozrzucone ani mobilne, lecz zorganizowane w 4 nieruchome kompleksy, przechodzące
przez całą błonę wewnętrzną, oznaczone kolejnymi numerami rzymskimi (I – IV). Każdy kompleks przedstawia
układ redox, posiadający określony potencjał utleniający; jak wyżej zaznaczono, elektrony przechodzą kolejno
przez kompleksy o wzrastających potencjałach. Kompleksy I, III i IV wykazują aktywność pomp protonowych,
transportując jony H

+

na zewnątrz błony wewnętrznej. Ponieważ kompleksy nie mają możliwości ruchu, istnieją

dodatkowe ruchome przenośniki – koenzym Q oraz cytochrom c.

Kompleks I określany jest jako dehydrogenaza NADH bądź oksydoreduktaza NADH : ubichinon.

Zawiera on grupę prostetyczną – FMN oraz centra Fe:S – zarówno Fe

2

S

2

, jak i Fe

4

S

4

. Kompleks ten katalizuje

wpierw przeniesienie 2 H

+

i 2 e

-

z NADH + H

+

na FMN – powstaje w ten sposób NAD

+

i FMNH

2

. Następnie

protony i elektrony są rozdzielane – te pierwsze wędrują do matrix, a te drugie podlegają transportowi przez
centra Fe:S. Ostatecznie elektrony zostają przekazane na ubichinon, który dobiera sobie 2 protony z matrix,
dając zredukowany ubichinol (Q → QH

2

). Układ NAD

+

/ NADH posiada potencjał -0,32 V, zaś układ ubichinon

/ ubichinol – +0,10 V. Energia uwolniona w wyniku przejścia substratów między tymi układami służy do
transportu 4 protonów z macierzy do przestrzeni międzybłonowej.

Kompleks II nosi nazwę oksydoreduktazy bursztynian : ubichinon lub inaczej dehydrogenazy

bursztynianowej (SDH). Zawiera FAD oraz centra Fe:S. SDH stanowi jeden z enzymów cyklu Krebsa (por.
punkt II-9), jednocześnie dostarczający równoważników redukujących do łańcucha oddechowego. SDH
katalizuje reakcję odwodornienia bursztynianu i przeniesienia 2 H

+

+ 2 e

-

na FAD; daje to w efekcie malonian

oraz FADH

2

. Następnie protony i elektrony są rozdzielane – protony tradycyjnie wędrują do matrix, a elektrony

transportowane są przez centra Fe:S. Elektrony, a za nimi protony, przyłączają się do ubichinonu, redukując go.
Układ bursztynian / fumaran posiada potencjał +0,03 V. Wyjątkowo jednak przepływowi substratów przez
kompleks II nie towarzyszy przezbłonowy transport protonów. Kompleks II jako jedyny nie jest związany z
aktywnością pompy protonowej, w związku z czym nie występuje tu przyrost (zysk) energetyczny.

Kompleks III to z kolei oksydoreduktaza ubichinon : cytochrom c. Zawiera on centrum Fe

2

S

2

, cytochrom

b w tzw. formie niskiej (b

L

) i wysokiej (b

H

) oraz cytochrom c

1

. Cząsteczki CoQ – zarówno te zredukowane w

kompleksach I i II, jak i posiadające protony przyłączone bezpośrednio z matrix (por. dalej) – oddają swoje
protony do przestrzeni międzybłonowej, przez co powracają do formy ubichinonowej (Q). Elektrony natomiast
wędrują dwiema drogami – jedna część przekazywana jest kolejno: na centrum Fe:S, na cytochrom c

1

, a

ostatecznie na cytochrom c, druga część natomiast łączy się z cytochromem b

L

, który w wyniku tego

przekształca się w b

H

. Ten ostatni przekazuje elektrony znów na cząsteczką ubichinonu, która dobiera sobie

bezpośrednio 2 protony z matrix, powiększając w ten sposób pulę QH

2

. Cytochrom c, podobnie jak CoQ,

stanowi rozpuszczalny transporter, odbierający elektrony z kompleksu III i oddający go kompleksowi IV. Układ
cytochrom c utleniony / zredukowany posiada potencjał +0,22 V. Energia uwolniona z substratów
przechodzących przez kompleks III wystarcza do transportu 4 protonów na zewnątrz błony.

Kompleks IV to oksydoreduktaza cytochrom c : tlen lub krócej – oksydaza cytochromowa. Posiada on

cytochromy a i a

3

(z których każdy zawiera żelazo hemowe) oraz 2 atomy miedzi – Cu

A

i Cu

B

. Elektrony oddane

kompleksowi IV przez cytochrom c

1

wiązane są wpierw przez atomy Cu

A

(dzięki możliwości przejścia Cu

2+

↔

Cu

+

), następnie przekazywane na hem a, dalej – na atomu Cu

B

i hem a

3

, aby ostatecznie posłużyć do redukcji

cząsteczki tlenu (½ O

2

→ ½ O

2

-

). Ta ostatnia przyciąga 2 protony z matrix, dając w reakcji końcowy produkt

łańcucha oddechowego – cząsteczkę wody. Układ tlen / woda ma potencjał redox równy + 0,82 V. Energia z
transportu substratów przez ostatni kompleks przekłada się na przeniesienie dwóch protonów przez wewnętrzną
błonę mitochondrialną.

Podsumowując – substraty, redukując kolejne układy o coraz to wyższym potencjale, tracą stopniowo

energię, zużywaną na wytworzenie gradientu protonowego. Różnica potencjału pomiędzy skrajnymi ogniwami
łańcucha – NAD

+

/ NADH oraz O

2

/ H

2

O – wynosi: ∆V = +0,82 – (-0,32) = 1,14 V, co przekłada się na energię:

∆G = - 2 mol

.

1,14 V

.

96500 C/mol ≈ - 220 kJ. Znak ujemny przed wynikiem oznacza, iż jest to energia oddana

przez substraty.

Warto zwrócić uwagę na różnicę drogi, jaką pokonują protony i elektrony z NADH, a jaką z FADH

2

:

substraty z tego pierwszego źródła przechodzą przez kompleksy I, III i IV, co daje w sumie 4 + 4 + 2 = 10
protonów przeniesionych na zewnątrz błony, natomiast z drugiego – pokonują kompleksy II, III i IV, ale
ponieważ II nie pompuje protonów, transportowi ulega tylko 4 + 2 = 6 z nich. Płynie stąd wniosek, iż utlenianie
NADH jest bardziej opłacalne niż utlenianie FADH

2

(por. następny punkt).

- -

56

6.

Fosforylacja oksydacyjna

Fosforylacja oksydacyjna to sprzężony z oddychaniem proces wytwarzania związku

bogatoenergetycznego (ATP), zachodzący w mitochondrium. Umożliwia on organizmom tlenowym (aerobom)
pozyskanie znacznie większej części dostępnej energii swobodnej substratów oddechowych w porównaniu z
organizmami beztlenowymi (anaerobami).

Źródłem energii do syntezy ATP jest wytworzony przez łańcuch oddechowy przezbłonowy gradient

stężenia protonów i pH. Ta różnica potencjału elektrochemicznego wykorzystywana jest przez „jednostki
fosforylujące”, pokrywające wewnętrzną powierzchnię błony mitochondrialnej. Taka pojedyncza jednostka
składa się z wielu podjednostek białkowych, które można podzielić na dwa kompleksy – F

0

i F

1

.

Hydrofobowy kompleks F

0

przechodzi przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Składa się z 6

podjednostek, w obrębie których wyróżnia się 4 różne łańcuchy polipeptydowe. Najmniejsza z
podjednostek tworzy transbłonowy kanał jonowy, przeznaczony dla protonów.

Oba kompleksy połączone są za pośrednictwem trzonka (szyjki), również złożonego z szeregu
podjednostek. Należą do nich m. in.: inhibitor F

1

regulujący przepływ protonów i syntezę ATP, OSCP –

białko warunkujące wrażliwość na oligomycynę oraz podjednostka F

c2

(F

6

).

Hydrofilowy kompleks F

1

(czynnik sprzęgający 1) ma w przybliżeniu kształt kuli o średnicy 8,5 nm i

znajduje się po wewnętrznej stronie błony. Składa się z 5 rodzajów podjednostek, występujących w
relacji stechiometrycznej α

3

β

3

γδε (czyli łącznie 9 o wspólnej masie: 3 x 56 + 5 x 53 + 34 + 14 + 6 =

378 kD). Kompleks F

1

wykazuje aktywność syntazy ATP transportującej H

+

, której praca

uwarunkowana jest przechodzeniem protonów przez kanał w kompleksie F

0

oraz przez sam kompleks

F

1

. Substratami do syntezy ATP są ADP i P

i

.

Historycznie rzecz biorąc, powstało kilka teorii wyjaśniających proces syntezy ATP. Jedne z nich zostały

już odrzucone jako nieprawdziwe, inne wciąż funkcjonują i stanowią współczesne podejście do istoty
fosforylacji.

Teoria sprzężenia chemicznego zakładała bezpośrednie sprzężenie chemiczne na wszystkich etapach
procesu syntezy ATP, tak jak to ma miejsce w reakcjach generujących ATP w szlaku glikolizy (por.
punkt IV-4-a). Teoria ta została odrzucona, ponieważ nie udało się wyizolować bogatoenergetycznych
pośredników łączących procesy utleniania i fosforylacji.

Teoria chemiosmotyczna (Mitchell) zakłada, że energia z procesów utleniania przenośników w
łańcuchu oddechowym wykorzystywana jest przez pompy protonowe związane z kompleksami I, III i
IV do transportu protonów na zewnątrz sprzęgającej (tzn. wewnętrznej) błony mitochondrialnej. Ta
ostatnia jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonów, a zwłaszcza dla protonów, które gromadząc się
po jej zewnętrznej stronie, wytwarzają przezbłonową różnicę potencjału elektrochemicznego (∆µ

H+

), na

który składa się potencjał chemiczny (∆pH) i potencjał elektryczny (∆E). Termodynamicznie
uwarunkowany, swobodny przepływ protonów w tym układzie skierowany jest od matrix do przestrzeni
międzybłonowej. Syntaza ATP, zawierając kanał jony, umożliwia ten przepływ, a dodatkowo pochłania
część jego energii, magazynując ją w odpowiednich wiązaniach ATP.
Teoria ta, choć dobrze tłumaczy działanie syntazy ATP, nie wyjaśnia do końca wszystkich aspektów
tego procesu. Wykazano bowiem, że to nie sama reakcja syntezy ATP wymaga dostarczenia
zewnętrznej energii, a raczej etap uwalniania tego związku z centrum katalitycznego enzymu.
Przypuszczano, iż wymaga to zajścia zmian konformacyjnych w obrębie kompleksu F

1

, do czego

miałby być niezbędny gradient protonowy.

Hipoteza konformacyjna (Boyer) definitywnie dowodzi, iż rolą gradientu protonowego nie jest udział w
syntezie ATP, lecz odłączeniu produktu od syntazy oraz że 3 miejsca wiążące substraty w tym enzymie
wzajemnie na siebie oddziałują. Wiązanie ADP + P

i

do jednego miejsca pobudza usunięcie ATP z

drugiego, czyli syntaza ATP wykazuje kooperatywność katalityczną. 3 podjednostki katalityczne β są
wprawdzie identyczne, ale w każdym momencie funkcjonalnie nierównoważne: jedno miejsce
katalityczne występuje w formie otwartej O i ma znikome powinowactwo do substratów, drugie (L)
wiąże substraty luźno i nie wykazuje aktywności katalitycznej, trzecie (T) wiąże substraty silnie i jest
aktywne. W sytuacji T ↔ ATP, L ↔ ADP + P

i

dostarczenie energii pobudza kaskadę przejść: T → O,

L → T, O → L. Protony przepływają przez kanał w syntazie ATP jedynie wówczas, gdy konformacje
L, O i T wzajemnie w siebie przechodzą. Te przejścia konformacyjne są powiązane
najprawdopodobniej przez zmiany w oddziaływaniach między podjednostkami syntazy.

Jak wiadomo, substratami do syntezy ATP są ADP i P

i

. Aby reakcja syntezy mogła się dokonać, oba one

muszą znaleźć się w bezpośrednim sąsiedztwie syntazy (tj. w matrix), dokąd muszą być przetransportowane
przez odpowiednie przenośniki (por. punkt III-2-b). Do samego procesu syntezy ATP potrzebny jest przepływ
przez kompleks F

0

F

1

trzech protonów, jednak aby dostarczyć do matrix cząsteczkę fosforanu nieorganicznego,

zużywany jest jeszcze czwarty – niezbędny do symportu z P

i

. Ponieważ utlenianie NADH w łańcuchu

oddechowym jest równoważne z transportem 4 + 4 + 2 = 10 protonów, zatem jedna cząsteczka NADH niesie ze

- -

57

sobą tyle energii, ile potrzeba do syntezy 10 : 4 = 2,5 cząsteczki ATP. Przez analogię – utlenianie FADH

2

przenosi przez błonę 4 + 2 = 6 protonów, więc niesie energię odpowiadającą 6 : 4 = 1,5 cząsteczki ATP. Jeżeli
natomiast zsyntetyzowana cząsteczka ATP zostaje zużyta w obrębie matrix, to nie ma potrzeby symportu P

i

(gdyż jest on już dostępny z hydrolizy ATP), zatem do syntezy 1 ATP potrzeba jedynie energii przepływu 3
protonów. W tej sytuacji utlenianie cząsteczki substratu oddechowego przez dehydrogenazy zależne od NAD

+

i

łańcuch oddechowy dostarcza 3 cząsteczek ATP, zaś przez dehydrogenazy zależne od FAD – 2 cząsteczek ATP:

S-H

2

+ NAD

+

→ S + NADH + H

+

NADH + H

+

+ 3 ADP + 3 P

i

→ NAD

+

+ 3 ATP

S-H

2

+ FAD → S + FADH

2

FADH

2

+ 2 ADP + 2 P

i

→ FAD + 2 ATP

Pod pojęciem trucizn oddechowych rozumie się związki chemiczne, które po dostaniu się do organizmu

zaburzają procesy oddychania komórkowego – tj. hamują łańcuch oddechowy, obniżają gradient protonów lub
hamują oksydacyjną fosforylację.

•

inhibitory łańcucha oddechowego

Barbiturany (amobarbital, amytol), piericydyna A i rotenon zaburzają przekazywanie elektronów z
centrum Fe:S kompleksu I na CoQ.

Dimerkaprol (BAL), antymycyna A i myksotiazol zaburzają transport z cytochromu c

1

na c.

Siakowodór (H

2

S), tlenek węgla (CO), cyjanki (CN

-

) i azydki (N

3

-

) hamują aktywność oksydazy

cytochromowej, m. in. przez wiązanie się z atomami żelaza hemowego.

Karboksyna i TTFA (czynnik chelatujące Fe) zaburzają przekazywanie równoważników z SDH na
CoQ.

Malonian jest kompetycyjnym inhibitorem SDH.

•

Związki rozprzęgające – są to substancje amfipatyczne, zwiększające przepuszczalność wewnętrznej
błony mitochondrialnej dla protonów, przez co zmniejszają błonowy potencjał elektrochemiczny i
wywołują spięcie syntazy ATP. W ich obecności procesy fizjologicznie związane (sprzężone) – łańcuch
oddechowy i fosforylacja oksydacyjna – przebiegają niezależnie od siebie (łańcuch pompuje protony, a
fosforylacja nie zachodzi) – tzn. są rozprzeżone, stąd nazwa. Do związków takich zalicz się m. in.: 2,4-
dinitrofenol (DNP), dinitrokrezol, pentachlorofenol, m-chlorokarbonylocyjanidofenylohydrazon
(CCCP) oraz karboksycyjanek-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP).

•

inhibitory fosforylacji oksydacjnej

Oligomycyna, wiążąc się z podjednostką OSCP, całkowicie blokuje kompleks F

0

– protony nie

przepływają przez kanał i fosforylacj nie zachodzi.

Związki takie jak: atraktylozyd, karboksyatraktylozyd czy kwas bongkrekowy hamowanie przenośnik
antyportowy ADP / ATP.

7.

Reaktywne formy tlenu (RFT, ang. ROS)

Wolne rodniki (oksydanty) to atomy, jony lub cząsteczki zdolne do samodzielnego życia, posiadające na

ostatnim orbitalu niesparowany elektron. Powstają one w wyniku działania różnych czynników na materię: w
reakcjach homolitycznego rozpadu wiązań, wyrwania atomu wodoru, wyrwania elektronu, addycji lub oksydacji.
Rodniki odznaczają się ogromną reaktywnością. W reakcjach przebiegających z ich udziałem wyróżnia się 3
etapy:

inicjacji – działanie czynników: absorpcja, jonizacja (działanie promieniowaniem jonizującym),
sonifikacja (działanie ultradźwiękami), reakcja red-ox,

prolongacji – nie zmienia się nominalna ilość rodników, a jedynie właściwość ta przechodzi na
rozmaite cząsteczki – nosicieli,

terminacji – kiedy w wyniku reakcji powstanie trwały produkt.

Rodniki powstają w żywych komórkach, jak również przenikają do nich ze środowiska zewnętrznego. Do

zjawisk odpowiedzialnych za generację RFT zaliczamy m. in.:

nieszczelność łańcucha oddechowego (1 – 4 %)

działanie NADPH-oksydazy: 2 O

2

+ NADPH → 2 O

2

-*

+ NADP

+

+ H

+

działanie oksydazy ksantynowej (patrz punkt VI-4-d)

toksyczne działanie wolnego żelaza:
Fe

3+

+ O

2

-*

→ Fe

2+

+ O

2

(reakcja Habera – Weissa)

Fe

2+

+ H

2

O

2

→ Fe

3+

+ OH

-

+ HO

*

(reakcja Fentona)

O

2

-*

+ H

2

O

2

→Fe→ O

2

+ OH

-

+ HO

*

- -

58

toksyczne działanie wolnej miedzi:
Cu

2+

+ O

2

-*

→ Cu

+

+ O

2

Cu

+

+ H

2

O

2

→ Cu

2+

+ OH

-

+ HO

*

O

2

-*

+ H

2

O

2

→Cu→ O

2

+ OH

-

+ HO

*

Do zewnątrzkomórkowych źródeł wolnych rodników zaliczamy: spodki spożywcze, leki i chemikalia,

zanieczyszczenia powietrza, ksenobiotyki domowe, tlen pod zwiększonym ciśnieniem, stres psychiczny,
narażenie na promieniowanie.

RFT są w małych stężeniach produkowane i wykorzystywane przez sam organizm w określonych celach.

Fizjologicznie biorą one udział w: transporcie O

2

przez HGB, aktywacji cytochromu P

450

, syntezie eikozanoidów

oraz niszczeniu czynników zakaźnych – bakterii, wirusów i grzybów. Jednak znaczne zwiększenie ich poziomu
jest dla organizmu bardzo szkodliwe – stan taki określa się jako stres oksydacyjny.

Przyczyną toksycznego działania RFT w organizmie jest głównie rodnik hydroksylowy HO

*

. Przenosi on

własny elektron na rożne molekuły i odszczepia od nich protony, przez co zapoczątkowuje kaskadę uszkodzeń.

Peroksydacja lipidów – markerem tego procesu jest stężenie aldehydu dimalonowego (OHC-CH

2

-

CHO). Cholesterol wchodzący w skład błon komórkowych (membranowy), jak również stanowiący
składnik frakcji LDL lipoprotein, ulega utlenianiu do 7-oksocholesterolu; utlenianiu ulega również
apolipoproteina B, stanowiąca białkowy składnik cząsteczek LDL (patrz punkt V-3-a i b). Na poziomie
błonowym obserwuje się: modyfikację aktywności enzymów błonowych, utlenianie grup
sulfhydrylowych (SH) białek błonowych i następowe zmiany ich konformacji, wzrost
przepuszczalności błon i konsekwentne rozprzęgnięcie transportu przez nie, modyfikację stanu
skupienia (płynności) oraz polaryzacji błon. Z kolei peroksydacja LDL powoduje zaburzenie ich
rozpoznawania przez komórki wątrobowe, wobec czego zmiatane są przez makrofagi, które w wyniku
przeładowania lipidami osiadają w ścianie naczyń jako tzw. komórki piankowe; jest to istota
powstawania blaszki miażdżycowej.

Uszkodzenia białek dotyczą gł. reszt bocznych aa. Uszkodzenie struktury białka może być wynikiem
jego fragmentacji bądź tworzenia wiązań krzyżowych między aa, co może wpływać na aktywność
enzymatyczną, podatność proteolityczną oraz właściwości antygenowe. Najczęstsze uszkodzenia to:

oksydacyjna modyfikacja Cys i Met – utlenianie atomu siarki,

utlenianie metali w metaloproteinach,

modyfikacje sacharydów w glikoproteinach,

tworzenie wiązań krzyżowych – gł. H-H, H-W, H-Y, Y-Y,

fragmentacja białka: oksydacyjna modyfikacja Pro i hydroliza reszty Pro z powstaniem N-
glutamylopeptydu bądź powstanie endonadtlenku His.

Uszkodzenia DNA mogą dotyczyć modyfikacji zasad azotowych, przemiany reszt cukrowej,
rozerwania wiązania glikozydowego lub fosfodiestrowego, powstania dimerów tymidynowych itp.

puryny: atak na wiązanie C

7

-C

8

→ rozerwanie pierścienia imidazolowego → powstanie poch.

pirymidyny,

U → 5-hydroksy-U, 5,6-dihydroksy-U, 5-hydroksymetylo-U,

C → 5-hydroksy-C, 5,6-dihydroksy-C,

T → 5,6-dihydro-T, glikol T, 5-hydroksy-6-hydro-T.

•

Mechanizmy obronne komórek przed stresem oksydacyjnym:

enzymatyczne:

dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) – dysproporcjonowanie O

2

-*

:

2 O

2

-*

+ 2 H

+

→ H

2

O

2

+ O

2

katalazy (CT) – rozkład nadtlenku wodoru:

H

2

O

2

→ H

2

O + ½ O

2

peroksydazy, np. glutationowa – rozkład H

2

O

2

z wykorzystaniem zredukowanego substratu:

H

2

O

2

+ S-H

2

→ 2 H

2

O + A

nieenzymatyczne:

białka:

obronne, np. albumina

kontrolujące obieg metali – Fe (ferrytyna, transferryna), Cu (cerulplazmina)

witaminy:

wit. C – kwas askorbinowy – antyoksydant fazy wodnej:

askorbinian →-2H→ dehydroaskorbinian

wit. E – tokoferol – antyoksydant fazy lipidowej
W reakcji zmiatania rodnika lipidowego sam przekształca się w formę rodnikową, po
czym na granicy fazy lipofilnej i hydrofilnej redukowany jest przez askorbinian.

karotenoidy: wit. A (retinol), α-, β-, γ-karoteny – antyoksydanty fazy lipidowej

- -

59

związki niskocząsteczkowe:

glutation (γ-glutamylocysteinyloglicyna) – we współpracy z peroksydazą glutationową:

H

2

O

2

+ 2 GSH → 2 H

2

O + GSSG

bilirubina związana z albuminą (osocze)

kwas moczowy (śródbłonek, hepatocyty)

melaniny – eumelanina i feomelanina (skóra)

kreatynina, karnozyna, kwas α-lipoinowy (tiooktanowy), flawonoidy roślinne

8.

Utlenianie mikrosomalne

Monooksygenazy systemów mikrosomalnych występują razem z cytochromami P

450

i b

5

. NADH i

NADPH dostarczają równoważników redukujących do redukcji tych cytochromów, które z kolei są utlenianie
przez substraty w cyklu hydroksylacyjnym. Takie mikrosomalne układy hydroksylacyjne występują w:

wątrobie, gdzie biorą udział w:

przemianie poch. wit. D (hydroksylacja w pozycji 25),

syntezie kwasów żółciowych (patrz punkt V-9)

detoksykacji ksenobiotyków, m. in. benzopirenu, aminopiryny, aniliny, morfiny, benzofelaminy,

w nerkach, gdzie biorą udział w przemianie pochodnych wit. D (hydroksylacja w pozycjach 1α lub 24)
(patrz punkt V-10 oraz VII-2-b)

w korze nadnerczy, gonadach i łożysku) gdzie biorą udział w steroidogenezie (hydroksylacja w
pozycjach 11β, 17α i 21α) (patrz punkt V-11).

Schemat mikrosomalnej hydroksylacji:

A-H + P

450

-Fe

3+

→ H-A-P

450

-Fe

3+

H-A-P

450

-Fe

3+

+ e

-

→ H-A-P

450

-Fe

2+

H-A-P

450

-Fe

2+

+ O

2

→ H-A-P

450

-Fe

2+

-O

2

H-A-P

450

-Fe

2+

-O

2

+ e

-

→ H-A-P

450

-Fe

2+

-O

2

-*

H-A-P

450

-Fe

2+

-O

2

-*

+ 2 H

+

→ P

450

-Fe

3+

+ A-OH + H

2

O

Reakcje reduktazy NADPH – cytochrom P

450

(dostarczanie 2 H

+

i 2 e

-

):

NADPH + H

+

+ FAD → NADP

+

+ FADH

2

FADH

2

+ 2 Fe

2

S

2

3+

→ FAD + 2 Fe

2

S

2

2+

+ 2 H

+

+ 2 e

-

9.

Cykl Krebsa = cykl kwasu cytrynowego = cykl kwasów trójkarboksylowych (TCA)

Cyklem Krebsa nazywamy ciąg reakcji zachodzących w matrix mitochondrialnej, polegający na

katabolizmie reszt acetylowych (kwasu octowego) z uwolnieniem równoważników wodorowych. Rola cyklu jest
dwojaka. Po pierwsze dostarcza on substratów dla łańcucha oddechowego w postaci atomów wodoru
przenoszonych na FAD i NAD

+

, ponadto dostarcza energii poprzez fosforylację substratową. Po drugie stanowi

węzłowy punkt metabolizmu, gdyż kończą się na nim lub od niego zaczynają liczne szlaki metaboliczne: jest to
punkt końcowy katabolizmu podstawowych składników pokarmowych (węglowodanów, lipidów i białek), jak
również punkt wyjścia dla: glukoneogenezy, syntezy KT, transaminacji i dezaminacji.

Enzymy cyklu zlokalizowane są w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej albo przyłączone do

wewnętrznej powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej – ułatwia to przenoszenie równoważników
redukujących na odpowiednie enzymy łańcucha oddechowego, umiejscowionego przecież również w
wewnętrznej błonie mitochondrialnej.

a)

reakcje cyklu

kondensacja:

CH

3

CO-CoA (AcCoA) + HOOC-CO-CH

2

-COOH (szczawiooctan) + H

2

O →syntaza cytrynianowa→

→ HOOC-CH

2

-C(OH)(COOH)-CH

2

-COOH (cytrynian) + CoA

izomeryzacja – reakcję tą hamuje fluorocytrynian:

cytrynian →akonitaza (hydrataza akonitanowa), -H

2

O→

HOOC-CH

2

-C(COOH)=CH-COOH (cis-akonitan) →akonitaza, Fe

2+

, +H

2

O→

→ HOOC-CH

2

-CH(COOH)-CH(OH)-COOH (izocytrynian)

- -

60

dehydrogenacja ((*): NAD

+

– mitochondrium; NADP

+

– mitochondrium / cytozol):

izocytrynian + NAD

+

→dehydrogenaza izocytrynianowa (*)→

→ HOOC-CH

2

-CH(COOH)-CO-COOH (szczawiobursztynian) + NADH + H

+

dekarboksylacja:

szczawiobursztynian →dehydrogenaza izocytrynianowa, -CO

2

→

→ HOOC-CH

2

-CH

2

-CO-COOH (α-ketoglutaran)

oksydacyjna dekarboksylacja (patrz punkt III-10) – reakcję tę hamuje arsenin i Hg

2+

:

α-ketoglutaran + NAD

+

+ CoA →kompleks oksydazy α-KG, -CO

2

→

→ HOOC-CH

2

-CH

2

-CO~CoA (sukcynylo-CoA) + NADH + H

+

oksydacyjna fosforylacja:

sukcynylo-CoA + GDP + P

i

→syntetaza sukcynylo-CoA = tiokinaza bursztynianowa (tworząca GDP/ADP)→

→ HOOC-CH

2

-CH

2

-COOH (bursztynian) + GTP + CoA

GTP + ADP → GDP + ATP

dehydrogenacja – katalizuje jedyny enzym błonowy szlaku; reakcja hamowana przez malonian:

bursztynian →dehydrogenaza bursztynianowa→ HOOC-CH=CH-COOH (cis) (fumaran)

hydratacja:

fumaran + H

2

O →fumaraza (hydrataza fumaranowa)→ HOOC-CH(OH)-CH

2

-COOH (L-jabłczan)

dehydrogenacja:

L-jabłczan + NAD

+

→dehydrogenaza jabłczanowa→

HOOC-CO-CH

2

-COOH (szczawiooctan) + NADH + H

+

b)

bilans energetyczny cyklu

dehydrogenaza izocytrynianowa

NAD

3

dehydrogenaza α-ketoglutaranowa

NAD

3

syntetaza sukcynylo-CoA

substrat. 1

dehydrogenaza bursztynianowa

FAD

2

dehydrogenaza jabłczanowa

NAD

3

12 moli ATP

c)

powiązania z innymi szlakami – amfiboliczność cyklu

węglowodany:

glukoneogeneza (patrz punkt IV-4-b):

szczawiooctan + GTP/ITP →karboksykinaza {P}-enolopirogronianowa (PEPCK)→

→ {P}-enolopirogronian (PEP) + CO

2

+ GDP/IDP

PEP →→ glukoza

konwersja do szczawiooctanu:

pirogronian + CO

2

+ H

2

O + ATP →karboksylaza pirogronianowa, biotyna (wit. H)→

→ szczawiooctan + ADP + P

i

lipidy (patrz punkt V-6-a):

AcCoA (matrix) → cytynian →liaza ATP-cytrynian→ AcCoA (cytozol) →→ synteza KT

aminokwasy – punkty wejścia szkieletów węglowych aa do cyklu Krebsa – patrz punkt VI-3

d)

regulacja cyklu

ogólna: kontrola oddechowa (łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna) ↔ podaż utlenianych
kofaktorów dehydrogenaz ↔ dostępność ADP ↔ szybkość zużywania ATP ↔ wysiłek organizmu

- -

61

wewnętrzna:

dehydrogenaza α-ketoglutaranowa – czynniki regulacji jak PDH (patrz punkt III-10)

syntaza cytrynianowa ← hamowanie przez ATP i długołańcuchowe KT

dehydrogenaza izocytrynianowa ← hamowanie przez ATP i NADH

dehydrogenaza bursztynianowa ← hamowanie przez szczawiooctan ↔ dehydrogenaza
jabłczanowa ↔ stosunek [NADH]/[NAD

+

]

10.

Kompleks oksydazy α-ketokwasów

W skład kompleksu oksydazy α-ketokwasów wchodzą po 6 łańcuchów każdego z trzech składowych

enzymów: swoistej dehydrogenazy (pirogronianowa, α-ketoglutaranowa), transferazy dihydrolipoamidowej oraz
dehydrogenazy dihydrolipoamidowej, jak również 5 kofaktorów: DPT, kwas liponowy, CoA, FAD oraz NAD

+

.

Kompleks stanowi regularny przestrzenny układ, poszczególne składowe są doń stale przyłączone i mają
ograniczone możliwości ruchu. Zasada działania zostanie dokładnie omówiona na przykładzie kompleksu PDH.

Kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) katalizuje oksydacyjną dekarboksylację pirogronianu

do AcCoA, przez co stanowi pomost m. in. pomiędzy szlakiem glikolizy, a cyklem Krebsa i syntezą KT. Na
jeden cykl pracy kompleksu składa się 5 reakcji.

•

W pierwszej pirogronian ulega połączeniu z koenzymem – difosforanem tiaminy (TDP; poch. wit. B

1

) i

dekarboksylacji:

CH

3

COCOOH →PDH→ CH

3

-C(OH)-[TDP] (hydroksyetyl) + CO

2

•

W następnej hydroksyetyl ulega przeniesieniu z TDP na kolejny kofaktor kompleksu – lipoamid
(połączenie kwasu liponowego z resztą Lys):

hydroksyetyl →acetylotransferaza dihydrolipoamidowa→ acetylolipoamid

•

W trzeciej reakcji reszta acetylowa ulega przeniesieniu z lipoamidu na CoA, w wyniku czego powstaje
produkt – AcCoA:

Ac-lipoamid + CoA → dihydrolipoamid + AcCoA

•

Ponieważ produktem 3. reakcji jest lipoamid w formie zredukowanej, toteż w 4. następuje jego
regeneracja z udziałem FAD:

dihydrolipoamid + FAD →dehydrogenaza dihydrolipoamidowa→ lipoamid + FADH

2

•

Powstały FADH

2

przekazuje atomy wodoru na NAD

+

, co stanowi wyjątkowe i niespotykane nigdzie

indziej przejście:

FADH

2

+ NAD

+

→ FAD + NADH + H

+

Zredukowana forma NADH + H

+

stanowi substrat łańcucha oddechowego. Kompleks PDH wraca do

stanu wyjściowego i może rozpocząć kolejny cykl pracy.

Regulacja pracy kompleksu opiera się na:

•

allosterycznym hamowaniu przez produkty końcowe (AcCoA i NADH)

•

modyfikacjach kowalencyjnych w postaci odwracalnej fosforylacji (aktywność wykazuje forma
zdefosforylowana):

kinaza kompleksu PDH hamowana jest przez Ca

2+

, pirogronian (substrat) i dwuchlorooctan, zaś

aktywowana przez wysokie wartości stosunków: [AcCoA]/[CoA], [NADH]/[NAD

+

] oraz

[ATP]/[ADP],

fosfataza aktywowana jest przez: Ca

2+

, Mg

2+

oraz insulinę.

W analogiczny sposób funkcjonuje kompleks dehydrogenazy α-ketoglutaranowej, stanowiący jeden z

enzymów cyklu Krebsa. Rolę substratu pełni tu α-ketoglutaran, a produktu – sukcynylo-CoA. (por. punkt III-9-a)

- -

62

ROZDZIAŁ IV – WĘGLOWODANY

1.

Budowa chemiczna, właściwości i funkcje cukrów prostych i złożonych

•

klasyfikacja węglowodanów

monosacharydy

triozy (C

3

), tetrozy (C

4

), pentozy (C

5

), heksozy (C

6

), heptozy (C

7

)

aldozy (polihydroksyaldehydy) / ketozy (polihydroksyketony)

oligosacharydy: disacharydy, trisacharydy itd.

polisacharydy

homoglikany / heteroglikany

pentozany / heksozany

a)

monosacharydy

•

Stereoizomeria monosachrydów:

Izomery konfiguracyjne D i L (enancjomery) – przynależność zależy od tego, po której stronie
wystepuje grupa hydroksylowa przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla. Skręcalność optyczna
roztworów w prawo (+) bądź w lewo (-) jest niezależna od izomerii D – L. Równomolową mieszaninę
obu izomerów nazywamy recematem (mieszaniną racemiczną, DL-mieszaniną); w wyniku znoszenia
się izomerii optycznej obu izomerów nie wykazuje ona aktywności optycznej.

Piranozowe i furanozowe formy pierścieniowe – poprzez działanie grupy karbonylowej na reszty
hydroksylowe, położone przy dalszych atomach węgla, powstają pięcio- i sześcioczłonowe cykliczne
formy monosacharydów. Przez podobieństwo ich budowy furanu lub piranu nazywamy je odpowiednio
furanozami i piranozami.

Powstanie form cyklicznych, tj. hemiacetali i hemiketali powoduje wystąpienie dodatkowego
asymetrycznego atomu węgla. Mówimy przez to o anomerach α i β: anomer α występuje, gdy grupa
karboksylowa przy atomie węgla hemi znajduje się po przeciwnej stronie niż reszta przy ostatnim
atomie węgla tworzącym pierścień, gdy zaś obie grupy znajdują się po tej samej stronie – jest to anomer
β. W roztworze ustala się stan równowagi pomiędzy obiema formami, co nosi nazwę mutarotacji.

Epimerami nazywamy cząsteczki różniące się konfiguracją grup hydroksylowych przy atomach C2-C4.

•

Szereg D-aldoz:

aldehyd D-glicerynowy

D-treoza

D-erytroza

D-liksoza

D-ksyloza

D-arabinoza

D-ryboza

D-taloza

D-Gal

D-idoza

D-guloza

D-Man

D-Glc

D-altroza

D-alloza

•

Szereg D-ketoz:

dihydroksyaceton

D-erytruloza

D-ksyluloza

D-rybuloza

D-tagatoza

D-sorboza

D-fruktoza

D-psikoza

D-sedoheptuloza

•

Pochodne monosacharydów:

estry

fosforany, np. PGAL, G-6-{P}

siarczany (składowe GAG)

deoksycukry = alditole, np. deoksyryboza, fukoza, rybitol

aminocukry, np. GlcNH

2

, GalNH

2

, ManNH

2

kwasy (→ laktony)

aldonowe

aldarowe

alduronowe, np. GlcUA, IdUA, GulUA

- -

63

glikozydy (brak mutarotacji)

O-glikozydy (acetale)

N-glikozydy

S-glikozydy

b)

disacharydy

•

posiadają właściwości redukujące, jeżeli w budowie wiązania O-glikozydowego nie biorą udziału
jednocześnie oba aromatyczne atomy węgla

•

przedstawiciele:

maltoza: α-D-Glc 1→4 α-D-Glc

sacharoza: β-D-Fru 2→1 α-D-Glc

laktoza: β-D-Gal 1→4 β-D-Glc

trehaloza: α-D-Glc 1→1 α-D-Glu

c)

polisacharydy

•

homoglikany

skrobia – glukazon, najważniejsze źródło węglowodanów w pokarmie

amylaza (15 – 20 %): α-D-Glc 1→4

amylopektyna (80 – 85 %): α-D-Glc 1→4 i 1→6 (raz na 24 – 30 reszt)

glikogen – „zwierzęca skrobia”, polisacharyd zapasowy zwierząt
α-D-Glc 1→4 i 1→6 (raz na 12 – 14 reszt → bardziej rozgałęziony niż skrobia)

inulina – fruktazon, złożony z ok. 30 reszt Fru 1→2; używana do badań klirensu nerkowego

dekstryny – półprodukty hydrolizy skrobii

błonnik (celuloza) (β-D-Glc 1→4) – masowy składnik pożywienia, nie ulegający trawieniu

chityna (β-D-GluNAc 1→4) – składnik pancerzy bezkręgowców

•

heteroglikany

GAG (glikozoaminoglikany, mukopolisacharydy, śluzowielocukry)
[GluNAc lub GalNAc + GlcUA lub IdUA]

n

kwas sialowy (SA) = kwas neuraminowy (NA) + X; np. N-Ac-Neu (NeuAc, NANA)
NA (C

9

) = ManNH

2

(C

6

) + Pyr (C

3

)

glikany proteoglikanów: (GAG

n

+ proteina)

m

+ HA

glikany glikoprotein

glikany glikolipidów

2.

Trawienie węglowodanów i jego zaburzenia

•

Amylaza ślinowa (optimum 6,6-6,8, wymaga Cl

-

) – rozkłada skrobię i glikogen do maltozy i innych

oligosacharydów przez hydrolizę wiązań 1→4. Ulega unieczynnieniu w pH < 4, dlatego jest
nieaktywna w kwaśnej treści żołądka.

•

α-amylaza trzustkowa (optimum 7,1) – rozkłada skrobię i glikogen do maltozy, maltotriozy, dekstryn
granicznych nierozgałęzionych oligosacharydów i niewielkiej ilości wolnej glukozy.

•

Sok jelitowy – zawiera swoiste oligo- i disacharydazy:

maltaza – α-glukozydaza (optimum 5,8-6,2) – odszczepia pojedyncze reszty cukrowe od sacharydów z
wiązaniem α(1,4), rozpoczynając od końca nieredukującego

kompleks sacharaza – izomaltaza (optimum 5-7) – po rozdzieleniu enzymy stają się aktywne,
hydrolizując sacharozę i wiązania α(1,6) dekstryn

laktaza – β-glikozydaza (optimum 5,4-8,0) – odszczepia galaktozę od laktozy, atakuje celobiozę i inne
β-glikany, druga domena katalityczna rozszczepia glikozyloceramidy

trehalaza – katalizuje hydrolizę trehalozy

•

Zaburzenia trawienia:

Niedobór laktazy jest przyczyną nietolerancji laktozy, sprowadzającej się do nietolerancji mleka.
Wyróżnia się niedobór dziedziczny (pierwotny – spowodowany mutacją genu) oraz wtórny –
towarzyszący chorobom jelit, zabiegom operacyjnym na jamie brzusznej itp. Obecność w świetle jelita
nie rozłożonej laktozy – substancji czynnej osmotycznie – powoduje biegunki osmotyczne. Z kolei jej
bakteryjna fermentacja dostarcza dużej ilość produktów gazowych, drażniących jelito i przez to
wywołujących wzdęcia i bóle brzucha.

Niedobór aktywności sacharazy i izomaltazy wywołuje podobne zjawiska.

- -

64

Disacharyduria to zaburzenie trawienia niektórych disacharydów, które w tej sytuacji wchłaniane są w
formie nie rozłożonej i w zwiększonej ilości wydalane są z moczem (np. 300 mg/d).

Wadliwe wchłanianie monosacharydów – dotyczy Gal i Glc (defekt SGLT-1) lub Fru i sorbitolu

3.

Wchłanianie i transport węglowodanów

a)

transport aktywny i bierny, białka transportujące

•

W świetle jelita aktywne są skupiska disacharydaz połączone z rąbkiem szczoteczkowym komórek
nabłonkowych. Produkty trawienia węglowodanów wchłaniane są z jelita czczego do krążenia
wrotnego w postaci monosacharydów, w tym głównie pentoz i heksoz. Proces wchłaniania odbywa się
przez dyfuzję prostą oraz transport aktywny. Ten ostatni jest bardziej wybiórczy i wymaga określonej
budowy transportowanej cząsteczki: konfiguracji grupy hydroksylowej przy C

2

jak w glukozie,

pierścienia piranozowego oraz obecności przy C

5

grupy metylowej lub jej pochodnej.

•

Transport glukozy i galaktozy odbywa się przez przenośniki zależna lub nie od Na

+

. Przenośniki

kotransportowe (SGLT-1) przenoszą jednocześnie cząsteczkę glukozy i kation Na

+

, przez co

współdziałają z Na

+

/K

+

-ATPazą; transport ten można więc zahamować ouabainą (inhibitor pompy Na

+

)

lub florazyną (inhibitor reabsorpcji nerkowej). Na komórce nabłonkowej występują ponadto
przenośniki niezależne od Na

+

– GLUT. Fruktoza wchłania się względnie wolno, biernie, przez

przenośnik GLUT-5.

•

Charakterystyka transporterów glukozy:

przenośnik

lokalizacja

rola

GLUT-1

mózg, nerki, jelito grube, łożysko, erytrocyty

pobieranie glukozy

GLUT-2

wątroba, komórki β wysp, jelito cienkie, nerki

szybkie pobieranie / uwalnianie glukozy

GLUT-3

mózg, nerki, łożysko

pobieranie glukozy

GLUT-4

serce, mięśnie, tkanka tłuszczowa

pobieranie glukozy zal. od insuliny

GLUT-5

jelito cienkie

wchłanianie glukozy

SGLT-1

jelito cienkie, nerka

aktywny transport zal. od Na

+

b)

zróżnicowanie tkankowe transportu

- -

65

c)

rola insuliny (patrz również punkt IV-8-b)

•

mechanizm wydzielania insuliny:
Glc → ↑ ATP → zamknięcie kanałów K

+

zal. od ATP → depolaryzacja błony → otwarcie kanałów

Ca

2+

zal. od potencjału → napływa Ca

2+

do komórki → egzocytoza pęcherzyków zawierających

insulinę

•

działanie insuliny:

mobilizacja i przeniesienie na powierzchnię błony przenośnika GLUT-4 (mięśnie, tkanka tłuszczowa)

modyfikacja ekspresji genów enzymów (wątroba)

•

wpływ na regulację insulinową:

związki endogenne: egzocytozę insuliny zwiększają aa i WKT, zaś zmniejszają aminy katecholowe

doustne leki p/cukrzycowe:

poch. sulfonylomocznika (np. tolbutamid) oraz glinidy (np. repaglinid) przyłączają się w pobliżu
kanałów K

+

zal. od ATP i blokują go, przez co zwiększają egzocytozę insuliny

glitazony (np. troglitazon) bezpośrednio modyfikują transkrypcję białek, w tym enzymatycznych,
podlegających kontroli insuliny

d)

rola fosforylacji monosacharydów

Fosforylacja monosacharydów pełni istotną rolę w ich transporcie. Heksokinaza ma duże powinowactwo

do heksoz (1 / K

M

= 20 1/mM), dlatego funkcjonuje jako transporter cukrów do tkanek; cechuje się małą

swoistością. Glukokinaza z kolei ma dużą swoistość i małe powinowactwo (1 / K

M

= 0,1 1/mM), stąd bierze

udział w regulacji stężenia glukozy do krwi; występuje w wątrobie i trzustce. Dzięki takiemu układowi po
posiłku glukoza transportowana jest do wątroby i zużywających ją tkanek, natomiast w stanie między posiłkami
wątroba oddaje glukozę do krwi, a tkanki obwodowe stale ją zużywają.

4.

Metabolizm glukozy

a)

glikoliza (szlak Embdena – Meyerhoffa – Parnasa = EMP)

•

lokalizacja komórkowa: cytozol; miejsca aktywne glikolitycznie skupione są w kompleksy mające
postać małych organelli komórkowych – glikolizosomów; enzymy szlaku zaadsorbowane są na błonach
ER

•

znaczenie glikolizy:

podstawowa droga katabolizmu glukozy do AcCoA

główny szlak metabolizmu pokarmowej fruktozy i galaktozy

może zachodzić w warunkach beztlenowych, przez co dostarcza energii tkance mięśniowej nawet w
stanie niedotlenienia

stanowi jedyne źródło energii dla komórek pozbawionych możliwości oddychania tlenowego –
pozbawionych mitochondriów (np. erytrocyty)

•

przebieg glikolizy:

ogólne równanie: Glc + 2 ADP + 2 P

i

→ 2 L-mleczan + 2 H

2

O + 2 ATP

fosforylacja:

Glc + ATP →heksokinaza, Mg

2+

→ Glc-6-{P} + ADP

Reakcja ta traktowana jest za fizjologicznie nieodwracalną dzięki uwalnianiu energii w postaci ciepła. Ma
miejsce allosteryczne hamowanie przez produkt.
Rodzaje heksokinazy:

glukokinaza – wątrobowa

galaktokinaza – wątrobowa

fruktkinaza – nie tylko wątrobowa

mózgowa – oddziałuje z błoną mitochondrialaną

izomeryzacja aldoketozowa:

α-D-Glc-6-{P} ↔izomeraza fosfoheksozowa↔ α-D-Fru-6-{P}

- -

66

fosforylacja:

D-Fru-6-{P} + ATP →fosfofruktokinaza-1 (PFK-1) → D-Fru-1,6-bis-{P} + ADP

Reakcja jest fizjologicznie nieodwracalna, ma ponadto duże znaczenie w regulacji glikolizy.

rozszczepienie:

D-Fru-1,6-bis-{P} ↔aldolaza↔ D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy (PGAL) + {P}-dihydroksyaceton

Aldolaza występuje w mózgu, wątrobie i mięśniach. Składa się z 4 podjednostek. Izoenzym A, obecny w
większości tkanek, słabo przeprowadza reakcję Fru-1-{P} → PGAL + {P}-dihydroksyaceton, zaś izoenzym B,
występujący w wątrobie i nerce, przeprowadza obie reakcje z podobnym powinowactwem. Przy niedoborze
aldolazy występuje wrodzona nietolerancja Fru. Z kolei wzrost tej aktywności obserwuje się przy zawale serca,
w zapaleniu wątroby, przy dystrofiach.

izomeryzacja:

D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy ↔izomeraza fosfotriozowa↔ {P}-dihydroksyaceton

utlenianie i fosforylacja:

D-aldehyd 3-{P}-glicerynowy + NAD

+

+ P

i

↔dehydrogenza PGAL↔ 1,3-bis-{P}-glicerynian + NADH + H

+

Dehydrogenaza PGAL jest tetramerem, a każda podjednostka posiada 4 grupy SH, z czego jedna wchodzi w
skład centrum katalitycznego. Ten etap szlaku blokowany jest przez jodooctan.

fosforylacja substratowa

1,3-bis-{P}-glicerynian + ADP ↔kinaza fosfoglicerynianowa, Mg

2+

↔ 3-{P}-glicerynian + ATP

W tej reakcji arsenian rozprzęga procesy utleniania i fosforylacji – nie powstaje ATP.

izomeryzacja – katalizowana przez mutazę fosfoglicerynianową

3-{P}-glicerynian ↔ 2,3-bis-{P}-glicerynian ↔ 2-{P}-glicerynian

dehydratacja

2-{P}-glicerynian ↔enolaza, Mg

2+

/Mn

2+

↔ {P}-enolopirogronian (PEP) + H

2

O

Reakcję tą hamuje obecność fluorków, dlatego dodaje się je do krwi pobieranej w celu oznaczenia poziomu
glukozy.

fosforylacja substratowa

PEP + ADP →kinaza pirogronianowa, Mg

2+

→ enolopirogronian + ATP

enolopirogronian →spontaniczna izomeryzacja→ pirogronian (w formie ketonowej)

Reakcję tą uważa się za fizjologicznie nieodwracalną. Jest ona hamowana przez alaninę. Kinaza pirogronianowa
występuje w kilku formach: R (erytrocyty), L (wątroba), M

1

i M

2

(mózg i mięśnie).

redukcja (w warunkach beztlenowych)

pirogronian + NADH + H

+

↔dehydrogenza mleczanowa (LDH)↔ L-mleczan + NAD

+

LDH posiada 5 izoenzymów, których oznaczenie stosowano przy diagnostyce zawału serca (H

4

) oraz funkcji

wątroby.

•

bilans energetyczny:

dehydrogenaza PGAL

utlenianie 2 NADH

3 x 2 = 6

kinaza {P}-glicerynianowa

fosforylacja substratowa 1 x 2 = 2

kinaza pirogronianowa

fosforylacja substratowa 1 x 2 = 2

fosforylacja heksoz:

heksokinaza

– 1

PFK-1

– 1

LDH

– 2 NADH

– 3 x 2 = – 6

warunki tlenowe: 8 ATP

warunki beztlenowe: 2 ATP

•

regulacja:

heksokinaza ←(-) Glc-6-{P} (produkt reakcji)

PFK-1 ←

← (+) Fru-6-{P}, Fru-2,6-bis-{P}
← (-) ↓ pH (prewencja kwasicy), ATP (znosi to AMP), cytrynian (← cykl Krebsa)
← Fru-1,6-bis-{P} (produkt) (← (-) cAMP)

- -

67

kinaza pirogronianowa ←

← (+)Fru-1,6-bis-{P}
← (-) alanina, cAMP (← (+) glukagon)

•

dalsze możliwe losy pirogronianu:

→transaminaza→ alanina →→ cykl Glu-Ala
→LDH→ mleczan → cykl Cori
→karboksylaza pirogronianowa→ szczawiooctan, jabłczan →→ cykl Krebsa
→dehydrogenza pirogronianowa→ AcCoA → cykl Krebsa / synteza kwasów tłuszczowych
→dekarboksylaza pirogronianowa→ aldehyd octowy → dehydrogenaza alkoholowa → etanol (bakterie)

•

W erytrocytach zachodzi alternatywny szlak glikolizy, różniący się ominięciem reakcji kinazy
fosfoglicerynianowej, zaś wytworzona z 1,3-bis-{P}-glicerynianu energia ulega rozproszeniu. Pozwala
to na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP (występuje
minimalny zysk energetyczny w postaci 1 ATP). Ponadto syntetyzowany jest 2,3-bis-{P}-glicerynian
(BPG) – allosteryczny regulator, przesuwający w prawo krzywą wysycenia hemoglobiny, co w efekcie
ułatwia oddawanie tlenu do tkanek.

1,3-bis-{P}-glicerynian →mutaza bisfosfoglicerynianowa→ 2,3-bis-{P}-glicerynian (BPG)

BPG →fosfataza 2,3-bis-{P}-glicerynianowa→ 3-{P}-glicerynian + P

i

b)

glukoneogeneza

•

Przez glukoneogenezę rozumiemy wszystkie mechanizmy i szlaki metaboliczne odpowiedzialne za
przekształcanie związków niewęglowodanowych w glukozę lub glikogen.

•

lokalizacja
Pełen zestaw enzymów niezbędnych do glukoneogenezy zawierają wątroba i nerki. Enzymy
zlokalizowane są w matriks mitochondrialnej (karboksylaza pirogronianowa), w cytozolu
(karboksykinaza PEP i Fru-1,6-bisfosfataza) oraz na błonach ER (Glc-6-fosfataza).

•

Znaczenie – zaspokajanie zapotrzebowania organizmu na glukozę przy niedostatecznej podaży
węglowodanów w diecie. Pomimo, iż energetyczne potrzeby organizmu mogą być zaspokajane przez
inne związki, dla niektórych przemian metabolicznych niezbędna jest glukoza (energia dla układu
nerwowego, erytrocytów, mięśni pracujących w deficycie tlenowych, pokarm dla płodu, glicerol dla
tkanki tłuszczowej, galaktoza do syntezy mleka). Ponadto za pośrednictwem tego szlaku usuwane są z
krążenia produkty metabolizmu innych tkanek (mleczan, glicerol, proponian).

•

przebieg

Glukoneogeneza obejmuje reakcje glikolizy, cyklu Krebsa oraz niektóre reakcje specjalne. Przebieg
glikolizy nie może zostać w prosty sposób odwrócony, dlatego w dodatkowych reakcjach omijane są jej
bariery termodynamiczne.

pirogronian → PEP

translokacja pirogronianu do mitochondrium

karboksylacja:

pirogronian + CO

2

+ ATP →karboksylaza pirogronianowa, biotyna (wit. H), Mg

2+

→

→ szczawiooctan + ADP + P

i

przeniesienie do cytozolu: wejście w cykl Krebsa → przekształcenie w jabłczan →
translokacja → powrót do szczawiooctanu

dekarboksylacja:

szczawiooctan + GTP →karboksykinaza PEP (PEPCK) → PEP + GDP + CO

2

Fru-1,6-bis-{P} → Fru-6-{P}
Reakcja katalizowana jest przez swoistą Fru-1,6-bisfosfatazę. Jej obecność warunkuje, czy dana tkanka
zdolna jest do syntezy glikogenu z fosfokinaz; zdolność tą posiadają: wątroba, nerki i mięsień.

Glc-6-{P} → Glc
Reakcja katalizowana jest przez swoistą Glc-6-fosfatazę, obecną w wątrobie i nerce, co pozwala tym
narządom na oddawanie glukozy do krwi.

Glc-6-{P} → glikogen
Reakcja ma odmienny przebieg i związana jest z utworzeniem UDP-Glc przez syntazę glikogenową.

- -

68

•

bilans energetyczny:

karboksylaza pirogronianowa

2 ATP

PEPCK

2 ATP

kinaza {P}-glicerynianowa

2 ATP

+ 6 ATP

dehydrogenaza PGAL

2 NADH

6 ATP

•

włączenie glikogenu:

glicerol + ATP →kinaza glicerolowa (wątroba, nerka)→ glicerolo-3-{P} + ADP

glicerolo-3-{P} + NAD+ →dehydrogenaza glicerolo-3-{P}→ {P}-dihydroksyaceton + NADH + H

+

•

metabolizm propionianu:

propionian + CoA + ATP →syntetaza acylo-CoA, Mg

2+

→ propionylo-CoA + AMP + PP

i

propionylo-CoA + CO

2

+ H

2

O + ATP →karboksylaza propionylo-CoA, wit. H→

→ D-metylomalonylo-CoA + ADP + P

i

D-metylomalonylo-CoA →racemaza metylomalonylo-CoA→ L-metylomalonylo-CoA

L-metylomalonylo-CoA →mutaza metylomalonylo-CoA, wit. B

12

→ sukcynylo-CoA

sukcynylo-CoA →→ cykl Krebsa

•

regulacja glikolizy i glukoneogenezy

indukcja i represja syntezy enzymów

obfitość glukozy

insulina

glukagon, GKS

enzymy gliko- i lipolizy

+

+

-

enzymy glukoneogenezy

-

-

+

kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosforylację

glukagon, A → AC → cAMP → kinaza białkowa zal. od cAMP → fosforylacja i inaktywacja kinazy Pyr

modyfikacje allosteryczne

karboksylaza Pyr

fosfofruktokinaza-1 (PFK-1)

- -

69

c)

szlak pentozofosforanowy
(szlak Warburga – Dickensa – Horeckera = WDH; ang. pentose phosphate pathway = PPP)

•

lokalizacja
Enzymy szlaku stanowią składnik cytozolu. Cykl przeprowadzany jest gł. przez wątrobę, nadnarcze,
tarczycę i gruczoł piersiowy. W erytrocytach przetwarzane jest w ten sposób do 10 % glukozy, a
powstałe równoważniki redukujące zużywane są do regeneracji GSH, zabezpieczającego przed
skutkami stresu oksydacyjnego i hemolizą.

•

znaczenie
PPP jest alternatywną drogą metabolizmu glukozy. Dostarcza NADPH do syntez redukcyjnych, np.
biosyntezy KT i steroidogenezy, oraz rybozy do syntezy nukleotydów i koenzymów.

•

porównanie z glikolizą

glikoliza

PPP

akceptor H

NAD

+

NADP

+

CO

2

-

obecny

ATP

produkt

-

rybozo-{P}

-

produkt

•

przebieg

ogólne równanie: 3 Glc-6-{P} + 6 NADP

+

→ 2 Glc-6-{P} + 3 PGAL + 3 CO

2

+ 6 NADPH + 6 H

+

etap oksydacyjny → wytwarzanie NADPH

Glc-6-{P} + NADP

+

→dehydrogenaza Glc-6-{P}, Mg

2+

/Ca

2+

→ 6-{P}-glukonolakton + NADPH + H

+

6-{P}-glukonolakton + H

2

O →hydrolaza glukonolaktonowa, Mg

2+

/Mn

2+

/Ca

2+

→ 6-{P}-glukonian

6-{P}-glukonian + NADP

+

→dehydrogenaza 6-{P}-glukonianowa→ 3-keto-6-{P}-glukonian + NADPH + H

+

3-keto-6-{P}-glukonian → rybulozo-5-{P} + CO

2

etap nieoksydacyjny → wytwarzanie prekursorów rybozy

d)

niektóre zaburzenie przemian glukozy

•

Kwasica mleczanowa – występuje m. in. przy zatruciu As i Hg, niedoborze wit. B

1

, w dziedzicznym

niedoborze dehydrogenazy Pyr, cukrzycy typu II.

- -

70

•

Anemia hemolityczna – jest m. in. objawem dziedzicznego niedoboru aldolazy A i kinazy Pyr w
erytrocytach.

•

Deficyt aktywności PFK w mięśniach → mała wydolność wysiłkowa.

•

Glukozuria = obecność glukozy w moczu w następstwie przekroczenia progu nerkowego dl tego
związaku.

•

Niedobór Fru-1,6-bisfosfatazy → zablokowanie glukoneogenezy → nagromadzenie mleczanu →
kwasica mleczanowa i hipoglikemia.

•

Hipoglikemia – może być efektem upośledzenia utleniania KT, przedawkowania leków
p/cukrzycowych (insulina lub leki doustne), występować w ciąży i u noworodków.

•

Fawizm – choroba spowodowana niedoborem aktywności dehydrogenazy Glc-6-{P}, co powoduje
zahamowanie PPP → deficyt GSH w erytrocytach → ↓ oporność hemolityczna → napadowa hemoliza
po spożyciu związków utleniających (kwas acetylosalicylowy, sulfonamidy, primarchina, ziarna bobu
(łac. vicia fava – stąd nazwa)).

•

Dziedziczna samoistna pentozuria – niedobór aktywności enzymu redukującego ksylulozę w ksilitol →
obecność w moczu znacznych ilości ksylulozy.

5.

Metabolizm glikogenu

a)

synteza glikogenu = glikogenogeneza (gł. mięśnie i wątroba)

Glc →heksokinaza / glukokinaza→ Glc-6-{P}

Glc-6-{P} ↔fosfoglukomutaza, Mg

2+

↔ Glc-1,6-bis-{P} ↔fosfoglukomutaza, Mg

2+

↔ Glc-1-{P}

Glc-1-{P} + UTP →pirofosforylaza UDP-Glc→ UDP + PP

i

PP

i

+ H

2

O →nieorganiczna pirofosfataza→ 2 {P}

UDP-Glc + (C

6

)

n

→syntaza glikogenowa→ UDP + (C

6

)

n+1

•

Ostatnia reakcja może jedynie dołączać glukozę do już istniejącego łańcucha, dlatego do
zapoczątkowania syntezy potrzebny jest primer – białko glikogenina – posiadające przyłączone do Tyr
4 reszty glukozowe.

•

Enzym rozgałęziający posiada aktywność amylo-[1→4]→[1→6]-transglukozydazy: gdy łańcuch staje
się zbyt długi, enzym ten odcina jego część, tworząc zeń boczne odgałęzienie.

•

Wraz ze zwiększaniem liczby nieredukujących reszt końcowych zwiększa się w cząsetczce glikogenu
całkowita liczba miejsc zdolnych do reakcji, umożliwiając przyspieszenie zarówno glikogenogenezy,
jak i glikogenolizy.

b)

fosforoliza glikogenu = glikogenoliza

•

Glikogenoliza nie jest prostym odwróceniem glikogenogenezy, lecz stanowi zupełnie inny szlak
przemian.

(C

6

)

n

+ {P} →fosforylaza→ (C

6

)

n-1

+ Glc-1-{P}

•

Enzym odgałęziający posiada podwójną aktywność:

α[1→4]→α[1→4]-transferazy glukonowej: przenosi trójsacharydową jednostkę z bocznej gałęzi na
łańcuch prosty i odsłania wiązanie α[1→6],

amylo-[1→6]-glukozydazy: odcina resztę glukozy odgałęzionej, w wyniku czego w procesie rozkładu
glikogenu powstaje niewielka ilość wolnej glukozy.

Glc-1-{P} ↔fosfoglukomutaza, Mg

2+

↔ Glc-6-{P}

Glc-6-{P} + H

2

O →Glc-6-fosfataza→ Glc + {P}

•

Glukozo-6-fosfataza występuje jedynie w wątrobie i w nerce, umożliwiając tym narządom eksport
wolnej glukozy z komórek do krwi.

- -

71

c)

integracja regulacji glikogenogenezy i glikogenolizy

•

Regulacja metabolizmu glikogenu jest efektywna dzięki równowadze między aktywnościami syntazy
glikogenowej i fosforylazy.

•

Fosforylaza glikogenu występuje w formie (a) ufosforylowanej oraz w formie (b) zdefosforylowanej.

Fosforylaza mięśniowa jest dimerem, zawiera PLP; forma (a) jest zawsze aktywna, zaś forma (b)
jedynie w obecności AMP, powstającego podczas wysiłku. Aktywacji skurczu mięśnia i glikogenolizy
zapoczątkowywana jest przez to samo białko wiążące Ca

2+

, zapewniając synchronizację tych procesów.

Fosforylaza wątrobowa jest tetramerem, forma (a) jest aktywna, zas forma (b) – nieaktywna.

•

Kinaza fosforylazy składa się z 4 rodzajów podjednostek w stosunku stechiometrycznym (αβγδ)

4

:

podjednostki α i β posiadają reszty Ser, które mogą być odwracalnie fosforylowane przez kinazę
białkową zal. od cAMP,

podjednostka γ zawiera miejsce katalityczne,

podjednostka δ wiąże 4 Ca

2+

, jest identyczna z kalmoduliną i podobna do podjednostki C troponiny

(TpC)

•

Syntaza glikogenowa składa się z 4 podjednostek, z których każda zawiera 7 reszt Ser odpowiadających
7 miejscom odwracalnej fosforylacji, w czym bierze udział co najmniej 6 kinaz białkowych: 2 zal. od
Ca

2+

/kalmoduliny, kinaza fosforylazy, kinaza białkowa zal. od cAMP oraz kinaza-3, 4 i 5 syntazy

glikogenowej (GSK).

•

Zarówno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenowa, mogą być odwracalnie fosforylowane w więcej
niż jednym miejscu przez odrębne kinazy. Te wtórne fosforylacje modyfikują wrażliwość pierwotnych
miejsc do odwracalną fosforylację. Taka wielopunktowa regulacja pozwala insulinie przez wzrost Glc-
6-{P} wywierać skutki przeciwne do cAMP.

d)

glikogenozy – choroby spichrzania glikogenu

numer

nazwa

enzym z deficytem aktywności

I

ch. von Gierkego

Glc-6-fosfataza

II

ch. Pompego

lizosomalna α[1→4] i α[1→6]

glukozydaza (kwaśna maltaza)

III

ch. Forbesa / Cori / dekstrynoza graniczna

enzym odgałęziający

IV

ch. Andersena / amylopektynoza

enzym rozgałęziający

V

syndrom McArdle’a

fosforylaza mięśniowa

VI

ch. Hersa

fosforylaza wątrobowa

VII

ch. Tauri

PFK w mięśniach i erytrocytach

VIII

kinaza fosforylazy w wątrobie

- -

72

6.

Inne szlaki metabolizmu monosacharydów

a)

szlak kwasu uronowego – alternatywny szlak utleniania glukozy, nie prowadzący do powstania ATP
(u człowieka synteza askorbinianu nie zachodzi z powodu braku odp. aktywności enzymatycznej)

- -

73

b)

metabolizm fruktozy

•

↑ podaż fruktozy →

→ ↑ synteza i estryfikacja KT, ↑ wydzielanie VLDL → hipertriacyloglicerolemia, chipercholesterolemia
LDL → działanie aterogenne
→ ↓ ATP → ↑ katabolizm purynowy → ↑ synteza kwasu moczowego → hiperurykemia → urykozuria

•

zaburzenia przemiany fruktozy:

↓ aktywność fruktokinazy → samoistna fruktozuria

↓ aktywność aldolazy B → dziedziczna nietolerancja fruktozy

↓ aktywność Fru-1,6-bisfosfatazy → hipoglikemia

cukrzyca → hiperglikemia → szlak sorbitolowy → zaćma cukrzycowa, neuropatia

c)

metabolizm galaktozy

•

↑ podaż galaktozy →reduktaza aldozowa→ ↑ galaktitol → zaćma

•

przyczyny galaktozemii: ↓ aktywność galaktokinazy, 4-epimerazy lub urydylilotransferazy (→ zab.
metabolizmu {P} w wątrobie → zab. funcki wątroby i mózgu)

- -

74

7.

Metabolizm heteroglikanów

a)

aminocukry – heksozoaminy

•

Prekursorem do syntezy wszystkich aminocukrów jest glukoza. Aminocukry są składnikami
glikoprotein, GAG i glikosfingolipidów – gangliozydów. Najpowszechniej spotykanymi
przedstawicielami są: glukozoamina (GlcNH

2

), galaktozoamina (GalNH

2

), mannozoamina (ManNH

2

)

oraz kwasu sialowe (SA) – gł. kwas neuraminowy (Neu). Aminocukry występują w formie N-
acetylowej (N-Ac-X), a donorem występującej w tych połączeniach grupy N-acetylowej jest AcCoA.

b)

glikoproteiny

•

Glikoproteiny (GP) to białka posiadające łańcuchy oligosacharydowe przyłączone kowalencyjnie do
rdzenia polipeptydowego.

•

Mogą one pełnić następujące funkcje: strukturalne (kolagen), „poślizgowe” (mucyny), transportujące
(transferryna, ceruloplazmina), immunologiczne (immunoglobuliny), hormonalne (TSH, hCG),
enzymatyczne (fosfataza alkaliczna), rola w interakcjach międzykomórkowych.

•

Rola i znaczenie łańcuchów oligosacharydowych GP:

modulacja właściwości fizykochemicznych, np. duże łańcuchy cukrowe w N-GP zwiększają ich
rozpuszczalność w wodzie,

ochrona przed rozkładem (proteolizą) lub umożliwienie obróbki proteolitycznej,

nadawanie aktywności biologicznej,

określenie docelowego miejsca transportu w obrębie komórki, np. sygnał Man-6-{P} powoduje
skierowanie białek do lizosomów,

determinacja okresu półtrwania białka (T

1/2

) w krwiobiegu – na powierzchni hepatocytów obecne są

receptory dla asialo-GP (z odsłoniętą resztą Gal), które są usuwane z krążenia

udział w procesach wzrostu i różnicowania (w tym również lokalizacja przerzutów nowotworowych)

•

Składnikami oligosacharydowych fragmentów GP są: Glc, GlcNH

2

, Gal, GalNAc, Man, Fuc, Xyl,

NeuAc.

•

Wbudowanie sacharydów do GP poprzedzone jest aktywacją prekursorów:

Glc-1-{P} + UTP ↔pirofosforylaza UDP-Glc↔ UDP-Glc + PP

i

UDP-Glc ↔epimeraza UDP-Glc↔ UDP-Gal

UDP-Gal + białko →galaktozylotransferaza→ białko-Gal + UDP

UDP →nukleotydodifosfataza→ UMP + P

i

antyport z/do GERL: UDP-Gal / UMP

- -

75

•

Klasyfikacja GP:

O-GP:

mucyny: GalNAc-Ser/Thr

proteoglikany: Gal-Gal-Xyl-Ser

kolageny: Gal-Hyl

N-GP (GlcNAc-Asp/Glu):

kompleksowe (+ Fuc, + SA)

wysokomannozowe

hybrydowe

zakotwiczone przez GPI

•

Mucyny występują w wydzielinach śluzowych. Dzieli się je na sekrecyjne i leukocytarne. Obecność
NeuAc oraz grup siarczanowych nadaje im ładunek ujemny i związaną z tym lepkość, z kolei
rozbudowana struktura powoduje elastyczność. Budowę ich można schematycznie przedstawić w
postaci: N-C-PTS-C-N, gdzie PTS oznacza sekwencje tandemowe. Mucyny spełniają funkcje ochronne
w stosunku do komórek, są odpowiedzialne za zachodzące między nimi oddziaływania oraz
maskowanie ich antygenów powierzchniowych.

•

Proces O-glikozylacji:

bierze w niej udział zespół glikozylotransferaz glikoproteinowych związanych z błonami, działających
w określanej kolejności, wykazujących swoistość katalityczną względem określonego typu wiązania

odpowiednie enzymy znajdują się w aparacie Golgiego

substratem do reakcji jest bezpośrednio odpowiedni sacharyd

proces zachodzi posttranslacyjnie i dotyczy reszt Ser i Thr

nie występuje {P}-{P}-dolichol ani glikozydazy (por. dalej)

•

Proces N-glikozylacji:

Istotny jest w nim długołańcuchowy (C

100

) alkohol – dolichol, ulegający wpierw fosforylacji:

dolichol + ATP →kinaza dolicholowa→ dolicholo-{P} + ADP

Następnie z pochodnych nukleotydowych i dolicholowych dołączane są doń monosacharydy (w liczbie
po 7 z obydwu rodzajów pochodnych) aż do wytworzenia struktury:

dolichol-{P}-{P}-GlcNAc

2

Man

3

Man

6

Glc

3

.

W kolejnym etapie następuje kotranslacyjne (równoległe z translacją mRNA na białko) przeniesienie
powstałego wcześniej oligosacharydu z dolicholu na białko, katalizowane przez transferazę
oligosacharydowo – białkową (proces hamowany jest przez tunikamycynę). Oligosacharyd przyłączony
zostaje do specyficznej sekwencji Ans-X-Ser/Thr, gdzie X = Pro, Asp lub Glu.

Następnie podstawowa sekwencja reszt sacharydowych w przyłączonej do białka strukturze ulega
dalszym modyfikacjom przez enzymy: α-glukozydazę I i II, mannozydazę α

1

, α

2

oraz I i II aparatu

Golgiego, transferazę GlcNac-{P} I i II, fukozotransferazę, galaktozotransferazę i sialotransferazę.
Jeżeli zachodzi wyłącznie odcinanie istniejących podjednostek sacharydowych, wówczas powstają N-
GP wysokomannozowe, jeżeli zaś dodatkowo dołączane są podjednostki – syntetyzowane są N-GP
kompleksowe i hybrydowe.

•

Glipiacja
Istotą glipiacji jest wyposażenie białka w tzw. kotwicę GPI (glikozylofosfatydyloinozytolową) o
budowie: białko-etanoloamina-{P}-Man

3

-GlcNH

2

-fosfatydyloinozytol, za pomocą której może ono

utrzymywać łączność z błoną komórkową. Zyskuje przez to większą ruchomość w błonie oraz
możliwość pełnienia roli w procesie przekazywania sygnałów. Glipiacja zachodzi posttranslacyjnie.
Dołączenie kotwicy GPI wiąże się z odcięciem z C-końca białka grupy hydrofobowej oraz reakcją z
grupą karboksylową. Rozkładu GPI dokonuje fosfolipaza C (PLC). Do białek wyposażonych w kotwicę
GPI zaliczamy m. in.: acetylocholinoesterazę (AChE) oraz izoenzym jelitowy i łożyskowy fosfatazy
zasadowej (ALP). Defekt kotwicy GPI w obrębie krwinek czerwonych jest przyczyną nocnej
napadowej hemoglobinurii.

c)

proteoglikany

•

Proteoglikany to grupa białek złożonych, zawierających kowalencyjnie przyłączone GAG
(glikozoaminoglikany), które same z kolei mogą być niekowalencyjnie przyłączone do HA.

•

Przykłady proteoglikanów: syndekan, β-glikan, serglikan, prelekan, agrekan, wesikan, dekorin,
biglikan, fibromodulina.

•

Mechanizm syntezy proteoglikanów:

przyłączenie GAG do rdzenia białkowego, zsyntetyzowanego w RER,

wydłużenie łańcucha katalizowane przez odpowiednie glikozylotransferazy – substratami są
nukleotydowe pochodne sacharydów,

- -

76

zakończenie wydłużania łańcucha odbywa się przez siarczanowanie reszt cukrowych bądź przerośniecie
łańcucha poza strefę glikozylacji,

ostateczne modyfikacje polegają na siarczanowaniu przez sulfotransferazy (donorem {S} jest PAPS –
fosfoadenylylosiarczan) oraz epimeryzacji (GlcUA → IdUA)

•

Występowanie GAG w organizmie:

kwas hialuronowy (HA) – płyn stawowy, ciało szkliste oka, tkanka łączna luźna

siarczan chondroityny A i B (CS) – chrząstki, kości, rogówka

siarczan keratanu 1 (KS1) – rogówka

siarczan keratanu 2 (KS2) – tkanka łączna luźna

heparyna (H) – ziarnistości mastocytów, wątroba, płuca, serce

siarczan heparanu (HS) – fibroblasty skóry, ściana aorty

siarczan dermatanu (DS) – występuje powszechnie

•

Funkcje GAG w organizmie:

składniki strukturalne macierzy pozakomórkowej (ECM),

oddziaływanie z białkami macierzy,

wiązanie kationów,

kształtowanie napięcia tkanek,

ułatwianie migracji komórek (HA),

sprężystość chrząstki (HA, CS),

przejrzystość rogówki (KS1, DS),

funkcja antykoagulacyjna (H) – gł. egzogenna,

receptory interakcji międzykomórkowych (HS),

selektywność filtracji kłębuszkowej (HS),

składniki pęcherzyków (HS)

d)

Mukopolisacharydozy (MPS) – są to wrodzone zaburzenia metaboliczne związane z defektami hydrolaz
lizosomalnych katabolizujących GAG (endo- i egzoglikozydaz, sulfataz itd.). Spowodowane są
mutacjami genów kodujących enzymy uczestniczące w rozkładzie określonych GAG. Niedobór
hydrolaz powoduje spichrzanie ich substratów w różnych tkankach, m. in.: wątroba, śledzona, kości,
skóra, OUN. Skutkuje to powiększeniem narządów, zaburzeniami wzrostu, zniekształceniami twarzy
oraz upośledzeniem umysłowym. Najczęściej występujące mukopolisacharydozy to zespoły: Hurler –
Scheiego, Huntera, Sanfilippo A – D, Morquio A – B, Monteaux – Lamy, Sly’ego.

8.

Regulacja przemiany węglowodanów

a)

zróżnicowanie tkankowe przemiany węglowodanowej i integracyjna rola wątroby

•

Poszczególne narządy organizmu różnią się zarówno sposobem pobierania cukrów (ich przenośnikami),
jak i zestawem enzymów biorących udział w ich metabolizmie oraz wrażliwością na bodźce
metaboliczne i hormonalne, regulujące przemianę węglowodanową.

•

Dla mózgu jedynym źródłem energii jest glukoza, a jej niedostatek, np. w wyniku zatrzymania akcji
serca, powoduje zmiany w obrębie kory mózgowej już po kilku minutach.

•

W komórkach mięśniowych (miocytach) zachodzi glikoliza, mogąca dostarczać energii nawet pod
nieobecność tlenu i zaciągać dług tlenowy. Powstały mleczan wydalany jest do krwi, wchodząc
następnie w cykl Corich. Część mleczanu, jak również glukoza pobierana z krwi, przekształcane są w
glikogen, który może ulegać fosforolizie. Nie występuje możliwość oddawania glukozy do krwi.
Produktem przemian (po transaminacji szczawiooctanu) może być alanina, usuwana do krwi i zasilająca
cykl glukozowo – alaninowy.

•

Tkanka tłuszczowa (adipocyty) pobiera glukozę z krwi i przekształca ją w 3-{P}-glicerynian i dalej w
glicerol, wykorzystywany do syntezy TAG. Po lipolizie glicerol usuwany jest do krwi, po czym
wątroba regeneruje go w szlaku glukoneogenezy.

•

W krwinkach czerwonych (erytrocytach) nie występują mitochondria, dlatego glukoza jest jedynym
źródłem energii. Ma tu miejsce modyfikacja glikolizy z powstaniem BPG, allosterycznego modyfikaora
uwalniającego tlen z oksyhemoglobiny. Ok. 10 % glukozy zużywana jest w oksydacyjnym etapie PPP
w celu regeneracji zredukowanej formy glutationu (GSH).

•

Nerka pod względem zestawu enzymów podobna jest do wątroby. Ma możliwość przeprowadzenia
glukoneogenezy, glikogenolizy łącznie z oddawaniem glukoz do krwi oraz fosforylację i dalsze
przemiany frukozy.

•

W gruczole sutkowym w okresie laktacji następuje przekształcanie glukozy w galaktozę oraz synteza
laktozy z obu powyższych monosacharydów.

- -

77

•

Tkanki przeprowadzające syntezy redukcyjne zużywają dużo glukozy na pierwszy, a tkanki
intensywnie dzielące się – na drugi etap PPP.

•

Wątroba pełni nadrzędną rolę, koordynując metabolizm węglowodanów w całym organizmie. Dochodzi
tu do regeneracji glukozy z produktów przemiany innych tkanek, tj.: mięśni, erytrocytów, czy tkanki
tłuszczowej, a więc: mleczanu, glicerolu, alaniny i propionianu. Zachodzi PPP. Stężenie glukozy we
krwi w okresie między posiłkami regulowane jest dzięki glikogenogenezie i glikogenolizie z
możliwością oddawania glukozy do krwi. Przeprowadzana jest izomeryzacja fruktozy do glukozy.
Działa szlak kwasu uronowego, dostarczając tego substratu do syntezy proteoglikanów. Z
glukuronianem sprzęgane są steroidy, bilirubina, leki i ich metabolity (np. kwas acetylosalicylowy), co
ułatwia ich wydalenie z moczem (funkcja detoksykacyjna). Granulocyty łącznotkankowego zrębu
wątroby produkują GAG heparynę, będącą naturalnym antykoagulantem. Wątroba jest zatem miejscem
zbierającym wszystkie szlaki metabolizmu węglowodanów.

b)

kontrola stężenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu węglowodanów

•

Glukoza w organizmie jest produktem i substratem wielu reakcji. Pojawia się w wyniku spożywania
pokarmów oraz przekształceni dwojakiego rodzaju związków – recyclingowych (mleczan i alanina)
oraz nierecyclingowych (aa, propionian i glicerol). Zużywana jest przez różne tkanki do różnych celów.

•

Regulacja stężenie glukozy odbywa się już na etapie jej wchłaniania. Powszechna w komórkach
heksokinaza jest allosterycznie modyfikowana przez glukozo-6-{P}, ma więc miejsce pewna
autoregulacja. W wątrobie i trzustce obecna jest niewrażliwa na glukozo-6-{P} glukokinaza oraz
dwukierunkowy transporter GLUT-2.

•

W komórkach B (β) trzustki napływ glukozy powoduje zwiększenie stężenia ATP, które blokuje kanały
K

+

. W podobny sposób działają doustne leki p/cukrzycowe – poch. sulfonylomocznika (m. in.

tolbutamid i gliburyd). Powoduje to dalej depolaryzację i otwarcie napięciowo-zależnych kanałów Ca

2+

,

co powoduje egzocytozę do krwi pęcherzyków zawierających insulinę. Dodatnio na jej wydzielanie
wpływają KT i aa, ujemnie zaś aminy katecholowe. Insulina dociera do swojego receptora o
stechiometrii α

2

β

2

. Podjednostka α bezpośrednio wiąże insulinę dzięki obecności domeny bogatej w

Cys. Podjednostka β ulokowana jest transbłonowo – jej część zewnętrzna łączy się z podjednostką α
przez mostek dwusiarczkowy, część cytozolowa zaś wykazuje aktywność kinazy tyrozynowej i
właściwości autofosforylujące. Przyłączenie insuliny do receptora indukuje w nim zmiany
konformacyjne. Receptory grupują się i internalizują w pęcherzyki klatrynowe, skąd mogą być
recyclingowane do cytoplazmy. Fosforylacja własnych i obcych reszt tyrozynowych stanowi podstawę
wewnątrzkomórkowego przekaźnictwa sygnału. Substrat IRS2 daje IRS2-Y-P i aktywuje kinazę PI3.
Ta zaś pośrednio powoduje szereg efektów:

translokację do błony transporterów GLUT-4 oraz receptorów własnych i IGF-2,

zmianę aktywności genów: PEPCK, IGFBP, glukagonu, hekso- i glukokinazy oraz kinazy
pirogroninowej,

zmianę aktywności enzymów przemiany: cAMP, glukozy, glikogenu (podwójnie), lipidów i cząsteczek
sygnałowych.

Z kolei IRS → IRS-Y-P a Shc → Shc-Y-P wpływają na mobilizację wzrostu komórek i syntezy DNA.
Insulina wpływa na rozwój organizmu, a jej brak powoduje leprechaunizmu (krasnoludkowatości). W
ten sposób dochodzi do zmniejszenia poziomu glukozy we krwi (efekt hipoglikemizujący).

•

Spadek poziomu glukozy w osoczu powoduje z kolei uwalnianie glukagonu przez komórki A (α) wysp
trzustkowych, który indukuje fosforylazę wątrobową, powodują glikogenolizę i uwalnianie glukozy do
krwi. W przeciwieństwie do glukagonu, aminy katechlowe wpływają zarówno na fosforlazę mięśniową,
jak i wątrobową, przez co umożliwiają mięśniom efektywniejszą pracę. Pomaga to również w
wytężonej pracy umysłowej, gdyż układ nerwowy jest wówczas lepie zaopatrzony w glukozę.
Uwalniany przy skurczu mięśnia wapń dodatkowo i podwójnie mobilizuje glikogenolizę.

•

Efekt hiperglikemizujący wywierają również glikokortykoidy przez mobilizację glukoneogenezy i
przysparzanie dla niej substratów, a także hormony przedniego płata przysadki (GH, ACTH),
demobilizujące przenośnik GLUT-4.

- -

78

ROZDIZAŁ V – LIPIDY

1.

Budowa chemiczna, podział i rola tłuszczów prostych i złożonych

a)

funkcje tłuszczów:

materiał energetyczny

tkanka tłuszczowa jest izolatorem termicznym oraz mechanicznie ochrania delikatne narządy przed
uszkodzeniem

izolacja elektryczna wokół aksonów mielinowych

składniki błon biologicznych

rozpuszczalniki witamin lipofilnych (A, D, E, K, F) oraz EFA

prekursory hormonów (steroidy), cząsteczek aktywnych biologicznie i międzykomórkowych
przekaźników informacji (eikozanoidy)

b)

podział lipidów:

proste (KT + alkohol)

tłuszcze właściwe (KT + glicerol) ... oleje płynne

woski (KT + długołańcuchowy alkohol alifatyczny)

złożone (KT + alkohol + X)

fosfolipidy (KT + alkohol + {P} + zasada azotowa)

glicerofosfolipidy

sfingofosfolipidy

glikolipidy = glikosfingolipidy (KT + glicerol + sacharyd)

inne

sulfolipidy

aminolipidy

prekursory i poch. lipidów: KT, glicerol, steroidy, alkohole, aldehydy tłuszczowe, ciała ketonowe,
węglowodory, witaminy lipofilne, hormony

lipidy obojętne = glicerydy oraz cholesterol wolny i jego estry

c)

kwasy tłuszczowe (KT, ang. fatty acids – FA)

KT dzielimy ogólnie na nasycone i nienasycone; są one nierozgałęzione i posiadają zazwyczaj parzystą
liczbę atomów węgla

kwasy nasycone w niższych temperaturach przyjmują formę zygzaka, zaś w wyższych dochodzi do
rotacji wokół wiązań podwójnych – dlatego błony biologiczne stają się cieńsze ze wzrostem
temperatury

w kwasach nienasyconych wiązania podwójne dodawane są między istniejącym wiązaniem podwójnym
a karboksylowym atomem węgla, dlatego wyodrębnić można rodziny ω9, ω6 i ω3; naturalne kwasy
nienasycone występują zazwyczaj w konfiguracji cis (kształt litery L o rozwarciu 120

o

)

n

3

2

1

CH

3

... CH

2

CH

2

COOH

ω

β

α

oznaczenie położenia wiązania podwójnego: 18:1,9; ∆

9

18:1; ω9 C18:1; n-9, 18:1

kwasy o konfiguracji trans występują w margarynie, wytwarzanej przez utwardzanie tłuszczów
roślinnych oraz w tłuszczach przeżuwaczy

w wielonienasyconych KT zwiększa się ilość możliwych konfiguracji, np. C20:4 – forma słupa lub
litery U

temperatura topnienia KT wzrasta wraz z długością łańcucha, zaś maleje ze wzrostem nienasycenia
cząsteczki; regulacja T

t

i związanego z tym składu KT zachodzi zależnie od funkcji – lipidy zapasowe

są nasycone, składniki błon już bardziej płynne, najbardziej zaś lipidy tkanek narażonych na chłód

d)

triglicerydy (TG) = triacyloglicerole (TAG)

TAG są główną formą zapasową KT

przyłączone do glicerolu KT zazwyczaj różnią się od siebie

z trójwymiarowego punktu widzenia atomy C

1

i C

3

glicerolu różnią się między sobą i są odmiennie

rozpoznawane przez enzymy

w syntezie i hydrolizie TAG biorą udział monoacyloglicerole (MAG) i diacyloglicerole (DAG)

- -

79

e)

fosfolipidy

głównym związkiem pośrednim syntezy TAG i fosfoglicerydów jest kwas fosfatydowy (KF: glicerol +
KT

1

+ KT

2

+ {P}); w pozycji sn-1 znajduje się zazwyczaj rodnik nasycony, zaś w sn-2 – rodnik

nienasycony

fosfoglicerydy występujące w organizmie ludzkim:

fosfatydyloglicerol (KF + glicerol)

bisfosfatydyloglicerol = kardiolipina (KF + glicerol + KF) – syntetyzowany w mitochondriach z
fosfatydyloglicerolu, składnik wewnętrznej błony mitochondrialnej, odpowiedzialny w dużym stopniu
za jej nieprzepuszczalność dla jonów

fosfatydyloetanoloamina = kefalina (KF + etanoloamina)

fosfatydylocholina = lecytyna (KF + cholina) – istotny składnik błon biologicznych, pełniący rolę w
przewodnictwie nerwowym; ponadto stanowi zapas grup metylowych oraz źródło rodników acylowych
do estryfikacji cholesterolu; dipalmitoilolecytyna jest składnikiem surfaktantu płucnego, którego
niedobór manifestuje się zespołem błon szklistych

fosfatydyloseryna (KF + Ser), fosfatydylotreonina (KF + Thr)

fosfatydyloinozytol (PI) (KF + mio-inozytol) + 2{P} → fosfatydyloinozytolo-4,5-bis{P} (PIP

2

) – rola

w wewnątrzkomórkowym szlaku przekazywania sygnałów

lizofosfolipidy (np. lizolecytyna) zawierają tylko jeden acyl, drugie miejsce pozostaje wolne

plazmalogeny stanowią 10% fosfolipdów mózgu i mięśni, posiadają przy C

1

wiązanie eterowe oraz

nienasycony alkohol (np. kwas plazmenowy + etanoloamina → plazmalogen etanoloaminowy =
plazmenyloetanoloamina)

sfingomieliny (ceramid + {P} + cholina; ceramid = sfingozyna + KT połączone wiązaniem amidowym)

f)

glikolipidy

tworzą one sacharydy powierzchni komórki (glikokaliks)

glikosfingolipidy = ceramid + fragment cukrowy

cerebrozydy

glukozyloceramid – tkanki pozanerwowe

galaktozylocerebrozyd – w mózgu i tkance nerwowej

sulfogalaktozylocerebrozyd (sulfatyd) – składnik mieliny

globozydy = ceramid + aminocukier

gangliozydy są pochodnymi glukozyloceramidu zawierającymi kwas sialowy (SA; gł. N-Ac-
neuraminowy = NANA); występują gł. w tkance nerwowej, pełniąc m. in. funkcje receptorowe

GM

3

: Cer-Glc-Gal-NeuAc

GM

1

: Cer-Glc-Gal(-NeuAc)-GalNAc-Gal – receptor toksyny cholery w jelicie cienkim

g)

steroidy

budowa steroidów opiera się na szkielecie węglowym cyklopentanoperhydrofenantrenu:

pierścienie cykloheksanowe występują w formie krzesłowej

wzajemne ułożenie pierścieni: A-B – cis/trans; B-C – trans; C-D – trans (w wyj. glikozydów
nasercowych)

h)

poliprenoidy składają się z jednostek izoprenowych (-CH=C(-CH

3

)-CH=CH-)

np.: koenzym Q (ubichonon), dolichol, witaminy A, E, K, β-karoten, kamfora, kauczuk

2.

Trawienie i wchłanianie lipidów

•

Lipaza językowa (optimum 4 – 4,5) wytwarzana jest przez gruczoły Ebnera na grzbiecie języka (u
człowieka enzym ten nie jest aż tak istotny)

•

W żołądku panują odpowiednie warunki do hydrolizy lipidów – temperatura powoduje ich upłynnienie,
ruchy perystaltyczne wspomagają proces tworzenia emulsji tłuszczowych, lipaza żołądkowa (optimum
4 – 4,5) wraz ze ślinowa trawią TAG do 1,2-DAG i KT. Optymalne pH dla lipaz wynosi 3 – 6. Chętniej
odszczepiane są KT krótsze i nienasycone, dlatego lipidy mleka są najlepszym substratem. KT krótko- i

- -

80

średniołańcuchowe wchłaniane są przez ścianę żołądka do ż. wrotnej, zaś KT długołańcuchowe
rozpuszczają się w kroplach tłuszczowych i wędrują do dwunastnicy.

•

Wątroba produkuje żółć, która zagęszczana jest w pęcherzyku żółciowym. Składa się z wody (86-97%)
i rozpuszczonych w niej składników stałych: kwasów żółciowych (37%), mucyny i barwników (21%),
soli nieorganicznych (33%), KT (7%) i cholesterolu (2%). śółć powoduje emulgację lipidów i pokrycie
nimi cząstek pokarmu, zobojętnienie treści żołądkowej, wydalanie cholesterolu, kwasów żółciowych i
barwników żółciowych, a także leków, toksyn i metali ciężkich (Cu, Zn, Hg).

•

Wraz z żółcią do dwunastnicy wydalany jest sok trzustkowy zawierający lipazę trzustkową
(optimum 8); trypsyna usuwa N-końcowy pentapeptyd (enterostatynę) z prolipazy, dając aktywną
lipazę, hamowaną początkowo przez sole kwasów żółciowych. Kolipaza łączy się z lipazą i fazą
graniczną TAG pokrytych przez sole – po zakotwiczeniu lipazy kolipaza znosi efekt inhibicji soli.
Lipaza odłącza KT z pozycji sn-1 i sn-2, a gł. produktami końcowymi trawienia są 2-MAG, które tylko
w 20% są izomeryzowane i rozkładane.

•

Esteraza cholesterolowa aktywowana solami kwasów żółciowych rozkłada estry cholesterolu, który
wchłaniany jest w formie wolnej.

•

Trzustkowa fosfolipaza A

2

(PLA

2

) aktywowana trypsyną i Ca

2+

przekształca glicerofosfolipidy w

lizofosfolipidy – detergenty wspomagające emulgację i trawienie tłuszczów.

•

W jelicie fosfataza (optimum 8,6) odszczepia {P} z glicerofosforanów, zaś zespół fosfolipaz (A

1

, A

2

, B,

C, D) rozkłada glicerolofosfolipidy na poszczególne składowe.

•

KT, 2-MAG i niewielkie ilości 1-MAG dyfundują z fazy olejowej zawiesiny tłuszczowej do miceli
mieszanych i liposomów, które z kolei osiągają rąbek szczoteczkowy śluzówki i ulegają wchłonięciu do
enterocytów. W ścianie jelita 1-MAG ulegają dalszej hydrolizie. 2-MAG wchodzą w szlak
monoacyloglicerolowy i są przekształcane do TAG (resynteza) przy udziale syntetazy acylo-CoA. TAG
zawierające KT o łańcuchach krótkiej i średniej długości mogą być wchłaniane bezpośrednio i
rozkładane w nabłonku. Produkty rozkładu lipidów przekształcane są do acylo-CoA i wykorzystywane
jako substraty do resyntezy TAG. Glicerol z jelita wędruje do krążenia wrotnego, zaś pochodzący z
enterocytów ulega przekształceniu do glicerolo-3-{P} i wbudowaniu w TAG. Powstałe w jelicie TAG
stanowią składnik chylomikronów limfy i wędrują przewodem piersiowym do lewego kąta żylnego,
gdzie osiągają łożysko żylne. KT krótszy niż C

10

przechodzą jako FFA do ż. wrotnej, gdyż nie zajmuje

się nimi syntaza acylo-CoA.

•

Poza witaminą D fitosterole nie wchłaniają się ze światła jelita.

•

zaburzenia wchłaniania:

zwłóknienie torbielowate trzustki (mukowiscydoza) → niewydolność egzogenna → stolce tłuszczowe

niedobór kolipazy → niedobór aktywnej lipazy trzustkowej → stolce tłuszczowe (steatorrhoea)

przetoka limfatyczno – moczowa → chyluria (wydalanie: „mlecznego moczu”) → karmienie KT < C

12

niepr. połączenie naczyń limfatycznych jamy brzusznej z jamą opłucnową → chylothorax → karmienie
KT < C

12

kamica żółciowa
Tworzenie kamieni żółciowych spowodowane jest niedostateczną rozpuszczalnością cholesterolu w
żółci. Rozpuszczalność ta zależy od stosunku stężeń cholesterolu, fosfatydylocholiny i soli kwasów
żółciowych (prawidłowo: 5% : 15% : 80%) oraz od zawartości wody. U chorych z kamica ma miejsce
spadek aktywności 7α-hydroksylazy i w efekcie zmniejszenie puli kwasów żółciowych w krążeniu
jelitowo – wątrobowym oraz wzrost syntezy cholesterolu przez hepatocyty, co z kolei powoduje
przesycenie żółci cholesterolem. Sprzyjający czynnik, np. infekcja bakteryjna, inicjuje powstanie jąder
krystalizacji, które nie wydalone wzrastają do znacznych rozmiarów. Powstałe kamienie usuwa się
operacyjnie (wraz z pęcherzykiem) lub rozbija ultradźwiękami. Litogenność żółci zmniejsza kwas
chenodeoksycholowy przez hamowanie syntezy cholesterolu na etapie HMG-CoA, natomiast
zwiększają niektóre leki, np. fibraty.

- -

81

3.

Transport lipidów w chłonce i w osoczu

a)

budowa lipoprotein

•

skład lipidów osocza:

TAG

fosfolipidy

ch. całk.

ch. wolny

WKT

mM

1,6

3,1

5,2

1,4

0,4

% KT

45

35

15

-

5

•

Problem transportu niepolarnych lipidów (TAG i estrów cholesterolu) w polarnym środowisku osocza
rozwiązany został przez ich związanie z lipidami amfipatycznymi (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z
białkami. W ten sposób powstają lipoproteiny (Lp). Lp składa się z lipidowego rdzenia (TAG i estry
cholesterolu), warstwy powierzchownej (fosfolipidy i wolny chlesterol) oraz z apolipoproteiny (apoLp)
o zróżnicowanej mobilności. ApoLp spełniają różne funkcje:

mogą stanowić część struktury Lp, np. apoB,

mogą stanowić kofaktory enzymów, np. A I dla LCAT, C II dla LPL,

mogą być ligandami dla receptorów Lp, np. B

100

+ E ↔ rec. LDL, A I ↔ HDL.

•

Podziału lipoprotein dokonuje się za względu na ich gęstość oraz umiejscowienie elekktroforetyczne:

klasa

położenie

gł. składnik

Φ

ρ

% białek

% lipidów

gł. apoLp

chylomikrony 0 (bezruch)

B

48

VLDL

pre-β

TAG

B

100

IDL

LDL

β

cholesterol

B

100

HDL

α

fosfolipidy

A

VHDL

FFA

↑
↑
↑

↓
↓
↓

↓
↓
↓

↑
↑
↑

albumina

Φ – średnica; ρ – gęstość

b)

transport lipidów w lipoproteinach osocza

•

Lipoliza TAG i działanie lipazy Lp (LPL) są źródłem WKT, które łączą się z albuminami osocza. Ich
ilość waha się w szerokich granicach: w stanie poabsorpcyjnym wynosi 0,5 mM, w głodzeniu 0,8 mM,
a w cukrzycy nawet 2 mM. WKT są najbardziej aktywną metabolicznie frakcją lipidów osocza. Ulegają
one utlenianiu lub estryfikacji – stan odżywienia ma niewielki wpływ na frakcję WKT pobieranych
przez tkanki, wpływa natomiast na proporcję kwasów utlenianych do estryfikowanych.

•

W pobliżu błony kompleks albumin z KT dysocjuje i te ostatnie wiązane są przez błonowe białko
wiążące KT. Następnie zachodzi kotransport z Na

+

oraz wiązanie przez wewnątrzkomórkowe białko

wiążące KT.

•

TAG eksportowane są przez jelito i wątrobę – jedyne narządy, skąd lipidy wędrują jako Lp. Na RER
produkowana jest apoB, która w SER ulega połączeniu z lipidem, a w aparacie Golgiego glikozylacji,
po czym Lp usuwana jest z komórki na zasadzie odwróconej pinocytozy.

•

W jelicie TAG pakowane są w chylomikrony, które – ze względu na rozmiary – nie mogą przejść przez
środbłonek naczyniowy, wobec czego usuwane są do przestrzeni między enterocytami, a stamtąd do
układu limfatycznego jelita. Wraz z chłonką dostają się do przewodu piersiowego, aby w lewym kącie
żylnym dostać się do układu krwionośnego.

•

Wątroba wysyła TAG w postaci VLDL, które przechodzą przez przestrzeń okołozatokową (Dissego) do
zatok wątrobowych, a stąd przez okienka śródbłonka do krwi.

•

Gdy chylomikrony i VLDL znajdą się już w układzie krążenia, przenoszone są na nie apoLp z HDL –
apoC i apoE.

•

TAG chylomikronów i VLDL hydrolizowane są przez LPL zlokalizowaną w ścianach włośniczek,
zakotwiczoną przez siarczan heparanu. LPL występuje w sercu, tkance tłuszczowej, śledzionie, płucach,
rdzeniu nerki, aorcie, przeponie, gruczole sutkowym i wątrobie noworodka. Ilość LPL zwiększa się po
podaniu heparyny. Kofaktorami hydrolizy są fosfolipidy i apoC II.

- -

82

•

Niewielka ilość KT wraca do krwiobiegu, aby związać się z albuminą, większość zaś wnika do tkanek.
K

M

tkanki tłuszczowej = 10 x K

M

serca, dlatego podczas głodzenia zachodzi redystrybucja pobierania

KT z tkanki tłuszczowej na korzyść serca. Podobna sytuacja ma miejsce w gruczole sutkowym podczas
laktacji.

•

LPL pozbawia chylomikrony 90% TAG i apoC, która wraca do HDL, ale nie apoE, która towarzyszy
chylomikronom resztkowym (remnantom chylomikronów). Podobnie VLDL przechodzi w remnenty
VLDL, czyli IDL. Oba typy remnantów wychwytywane są przez hepatocyty w procesie endocytozy z
udziałem receptorów (receptor B

100

+ E, LRP = receptor α

2

-makroglobuliny). Lipaza wątrobowa działa

jako ligand Lp oraz uczestniczy w hydrolizie jej TAG oraz fosfolipidów. IDL nie wychwycone przez
wątrobę ulegają przekształceniu w LDL (przenoszące gł. cholesterol).

•

LDL ulegają degradacji w wątrobie (70%) oraz w tkankach pozawątrobowych (30%) – wychwytywane
są przez receptor LDL (B

100

+ E). W apoB

48

brakuje C-domeny apoB

100

, czyli właściwego ligandu dla

receptora, z powodu procesu redagowania mRNA w jelicie (transkrypcji do apoLp ulega tylko 48%
genu – por. punkt VIII-3-d).

•

Receptor LDL jest białkiem transbłonowym o masie 115 kD, posiadającym 5 domen:

1: N-koniec – wiąże się z sekwencją 7 x 40 (↑ Cys) → ujemnie naładowane boczne łańcuchy oddziałują
z dodatnio naładowaną apoB

100

; po endocytozie protonacja Gln i Asn w kwaśnych endosomach uwalnia

LDL od receptora

2: homologiczna do części EGF, zawiera 2 łańcuchy oligosacharydowe (N)

3: dużo reszt Ser/Thr z przyłączonymi sacharydami (O) – te i zw. z glikoforyną funkcjonują jako
podpórki – odstają od błony, dzięki czemu domena 1. jest dostępna dla LDL

4: transbłonowa

5: cytozolowa, kontaktuje oddziaływanie receptora z dołkami opłaszczonymi → reguluje endocytozę

•

HDL syntetyzowane są w wątrobie i w jelicie w połączeniu z apoA I, po czym w osoczu dołączane są
apoC i apoE (HDL stanowi ich skład). Nowo wytworzona HDL ma kształt dyskoidalny, zawiera
dwuwarstwę fosfolipidową, wolny cholesterol, apoA I i LCAT (acylotransferaza lecytyna : cholesterol).
LCAT przenosi acyle z fosfolipidów (lecytyna) na cholesterol, dając estry cholesterolu i lizolecytynę; te
pierwsze wnikają do wnętrza, zaś lizolecytyna łączy się z albuminą osocza. W ten sposób HDL

3

staje

się pseudomicelarne i przekształca w HDL

2

, które znów ulega lipazie wątrobowej i powraca jako HDL

3

,

dodatkowo oddzielana jest wolna apoA I, która tworzy pre-β-HDL lub jest rozkładana w nerce.
Aktywność lipazy wątrobowej zwiększają androgeny, a zmniejszają estrogeny, dlatego kobiety
posiadają więcej HDL

2

.

c)

zaburzenia transportu lipoproteinowego

•

hipolipoproteinemie

abetalipoproteinemia → kropelki lipidów gromadzą się w ścianie jelita i wątrobie

rodzinna hipobetlipoproteinemia → ↓ LDL → długowieczność

rodzinny niedobór α-lipoproteiny → ch. wyspy Tanger / ch. rybiego oka, niedobory apoA I

•

hiperlipoproteinemie

rodzinny brak LPL (I) – powolne oczyszczanie osocza

rodzinna hipercholestrolemia (II) → wysoka aterogenność (szybsza miażdżyca)

ch. Walmana – spichrzanie cholesterolu

rodzinna hiperbetalipoproteinemia (III) – defekt apoE, żółtaki, aterogenność

rodzinna hipertriacyloglicerolemia (IV) → aterogenność, NIDDM, otyłość

rodzinna hiperlipoproteinemia (V) → ↑ TAG i cholesterol

rodzinna hiperalfalipoproteinemia → ↑ HDL → długowieczność

niedobór LPL → zwyrodnienie tłuszczowe ścian naczyń

rodzinny niedobór LCAT → HDL rulonowe, obecna Lp X

rodzinny nadmiar Lp α → ↓ fibrynoliza, aterogenność

•

apoE występuje w trzech izoformach (E

2

, E

3

, E

4

) – pacjenci homozygotyczni względem genu E

4

wykazują kilkakrotne zwiększenie zachorowalności na ch. Alzheimera, gdyż apoE

4

łatwiej wiąże się do

β-amyloidu płytek zwyrodnieniowych układu nerwowego.

- -

83

d)

rola wątroby w metabolizmie lipidów (patrz również punkt VII-5-b)

produkcja żółci ułatwiającej trawienie i wchłanianie lipidów z jelita

aktywne układy enzymatyczne syntetyzujące i utleniające KT, syntetyzujące TAG i fosfolipidy

przekształcanie KT w ciała ketonowe (ketogeneza)

integracja metabolizmu Lp osocza

Wzrost syntezy TAG i wydzielanie VLDL występuje w stanie sytości, przy karmieniu węglowodanami
(zwł. fruktozą), przy wysokim poziomie WKT, przy spożywaniu etanolu oraz przy wzroście stosunku
insulina : glukagon.

Mechanizm zmian patomorfologicznych wątroby:
marskość ← włóknienie ← stłuszczenie (nagromadzenie lipidów gł. TAG) ←
← typ I: ← ↑ WKT ← mobilizacja z adipocytów, hydroliza TAG przez LPL, ↓ insulina (← głodzenie)
← typ II: metaboliczny blok syntezy Lp

← blok syntezy apoLp

← puromycyna, etionina (→ ↓ ATP), CCl

4

, CHCl

3

, P, Pb, As

← ↓ synteza VLDL ← ↓ synteza białka ← głodzenie

← blok łączenia apoLp z lipidami ← stres oksydacyjny ← CCl

4

← niewydolność wydzielnicza

← stres oksydacyjny ← CCl

4

← zab. glikozylacji ← kwas orotowy

← ↓ fosfolipidy ← ↓ EFA, ↑ cholesterol, ↓ cholina (cz. lipotropowy) ← ↓ Met (donor grupy metylowej)

Metabolizm etanolu:
I: etanol + NAD

+

→dehydrogenaza alkoholowa→ aldehyd octowy + NADH

aldehyd octowy →dehydrogenaza aldehydowa→ kwas octowy → AcCoA

NADH → ↓ utlenianie i ↑ estryfikacja KT → stłuszczenie wątroby

→ ↑ lipogeneza, ↑ biosynteza cholesterolu

→ hiperlaktocydemia → ↓ wydalanie moczanów

→ hamowanie dehydrogeazy jabłczanowej → hamowanie cyklu Krebsa (TCA)

II: etanol + NADPH + O

2

→MEOS→ aldehyd octowy + NADP

+

+ 2 H

2

O

→ adaptacja do alkoholizmu

→ konkurencja z lekami (np. barbiturany)

III: katalaza (niewielki udział)

- -

84

4.

Tkanka tłuszczowa – rola w metabolizmie lipidów

a)

metabolizm adipocytów

•

Tkanka tłuszczowa jest głównym magazynem TAG w organizmie, których ilość jest wypadkową
szybkości lipogenezy i β-oksydacji.

•

Jednym z substratów do syntezy TAG jest gligerolo-3-{P}, który może powstawać dzięki kinazie
glicerolowej. Ta jednak wykazuje niewielką aktywność, wobec czego źródłem jest glukoza,
przekształcana w procesie glikolizy w {P}-hydroksyaceton, redukowany następnie przez
dehydrogenazę glicerolo-3-{P} do glicerolo-3-{P}. Glukoza może również: zasilać TCA (→ CO

2

), PPP

(→ NADPH), być przekształcona w AcCoA i dalej w acylo-CoA.

•

Do adipocytów docierają TAG z Lp. Po rozkładzie przez LPL glicerol wraca do osocza i jest
metabolizowany przez kinazę glicerolową w wątrobie lub nerkach, zaś KT tworzą pulę WKT

2

o

krótkim T

1/2

.

•

TAG adipocytów ulegają lipolizie przez lipazę wrażliwą na hormony ((+): ACTH, TSH, ADH, A/NA,
glukagon, (-): insulina, PGE

1

, kwas nikotynowy) do glicerolu, usuwanego do osocza oraz do KT

tworzących pulę WKT

1

. Obie pule WKT dostarczają substratu do syntezy acylo-CoA.

•

Gdy estryfikacja nie równoważy lipolizy, WKT gromadzą się i przenikają do osocza, łącząc się z
albuminami.

- -

85

b)

regulacja

•

Procesy zachodzące w tkance tłuszczowej podlegają ścisłe regulacji hormonalnej.

•

Insulina mobilizuje przenośnik GLUT-4 na powierzchnię komórki, wzmaga aktywność dehydrogenazy
pirogronianowej, karboksylazy AcCoA (ACC) i acylotransferazy glicerolo-3-{P} oraz hamuje
aktywność lipazy wrażliwej na hormony, przez co wzmaga metabolizm i usuwa glukozę w osocza oraz
hamuje uwalnianie WKT do krwi.

•

Lipolizę pobudzają: A/NA, glukagon, ACTH, α/β-MSH, TSH, GH, ADH, KS, T

3/4

, metyloksantyny.

c)

Brunatna tkanka tłuszczowa uczestniczy w termogenezie. Występuje u zwierząt hibernujących i
noworodków ludzkich. Jej brązowy kolor pochodzi od nagromadzenia cytochromów w mitochondriach.
Zawiera dodatkowo białko termogeninę (hamowaną przez puryny). Pod wpływem pobudzenia układu
współczulnego wydzielana NA zwiększa poziom cAMP, przez co lipaza hormonozależna staje się
aktywna i hydrolizuje TAG do WKT. Te odblokowują termogeninę oraz dostarczają acylo-CoA,
przenoszonego następnie do wnętrza mitochondriów, utlenianego w szlaku β-oksydacji i
dostarczającego równoważników redukujących, które z kolei wykorzystywane są przez łańcuch
oddechowy do tworzenia gradientu pH. Normalnie służy on do pracy syntazy ATP, jednak termogenina
wykorzystuje gradient do „jałowych cykli”, podczas których energia nie jest gromadzona w
wysokoenergetycznych wiązaniach, lecz rozpraszana, podnosząc temperaturę tkanki, a przez to całego
organizmu.

- -

86

5.

Utlenianie kwasów tłuszczowych

a)

lokalizacja komórkowa i tkankowa
Utlenianie KT zachodzi w matrix mitochondrialnej. Proces ten zachodzi gł. w wątrobie, chociaż
większość tkanek organizmu jest w tanie przeprowadzić pełny szlak oksydacji KT.

b)

aktywacja i transport KT do mitochondrium
Utlenianie KT poprzedzone jest ich aktywacją, polegającą na przekształceniu w bezpośredni substrat
dla β-oksydacji. Jest to jedyna reakcja szlaku wymagająca ATP.

KT + ATP + CoA →syntetaza acylo-CoA (tiokinaza)→ acylo-CoA + AMP + PP

i

PP

i

+ H

2

O →pirofosfataza nieorganiczna→ 2 {P}

Dzięki obecności pirofosfatazy nieorganicznej liczba traconych wysokoenergetycznych wiązań fosforowych
wzrasta do 2 i z tego powodu reakcja zachodzi do końca. Syntetazy acylo-CoA występują na ER, w
peroksysomach, na zewnętrznej błonie mitochondrialnej i w jej matrix.

Karnityna syntetyzowana jest z Lys i Met w wątrobie i w nerkach, zaś największa jej ilość występuje w
mięśniach. Niższe KT mogą być aktywowane i utleniane bez jej udziału, w przeciwieństwie do wyższych.

c)

β-oksydacja nasyconych KT

Proces ten zachodzi w matrix mitochondrialnej przy udziale kompleksu enzymatycznego oksydazy KT,
umiejscowionego w pobliżu łańcucha oddechowego. Zależnie od długości KT jest on utleniany przez
swoiste dla siebie enzymy

•

przebieg:

dehydrogenacja – powstaje ∆

2

-trans-enoilo-CoA

R-CH

2

-CH

2

-CO~SCoA + FAD →dehydrogenaza acylo-CoA→ R-CH=CH-CO~SCoA + FADH

2

hydratacja – powstaje L(+)-3-hydroksyacylo-CoA
R-CH=CH-CO~SCoA + H

2

O →hydrataza ∆

2

-enoilo-CoA→ R-CH(OH)-CH

2

-CO~SCoA

dehydrogenacja – powstaje 3-ketoacylo-CoA
R-CH(OH)-CH

2

-CO~SCoA + NAD+ →dehydrogenaza L(+)-3-hydroksyacylo-CoA→

→ R-CO-CH

2

-CO~SCoA + NADH + H

+

rozcięcie – powstaje acylo-CoA skrócony o C

2

i AcCoA

R-CO-CH

2

-CO~SCoA + CoA-SH →tiolaza 3-ketoacylo-CoA (acetylotransferaza acetoacetylo-CoA) →

→ R-CO~SCoA + CH

3

-CO~S-CoA

•

bilans energetyczny:

aktywacja:

- 2 ATP

FADH

2

+ 2 ATP x (n-1)

NADH + H

+

+ 3 ATP x (n-1)

AcCoA

+ 12 ATP x n

Dla kwasu o C

2n

atomach węgla zysk energetyczny wynosi 12 n + 5 (n – 1) = 17 n – 7 ATP

np. dla kwasu palmitynowego (C

16

) mamy 128 ATP.

- -

87

•

KT o nieparzystej liczbie atomów węgla są utleniane w podobny sposób, aż powstanie z nich
trójwęglowa reszta propionylo-CoA. Ten ulega przekształceniu do sukcynylo-CoA, który
metabolizowany jest w cyklu Krebsa (patrz punkt IV-4-b). Reszta propionylowa jest jedynym
glukogennym fragmentem nieparzystych KT.

•

W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana β-oksydacja, gdyż obok AcCoA powstaje H

2

O

2

na etapie

dehydrogenazy z flawoproteiną, który następnie rozkładany jest przez katalazę. Sytuacja ta nie jest
związana z fosforylacją i produkcją ATP, lecz ułatwia działanie na KT o bardzo długich łańcuchach
(≥ C

20

). Peroksysomy nie utleniają acylo-CoA krótszych niż C

8

.

•

α-oksydacja zachodzi w mózgu i polega na stopniowym usuwaniu po jednym atomie węgla, począwszy
od C

1

. Reakcja ta nie wymaga CoA, nie powstają też w niej wiązania makroergiczne.

•

ω-oksydacja zachodzi w ER przy udziale CYP. Końcowa reszta metylowa KT (CH

3

-) utleniana jest

kolejno do pochodnej alkoholowej (-CH

2

OH), a następnie karboksylowej (-COOH). Powstały kwas

dwukarboksylowy ulega oksydacji do kwasu adypinowego (C

6

) lub korkowego (C

8

), które są wydalane

z moczem.

d)

oksydacja nienasyconych KT

•

Zależnie od położenia wiązania nienasyconego odpowiednie acylo-CoA degradowane są w szlaku β-
oksydacji do momentu powstania ∆

3

-cis-acylo-CoA lub ∆

4

-cis-acylo-CoA.

•

W pierwszym przypadku pochodna ∆

3

ulega izomeryzacji przez izomerazę ∆

3

-cis/trans→∆

2

-trans-

enoilo-CoA do ∆

2

-trans-enoilo-CoA, po czym ulega dalszemu utlenianiu.

•

Każdy ∆

4

-cis-acylo-CoA – zarówno powstający z utleniania pochodnej ∆

3

, jak i wchodzący do szlaku

bocznie, jest poddawany dehydrogenazie acylo-CoA i tak powstaje ∆

2

-trans-∆

4

-cis-dienoilo-CoA. Ten

ulega działaniu NADPH-zależnej reduktazy ∆

2

-trans-∆

4

-cis-dienoilo-CoA, w wyniku czego powstaje

∆

3

-trans-enoilo-CoA, na który działa znów izomeraza ∆

3

-cis/trans→∆

2

-trans-enoilo-CoA, dając ∆

2

-

trans-enoilo-CoA, który utleniany jest następnie w klasycznym szlaku β-oksydacji.

e)

ketogeneza

Powstawanie ciał ketonowych u człowieka ma miejsce w wątrobie w warunkach znacznego nasilenia β-

oksydacji. Powoduje to odwrócenie reakcji katalizowanej przez tiolazę, czyli kondensację 2 AcCoA → aceto-
acetylo-CoA. Do niego przyłącza się jeszcze jedna cząsteczka AcCoA, i w reakcji katalizowanej przez syntazę
HMG-CoA (mit) powstaje 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo-CoA (HMG-CoA). Następnie liaza HMG-CoA (mit)
odłącza AcCoA, pozostawiając acetooctan, który pozostaje w równowadze z D(-)-β-hydroksymaślanem dzięki
obecności dehydrogenazy D(-)-hydroksymaślanowej (mit); stan tej równowagi zależy od stosunku
[NAD

+

]/[NADH]. Acetooctan ulega również spontanicznej dekarboksylacji do acetonu. Wymienione trzy

związki, określane łącznie jako ciała ketonowe, transportowane są z krwią, gdzie ich stężenie nie powinno
przekraczać 0,2 mM. Z osoczem wędrują one do płuc, gdzie lotny aceton jest wydychany (zapach acetonu z ust
jest jednym z objawów cukrzycy), a także do nerek, gdzie kilka % usuwanych jest z moczem. Ketonemia
(nadmiar ciał ketonowych w osoczu) spowodowany jest raczej zwiększonym ich wytwarzaniem w wątrobie, niż
zmniejszoną utylizacją przez tkanki pozawątrobowe. Dla tkanek pozawątrobowych ciała ketonowe stanowią
bowiem substraty oddechowe – β-hydroksymaślan przekształcany jest do acetooctanu, który z kolei dzięki
transferazie CoA sukcynylo-CoA : acetooctan łączy się z AcCoA. Powstały acetoacetylo-CoA ulega działaniu
tiolazy, dając 2 cząsteczki AcCoA, które utleniane są w cyklu Krebsa.

Regulacja ketogenezy opiera się na trzech zasadniczych przemianach:

po pierwsze: ketogeneza występuje przy zwiększonym utlenianiu KT, pochodzącym z lipolizy TAG w
adipocytach, regulują ją zatem czynniki mobilizujące WKT,

po drugie: WKT oprócz utleniania mogą być estryfikowane, przy czym decydującą rolę odgrywa CPT I
– zmniejsza ona swoją aktywność w stanie sytości pod wpływem malonylo-CoA. Wówczas
pochłaniane przez hepatocyty WKT są estryfikowane i eksportowane jako VLDL. W okresie głodzenia
jest odwrotnie:↑ WKT → ↑ acylo-CoA → ↓ ACC → ↓ malonylo-CoA → ↑ CPT I.

po trzecie: proporcja AcCoA ulegającego ketogenezie i oksydacji jest tak regulowana, aby całkowita
powstała energia nie wahała się zbytnio w czasie. Ketogeneza pozwala wątrobie utleniać zwiększające
się ilości KT w układzie ściśle skojarzonych oksydacyjnych fosforylacji bez zwiększania całkowitego
wydatku energetycznego.

- -

88

f)

zaburzenia oksydacji KT

niedobór karnityny
← wcześniaki, hemodializa, acyduria spowodowana kwasami organicznymi
→ napady hipoglikemii, hiperlipidemia i osłabienie mięśni (objawy podobne do zespołu Reye’a)

niedobór CPT I – dotyczy wątroby; → hipoglikemia

niedobór CPT II – dotyczy gł. mięśni; → osłabienie, martwica, mioglobinuria

hamowanie CPT
← hipoglikemizujący efekt leków p/cukrzycowych – poch. sulfonylomocznika (tolbutamid, gliburyd)

ostre ciążowe stłuszczenie wątroby
← deficyt dehydrogenazy długołańcuchowych β-hydroksyacylo-CoA

niedobór liazy HMG-CoA → zab. ketogenezy i degradacji leucyny

jamajska choroba wymiotna – hipoglicyna hamuje oksydację

acyduria dwukarboksylowa ← brak dehydrogenazy dla KT o łańcuchach średniej długości

ch. Refsuma ← nagromadzenie kwasu fitanowego z fitolu

zespół Zellwegera (mózgowo – wątrobowo – nerkowy)
← brak peroksysmów w tkankach
→ gromadzenie w mózgu wielonienasyconych długołańcuchowych KT (C

26

-C

38

)

→ upośledzenie syntezy kwasów żółciowych i lipidów eterowych (plazmalogenów)

ketoza (ketonemia i następowa ketonuria) → może spowodować kwasicę ketonową, co ma miejsce np.
w cukrzycy

6.

Lipogeneza – synteza kwasów tłuszczowych

a)

lokalizacja i transport substratów

•

Enzymy biosyntezy KT zlokalizowane są w cytozolu, zaś układ elongacji łańcucha na ER hepatocytów.
Lipogeneza zachodzi w wątrobie, nerce, mózgu, płucach, gruczole sutkowym i adipocytach.

•

AcCoA powstały z węglowodanów wskutek wewnątrzmitochondrialnego utleniania pirogronianu nie
może swobodnie przechodzić do cytozolu, by dać się przekształcić w KT. AcCoA kondensuje więc ze
szczawiooctanem w cytrynian, który ulega antyportowi z jabłczanem i OH

-

do przestrzeni

pozamitochondrialnej; tu dzięki ATP, CoA i liazie ATP : cytrynianowej ulega przekształceniu w
AcCoA, który może ulegać karboksylacji przez ACC do malonylo-CoA i budować KT. Pozostały
szczawiooctan może przejść w jabłczan dzięki NADH-zależnej dehydrogenazie jabłczanowej, po czym
następuje generacja NADPH przez „enzym jabłczanowy”. Jabłczan może również wniknąć do
mitochondrium.

b)

przebieg lipogenezy

•

Pierwszym etapem lipogenezy jest karboksylacja AcCoA katalizowana przez kompleks enzymatyczny,
złożony m. in. z biotyny (wit. H) i jej karboksylazy, białka nośnikowego karboksybiotyny,
transkarboksylazy oraz allosterycznego miejsca regulatorowego. Donorem CO

2

jest HCO

3

-

.

AcCoA + HCO

3

-

+ ATP →ACC→ malonylo-CoA + ADP + P

i

•

U człowieka kompleks syntazy KT jest homodimerem i tylko w takiej formie wykazuje aktywność.
Każdy monomer jest pojedynczym polipeptydem, kodowany przez jeden gen, co zapewnia dużą
wydajność i brak interferencji. Monomery łączą się mostkiem dwusiarczkowym obecnym między 4’-
{P}-panteteiną białka przenoszącego acyl (ACP), a cysteiną syntazy 3-ketoacylowej (położenie 69).
Kompleks wykazuje 7 aktywności enzymatycznych: transacylaza acetylowa, transacylaza malonylowa,
syntaza 3-ketoacylowa, reduktaza 3-ketoacylowa, hydrataza, reduktaza enoilowa oraz tioesteraza.

Kolejność reakcji:

połączenie AcCoA z Cys-HS przez transacylazę acetylową

połączenie malonylo-CoA z grupą SH 4’-{P}-panteteiny przez transacylazę malonylową; wytworzenie
acetylo(acylo)-malonylo-enzymu

atak grupy acylowej na grupę metylenową reszty malonylowej katalizowany przez syntazę 3-
ketoacylową oraz uwolnienie CO

2

, dzięki czemu reakcja zachodzi do końca; powstanie 3-ketoacylo-

enzymu = acetoacetylo-enzymu

redukcja grupy 3-ketoacylowej przez reduktazę 3-ketoacylową

- -

89

dehydratacja grupy 3-hydroksyacylowej przez hydratazę

redukcja wiązania nienasyconego przez reduktazę enoilową; utworzenie nasyconego acylo-S-enzymu

połączenie malonylo-CoA z grupą HS 4’-{P}-panteteiny i wyparcie reszty acylowej na miejsce
połączenia z Cys-HS

sześciokrotne powtórzenie procesu → wytworzenie rodnika palmitylowego (C

16

)

hydroliza do czystego enzymu i palmitynianu przez tioesterazę = deacylazę (w gruczole sutkowym
enzym ten występuje w kilku formach, odpowiednio dla C

8

, C

10

i C

12

)

•

Sumaryczna reakcja:

CH

3

-CO~SCoA + 7 HOOC-CH

2

-CO~SCoA + 14 (NADPH + H

+

) →

→ CH

3

-(CH

2

)

14

-COOH + 7 CO

2

+ 6 H

2

O + 8 CoA-SH + 14 NADP

+

•

Inicjatory reakcji:

standardowy: AcCoA

w gruczole sutkowym i wątrobie: butyrylo-CoA

dla nieparzystych KT: propionylo-CoA

•

Źródła NADPH:

PPP – wątroba, adipocyty, gruczoł sutkowy,

„enzym jabłczanowy” = dekarboksylująca dehydrogenaza jabłczanowa

pozamitochondrialna dehydrogenaza cytrynianowa

•

Otrzymanie KT dłuższych niż C

16

możliwe jest dzięki mikrosomalnemu układowi elongazy KT. Do

reakcji wchodzi nasycony lub nienasycony KT ≥ C

10

, który aktywowany jest do acylo-CoA. Ten łączy

się z malonylo-CoA dzięki syntetazie 3-ketoacylo-CoA. Powstały produkt ulega swoistej reduktazie,
hydratazie oraz reduktazie 2,3-enoiloacylo-CoA. Ostatecznie powstaje łańcuch wydłużony o C

2

. W

mózgu elongacja ulega przyspieszeniu podczas mielinizacji, aby dostarczyć KT C

22

i C

24

dla

sfingolipidów. Głodzenie i cukrzyca hamują elongację. Istnieje również mniej wydajny
mitochondrialny układ elongazy wykorzystujący AcCoA.

•

Anaboliczną fazę cyklu żywieniowego stanowi m. in. przekształcanie w tłuszcz nadmiaru glukozy,
pirogronianu, mleczanu i AcCoA. Głównym czynnikiem regulującym aktywność lipogenezy jest stan
odżywienia organizmu – proces ulega zwolnieniu przy głodówce, diecie tłuszczowej i niedoborze
insuliny (np. w przebiegu cukrzycy). Lipogeneza zależy również odwrotnie proporcjonalnie od stężenia
WKT w osoczu. Fruktoza wzmaga lipogenezę przez ominięcie regulacji glikolizy na poziomie PFK-1;
dostarcza przez to zarówno substratu do syntezy KT, jak i glicerolu do ich estryfikacji.

•

Regulacja lipogenezy występuje w formie krótkoterminowej – jako modyfikacje kowalencyjne i
allosteryczne oraz w formie długoterminowej kontroli adapatacyjnej – przez modyfikację ekspresji
genów.

- -

90

c)

synteza nienasyconych KT

•

Możliwe jest wstawianie wiązań podwójnych do KT w pozycjach ∆

4,5,6,9

, lecz nie dalej (zdolność tą

posiadają rośliny, co związane jest z syntezą EFA).

•

Jednonienasycone KT otrzymywane są z odpowiednich acyli nasyconych przez mikrosomalny układ
∆

9

-desaturazy (wątroba i inne narządy) złożony z cytochromu b

5

, reduktazy NADPH – cytochrom b

5

oraz desaturazy z żelazem niehemowym wrażliwym na CN

-

.

palmitoilo-CoA + O

2

+ NADH + H

+

→∆

9

-desaturaza→ palmitooleilo-CoA + 2 H

2

O + NAD

+

steareilo-CoA + O

2

+ NADH + H

+

→∆

9

-desaturaza→ oleilo-CoA + 2 H

2

O + NAD

+

•

Dodatkowe wiązania podwójne wprowadzane są między istniejące już wiązanie nienasycone (∆

9

) oraz

atom C

1

przez układ ∆

5

-desaturazy i elongazy. W ten sposób można otrzymać kwas arachidonowy z α-

linolenowego, dzięki czemu nie jest on niezbędny w pożywieniu. Aktywność tego układu zmniejszają:
A, glukagon i deficyt insuliny.

α-linolenoilo-CoA →∆

5

-desaturaza→ γ-linolenoilo-CoA →elongaza→

→ dihomo-γ-linolenoilo-CoA →∆

5

-desaturaza→ arachidonoilo-CoA

•

Egzogenne kwasy tłuszczowe (EFA, wit. F) potrzebne są do tworzenia eikozanoidów oraz stanowią
strukturalne lipidy komórki – kwas arachidonowy stanowi do 10 % KT fosfolipidów, zaś DHA
występuje w jądrze, spermie, korze mózgowej i siatkówce, gdzie zwiększa płynność lipidów
wspomagającą działanie rodopsyny (w przypadku niedoboru rozwija się retinitis pigmentosa).
Generalnie deficyt EFA powoduje zmiany skórne i zaburzenia transportu lipidów. Zaburzenia
metabolizmu EFA występują przy zwłóknieniu torbielowatym trzustki (mukowiscydoza),
acrodermatitis enteropathica, zespole wątrobowo – nerkowym, chorobie Crohna, marskości wątroby,
zespole Reye’a, zespole Zellwegera oraz alkoholizmie.

d)

metabolizm eikozanoidów (patrz również punkt VII-1-b)

PG – odkryte w nasieniu (stąd nazwa), hormony miejscowe (autakoidy) biorące udział m. in. w rozwoju
stanu zapalnego

PGI – produkowana przez śródbłonek, hamuje skurcz naczyń i agregację trombocytów

TX – produkowane przez trombocyty, nasilają skurcz naczyń i agregację trombocytów

LT – zw. z leukocytami, silne rozszerzenie naczyń i skurcz oskrzeli

- -

91

7.

Synteza trójglicerydów

a)

lokalizacja tkankowa i komórkowa

Kinaza glicerolowa występuje w wątrobie, nerkach, jelicie, brunatnej tkance tłuszczowej i gruczole
sutkowym, niewielką zaś aktywność wykazuje w mięśniach i żółtej tkance tłuszczowej (tam za to działa
dehydrogenaza glicerolo-3-{P}). Większość enzymów syntezy TAG występuje w ER, chociaż
acylotransferaza glicerolo-3-{P} związana jest z mitochondriami, a fosfohydrolaza fosfatydowa – z
cytozolem (przy czym jej forma aktywna związana jest z błonami).

b)

przebieg syntezy

- -

92

8.

Cholesterol

a)

biosynteza cholesterolu

Wszystkie tkanki złożone z komórek eukariotycznych posiadają zdolność syntezy cholesterolu. Ok. połowa
puli cholesterolu w ludzkim organizmie pochodzi z pożywienia (gł. jajka, mięso, wątroba, mózg), reszta jest
syntetyzowana de novo – 10 % w wątrobie oraz w 10 % w jelitach. Proces biosyntezy cholesterolu ma
miejsce w ER i w cytozolu.

Regulacja syntezy cholesterolu zachodzi na etapie HMG-CoA. T

3/4

wpływają na szlak jak insulina, zaś KS

jak glukagon.

- -

93

b)

trawienie i wchłanianie cholesterolu

pokarm → cholesterol + jego estry →hydroliza estrów→ cholesterol → wchłanianie (żółć) →
→ estryfikacja 80 – 90 % → chlomikrony →LPL→ remnanty chylomikronów →
→ wątroba (hydroliza remnantów chylomikronów, IDL i LDL) →
→ VLDL →LPL→ IDL → LDL → tkanki pozawątrobowe

c)

równowaga cholesterolu i endocytoza LDL

pula cholesterolu:
(+):

← pobieranie w Lp przez receptor LDL lub oczyszczający (zmiatający)
← pobieranie do błony
← biosynteza
← hydroliza estrów cholesterolu

(-):

← usuwanie gradientu stężeń do HDL

3

← estryfikacja przez ACAT (acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol)
← synteza kwasów żółciowych i hormonów sterydowych

d)

wydalanie cholesterolu

•

Z pożywieniem dostarczane jest ok. 0,4 g cholesterolu dziennie.

•

Wraz z żółcią do jelita wydala się dziennie ok. 0,6 g cholesterolu oraz 0,4 g kwasów żółciowych, z
czego 98 % ulega zwrotnemu wchłonięciu w jelicie krętym do krążenia jelitowo – wątrobowego.

•

W wyniku działania flory bakteryjnej jelita w cholesterolu powstaje koprostanol.

e)

miażdżyca

Istotą miażdżycy jest odkładanie cholesterolu z lipoprotein zawierających apoLp B

100

w postaci wolnej i

zestryfikowanej w tkance łącznej ścian tętnic. Do czynników ryzyka zaliczamy: nadciśnienie tętnicze, nadmierne
spożycie soli, kawy i alkoholu, obfite posiłki, dietę wysokotłuszczową, picie miękkiej wody, nadwagę, palenie
tytoniu (nikotyna, CO, stres oksydacyjny), płeć męską, otyłość zwłaszcza brzuszną (↓ HDL), brak ruchu, stres.
Wzrost zachorowalności występuje przy określonych hipolipoproteinemiach, w cukrzycy, nerczycy lipidowej,
niedoczynności tarczycy i uogólnionej hiperlipidemii. Prognoza choroby zależy od stosunku [cholesterol HDL] :
[cholesterol LDL]. Terapia niefarmakologiczna obejmuje m. in. zmianę diety polegającą na zastąpieniu
nasyconych KT (masło, tłuszcz wołowy, olej kokosowy) przez jedno- (oliwa z oliwek) i wielonienasycone (olej
słonecznikowy, sojowy, kukurydziany, bawełniany) oraz wykluczenie fruktozy i zawierające ją sacharozy
(działanie hiperlipemizujące). Nasycone KT nasilają tworzenie oraz spowalniają katabolizm mniejszych
cząsteczek VLDL z większą ilością cholesterolu. Natomiast nienasycone KT nasilają katabolizm i wydalanie
cholesterolu oraz LDL poprzez oddziaływanie z ich receptorami (zjawisko regulacji w górę). W terapii
farmakologicznej stosuje się: żywice jonowymienne (cholestyramina, cholestipol), fibraty (klofibrat,
gemfibrozil), leki hamujące lipolizę (kwas nikotynowy), antyoksydanty (probukol). W wyjątkowych

- -

94

przypadkach decyduje się na zabieg chirurgiczny, polegający na wyłączeniu jelita krętego z konsekwentnym
zaburzeniem krążenia jelitowo – wątrobowym kwasów żółciowych.

9.

Kwasy żółciowe

Synteza kwasów żółciowych zachodzi w wątrobie. Prekursorem jest cholesterol, hydroksylowany przez

7α-hydroksylazę (ER); reakcja wymaga O

2

, NADPH, witaminy C i CYP. Jest to etap regulujący całą syntezę –

nasila go sam cholesterol, hamuje zaś produkt (kwasy żółciowe – poprzez receptor FXR) oraz niedobór
witaminy C. 7α-hydroksylaza regulowana jest wspólnie z reduktazą HMG-CoA, obie też ulegają modyfikacjom
kowalencyjnym, przy czym hydroksylaza wykazuje aktywność w formie ufosfrylowanej.

Powstały 7α-hydroksycholesterol podlega następnie kilku etapom przemian z udziałem O

2

, NADPH,

CoA i ewentualnie 12α-hydroksylazy – wysycane jest wiązanie ∆

5,6

, łańcuch boczny skracany jest o C

3

(propionylo-CoA), reszta karboksylowa wiązana z CoA, zaś C

12

hydroksylowany. Powstaje w ten sposób

choloilo-CoA oraz chenodeoksycholoilo-CoA, które łączone z glicyną i tauryną w proporcji 1:3 dają pierwotne
kwasy żółciowe, wydalane z żółcią do światła jelita. Umożliwiają tam trawienie i wchłanianie, tworzenie emulsji
tłuszczowych i rozbijanie tłuszczu na micele, pokrywanie tłuszczem innych cząstek pokarmowych i lepszy
dostęp enzymów. Dzięki działalności flory bakteryjnej jelita pierwotne kwasy ulegają dekoniugacji i 7α-
dehydroksylacji, dając odpowiednio kwas deoksycholowy i litocholowy – wtórne kwasy żółciowe. W jelicie
krętym ogromna większość kwasów żółciowych ulega wchłonięciu do krążenia jelitowo – wątrobowego, z
wyjątkiem nierozpuszczalnego kwasu litocholowego. Reszta wydalana jest z kałem, stanowiąc główną drogę
wydalania cholesterolu z organizmu.

- -

95

10.

Kalcyferole (patrz również punkt VII-2-b)

Witamina D jest prohormonem sterydowym, jej przedstawicielem jest ergosterol, występujący w

roślinach i drożdżach oraz 7-dehydrocholesterol, obecny u zwierząt – różnią się one między sobą nasyceniem i
metylacją łańcucha bocznego. Każdy z nich ulega u odpowiednich gatunków reakcji fotolitycznej,
przebiegającej z rozbiciem wiązana C

9

-C

10

w pierścieniu B, dając ergokalcyferol (D

2

) lub cholekalcyferol (D

3

).

Witaminy te po spożyciu w pokarmach (gł. olej rybi, żółtka jaj, wątroba) wchłaniane są przez jelita do krwi,
gdzie wiąże je białko nośnikowe. Wychwytywane przez wątrobę ulegają 25-hydroksylazie (ER), a powstała 25-
OH-D

3

jest formą zapasową gromadzoną w hepatocytach, adipocytach i miocytach, podlega krążeniu jelitowo –

wątrobowemu. W kanalikach nerkowych, kościach i łożysku 25-OH-D

3

ulega 1-hydroksylazie (mitochondria),

dając 1α,25-(OH)

2

-D

3

(synteza regulowana przez PTH i [{P}] w osoczu). Szlak alternatywny prowadzi przez 24-

hydroksylazę (mitochondria), obecna w kanalikach nerkowych, chrząstce, kościach, jelicie i łożysku. Aktywna
witamina D reguluje ekspresję odpowiednich genów, przez co uczestniczy w regulacji gospodarki wapniowo –
fosforanowej i kształtowaniu kości, procesach różnicowania oraz zjawiskach immunologicznych.

- -

96

11.

Hormony sterydowe

•

Hormony o budowie sterydowej syntetyzowane są przez korę nadnerczy oraz przez gonady.

•

Kora nadnerczy (cortex glandulae adrenalis) syntetyzuje kortykosteroidy. W obrębie kory wyróżniamy
3 warstwy, wydzielające odmienne rodzaje hormonów. Warstwa kłębuszkowata produkuje
mineralokortykosteroidy (C

21

), których głównym przedstawicielem jest aldosteron. Warstwa

pasmowata produkuje glukokortykosteroidy (C

21

): kortyzol = hydrokortyzon, kortyzon i kortykosteron.

Warstwa siateczkowata produkuje androgeny (C

19

): DHEA i androstendion.

•

Substratem do syntezy hormonów steroidowych jest cholesterol. W tkankach docelowych
steroidogenezy podlega on działaniu enzymu odgałęziającemu z grupy cytochromu P450 (CYP SCC –
ang. side-chain cleavage enzyme), który pozbawia cholesterol atomów C

22

-C

27

; produktem tej reakcji

jest ∆

5

-pregnenolon, właściwy macierzysty związek wszystkich naturalnych sterydów. W wyniku

działania nań enzymów: dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej, 21-α-hydroksylazy, 11-β-
hydroksylazy, 17-α-hydroksylazy, 17,20-liazy oraz syntazy aldosteronowej powstają wymienione
wyżej grupy hormonów kory nadnercza.

•

Główne działanie mineralokortykoidów polega na wzroście resorpcji zwrotnej wody, Na

+

i Cl

-

w

kanaliku dalszym, przez co regulowana jest objętość płynów krążących w łożysku naczyniowym oraz
ich ciśnienie osmotyczne. Działanie glukokortykoidów polega na rozległym wpływie na metabolizm
(↑ glikemia – stąd nazwa, nasilenie katabolizmu lipidowego i azotowego), gospodarkę wodno –
elektrolitową (choć nie w takim stopniu jak aldosteron), syntezę składników tkanki łącznej oraz na
modyfikacji układu immunologicznego – m. in. hamowaniu tkanki limfoidalnej i działaniu
przeciwzapalnym przez hamowanie izoenzymu 2 syntazy PGH

2

(PGHS-2).

•

Gonada męska (jądro; testis) produkuje androgeny (C

19

), gł. testosteron. Jego synteza możliwa jest

dzięki obecności dodatkowego enzymu – dehydrogenazy 17-β-hydroksysteroidowej, która pozwala
przeprowadzić DHEA w androstandiol oraz androstendion w testosteron. Ten podlega obwodowej
redukcji przez 5α-reduktazę do dihydrotestosteronu (DHT), wykazującego większą aktywność i
odpowiedzialnego za większość efektów działania androgenów. Androgeny są niezbędne do
wykształcenia męskich cech płciowych; ponadto działają anabolicznie m. in. na układ ruchu,
zwiększając masę mięśni szkieletowych i aktywność osteoblastów, pobudzają do wydzielania gruczoły
łojowe (objawy trądziku) oraz stymulują przerost gruczołu krokowego.

•

Androgeny metabolizowane są do 17-ketosteroidów (17-KS), wydalanych następnie z moczem. U
kobiet całość wydalanych 17-KS pochodzi z nadnerczy, zaś u mężczyzn 2/3 ma pochodzenie
nadnerczowe, a 1/3 gonadalne. 17-KS używane są jako marker diagnostyczny. Zwiększenie ich
poziomu występuje fizjologicznie w ciąży, a także towarzyszy takim patologiom jak: rak kory
nadnerczy, guz wirylizujący nadnerczy lub jajników, zespół Cushinga, zespół nadnerczowo – płciowy
(wrodzony przerost nadnerczy), nowotwory jądra produkujące androgeny. Z kolei spadek poziomu 17-
KS towarzyszy pierwotnej i wtórnej niedoczynności kory nadnerczy (o różnej etiologii) oraz obniżeniu
czynności hormonalnej jąder, np. przy hipogonadyzmie.

•

Gonada żeńska (jajnik) wytwarza progestageny (C

21

), gł. progesteron oraz estrogeny (C

18

): estradiol,

estron i estriol. Do syntezy progesteronu wystarczy aktywność enzymu odgałęziającego i
dehydrogenazy 3-β-hydroksysteroidowej. Natomiast powstawanie estrogenów wymaga obecności
dehydrogenazy 17-β-hydroksysteroidowej (jak w jądrze), desmolazy, katalizującej C

19

-demetylację oraz

aromatazy, nadającej pierścieniowi A szkieletu steroidowego charakter aromatyczny. Estrogeny są
niezbędne do dojrzewania płciowego dziewcząt i płodności kobiet; ponadto przeciwdziałają miażdżycy
(hamowanie lipazy wątrobowej → ↑ HDL

2

) oraz osteoporozie (hamowanie osteoklastów).

Progestageny, wydzielane gł. przez ciałko żółte, ułatwiają zagnieżdżenie trofoblastu i umożliwiają
utrzymanie ciąży; poza tym pobudzają rozwój gruczołów sutkowych oraz przyspieszają metabolizm –
związany jest z tym niewielki skok temperatury ciała towarzyszący owulacji (wykorzystanie w
naturalnej antykoncepcji – metodzie termicznej i nowszych, objawowo – termicznych).

- -

97

- -

98

ROZDZIAŁ VI – PRZEMIANA AZOTOWA

1.

Trawienie białek w przewodzie pokarmowym

a)

enzymy i ich specyficzność

•

Trawienie białek rozpoczyna się w żołądku, gdzie kontakt z HCl wytwarzanym przez komórki
okładzinowe powoduje ich denaturację, tj. utratę struktury IV i III-rzędowej przez zniszczenie wiązań
wodorowych, wyprostowanie polipeptydów i wzrost podatności na działanie proteaz.

•

Główną funkcją żołądka jest trawienie białek. Komórki główne wytwarzają zymogen, który pod
wpływem aktywacji proteolitycznej przez H

+

ulega przekształceniu w pepsynę (A – dno, B –

odźwiernik; optimum 1 – 2). Pepsyna rozkłada dalsze cząsteczki zymogenu na zasadzie autokatalizy.
Pepsyna jest endopeptydazą atakującą wiązania peptydowe utworzone przez aa aromatyczne lub
dwukarboksylowe, dzieląc zdenaturowane białko na duże polipeptydy.

•

Rennina (chymozyna; optimum 4) występuje w żołądku niemowląt, gdzie w obecności Ca

2+

przekształca kazeinęw parakazeinę, będącą substratem dla pepsyny, zapobiegając szybkiemu
przedostaniu się mleka z żołądka do jelit.

•

Treść żołądkowa przechodzi do dwunastnicy, gdzie jest neutralizowana przez zasadową żółć i
zasadowy sok trzustkowy (optimum 7,5 – 8).

•

Sok trzustkowy zawiera liczne enzymy proteolityczne. Do endopeptydaz zaliczamy: trypsynę,
chymotrypsynę i elastazę – wszystkie wydzielane początkowo jako zymogeny. Śluzówka jelita
wydziela enteropeptydazę (enterokinazę), rozbijającą wiązania peptydowe Lys, przez co rozprostowuje
i uaktywnia trypsynę (optimum 7,9; działa na aa zasadowe). Aktywna trypsyna przeprowadza
autokatalizę oraz przekształca chymotrypsynogen w chymotrypsynę (optimum 8,0; działa na
pozbawione ładunku), proelastazę w elastazę (działa na małe aa) oraz prokarboksypeptydazę w
karboksypeptydazę (egzopeptydaza odłączająca pojedyncze C-końcowe aa od polipeptydów).

•

Schemat aktywacji proteolitycznej chymotrypsyny:

pro-CT:

1

245

↓

π-CT:

1

15 16

245

↓

α-CT:

1 A 13 16 B

146 149 C

245

•

Sok jelitowy zawiera aminopeptydazę (ezgopeptydaza odcinająca N-końcowe aa poli- i oligopeptydów)
oraz dwupeptydazy o różnej swoistości.

•

Naturalne izomery L-aa transportowane są aktywnie przez rąbek szczoteczkowy przy udziale PLP przez
liczne przenośniki podobne do SGLT-1. Wyróżniamy następujące przenośniki:

zależne od Na

+

: dla aa obojętnych, Phe i Met oraz Pro i Hyp,

niezależne: dla aa lipofilnych i obojętnych (Leu, Phe) oraz zasadowych (Lys).

(transport aa w kanalikach nerkowych – patrz punkt VII-6-a)

•

Flora bakteryjna jelita powoduje przekształcanie niewchłoniętych aa:

dekarboksylaza bakteryjna wytwarza ptomainy (R-CH

2

-NH

2

): Lys → kadaweryna, Arg → agametyna,

Tyr → tyramina, Orn → putrescyna, His → histamina,

Trp → indol, metyloindol (skatol)

aa siarkowe przekształcane są w tiole (metylomerkaptan, etylomerkaptan), z których powstaje
siarkowodór: CH

3

SH + 2 H → CH

4

+ H

2

S

powstały z deaminacji amoniak dostaje się do krążenia wrotnego, skąd eliminuje go wątroba; w
schorzeniach tego narządu możne rozwinąć się hiperamonemia, prowadząca do amoniakowej śpiączki
wątrobowej i encefalopatii wątrobowej

antybiotyki (np. neomycyna) hamują wzrost flory fizjologicznej

•

zaburzenia trawienia i wchłaniania białek:

wchłanianie nie strawionych białek może wywołać reakcje immunologiczne,

sprue rodzinna (nie tropikalna) powstaje gdy polipeptydy powstałe z glutenu uszkadzają śluzówkę jelita
oraz powodują powstawanie przeciwciał p/glutenowych; jej odpowiednikiem u dzieci jej celiakia
(choroba trzewna),

złe wchłanianie produktów trawienia białek wywołuje obrzęki i osteoporozę,

- -

99

defekt przenośnika jelitowego dla aa obojętnych wywołuje chorobę Hartnupów (uogólniona
aminoacyduria, objawy przypominające pelagrę),

kwashiorkor występuje gdy dziecko odstawione od piersi matki przechodzi na dietę niskobiałkową,

wyniszczenie (kacheksja, marazmus) to niedobór energetycznego pożywienia oraz swoistych aa

b)

transport azotu pomiędzy tkankami

Główną rolę w utrzymaniu stężenie krążących w osoczu aa odgrywają mięśnie i wątroba – miocyty są

źródłem ponad połowy puli wolnych aa, zaś hepatocyty przeprowadzają glukoneogenezę i cykl mocznikowy,
niezbędny do wydalania nie magazynowanego azotu. W stanie poresorpcyjnym aa uwalniane są z mięśni –
dotyczy to gł. Ala i Gln. Ta ostatnia wędruje do jelit i nerek, gdzie stanowi źródło amoniaku i powraca do krwi
jako Ala lub Ser (tylko z nerek). Ala – ostateczny transporter azotu – wychwytywana jest przez wątrobę, gdzie
stanowi główny aa glukogenny, ponieważ hamuje glikolizę na etapie kinazy pirogronianowej oraz stanowi
doskonały substrat dla glukoneogenezy, wysycający ten proces dopiero w stężeniu 20 – 30 x większym od
fizjologicznego. Część aa ulega w wątrobie cyklowi mocznikowemu. Po bogatobiałkowym posiłku transport
zachodzi w odwrotnym kierunku, tj. z tkanek trzewnych do mięśni. Aa o rozgałęzionym łańcuchu – gł. Val –
stanowią na czczo źródło energii dla OUN, w stanie resorpcyjnym zaś wychwytywane są przez mięśnie po
uprzednim oszczędzeniu przez wątrobę.

2.

Ogólna przemiana aminokwasów i metabolizm grupy aminowej

W przeciwieństwie do innych składników pokarmowych, jak cukry i tłuszcze, aa nie są w organizmie

gromadzone w postaci zapasowej, lecz usuwane w przypadku nadmiaru. Pierwszym etapem tych przemian jest
zazwyczaj transaminacja, tj. wymiana grupy aminowej z α-ketokwasem, dają nowy ketokwas i nowy aa. Glu
jako jedyny nie wymienia azotu z innym związkiem, lecz odłącza go w procesie oksydacyjnej dezaminacji. Tak
powstały NH

3

jest transportowany, aby ostatecznie ulec połączeniu z CO

2

w cyklu mocznikowym, dając

mocznik – gł. metabolit azotowy u człowieka.

a)

transaminacja

•

Aa pokarmowe oraz własne traktowane są identycznie, tj. rozbijane na grupę aminową i szkielet
węglowy.

•

Typowa transaminacja polega na przemianie 2 α-aa i 2 α-ketokwasów.

•

Czasami do reakcji wchodzą grupy karbonylowe i nie-α-aminowe, np. grupa δ-aminowa Orn.

•

Transaminacji nie ulegają: Lys, Thr, Pro i Hyp.

•

W większości tkanek obecne są: transaminaza Ala – Pyr (AlAT, GPT, SGPT) oraz Glu – szczawiooctan
(GluAT, GOT, SGOT).

•

Każda transaminacja jest swoista dla jednej pary substratów.

•

Dzięki temu że Ala może wejść do reakcji katabolizowanej przez GluAT, cały azot aminowy
pochodzący z aa podlegających transaminacji może być zgromadzony w Glu.

•

W miejscu katalitycznym transaminaz występuje PLP (fosforan pirydoksalu) – pochodna wit. B

6

wchodząca w skład enzymów metabolizujących aa.

- -

100

•

Aa przyłącza się do PLP przez połączenie typu zasady Schiffa.:

•

Mechanizm transaminacji (przykład reakcji ping – pong):

w sytuacji wyjściowej PLP połączony jest z apoenzymem przez zasadę Schiffa pomiędzy grupą ε-
aminową Lys a grupą aldehydową pirydoksalu,

przyłączenie α-aa

1

powoduje wyparcie grupy ε-aminowej Lys, połączenie PLP z apoenzymem przez

wiązanie jonowe z udziałem grupy fosforanowej PLP oraz utworzenie nowej zasady Schiffa –
aldoiminy.

odłączenie H

+

od C

2

α-aa

1

powoduje przegrupowanie do ketoiminy i dearomatyzację PLP,

przyłączenie H

2

O i H

+

powoduje rozpad do α-ketokwasu

1

i fosforanu pirydoksaminy, połączonego

nadal jonowo z apoenzymem,

następnie zachodzi reakcja odwrotna – przyłącza się α-ketokwas

2

i usuwane są H

2

O i H

+

z utworzeniem

ketoiminy,

przyłączenie H

+

powoduje przegrupowanie wiązań i powstanie aldoiminy,

odłączenie α-aa

2

daje powrót do stanu wyjściowego, tj. PLP połączony przez zasadę Schiffa z grupą ε-

aminową Lys apoenzymu,

niedobór wit. B

6

wystepuje przy wielowitaminowym deficycie grupy B, podczas laktacji, u alkoholików

oraz przy leczeniu gruźlicy izoniazydem (INH):

izonikotynian hydrazyny (izoniazyd) + pirydoksal → hydrazon pirydoksalu (→ mocz) + H

2

O

•

Aa mogą być również przekształcane przez oksydazę aa, obecną w wątrobie i nerkach:

b)

dezaminacja

Centralną pozycję w metabolizmie azotu zajmuje dehydrogenaza Glu – enzym rozpowszechniony w

wielu tkankach i wykorzystujący NAD(P)

+

. Katalizuje on odwracalne przejście Glu ↔ α-ketoglutaran + NH

3

. W

wątrobie aktywność tą nasila ADP, zmniejszają zaś: ATP, GTP oraz NADH.

c)

transport

Stale wytwarzany w tkankach amoniak jest toksyczny dla organizmu, dlatego też musi być na bieżąco
usuwany. Funkcję tę pełni wątroba, syntetyzując Glu, Gln i mocznik.

Syntetaza glutaminowa katalizuje reakcję:

Glu + NH

4

+

+ ATP → Gln + H

2

O + ADP + P

i

Jest to enzym mitochondrialny, występujący w znacznych ilościach w tkance nerwowej, gdzie głównym
mechanizmem detoksykacyjnym jest synteza Gln. W stanach nadmiaru NH

3

zachodzi karboksylacja

ketokwasów na potrzeby sprzęgania i unieczynniania NH

3

.

Uwalnianie azotu amidowego Gln katalizuje glutaminaza: Gln + H

2

O → Glu + NH

4

+

.

Współdziałanie obu powyższych enzymów warunkuje równowagę pomiędzy jonem amonowym a Gln.

- -

101

d)

eliminacja

U człowieka 80 – 95 % azotu wydalane jest przez nerki w postaci mocznika, powstałego w cyklu
mocznikowym, zachodzącym gł. w wątrobie. Cykl ten ma zatem kluczowe znaczenie w detoksykacji
organizmu.

Po przetransportowaniu CO

2

i NH

4

+

do matrix mitochondrialnej reagują one z 2 ATP, co katalizuje

syntetaza karbamoilofosforanowa I (mitichondrialna).

Reszta karbamoilowa ulega przeniesieniu na Orn, która dostaje się do mitochondrium dzięki
translokazie ornitynowej. Produktem reakcji jest P

i

oraz Cyt, eksportowana do cytozolu. Reakcję

katalizuje transkarbamoilaza ornitynowa.

W cytozolu cytulina reaguje z ATP dając cytrulilo-AMP, który wraz z Asp tworzy argininobursztynian.
Reakcję katalizuje syntetaza argininobursztynianowa.

Argininobursztynian ulega trans-eliminacji katalizowanej przez argininobursztynazę, w wyniku czego
powstaje Arg i fumaran.

Arginaza występuje w wątrobie, tkance nerwowej, mózgu, gr. sutkowym, jądrze, skórze; aktywność ta
hamowana jest przez Orn i Lys. Katalizuje ona rozczepienie grupy guanidynowej Arg, dając Orn i
mocznik, usuwany do krwi.

Regulacja cyklu:

Głodzenie nasila syntezę enzymów, aby możliwe było wydalanie większej ilości mocznika z
powodu zwiększonego katabolizmu białkowego.

Kluczowe znaczenie ma pierwsza reakcja cyklu – syntetaza karbamoilfosforanowa I wykazuje
aktywność wyłącznie w obecności allosterycznego modyfikatora (N-Ac-Glu) zwiększaącego
powinowactwo do ATP. Poziom N-Ac-Glu jest wypadkową reakcji syntezy i degradacji:

Glu + AcCoA →syntaza N-Ac-Glu→ N-Ac-Glu →hydrolaza N-Ac-Glu→ Glu + octan

- -

102

Zaburzenia cyklu – ogólnie wywołują wymioty, unikanie pokarmów bogatobiałkowych, przerywaną
ataksję, nerwowość, letarg i opóźniony rozwój umysłowy.

hiperamonemia typ I – defekt syntetazy karbamoilofosforanowej I

hiperamonemia typ II – defekt transkarbamoilazy Orn → ↑ Glu

cytrulinemia – defekt syntetazy argininobursztynianowej, ↑ Cyt

acyduria argininobursztynianowa – defekt argininobursztynazy, → łamliwe włosy skupione w
kępki

w cytrulinemii i acydurii argininobursztynianowej podaje się Arg i benzoesan

hiperargininemia – defekt arginazy → ↑ Arg, podobieństwo do lizynocystynurii

3.

Metabolizm poszczególnych aminokwasów

Ze względu na możliwość biosyntezy de novo wszystkie aa dzielimy na endogenne i egzogenne. Te

pierwsze mogą być zsyntetyzowane przez organizm człowieka, drugie zaś nie – z powodu braku odpowiednich
enzymów – i muszą być dostarczane wraz z pokarmem. Do aa endogennych zaliczamy: Glu, Gln, Ala, Asp, Ans,
Ser, Gly, Pro, Cys, Tyr, Hyp i Hyl, pozostałe zaś – do egzogennch. Możliwość syntezy niektórych aa (ich
endogenny charakter) zależy w pewnych przypadkach od odpowiedniej podaży innych, np. Tyr może być
syntetyzowana pod warunkiem obecności odpowiedniej ilości Phe. Charakter aa zmienia się również z wiekiem,
np. Arg jest egzogenna dla dzieci, z powodu ich szybkiego wzrostu, natomiast u dorosłych całkowicie wystarczą
zasoby produkowane w cyklu mocznikowym.

Ze względu na to, czy produkty katabolizmu szkieletu węglowego danego aa zasilają szlaki syntezy

węglowodanów czy lipidów, dzielimy aa na glukogenne i ketogenne. Do aa czysto glukogennych należą: Gly,
Ala, Val, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Glu, Arg, His, Pro i Hyp, do czysto ketogennych – jedynie Leu, zaś do
jednocześnie gluko- i ketogennych: Ile, Lys, Phe, Tyr oraz Trp.

a)

Kwas asparaginowy (asparaginian, Asp, D) jest aa endogennym. Syntetyzowany jest ze szczawiooctanu
w reakcji transaminacji:

szczawiooctan + Ala →AT→ Asp + Pyr.

Jego katabolizm polega na przebiegu tej samej reakcji w przeciwną stronę.

b)

Asparaginaza (amid kwasu asparaginowego, Asn, N) jest również endogenna. Powstaje z Asp w reakcji
katalizowanej przez syntetazę Asn:

Asp + Glu + ATP →syntetaza Asn→ Asn + Glu + AMP + PP

i

(→ 2 P

i

)

Jej rozkład przez asparaginazę daje z powrotem Asp:

Asn + H

2

O →asparaginaza→ Asp + NH

4

+

c)

Kwas glutaminowy (glutaminian, Glu, E) jest endogenny – powstaje z α-ketoglutaranu w reakcji
katalizowanej przez dehydrogenazę Glu:

α-ketoglutaran + NH

4

+

+ NAD(P)H + H

+

→dehydrogenaza Glu→ Glu + H

2

O + NAD(P)

+

Katabolizowany jest z powrotem do α-KG w reakcji transaminacji:

Glu + Pyr →AT→ α-ketoglutaran + Ala

Glu jest substratem do syntezy γ-aminomaślanu (GABA), pełniącego funkcje hamującego
neurotransmitera w UN:

Glu ↔dekarboksylaza Glu, PLP↔ GABA

GABA ulega degradacji przez przekształcenie do składników cyklu Krebsa:

GABA → semialdehyd bursztynowy → α-KG lub bursztynian

d)

Glutamina (amid kwasu glutaminowego, Gln, Q) jest endogenna – syntetyzowana z Glu przy udziale
aktywności syntetazy Gln:

Glu + NH

4

+

+ ATP →syntetaza Gln→ Gln + ADP + P

i

Rozkładana jest do Glu przy udziale glutaminazy:

Gln + H

2

O →glutaminaza→ Glu + NH

4

+

e)

Alanina (Ala, A) jest zarówno syntetyzowana, jak i katabolizowana przez transaminację z / do
pirogronianu:

Pyr + Glu ↔AT↔ Ala + α-KG

f)

Glicyna (Gly, G) jest aa endogennym. Może być syntetyzowana na kilka sposobów:

z glioksalanu przez transaminację (w wątrobie):

glioksalan + α-aa ↔AT↔ Gly + α-ketokwas (1)

- -

103

z choliny:

cholina ↔ aldehyd betainowy ↔ betaina ↔ dimetyloglicyna ↔ sarkozyna ↔ Gly (2)

z Ser:

Ser + THF ↔hydroksymetylotransferaza Ser↔ Gly + metyleno-THF (3)

Powstająca z Gly cholina używana jest do syntezy:

acetylocholiny (ACh) – neurotransmitera:

cholina + AcCoA →acetylotransferaza cholinowa→ ACh

ACh →esteraza cholinowa (AChE)→ cholina + octan

fosfolipidów – składników błon biologicznych:

cholina → cholino-{P} →CDP-cholina

CDP-cholina + DAG → fosfatydylocholina = lecytyna

Degradacja Gly zachodzi albo przez zachodzenie reakcji (1) i (3) w drugą stronę albo przez rozkład z
udziałem syntazy Gly:
Gly + NAD

+

+ THF →syntaza glicynowa, PLP→ CO

2

+ NH

4

+

+ NADH + H

+

+ metyleno-THF

g)

Seryna (Ser, S) jest endogenna. Może powstawać albo z Gly w wyżej podany sposób (tą drogą zachodzi
również jej degrdacja), jak również z 3-{P}-glicerynianu w ciągu przemian:

3-{P}-glicerynian + NAD

+

→ {P}-hydroksypirogronian + NADH + H

+

{P}-hydroksypirogronian + α-aa →AT→ {P}-seryna + α-ketokwas

{P}-seryna + H

2

O → seryna + P

i

h)

Prolina (Pro, P) jest aa endogennym. Zarówno jej synteza, jak i rozkład, zachodzą przez przekształcenia
z / do Glu:

Glu + NADH + H

+

↔dehydrogenaza↔ γ-semialdehyd Glu + NAD

+

γ-semialdehyd Glu ↔ dehydroprolina + H

2

O

dehydroprolina + NADH + H

+

↔dehydrogenaza Pro↔ Pro + NAD

+

i)

Hydroksyprolina (Hyp) jest endogenna, choć nie jest kodowana przez żaden kodon mRNA. Powstaje z
Pro w wyniku nieodwracalnej hydroksylacji zachodzącej na mikrosomach (ER) w skórze, wątrobie,
płucach, sercu, mięsniach i ziarninujących ranach:

Pro →hydroksylaza Pro, Fe

2+

, O

2

, wit. C, α-KG→ Hyp

Może być degradowana do Pyr i glioksalanu, głównie jednak wydalana jest z moczem w formie
niezmienionej. Ponieważ występuje wyłącznie w proteinach łącznotkankowych – kolagenie i elastynie
– jej poziom uznawany jest za diagnostyczny wskaźnik szybkości degradacji tkanki łącznej (gł. kości).
Wzrasta on w takich patologiach jak: choroba Pageta, pierwotna i wtórna nadczynność przytarczyc /
tarczycy / kory nadnerczy, przerzuty nowotworowe do kości oraz w osteoporozie.

j)

Arginina (Arg, R) jest generalnie endogenna, choć zależy to od wieku (patrz wyżej). Jest elementem
cyklu mocznikowego (patrz punkt VI-2-d) – syntetyzowana przy udziale argininobursztynazy, zaś
degradowana przez arginazę do Orn. Arg bierze udział w syntezie dwóch istotnych związków:

kreatyna – przenośnik energii gł. w mięśniach:

Arg + Gly →transamidynaza Arg-Gly (nerka)→ glikocyjamina = guanidynooctan

guanidynooctan + ATP + SAM →metylotransferaza guanidynooctanowa (wątroba)→

→ fosforan kreatyny (PCr, mięśnie, mózg, krew) + ADP + SA-homocysteina

fosfokreatyna + ADP ↔kinaza (fosfo)kreatynowa = CK / CPK↔ kreatyna + {P} + ATP

kreatyna →nieenzymatyczna cyklizacja w mięśniach→

→ kreatynina (→ wydalanie z moczem) + H

2

O

Ponieważ powstawanie kreatyniny jest reakcją nieenzymatyczną, jej poziom jest proporcjonalny do
masy mięśniowej organizmu (wykorzystywane w sporcie). Szybkość usuwania kreatyniny z krwiobiegu
przez nerki (tzw. klirens endogennej kreatyniny) przyjmuje się za równy szybkości filtracji
kłębuszkowej (GFR) – parametr służący do oceny sprawności pracy nerek (np. w oparciu o niego
określa się stopień zaawansowania przewlekłej niewydolności nerek). GFR można również obliczyć
pośrednio na podstawie stężenia kreatyniny we krwi (wzór Cockcroft’a – Gault’a).
Z kolei poziom CPK jest wskaźnikiem diagnostycznym uszkodzenia tkanek, gł. mięśni. Wzrasta przy
kontuzjach, nadmiernym wysiłku fizycznym, w chorobach mięśni, w tym serca, OUN, wylewach,
napadach epileptycznych, niedoczynności tarczycy, radioterapii, farmakoterapii statynami. Spadek CPK
może oznaczać RZS lub alkoholową chorobę wątroby. Izoenzym sercowy (CK-MB) używany jest w
diagnostyce zawału mięśnia sercowego. (por. II-5-b i c)

- -

104

tlenek azotu (NO):

Arg + O

2

→ syntaza tlenku azotu (NOS)→ Cyt + NO

NOS wymaga kofaktorów: NADPH, FAD, FMN, THB (tetrahydrobiopteryny) oraz hemu. Występuje w
trzech formach – dwóch konstystucyjnych (śródbłonkowa – eNOS, neuronalna – nNOS) oraz jednej
indukowalnej (makrofagowa – iNOS). NO produkowany przez śródbłonek w odpowiedzi na
pobudzenie PS

+

(→ ACh → PIP

2

→IP

3

+ DAG → ↑ Ca

2+

→ Ca

2+

/kalmodulina → NOS → NO)

dyfunduje do leżącej głębiej mięśniówki gładkiej naczyń, gdzie pobudza GC do produkcji cGMP, który
stymuluje defosforylację łańcuchów lekkich miozyny, wykazując działanie rozszerzające naczynia oraz
hamujące agregację trombocytów. Działanie tego układu można nasilić podając egzogenny donator NO
(np. nitroglicerynę) lub zahamować PDE rozkładającą cGMP (np. sildenafil). NO jest usuwany przez
wiązanie z hemoproteinami oraz interakcje ze związkami tlenu:

NO + ½ O

2

→ NO

2

NO + HO

2

*

→ ONOOH (peroksyazotyn) → NO

2

+ OH

*

k)

Ornityna (Orn) nie jest kodowana przez mRNA, a jedynie powstaje z Arg jako jeden z produktów cyklu
mocznikowego. Może albo włączyć się w następny obrót cyklu (kondensacja z karbamoilofosforanem)
albo zostać rozłożona przez transaminację:

Orn + α-KG →δ-aminotransferaza Orn→ γ-semialdehyd Glu + Glu

Dalsze przemiany γ-semialdehydu Glu prowadzą do Glu lub Pro (patrz Pro). Orn może podlegać
również dekarboksylacji do putrescyny, która stanowi substrat do syntezy biogennych amin
alifatycznych – poliamin:

Poliaminy (spermidyna i spermina) to zasadowe substancje związane z proliferacją i wzrostem
komórkowym (przez wiązanie z kwasami nukleinowymi powodują ich stabilizację i stymulują
biosyntezę). Ponadto obniżają RR i temperaturę ciała.

l)

Cysteina (Cys, C) należy do aa endogennych. Syntetyzowana jest w przez fuzję dwóch innych aa – Met
i Ser, a dokładniej (patrz również Met):

Met →→→ homocysteina

homocysteina + Ser → cystationina → Cys

Może również powstawać przez rozkład wiązań dwusiarczkowych cystyny:

Cys-S-S-Cys + NADH + H

+

→reduktaza cystynowa→ 2 Cys-SH + NAD

+

Jej katabolizm jest odbywa się również na dwa sposoby, prowadzące do wspólnego końca:

I: Cys →dioksygenaza→ cysteinosulfinian →AT→ β-sulfinylo-Pyr →desulfinaza→ Pyr

II: Cys →AT→ tiolo-Pyr →siarkotransferaza→ Pyr

Oprócz wyjątkowej funkcji w kształtowaniu struktury białek, Cys stanowi jeden z substratów do
syntezy glutationu (GSH):

Cys + Glu + ATP →syntetaza γ-Glu-Cys→ γ-glutamylocysteina + ADP

γ-Glu-Cys + Gly + ATP →syntetaza GSH→ ADP + γ-glutamylocysteinyloglicyna (GSH)

- -

105

m)

Fenyloalanina (Phe, F) jest dla człowieka egzogenna (organizm nie potrafi samodzielnie jej
wytworzyć). Praktycznie jedyną reakcją (poza wbudowywania do białek) Phe jest hydroksylacja do Tyr
zachodząca w hepatocytach:

Phe →hydroksylaza Phe→ Tyr

Niedobór tego enzymu jest przyczyną hiperfenyloalaninemii typu I, czyli klasycznej fenyloketonurii
(PKU). Wobec braku enzymu Phe jest katabolizowana przez transaminację do nie fizjologicznych
metabolitów, jak fenylopirogronian (fenyloketon), felylooctan i fenyloetyloamina; ten pierwszy można
wykrywać w moczu i stanowi wówczas wskaźnik diagnostyczny PKU.

n)

Tyrozyna (Tyr, Y) jest aa endogennym, który powstaje w wyniku hydroksylacji Phe – o ile nie
występuje niedobór tej ostatniej lub blok metaboliczny hydroksylacji (PKU). Katabolizm Tyr obejmuje
szereg reakcji:

Tyr + α-KG →AT, PLP→ {P}-hydroksyfenylo-Pyr + Glu

{P}-hydroksyfenylo-Pyr + ½ O

2

→dioksygenaza, Cu

2+

, wit. C→ homogentyzynian + CO

2

homogentyzynian + ½ O

2

→dioksygenaza, Fe

2+

→ maleiloacetooctan

maleiloacetooctan →izomeraza cis-trans, GSH→ fumaryloacetooctan

fumaryloacetooctan + H

2

O →fumaryloacetoacetaza→ fumaran + acetooctan (AcAc)

Następnie fumaran wchodzi do cyklu Krebsa, zaś acetooctan zasila pule ciał ketonowych (patrz punkt
V-5-e). Niedobór dioksygenazy homogentyzynianu powoduje alkaptonurię. Główne objawy choroby
związane są ze wzmożoną konwersją Tyr do melaniny i jej odkładaniem w tkankach i obejmują:
ochranozę (wzmożoną pigmentację tkanki łącznej), zapalenie stawów oraz ciemnienie moczu na
powietrzu.
Ponadto Tyr może ulegać:

dezaminacji do tyraminy,

sprzęganiu z jodem do mono- (MIT) i dwujodotyrozony (DIT), z których następnie powstają hormony
tarczycy – trójjodoyronina (T

3

) oraz tyroksyna (T

4

),

hydroksylacji przez hydroksylazę Tyr do dihydroksyfenyloalaniny (DOPA):

Tyr →3-monooksygenaza (hydroksylaza) Tyr, Cu

2+

→ DOPA

DOPA pełni niezwykle istotną rolę metaboliczną, stanowi bowiem związek wyjściowy dla dwóch
ważnych szlaków, tj.:

syntezy amin katecholowych (neurony, rdzeń nadnerczy), stanowiących neurotransmitery i hormony:

DOPA →dekarboksylaza DOPA, PLP→ dopamina (D)

dopamina →β-oksydaza dopaminowa, Cu

2+

, wit. C→ noradrenalina (NA)

noradrenalina →N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa→ adrenalina (A)

Katecholaminy są katabolizowane przez oksydazę monoaminową (monoaminooksydazę = MAO) oraz
katecholoksymetylotransferazę (COMT) odpowiednio: D do kwasu homowalinowego (HVA), NA do
normetanefryny i kwasu wanilinomigdałowego (VMA), zaś A do metanefryny i VMA. Zarówno wolne
aminy katecholowe, jak i ich metabolity, stanowią wskaźnik diagnostyczny ogólnoustrojowej produkcji.
Markery te ulegają zwiększeniu w guzie chromochłonnym rdzenia nadnerczy (phaeochromocytoma).

syntezy barwników skóry i wytworów naskórkowych – melanin (melanogeneza):

DOPA →oksydaza katechlowa→ dopachinon

dopachinon →→→ trichochromy, feomelaniny (czerwone), melaniny mieszane, melanochrom

melanochrom i inne →→→ eumelaniny (ciemnobrązowe)

eumelaniny / feomelaniny + białka macierzy melanosomalnej → melanoproteiny

Zaburzenia enzymów szlaku melanogenezy prowadzą do hipopigmentacji bądź albinizmu.

o)

Lizyna (Lys, K) jest dla człowieka aa egzogennym. Ulega ona katabolizmowi bez transaminacji do CO

2

i H

2

O. Lys stanowi substrat do syntezy karnityny – przenośnika długołańcuchowych KT przez błonę

mitochondrialną (patrz punkt IV-5-b):

Lys → N

6

-trimetylo-Lys → N

6

-trimetylo-3-hydroksy-Lys → karnityna

Może również ulegać mikrosomalnej hydroksylacji do Hyl.

p)

Hydroksylizyna (Hyl, Lys-OH) jest endogenna, choć nie kodowana przez mRNA – powstaje z Lys pod
wpływem swoistej hydroksylazy na zasadzie analogicznej do syntezy Hyp z Pro:

Lys →hydroksylaza Lys, Fe

2+

, O

2

, wit. C, α-KG→ Hyl

- -

106

q)

Histydyna (His, H) jest aa egzogennym. Ulega degradacji w następującym ciągu reakcji:

His →histydaza→ urokanian

urokanian →urokanaza→ 4-imidazolo-5-propionian

4-imidazolo-5-propionian →imidazolopropionaza→ N-formimino-Glu (FIGLU)

FIGLU + THF →formiminotransferaza Glu→ Glu + formimino-THF

His jest ponadto prekursorem aminy biogennej – histaminy:

His → dekarboksylaza aa aromatycznych / dekarboksylaza His → histamina

Dekarboksylaza His hamowana jest przez aa α-metylowe. Histamina bierze udział w rozwoju alergii i
stanu zapalnego. Katabolizowana jest przez imidazolo-N-metylotransferazę, monooksygenazę (MAO) i
dioksyganazę (DAO) do N-metyloimidazolooctanu. Histamina może być wydzielana przez pewne guzy
przewodu pokarmowego (np. rakowiaka).

r)

Treonina (Thr, T) jest aa egzogennym. Katabolizm przebiega nastepująco:

Thr →aldolaza Th, PLP→ aldehyd octowy + Gly

aldehyd octowy →dehydrogenaza aldehydowa→ octan →syntaza AcCoA→ AcCoA

s)

Metionina (Met, M) również jest egzogenna. Ulega następującym reakcjom katabolicznym:

Met →aktywacja, - CH

3

, - S, - NH

3

→ α-ketomaślan

α-ketomaślan →oksydacyjna karboksylacja→ α-KG

α-KG → - CO

2

→ propionylo-CoA

propionylo-CoA → + CO

2

→ metylomalonylo-CoA

metylomalonylo-CoA →wit. B

12

→ sukcynylo-CoA

Dzięki niepowtarzalnej budowie (grupa metylowa połączona z resztą cząsteczki przez atom siarki) Met
bierze udział w przenoszeniu grup metylowych na inne związki:

Met + ATP →adenozylotransferaza Met→ S-adenozylo-Met (SAM)

SAM + X →transmetylaza→ SA-homocysteina + X-CH

3

SA-homocysteina →adenozylotransferaza→ homocysteina

Ponadto dekarboksylowana SAM bierze udział w syntezie poliamin (patrz Orn), zaś homocysteina – w
syntezie Cys (patrz Cys).

t)

Tryptofan (Trp, W) zaliczany jest do aa egzogennych. Ulega on katabolizmowi w skomplikowanym
szlaku kinureninowo – antranilanowym z udziałem PLP do CO

2

i H

2

O. Trp jest prekursorem związków

aktywnych biologicznie: serotoniny oraz melatoniny:

Trp →hydroksylaza Trp→ 5-hydroksy-Trp (5-HTP)

5-HTP →dekarboksylaza 5-HTP / aa aromatycznych→ 5-hydroksytryptamina (5-HT, serotonina)

5-HT →transmetylaza hydroksyindolowa (HIOMT)→ 5-metoksytryptamina

5-HT →MAO→ 5-hydroksyindolooctan (HIAA)

5-HT →N-Ac-transferaza 5-HT→ N-Ac-5-HT

N-Ac-5-HT →HIOMT→ N-Ac-5-metoksytryptamina = melatonina

Serotonina bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, m. in. w regulacji motoryki przewodu
pokarmowego oraz agregacji trombocytów (patrz punkt VI-4-d). Serotonina i jej metabolity (HIAA),
podobnie jak histamina, mogą być wydzielane przez guzy neuroendokrynne przewodu pokarmowego
(np. rakowiaka). Oznaczenie poziomu HIAA w moczu odzwierciedla ogólnoustrojową produkcję
serotoniny.

- -

107

u)

Walina (Val, V), leucyna (Leu, L) oraz izoleucyna (Ile, I) są określane wspólnie jako aa o
rozgałęzionym łańcuchu bocznym. Cała grupa jest egzogenna. Ulegają one rozkładowi w wątrobie,
nerkach, mięśniach, sercu oraz tkance tłuszczowej.

Zaburzenie aktywności dehydrogenazy ketokwasów poch. z aa rozgałęzionych jest przyczyną choroby

syropu klonowego (nazwa wzięła się od charakterystycznego zapachu moczu osób na nią cierpiących).
Nieprzestrzeganie diety prowadzi do upośledzenia fizycznego i umysłowego.

•

Punkty wejścia metabolitów aa do cyklu Krebsa:

← szczawiooctan ← Asp ← Asn
← cytrynian ←

AcCoA ← Ile, Leu, Trp

← Pyr ← Ala, Cys, Gly, Hyp, Ser, Thr

← AcAcCoA ← Leu, Lys, Phe, Trp, Thr

← α-ketoglutaran ← Glu ← Arg, His, Gln, Pro
← sukcynylo-CoA ← Ile, Met, Val
← fumaran ← Phe, Tyr

4.

Przemiana nukleotydów

a)

trawienie kwasów nukleinowych w przewodzie pokarmowym

sok trzustkowy – rybonukleaza, dezoksyrybonukleaza → trawienie kwasów nukleinowych do
nukleotydów

sok jelitowy – polinuklotydazy, nukleozydazy (→ rozkład nukleotydów do zasad N i pentozo-{P})

- -

108

b)

budowa nukleotydów (patrz punkt VIII-1-a)

A = 6-aminopuryna

O = kwas 2,4-diokso-1,2,3,6-tetrahydro-4-pirymidynowy

G = 2-amino-6-oksypuryna

U = 2,4-dioksypirymidyna

H = 6-oksypuryna

C = 2-oksy-4-aminopirymidyna

X = 2,6-dioksypuryna

T = 2,4-dioksy-5-metylo-pirymidyna

c)

biosynteza nukleotydów purynowych

•

Szlak ten jest o tyle istotny, o ile pobrane z pokarmem zasady azotowe nie są wcale lub prawie wcale
wbudowywane do endogennych kwasów nukleinowych.

•

Głównym narządem syntezy puryn jest wątroba. Zdolności tej pozbawiony jest mózg, erytocyty i
leukocyty wielojądrzaste.

•

synteza de novo – z amfibolicznych związków pośrednich (kreski z prawej strony oznaczają
występowanie aktywności enzymatycznych w kompleksach; N – ogólny symbol nukleotydu)

- -

109

- -

110

•

reakcje rezerwowe (ang. „salvage”)

fosforylacja puryn:

A + PRPP →{P}-rybozylotransferaza adeninowa→ AMP + PP

i

H + PRPP →{P}-rybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa (HGPRT-aza)→ IMP + PP

i

G + PRPP →HGPRT-aza→ GMP + PP

i

fosforylacja nukleozydów purynowych:

N-R + ATP →kinaza→ NMP + ADP

•

regulacja syntezy puryn

•

biosynteza dezoksyrybonukleodytów (redukcja rybonukleotydów)

d)

degradacja puryn – zachodzi gł. w wątrobie i prowadzi do powstania kwasu moczowego

- -

111

U człowieka ostatecznym produktem katabolizmu purynowego jest kwas moczowy. Większość innych

ssaków potrafi natomiast utleniać mocznik do alantoiny, nazwanej tak od jednej z błon płodowych – omoczni
(łac. allantois) – w której ulega gromadzeniu. Kwas moczowy pełni rolę antyoksydantu, co stanowi przewagę
nad alantoiną, jest jednak od niej kilkukrotnie gorzej rozpuszczalny w wodzie. Z tego powodu przy nadmiernym
stężeniu we krwi (hiperurykemii) ulega wytrąceniu, uszkadzając nerki (kamica moczanowa, niewydolność) i
stawy (guzki dnawe – dna moczanowa). Przyczynami hiperurykemii mogą być: wysoka podaż puryn i/lub
fruktozy w diecie, głodzenie, jednoczesny rozpad dużej ilości komórek – np. rozległe urazy, oparzenia, zespół
rozpadu guza (TLS) towarzyszący nowotworom układu krwiotwórczego. Postępowanie lecznicze obejmuje:

odpowiednią dietę,

zmniejszenie syntezy kwasu moczowego – inhibitory oksydazy ksantynowej (allopurinol),

zwiększenie rozpuszczalności moczanów w moczu przez podniesienie jego pH – np. inhibitory
anhydrazy węglanowej (acetazolamid),

podanie enzymu rozkładającego kwas moczowy do alantoiny – rekombinowana urykaza (rasburikaza)

e)

odzysk puryn – cykl nukleotydów purynowych

f)

synteza nukleotydów pirymidynowych

- -

112

•

synteza de novo

•

szlaki rezerwowe

fosforylacja pirymidyn, np. OA + PRPP →rybozylotransferaza orotanowa→ OMP + PP

i

fosforylacja rybonukleotydów:

U-R + ATP →kinaza urydynowo-cytydynowa→ UMP + ADP

C-R + ATP →kinaza urydynowo-cytydynowa→ CMP + ADP

C-dR + ATP →kinaza deoksycytydynowa→ dCMP + ADP

T-dR + ATP →kinaza tymidynowa→ dTMP + ADP

•

regulacja syntezy pirymidyn

- -

113

g)

degradacja pirymidyn → produkty rozpuszczalne w wodzie

h)

kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydów

•

rola kwasu foliowego w metabolizmie nukleotydów

kwas foliowy = pterydyna + PABA + Glu

W jelicie kwas foliowy ulega reduktazie folianowej zależnej od NADPH, dając DHF (reakcję hamuje
trimetoprim) oraz THF (hamuje metotreksat (MTX)).

Rolą THF jest udział w przenoszeniu reszta jednowęglowych (C

1

):

Niedobór kwasu foliowego i/lub wit. B

12

uniemożliwia syntezę nukleotydów purynowych i TMP, a

przez to niedokrwistość megaloblastyczną.

•

Synteza puryn blokowana jest przez analogi Glu:

azaseryna → blok włączania N

3

diazanorleucyna → blok włączania N

9

azatiopryna → 6-merkaptopuryna (6MP) → bezpośredni blok powstawania AMP i XMP

kwas mykofenolowy (MPA) → bezpośredni blok powstawania XMP

•

Analogi pirymidyn kompetycyjnie hamują enzymy biorące udział w ich biosyntezie ({P}-
rybozylotransferaza orotanowa, np. 5-fluorouracyl (5FU), allopurinol.

- -

114

•

Wydalanie i reabsorpcja moczanów są kompetycyjnie hamowane przez wysokie dawki ASA.

•

Klasyfikacja chorób przebiegających z hiperurykemią:

prawidłowe wydalanie moczanów, defekt pracy nerek

nadmierna produkcja i wydalanie moczanów

niedobór enzymatyczny (sPRPP, HGPRT, glukozo-6-fosfataza)

wtórna patologia (nowotwór, łuszczyca)

nieznana etiologia

•

Przyczyną dny moczanowej jest enzymatyczne upośledzenie katabolizmu puryn (↑ v

m

, ↓ K

M

lub brak

regulacji syntazy PRPP, niedobór HGPRT-azy). Hiperurykemia prowadzi do krystalizacji moczanów w
stawach w postaci guzków dnawych, przeciwko którym skierowana zostaje odpowiedź zapalna.
Rozwija się przewlekłe dnawe zapalenie stawów dające artretyzm.

•

W zespole Lescha – Nyhana występuje deficyt aktywności HGPRT-azy, co powoduje ↑ PRPP →
↑ puryn → hiperurykemia, kamica moczanowa, porażenie móżdżkowe, samookaleczenia.

•

Choroba von Gierkego polega na niedoborze glukozo-6-fosfatazy, co powoduje ↑ PRPP, hiperurykemię
i kwasicę mleczanową.

•

Niedobór aktywności oksydazy ksantynowej może być spowodowany mutacją kodującego genu lub
silnym uszkodzeniem wątroby. Objawia się hiperurykemią, ksantynurią i kamicą ksantynową.

•

niedobór transaminazy → kwasica β-aminoizomaślanowa

•

niedobór ornitynotranskarbamoilazy → lekka kwasica orotowa, nietolerancja białek, encefalopatia
wątrobowa

•

orotoacudyria:

typ II – defekt dekarboksylazy orotydylanowej → anemia megaloblastyczna

typ I – j. w. + defekt {P}-rybozylotransferazy orotanowej → j. w. + niedobór immunologiczny

•

niedobór deaminazy adenozynowej (1) lub fosforylazy nukleotydu purynowego (2) → nagromadzenie
nie rozłożonego dATP i gGTP → allosteryczne zahamowanie reduktazy rybonukleotydowej →
pozbawienie komórek dCTP → niedobór immunologiczny: (1) → limfocyty T i B, (2) → tylko
limfocyty T

5.

Metabolizm porfiryn

•

struktura porfiny – 4 pierścienie pirolowe (I – IV) połączone mostkami metinowymi (α – δ)
(por. punkt I-3-e)

•

podstawniki: A = octan, M = metyl, P = propionian, V = winyl

•

gł. hemoproteiny: mioglobina, hemoglobina, cytochrom c, cytochrom P

450

(CYP), katalaza (CT), 2,3-

dioksygenaza Trp, syntaza tlenku azotu (NOS)

- -

115

a)

synteza hemu – 85 % zachodzi w komórkach erytroidalnych szpiku, zaś prawie cała reszta w wątrobie

•

regulacja syntezy hemu zachodzi na etapie syntazy ALA i polega gł. na modulacji ekspresji genów

← (-) hem + aporepresor
← (+) leki metabolizowane przez CYP (barbiturany, gryzeofulwina)
← (-) podawanie glukozy lub hematyny

- -

116

b)

rozkład hemu – część porfirynowa katabolizowana jest przez komórki układu siateczkowo –
śródbłonkowego (RES) wątroby, śledziony i szpiku

c)

zaburzenia metabolizmu porfiryn

Porfirie to wrodzone (dziedziczone gł. AD) lub nabyte choroby związane z wadliwą syntezą hemu.

Zależnie od enzymu, którego dotyczy defekt, wyróżnia się 5 typów choroby. Nagromadzenie ALA i PBG w
tkankach i płynach ustrojowych powoduje toksyczne działanie na nerwy brzuszne, stąd bóle brzucha. Wychwyt
ALA przez mózg i jego hamujący wpływ na aktywność ATP-azy powoduje upośledzenie neurotransmisji i przez
to – zaburzenia neuropsychiczne. Zwiększony poziom porfirynogenów w skórze i tkankach, połączony z ich
samorzutnym utlenianiem się do porfiryn pod wpływem światła, znacznie nasila stres oksydacyjny; wolne
rodniki uszkadzają organella komórkowe, m. in. lizosomy, które uwalniają enzymy, niszczące skórę i
powodujące jej bliznowacenie (stąd nadwrażliwość na światło). Leczenie polega na unikaniu leków i alkoholu,
podawaniu glukozy, hematyny (hamują syntezę hemu) i β-karotenu (antyoksydant) oraz aplikowaniu na skórę
filtrów hamujących promienie światła widzialnego u UV.

- -

117

hiperbilirubinemia → dyfuzja do tkanek → żółtaczka

↑ produkcja ← np. hemoliza

↓ usuwanie ← np. uszkodzenie wątroby, niedobór

enzymu, mechaniczna blokada odpływu

hiperbilirubinemia retencyjna = miąższowa

hiperbilirubinemia zwrotna = zastoinowa

↑ bilirubina nie sprzężona = pośrednia

↑ bilirubina sprzężona = bezpośrednia

→ żółtaczka jąder podstawnych (kernicterus)

→ ↑ bilirubina w moczu (choluria)

hiperbilirubinemia z dominacją bilirubiny nie sprzężonej

anemia hemolityczna

fizjologiczna żółtaczka noworodków ← hemoliza HbF i niewydolność enzymatyczna wątroby w
zakresie dostatecznie szybkiego usuwania bilirubiny pośredniej; żółtaczka jąder podstawnych
mózgu powoduje upośledzenie umysłowe; leczenie obejmuje podawanie fenobarbitalu (nasila
proces sprzęgania) oraz fototerapię (stymuluje rozkład bilirubiny w skórze)

zespół Criglera – Najjara

typ I – wrodzona żółtaczka niehemolityczna ← defekt UDP-glukuronylotransferazy

typ II – podobny defekt o łagodniejszym przebiegu

zespół Gilberta ← defekt wychwytu i sprzęgania bilirubiny

hiperbilirubinemia toksyczna ← uszkodzenie wątroby: CCl

4

, CHCl

3

, arsfenamina (Salwarsan),

acetaminofen (Paracetamol), WZW, marskość, zatrucie grzybami (muchomory – amanototoksyny)

hiperbilirubinemia z dominacją bilirubiny sprzężonej

niedrożność przewodów żółciowych, ucisk przez guz trzustki → cholestaza → żółtaczka
cholestatyczna

zespół Dubina – Johnsona, przewlekła żółtaczka samoistna – defekt przenośnika sprzężonej
bilirubiny do kanalików żółciowych

zespół Rotora – defekt transportu anionów organicznych przez hepatocyty

typ żółtaczki

bilirubina sprzężona w moczu

urobilinogen w moczu

fizjologia

w normie

niewiele

hemolityczna

-

↑

mechaniczna

+

-

typ żółtaczki

bilirubina w surowicy

bilirubina w moczu

urobilinogen w moczu

urobilinogen w kale

fizjologia

+

–

+

+

hemolityczna

↑ pośrednia

–

↑

↑

wątrobowa

↑

+ / –

↓ / +

↓

mechaniczna

↑ bezpośrednia

+

–

–

- -

118

ROZDZIAŁ VII – BIOCHEMIA FUNKCJONALNA TKANEK

1.

Endogenne regulatory procesów metabolicznych

a)

regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaźniki wtórne

•

receptory

Działanie hormonu na komórkę rozpoczyna się od połączenia z wysoko swoistym receptorem. Są to

struktury zapewniające wychwyt hormonów już w bardzo niewielkich stężeniach, 10

6

– 10

9

x mniejszych niż

cząsteczki o podobnej budowie. Oprócz swoistości receptory charakteryzują się dużym powinowactwem, szybką
odwracalnością oraz wysycalnością.

W strukturze receptora wyróżniamy dwie domeny czynnościowe – rozpoznającą (przyłącza hormon) oraz

sygnalizacyjną (przekłada informację na czynność wewnątrzkomórkową – tzw. sprzężenie receptorowo –
efektorowe). Receptory składają się z kilku części, np. nAChR – z 5, insulinowy – 4, kaskadowy cAMP – 7,
steroidowy – 4.

Jeżeli chodzi o umiejscowienie, to hormony białkowe, polipeptydowe i katecholaminy łączą się z

receptorami błonowymi, modulującymi aktywność enzymów, zaś hormony sterydowe, tarczycowe i retinolowe
stanowią ligandy dla receptorów śródkomórkowych (cytozolowych lub jądrowych), które modyfikują ekspresję
genów. Receptory sieroce są spokrewnione z rodziną receptorów typu steroidowo – tarczycowego, ale nie
posiadają znanego ligandu. Przykładowo receptor glikokortykoidowy ma budowę: C koniec – domena wiążąca
hormon – domena wiążąca DNA (ściślej sekwencję odpowiedzi hormonalnej – HRE) – 2 regiony aktywujące
transkrypcje genu – 2 regiony translokacji z cytoplazmy do jądra – region wiążący Hsp (białko szoku cieplnego,
chaperon) w nieobecności ligandu – N koniec.

•

hormony

Hormony są cząsteczkami chemicznymi, które po związaniu ze swoistymi receptorami modulują

czynności życiowe komórki. Hormony są substancjami endogennymi, co odróżnia je od wielu ksenobiotyków,
które również mogą wywoływać efekty biologiczne.

Hormony klasyfikować można ze względu na różne kryteria. Pod względem struktury chemicznej

mówimy o pochodnych aminokwasów, polipeptydach i steroidach. Mogą to być cząsteczki rozpuszczalne w
wodzie (hydrofilne) lub w tłuszczach (lipofilne). Receptory dla hormonów mogą być zlokalizowane na
powierzchni komórki bądź w jej wnętrzu. Wreszcie odnośnie II przekaźnika – może nim być kompleks hormonu
z receptorem, cAMP, cGMP, PIP

2

, Ca

2+

lub kaskada kinazowa. Powyższe cechy układają się w pewne wzory, co

pozwala na klasyfikacją hormonów na dwie główne grupy.

Pierwsza grupa hormonów obejmuje steroidy, jodotyroniny, kalcytriol i retinoidy. Są to związki lipofilne,

dlatego do transportu w osoczu wymagają białek nośnikowych, co przedłuża ich okres półtrwania do rzędu
godzin lub dni. Jednocześnie lipofilność pozwala im na przenikanie przez błony wszystkich komórek, jednak
wywierają efekty biologiczne wyłącznie tam, gdzie znajduje się swoisty dla nich receptor. Połączenie hormonu
pierwszej grupy z receptorem śródkomórkowym daje II przekaźnik. Taki kompleks ulega aktywacji (np. przez
odłączenie Hsp90 w receptorze glikokortykoidowym), po czym może migrować do jądra i wiązać się z
chromatyną, aktywując lub dezaktywując określone geny. Modyfikacja może zachodzić na różnych etapach
szlaku informacyjnego: transkrypcji, translacji, stężenia swoistych białek (nie więcej niż 1%). Wyróżnić można
dwa miejsca regulujące gen i położone przed nim, na które może wpłynąć hormon: nieswoisty element
promotorowy określający miejsce wiązania polimerazy RNA II oraz swoista sekwencja odpowiedzi hormonalnej
(HRE) składająca się z kilku fragmentów i odpowiedzialna za modulację częstości inicjacji transkrypcji (HRE
wiąże się z kompleksem silniej niż inne fragmenty DNA – por. punkt VIII-3-b). Geny kontrolowane przez kilka
hormonów mają odpowiednią liczbę HRE. Zmienna ilość HRE i fragmentów DNA współtworzy jednostki
odpowiedzi hormonalnej (HRU) – ich analiza pozwala na całościową ocenę wpływu hormonu na komórkę.
Aktywność genów może być modulowana przez hormony peptydowe również za pośrednictwem cAMP oraz
CREB.

- -

119

grupa hormonów

swoisty HRE

hormony płciowe: androgeny, estrogeny, progestyny

ARE, ERE, PRE

hormony kory nadnerczy: gliko- i mineralokortykoidy

GRE, MRE

hormony tarczycy: trójjodotyronina i tyroksyna

TRE

kalcytriol (aktywna witamina D

3

)

VDRE

kwas retinolowy (poch. witaminy A)

RARE

Druga grupa hormonów składa się z polipeptydów, białek i katecholamin. Są to cząsteczki hydrofilne, nie

transportowane w połączeniach z białkami nośnikowymi, dlatego ich okres półtrwania jest rzędu minut. Po
związaniu z receptorem błonowym uwalniany jest II przekaźnik – w zależności od niego wyróżniamy 4
podgrupy:

podgrupa

II przekaźnik

przykłady hormonów i receptorów

II A

cAMP

(+) ACTH, CT, FSH, hCG, ADH, CRH, LPH, LH, MSH, PTH, TSH,
glukagon, katecholaminy (receptor β)

II B

cGMP

ANF, NO

II C

Ca

2+

/ PIP

2

receptory M (ACh), CCK, PDGF, OT, TRH, ADH, PS, angiotensyna II,
gastryna, gonadoliberyna, katecholzminy (receptory α

1

)

II D

kaskada kinaz

FGF, IGF-I/II, EGF, NGF, PDGF, EPO, GH, CS, PRL, insulina

Hormony grupy II A wpływają na cyklazę adenylanową (AC), aktywując ją (H

S

+

) lub dezaktywując (H

i

-

).

Aktywna cyklaza katalizuje przejście ATP w cykliczny AMP (cAMP). Ten sam hormon może jednak różnie
zmieniać poziom cAMP w różnych tkankach, np. adrenalina działa głównie na mięśnie, a glukagon głównie na
wątrobę. Jeżeli tkanka reaguje na kilka hormonów tej samej podgrupy, to musi posiadać dla każdego z nich
niepowtarzalny receptor, regulujący na właściwy sobie sposób aktywność cyklazy. Równoczesne działanie
hormonów na komórkę nie jest jednak addytywne.

Cyklaza adenylanowa nie występuje samodzielnie, lecz jako fragment większego kompleksu – receptor

dla hormonów tej podgrupy składa się ponadto z części wiążącej hormon oraz białka G. Bezpośredni receptor
składa się z 7 hydrofobowych transbłonowych domen; poprzez zmiany konformacji pod wpływem hormonu ma
on zdolność indukcji białka G. Samo zaś białko G (białko wiążące GTP – GTPBP) jest heterotrimerem o
budowie αβγ. Istnieje wiele odmian GTPBP – wyróżniona dotychczas 16 odmian podjednostki α, 6 β, 12 γ oraz
8 odmian cyklaz. Podjednostki β i γ są ściśle ze sobą związane i zakotwiczone w błonie dzięki posttranslacyjnej
poliprenylacji resztami farnezylu oraz mirystylacji. Podjednostka α jest mobilna i w zależności od jej
występowania w wersji α

S

lub α

i

mówimy o białkach G pobudzających (G

S

) oraz hamujących (G

i

). Indukcja

przez bezpośredni receptor katalizuje reakcję: GDP-αβγ + GTP → GTP-α + βγ + GDP, zaś powrót do stanu
wyjściowego możliwy jest dzięki GTP-azowej aktywności podjednostki α

S

. Toksyna cholery jest

nieodwracalnym aktywatorem cyklazy przez zniesienie aktywności GTP-azy, podobnie toksyna krztuśca przez
zniesienie aktywności podjednostki α

i

. Podjednostka α związana z GTP aktywuje odpowiedni efektor – może

nim być nie tylko cyklaza adenylanowa, lecz również kanały potasowe, wapniowe lub fosfolipaza C (PLC).
Dzięki temu kompleksy białek biorą udział w regulacji metabolizmu, skurczu mięśnia, akcji serca i ciśnienia
tętniczego, aktywności nerwowej oraz w percepcji wzrokowej i węchowej.

cAMP wywiera odpowiednie efekty fizjologiczne poprzez połączenie z heterotetrameryczną cząsteczką

kinazy zależnej od cAMP. Składa się ona z dwóch podjednostek regulatorowych (R) i dwóch katalitycznych (C):
4 cAMP + R

2

C

2

→ R

2

(cAMP)

4

+ 2 C. Uwolniona i przez to zaktywowana podjednostka katalityczna katalizuje

przeniesienie reszty γ-fosforanowej z ATP na serynę lub treoninę odpowiedniego białka, zazwyczaj w sekwencji
RRXS lub KRXXS. Powstanie fosfoprotein wywołuje efekty biologiczne, jako że fosforylacja dotyczy
najczęściej cząsteczek enzymów. Dochodzą do tego wtórne fosforylacje oraz wpływ cAMP na geny poprzez
białko CREB. Przerwanie działania odbywa się głównie przez hydrolizę cAMP do 5’-AMP przez
fosfodiesterazy (PDE). Podlegają one regulacji przez inne hormony, kompleks Ca

2+

-kalmodulina oraz

ksenobiotyki (np. metyloksantyny). Również fosfoproteiny ulegają rozkładowi przez fosfatazy, które z kolei
mogą znów być regulowane przez odwracalną fosforylację oraz interakcje z białkami.

Hormony grupy II B działają podobnie na cyklazę guanylanową, katalizującą przejście GTP w cGMP.

Ten ostatni pełni funkcję II przekaźnika dla atriopeptyn (np. ANF), wywołując natriurezę, diurezę,
wazodylatację oraz spadek produkcji aldosteronu. Podobnie działają: tlenek azotu (NO), nitroprusydek sodu,
nitrogliceryna, azotyn sodu (NaNO

2

), azydek sodu (NaN

3

) – dzięki fosforylacji łańcuchów lekkich miozyny

miocyty ulegają relaksacji, a naczynia – rozszerzeniu. Efekt ten wzmagają inhibitory PDE, np. cytrynian
sildenafilu (preparat Viagra).

- -

120

Jon wapniowy (Ca

2+

) jest istotnym regulatorem wewnątrzkomórkowym, biorącym udział w skurczu

mięśnia, hemostazie, przekaźnictwie synaptycznym oraz modyfikacji aktywności enzymów. Pomimo znacznego
gradientu stężenia – ok. 5 – 10 tys. x (Ca

2+

w ECF ≈ 2,5 mM a w ICF ≈ 0,1 – 10 µM) – transport przez błonę jest

ograniczony. Stan taki możne być zmieniony przez działanie hormonów podgrupy II C, mobilizujących
wymiennik Na

+

/Ca

2+

(duża pojemność a małe powinowactwo). Ponadto występują: wymiennik Ca

2+

/H

+

(duże

powinowactwo a mała pojemność) oraz mechanizm mobilizacji wapnia z mitochondriów i ER. Wiele swoistych
efektów Ca

2+

wywiera przez zależne od siebie białko regulatorowe – kalmodulinę. Po wysyceniu w nim czterech

miejsc wiążących Ca

2+

zmiany konformacyjne prowadzą do uformowania α-helisy, co pozwala na modyfikację

aktywności enzymów. Często kalmodulina stanowi fragment większego kompleksu białkowego, w których pełni
wówczas funkcje regulatorowe. Połączenie Ca

2+

-kalmodulina jest w stanie modyfikować aktywność

następujących enzymów: cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa, PDE, Ca

2+

-zależna kinaza białkowa,

kinaza białkowa zależna od Ca

2+

i fosfolipidów, kinaza miozyny, kinaza fosforylazy, kinaza NAD

+

, fosfataza

fosfoproteinowa 2B, fosfolipaza A

2

, kinaza pirogronianowa, dehydrogenaza pirogronianowa, karboksylaza

pirogronianowa, Ca

2+

/Mg

2+

-ATP-aza, dehydrogenaza glicerolo-3-{P}, syntaza glikogenowa.

Szlak polifosfoinozytolowy polega na aktywacji fosfolipazy C (PLC) oraz otwarciu kanałów wapniowych

przez kompleks receptora z hormonem za pośrednictwem białka G. PLC katalizuje rozpad błonowego
fosfatydyloinozytolodwufosforanu (PIP

2

) do inozytolotrójfosforanu (IP

3

) oraz diacyloglicerolu (DAG). Ten

pierwszy indukuje uwalnianie wapnia z ER i mitochondriów. Wzrost cytozolowego poziomu wapnia powoduje
jego łączenie z kalmoduliną oraz konsekwentną aktywację kinaz kalmoduliny – swoistej i wieloczynnościowej.
IP

3

może ulec przekształceniu w nieaktywny IP

2

lub w potencjalnie aktywny IP

4

. 1,2-DAG wraz z Ca

2+

aktywuje

kinazę białkową C (PKC). Kinazy kalmoduliny oraz PKC fosforylują odpowiednie białka. Powstałe
fosfoproteiny oraz inne skutki działania Ca

2+

wywołują reakcje biologiczne.

Hormony grupy II D działają przez kaskadę kinaz białkowych. Do tej grupy należą regulatory procesów

wzrostu i różnicowania oraz reakcji zapalnych. Hormon bezpośrednio lub pośrednio (tj. odpowiednio przez
receptor bądź proteiny Tyk-2 czy JAK-1/2) aktywuje kinazy tyrozynowe, które dalej katalizują lawinę
fosforylacji.

b)

eikozanoidy – budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne

Eikozanoidy są pochodnymi kwasu arachidonowego oraz innych 20-węglowych kwasów tłuszczowych z

wiązaniami podwójnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi. Związki te pełnią funkcje lokalnie
działających hormonów, oddziaływujących na komórki docelowe za pośrednictwem receptorów związanych z
białkami G. Cząsteczka kwasu arachidonowego pochodzi zazwyczaj z pozycji sn-2 fosfolipidów błonowych,
skąd odszczepiana jest przez fosfolipazę A

2

(PLA

2

); proces ten nasila adrenalina, angiotensyna II, bradykinina,

trombina oraz Ca

2+

. Następnie od arachidonianu rozpoczyna się szlak cyklooksygenazy (PG, PGI, TX) oraz

lipoksygenazy (LT, LX). Wyróżniamy 3 grupy (I, II, III) eikozanoidów powstających z kwasów tłuszczowych
zawartych w diecie: linolowego, arachidonowego oraz α-linolenowego. Eikozanoidy charakteryzuje się podając,
do której z 5 rodzin należą, dodając literę, oznaczającą ilość i rodzaj podstawników oraz liczbę, oznaczającą
całkowita ilość wiązań podwójnych oraz serię.

Biosynteza prostanoidów jest katalizowana przez syntazę prostaglandyny H (PGHS, izoenzym 1 i 2),

posiadającą aktywność cyklooksygenazy (COX) i peroksydazy: arachidonian + 2 O

2

→ PGG

2

→ PGH

2

.

Powstały endoperoksyd może ulec przekształceniu do: PGD

2

(izomeraza), PGE

2

(izomeraza) i dalej PGF

2α

(reduktaza), PGI

2

(syntaza prostacyklinowa) i dalej 6-keto-PGF

1α

, TXA

2

(syntaza tromboksanowa) i dalej TXB

2

oraz do malonylodwualdehydu i hydroksyheptadekatrienoanu (HHT). Podobne przekształcenia zachodzą w
grupach I i III.

Cyklooksygenaza wykazuje zdolność katalizowania samozagłady – gdy zaprzestaje syntezy prostanoidów

rozkłada samą siebie. Ze względu na udział prostanoidów w rozwoju stanu zapalnego wiele leków p/zapalnych
uderza właśnie w układ PGHS. Substancje p/zapalne można podzielić na sterydowe i niesterydowe.

- -

121

Fizjologicznie kortykosteriody całkowicie hamują transkrycję PGHS-2. Kwas acetylosalicylowy acyluje i
inaktywuje PGHS. Wiele niesteroidowych leków p/zapalnych (NLPZ, ang. NSAID) kompetycynie hamuje
cyklooksygenazę, np. ibuprofen czy indometacyna. Raz powstałe prostanoidy ulegają degradacji przez
dehydrogenazę 15-hydroksyprostaglandynową; wpływ ten jest hamowany przez sulfasalazynę i indometacynę.

Szlak lipoksygenazy prowadzi do powstania leukotrienów (LT) i lipoksyn (LX). LT to sprzężone trieny

wytworzone w leukocytach, mastocytach i trombocytach. Występują tam 5-, 12- oraz 15-lipoksygenaza, które
przekształcają arachidonian w hydroksyperoksyeikozatetraenoany (HPETE), te zaś z kolei pod wpływem
peroksydazy dają hydroksyeikozatetraenoany (HETE). Przez dehydratację 5-HPETE powstaje LTA

4

, który

hydrolaza epoksydu LTA

4

przekształca w LTB

4

, zaś S-transferaza glutationowa w LTC

4

. Następnie GGTP

przekształca LTC

4

w LTD

4

, zaś dwupeptydaza Cys-Gly – LTD

4

w LTE

4

. LX są sprzężonymi tetraenami

powstającymi w leukocytach pod wpływem więcej niż jednej lipoksygenazy, natomiast ich dalsze
przekształcanie w LXA

4

-E

4

zachodzi podobnie jak LT.

Prostaglandyny (PG) i prostacykliny (PGI) biorą udział w rozwoju stanu zapalnego, regulacji szerokości

naczyń krwionośnych ((-): PGA, PGE, PGI, (+): PGF), PGI

2-3

produkowane w śródbłonku zapobiegają agregacji

trombocytów, zawarte w nasieniu pobudzają mięśniówkę macicy, wydzielane przez płód indukują poród;
stosowane są w antykoncepcji, aborcji, chorobie wrzodowej żołądka, stanie zapalnym, nadciśnieniu, astmie
oskrzelowej i nieżycie nosa. Tromboksany (TX) produkowane przez płytki autokrynnie indukują ich agregację i
zwężają naczynia (TXA

2

). Leukotrieny (LT) produkowane są w leukocytach; wchodzą w skład substancji wolno

działającej anafilaksji (SRS-A) – LTC

4

-E

4

wywołują silny skurcz oskrzeli. LTB

4

-E

4

rozszerzają naczynia

krwionośne i zwiększają ich przepuszczalność oraz indukują chemotaksję i aktywację leukocytów, przez co
przyczyniają się do rozwoju odpowiedzi immunologicznej.

2.

Gospodarka wapniowo – fosforanowa w organizmie i jej regulacja

a)

rola wapnia oraz białek wiążących wapń

Wapń jest dla organizmu pierwiastkiem niezbędnym, pełniącym wiele bardzo rozmaitych funkcji.

Nieorganiczne sole wapnia (fosforany i węglany) stanowią jeden z głównych składników strukturalnych kości i
zębów. Wapń jest pierwiastkiem bardzo nierównomiernie rozmieszczonym w organizmie, a wzrost jego stężenia
w komórce powoduje liczne zmiany metaboliczne, m. in. przez łączenie z kalmoduliną, aktywację kinaz i
fosforylację odpowiednich białek, w tym wielu enzymów. Z kalmoduliną analogiczna jest podjednostka C
troponiny (TpC), a napływ Ca

2+

do miocytu powoduje jego skurcz. W przypadku mięśni szkieletowych jest to

wapń organelli komórkowych (głównie retikulum sarkoplazmatycznego), zaś skurcz mięśni gładkich i mięśnia
sercowego zależny jest również od zasobów pozakomórkowych. Brak kontroli nad rozkładem wapnia w
przestrzeniach wodnych organizmu prowadzi do stężenia pośmiertnego. Wiele leków naczyniowych i
nasercowych wywołuje swój efekt poprzez wpływ na czynność kanałów wapniowych. Depolaryzacja błony
kolbki aksonu powoduje otwarcie napięciowo–zależnych kanałów wapniowych, wapń indukuje łączenie się
pęcherzyków zawierających neurotransmiter z błoną presynaptyczną, warunkuje zatem przekaźnictwo
synaptyczne. Wapń bierze również udział w hemostazie przez łączenie się z resztami Gla (γ-
karboksyglutaminianowymi) występującymi na osoczowych czynnikach krzepnięcia: II, VII, IX i X; efekt
biologiczny jest efektem interakcji białek, fosfolipidów i Ca

2+

. Ponadto wapń zwiększa szczelność naczyń i błon

komórkowych.

Ciało ludzkie zawiera ok. 1 kg wapnia, stanowiącego 4 % jego suchej masy. Z tej ilości aż 99 % tworzy

hydroksyapatyt kości, z czego tylko 1 % może ulegać wymianie z pulą wapnia płynu pozakomórkowego; proces
ten podlega ścisłej regulacji hormonalnej. W osoczu wapń występuje w kompleksach z cytrynianami,
fosforanami i innymi anionami nieorganicznymi (6 %), w połączeniu z białkami (CBP, 47 %) oraz jako wolny i
zjonizowany (47 %). Ta ostatnia forma jest aktywna i ze względu na to wymaga najbardziej precyzyjnej
regulacji. Fizjologicznie łączny poziom wapnia we krwi wynosi 2,25 – 2,75 mM (9 – 11 mg%) – mówimy
wówczas o izokalcemii. Białka wiążące wapń z grupy albumin i globulin są po pierwsze niezbędne do
wchłaniania tego pierwiastka z przewodu pokarmowego (w pokarmie powinno każdego dnia znaleźć się 0,8 –
1,2 mg), a po drugie zapobiegają przekroczeniu iloczynu rozpuszczalności i powstawaniu ektopowych

- -

122

kalcyfikacji. Hipoproteinemia wiąże się zatem z hipokalcemią. Podobnie obniżenie pH powoduje przejście
wapnia z CBP do formy jonowej, zaś wzrost pH działa odwrotnie (wyjaśnia do drętwotę w zespole
hiperwentylacyjnym).

b)

regulacja przemiany wapniowej

Wchłanianie wapnia obejmuje: wychwyt przez rąbek szczoteczkowy i błonę mikrokosmków, aktywny

transport przez błonę enterocytów oraz również aktywne wydalanie do płynu pozakomórkowego.

•

parathormon (PTH)

Niedoczynność przytarczyc może być pierwotna (np. autoimmunologiczna), wtórna (jatrogenna) lub

rzekoma (defekt efektora). W każdym przypadku powoduje obniżenie stosunku Ca / {P}, może powodować
tężyczkę, porażenie mięśni oddechowych, skurcz głośni, zmiany skórne, zaćmę oraz kalcyfikację jąder
podkorowych mózgu.

Nadczynność przytarczyc może być pierwotna – w wyniku przerostu lub nowotworu. Stan taki, podobnie

jak wydzielanie peptydu podobnego do PTH (PTHRP), powoduje wzrost stosunku Ca / {P}, rozległą resorpcję
kości, kamicę nerkową, wapnicę i / lub niewydolność nerek, zapalenia dróg moczowych. Niewydolność nerek
powoduje spadek produkcji kalcytriolu i wtórną nadczynność przytaczyc – błędne koło chorobowe prowadzi do
osteodystrofii nerkowej.

•

Kalcytonina (CT) (32 aa) produkowana jest głównie przez komórki pęcherzykowe (parafolikularne,
komórki C) tarczycy. Przy N końcu obecna jest 7-aa pętla, połączona wiązaniem dwusiarczkowym.
Hiperkalcemia mobilizuje produkcję CT, to zaś zwiększa aktywność nerkowej 24-hydroksylazy;
powoduje to spadek poziomu kalcytiolu i konsekwentne obniżenie [Ca

2+

] w ECF.

- -

123

•

kalcytriol – 1,25(OH)

2

-D

3

Krzywica u dzieci a osteomalacja u dorosłych występuje wskutek spadku zarówno Ca

2+

jak i {P}. Typ I

spowodowany jest deficytem aktywności 1α-hydroksylazy, zaś typ II – defektem motywu palca cynkowego w
receptorze i tym samym jego niewrażliwości na ligand (por. punkt VIII-1-j).

c)

rola fosforanu nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powiązania z gospodarką wapniową

Chociaż chemicznie czysty fosfor jest pierwiastkiem silnie szkodliwym, to w formie ortofosforanu

występuje w wielu związkach chemicznych ciała ludzkiego, nie wykazując działań toksycznych. Fosfor stanowi
2,5 % suchej masy ciała; dzienne zapotrzebowanie wynosi 800 – 1200 mg. Większość tego pierwiastka
zdeponowana jest w tkance kostnej w postaci hydroksyapatytu. Reszta fosforanowa przyłączona jest również do
wielu związków: kofaktorów (DPT, FMN, FAD, NAD

+

, NADP

+

, CoA, PLP), przenośników energii (ADP, ATP,

PCr), II przekaźników hormonalnych (cAMP, cGMP), kwasu fosfatydowego ({P} + glicerol + 2 FA)
wchodzącego w skład fosfolipidów błon plazmatycznych oraz nukleotydów i przez to DNA i RNA. O
wykorzystaniu fosforanu w procesach magazynowania energii decyduje szybki potencjał przenoszenia grupy,
czyli tzw. bogatoenergetyczne wiązania fosforanowe. Odwracalne dołączanie fosforanu do białek, katalizowane
przez kinazy i fosfatazy, umożliwia regulacje procesów metabolicznych oraz ich integracje na poziomie
komórki. Odłączenie pirofosforanu (PP

i

) w trakcie przemian chemicznych oraz jego rozkład do 2 {P} przez

nieorganiczną fosfatazę umożliwia zachodzenie wielu reakcji do końca.

Fosforan występuje w kościach i w osoczu (izofosfatemia 1 – 1,5 mM / 3 – 4,5 mg%) w połączeniu z

Ca

2+

– ten fakt oraz wspólna regulacja hormonalna przyczyniły się do rozpatrywania ich wspólnie, dlatego mówi

się o gospodarce wapniowo – fosforanowej. Obecność we krwi anionów fosforanowych o różnym stopniu
uprotonowania pozwala na ich funkcjonowanie jako układu buforującego osocza. Ilość fosforanu zależy od
przypływu z pokarmem i mobilizacji przez osteoklasty oraz od wydalania z moczem i deponowania jako

- -

124

hydroksyapatytu. Hiperfosfatemia mobilizuje PTH, który pobudza osteolizę i klirens {P}, wypadkowo
zmniejszając [{P}] w ECF. Kalcytriol z kolei obniża klirens {P}. Hipofosfatemia oddziałuje na kości równie
niekorzystnie jak hipokalcemia.

3.

Gospodarka żelazem w organizmie – wchłanianie, regulacja, zaburzenia przemiany

śelazo dostarczane jest z pokarmem w ilości 10 – 15 mg dziennie, jednak z powodu małej wydajności

wchłaniania do krwiobiegu dostaje się tylko 1 mg. Wchłanianie Fe

2+

zachodzi przez komórki krypt jelita czczego

przy udziale białka apoferrytyny. Następnie żelazo łączy się z przenoszącym je białkiem – transferryną (β

1

-

globulina), która przenosi Fe

3+

do szpiku i innych narządów. Transferryna po związaniu się z receptorem ulega

internalizacji na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem. W lizosomach następuje oddzielenie Fe

3+

, po czym

kompleks apotransferrytyny z receptorem wędruje do błony, gdzie również ulega rozpadowi. Transferryna
występuje we krwi w stężeniu ok. 300 mg% i jest w stanie związać ok. 3 mg Fe / l osocza (tzw. całkowita
zdolność wiązania żelaza = TIBC). Fizjologicznie wysycenie ferrytyny wynosi ok. 1/3, a zatem 3 – 4 mg w
całym organizmie.

W obrębie komórki żelazo ulega wbudowaniu w hem, by następnie wejść w skład hemoprotein, do

których należą: hemoglobina (2,5 g Fe), mioglobina, cytochromy (CYP, cyt. c), katalaza, dioksygenaza
tryptofanowa, syntaza tlenku azotu (NOS) i inne (łącznie 300 mg). Każdego dnia 1 % erytrocytów ulega
rozkładowi, uwalniając przez to 25 mg żelaza, które ulega związaniu przez transferrynę.

Ferrytyna jest białkiem magazynującym żelazo. Składa się z apoferrytyny (24 podjednostki x 18,5 kD =

444 kD) otaczającej 3 – 4 tys. atomów żelaza występujących w postaci micelarnej. Częściowa degradacja
ferrytyny prowadzi do powstania hemosyderyny. W białkach magazynujących zgromadzone jest łącznie ok. 1 g
żelaza.

Każdego dnia w wyniku złuszczania komórek nabłonka jelitowego zawierających żelazo i wydalania ich

z kałem organizm traci ok. 1 mg żelaza.

Ilość żelaza w komórce wpływa na syntezę wiążących je białek oraz ich receptorów. Wzrost poziomu Fe

wzmaga translację mRNA ferrytyny oraz degradację mRNA receptora transferrynowo – ferrytynowego (TfR). Z
kolei spadek stężenia Fe nasila translację mRNA TfR, zaś unieczynnia mRNA apoferrytyny (por. punkt VIII-4-
e).

Zagadnienie przemian żelaza jest istotne u kobiet z powodu comiesięcznych jego strat. Podobnie u

ciężarnych dzienne zapotrzebowanie wzrasta do 25 mg. Do niedoboru dochodzić może w wyniku
nieprawidłowego odżywiania. Deficyt żelaza może powodować anemię (niedokrwistość), a erytrocyty są
wówczas hipochromiczne (niedobarwliwe). Nadmiar żelaza w organizmie określa się jako hemochromatoza.
Może być ona pierwotna (o podłożu genetycznym – mutacja 6p21.3) lub wtórna (w wyniku częstych transfuzji
lub gotowania w żelaznych naczyniach). Przyczyną nadmiernego poziomu żelaza (> 15 g w organizmie) jest
utrata regulacji wchłaniania tego pierwiastka. W nadmiernych ilościach żelazo przyczynia się do nasilenia stresu
oksydacyjnego, który uszkadza wiele tkanek, gł. wątroby, trzustki, skóry i miokardium. Gromadzenie się w
skórze melaniny i żelaza nadaje jej barwę szaro-ziemistą. Dodatkowo rozwija się marskość wątroby, cukrzyca,
kardiomiopatie, artropatie oraz bezpłodność. Leczenie polega na powtarzalnych upustach krwi oraz podawaniu
środków chelatujących (np. desferioksamina).

Haptoglobina (HAP) jest białkiem osocza związanym z transportem pozakrwinkowej hemoglobiny. HAP

występuje w surowicy w ilości 0,4 – 1,7 g / l, która pozwala związać 400 – 1800 mg HGB. Codziennie 10 %
katabolizowanej HGB przedostaje się do krążenia, skąd mogłaby być usuwana z moczem (65 kD), powodując
straty żelaza i wytrącanie w świetle kanalików. HAP występuje w 3 formach polimorficznych (Hp 1-1, 2-1, 2-2),
z których każda ma masę > 90 kD. Powstały kompleks HAP-HGB (155 kD) nie ulega przesączaniu, jest za to
wychwytywany i rozkładany przez hepatocyty, po czym żelazo może być wykorzystane ponownie. HAP jest
ponadto białkiem ostrej fazy. Hemopeksyna (β

1

-globulina) wiąże wolny hem; wpierw albumina tworzy z

methemem methemalbuminę, aby następnie przekazać go hemopeksynie.

4.

Biochemia krwi

a)

białka osocza i ich rola

Osocze krwi zawiera fizjologicznie 70 – 80 g/l białek. Są to zarówno białka proste (głównie albuminy),

jak i złożone (lipo-, gliko-, chromo- i metaloproteiny). Ze względu na budowę i ruchliwość elektroforetyczną
wyróżniamy: albuminy (ok. 55%), globuliny α

1

, α

2

, β i γ (ok. 38%) oraz fibrynogen (7%). Najważniejsze α

1

globuliny to: kwaśna glikoproteina (α-seromukoid, orozomukoid), HAP, HDL

1

i transkortyna, α

2

: CER, HDL

2

,

protrombina i α

2

-makroglobulina, β: LDL, transferyna i plazminogen. Stosunek ilości albumin do globulin

nazywamy wskaźnikiem białkowym osocza; wynosi on średnio 1,2 w elektroforezie oraz 1,7 przy wysalaniu;

- -

125

wzrasta w krwotokach, a maleje w stanie zapalnym, chorobach nerek i wątroby oraz deficycie białka w
pożywieniu. Funkcje białek są bardzo istotne, jak i różnorodne:

•

utrzymywanie ciśnienia onkotycznego (3,5 kPa / 25 mmHg), za co w 75 – 80 % odpowiedzialne są
albuminy,

•

rola buforująca dzięki charakterowi amfoterycznemu,

•

stabilizacja składników morfotycznych dzięki powierzchniowemu ładunkowi elektrycznemu (dlatego
wskaźnik białkowy osocza jest skorelowany z odczynem opadania krwinek – OB),

•

hemostaza, m. in. obecność ok. 20 czynników krzepnięcia,

•

funkcje odpornościowe – γ-globuliny (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD), układ dopełniacza (C1-9), białka
ostrej fazy (CRP, HAP, CER, AAT, kwaśna α

1

-glikoproteina = orozomukoid = seromukoid,

plazminogen, fibrynogen)

•

aktywność enzymatyczna (np. ChE połączona przez GPI z RBC), diagnostyczne enzymy komórkowe
(AlAT, AspAT, GGTP, LDH, CPK),

•

aktywność hormonalna (np. EPO),

•

modyfikacja aktywności innych białek, np. antyproteazy: α

1

-antytrypsyna (AAT) – inhibitor proteaz

serynowych, antychymotrypsyna, α

2

-makroglobulina – inhibitor panproteinazowy,

•

transport:

nieswoisty: albuminy (bilirubina, FFA, hormony, Ca

2+

, Cu

2+

, Zn

2+

, sulfonamidy, penicylina G,

dikumarol, kwas acetylosalicylowy), lipoproteiny (FA, TG, cholesterol i jego estry),

swoisty: Fe (transferyna, ferrytyna, hemosyderyna), hem (hemopeksyna), HGB (HAP), Cu

2+

(CER),

Ca

2+

(CBP), witamina B

12

(TC), T

3/4

(TBP, TBPA), glikokortykoidy (transkortyna), retinoidy (RBP),

hormony płciowe (TBP), cholekalcyferol (VDBP).

b)

struktura i funkcja erytrocytów

Główną funkcją erytrocytów jest transport O

2

, CO

2

i H

+

oraz ich wymiana z tkankami. Krwinka czerwona

zbudowana jest z błony komórkowej otaczającej roztwór hemoglobiny, stanowiącej 95% wszystkich białek.
Błona jest dwuwarstwowa, złożona w połowie z białek i w połowie z lipidów. Głównymi proteinami są:
spektryna α

2

β

2

, ankiryna, białko wymiany jonów (prążka 3.), białko prążka 4.1, aktyna, G6PDH, tropomiozyna,

glikoforyny A, B i C, adducyna. Do lipidów błony zewnętrznej należą fosfolipidy cholinowe (PC, Sph), zaś na
błonie wewnętrznej występują fosfolipidy zawierające aminokwasy (PE, PS). Ponadto na błonie występują
determinanty antygenowe w postaci układów grupowych krwi; najistotniejszy (główny) układ ABO zależy od
genów: H (Fuc-transferaza), A (NAc-Gal-transferaza) oraz B (Gal-transferaza). Błona zawiera układy
transportowe o dużym powinowactwie do glukozy – przenośnik GLUT-1 (permeaza glukozowa). Erytrocyt nie
zawiera natomiast mitochondriów (nie funkcjonuje cykl Krebsa ani łańcuch oddechowy), lizosomów, aparatów
Golgiego ani jądra (brak syntezy kwasów nukleinowych, białek, FA i glikogenu).

Głównym czynnikiem stymulującym tworzenie erytrocytów jest erytropoetyna (EPO), wytwarzana przez

nefrony w odpowiedzi na spadek pO

2

. EPO po dostaniu się do szpiku pobudza kinazy za pośrednictwem

receptora, co powoduje proliferację komórek macierzystych.

Głównym źródłem energii jest glukoza osocza. W wyniku glikolizy beztlenowej powstaje mleczan i ATP,

zużywany m. in. na utrzymanie dwuwklęsłego kształtu krwinki oraz równowagi wodno-elektrolitowej.
Jednocześnie obecna jest modyfikacja glikolizy, gdyż kosztem wytwarzania tylko jednej cząsteczki ATP z jednej
cząsteczki glukozy powstaje 2,3-BPG – allosteryczny modyfikator dysocjacji oksyhemoglobiny, umożliwiający
sprawniejsze oddawanie tlenu w tkankach. Alternatywnie 5 – 10 % wchłoniętej glukozy zużywa PPP, w wyniku
czego powstaje NADPH, zużywany przez reduktazę glutationową do regeneracji glutationu (GSH). GSH jest
jednym z nieenzymatycznych mechanizmów obrony przed stresem oksydacyjnym. Reaktywne formy tlenu
(RFT; ROS) (O

2

-*

, H

2

O

2

, ROO

*

, OH

*

) powstają w wyniku autooksydacji hemoglobiny (ok. 3 % dziennie),

nieszczelności łańcucha oddechowego (do 4 %), działania enzymów: reduktazy CYP, oksydazy ksantynowej,
oksydazy α-aminokwasów, oksydazy NADPH, mieloperoksydazy czy reakcji Fentona czy Habera – Weissa
(szkodliwość metali – Fe i Cu). Istotnym enzymem PPP jest błonowa G6PDH, zaś jej niedobór znany jest jako
fawizm; wówczas spożycie produktów zawierających silne utleniacze (bób, primarchina, sulfonamidy, naftalen)
wywołuje napady hemolizy i konsekwentną anemię. Stres oksydacyjny może prowadzić do peroksydacji lipidów
błonowych i hemolizy oraz do utleniania grup sulfhydrylowych hemoglobiny i powstawania ciałek Heinza.
Powstanie methemoglobiny jest niwelowane przez jej reduktazę sprzężoną z utlenianiem cytochromu b

5

, który z

kolei jest regenerowany przez utlenianie NADH z udziałem reduktazy cytochromu b

5

(reduktazy

methemoglobiny). Methemoglobinemia może być wrodzona (niedobór aktywności reduktazy) lub nabyta
(spożycie dużej ilości sulfonamidów lub aniliny). Leczenie polega na podawaniu środków redukujących (kwas
askorbinowy, błękit metylenowy). Erytrocyty zawierają liczne enzymy metabolizmu nukleotydowego:
deaminazę adenozynową, nukleotydazę pirymidynową i kinazę adenylanową.

- -

126

Stare i uszkodzone erytrocyty wychwytywane są przez makrofagowo – histiocytarny układ siateczkowo –

śródbłonkowy (RES niektórych narządów miąższowych, głównie wątroby i sledziony. Hemoglobina rozkładana
jest do globiny i hemu. Łańcuchy globinowe ulegają dalszemu rozkładowi do aminokwasów, które mogą być
powtórnie wykorzystane. Hem z kolei pozbawiany jest żelaza i utleniany do bilirubiny, która z żółcią dostaje się
do światła jelita i wchodzi w skład mas kałowych.

c)

budowa i metabolizm leukocytów na przykładzie neutrofili

Główną funkcją neutrofili jest udział w odpowiedzi immunologicznej. Odznaczają się one aktywnym

metabolizmem i zawierają wiele unikatowych białek.

Pozyskiwanie energii zachodzi na drodze glikolizy tlenowej oraz umiarkowanej fosforylacji oksydacyjnej

z powodu relatywnie niewielkiej liczby mitochondriów. Działa również PPP, dostarczając NADPH m. in. do
funkcjonowania NADPH-oksydazy.

Neutrofile są ruchliwymi komórkami żernymi, biorącymi główny udział w ostrym odczynie zapalnym.

Przedostanie się mikroorganizmów do tkanek powoduje reakcję makrofagów, które, gdy nie są w stanie
samodzielnie ich zwalczyć, wydzielają czynniki chemotaktyczne dla neutrofili, powodując ich aktywację i
imigrację. Podobnie działa np. składnik C5a dopełniacza oraz egzogenne peptydy bakteryjne (N-formino-Met-
Leu-Phe). Przyciągane w dane miejsce neutrofile muszą opuścić światło naczynia (diapedeza), ponieważ jednak
normalnie nie są do tego zdolne, musi zajść ciąg przemian chemicznych. Mastocyty (komórki tuczne) uwalniają
histaminę, która rozszerza naczynia i zwiększa ich przepuszczalność. Białka osocza dostarczają aktywnych
fragmentów dopełniacza (C3a, C4a, C5a), wazodylatacyjnej bradykininy i produktów rozpadu fibryny (FDP).
Same neutrofile wydzielają różne eikozanoidy, w tym wazodylatacyjne PG i TX oraz PAF (czynnik aktywujący
płytki). Z kolei zaktywowane płytki uwalniają serotoninę. Wszystkie przedstawione procesy wywołują
przekrwienie danej części ciała, powodując podniesienie temperatury (łac. calor), obrzęk (oedema),
zaczerwienienie (rubor) i drażnienie zakończeń nerwowych (ból – dolor); są to cztery objawy stanu zapalnego,
znane już w starożytności. Przyciągnięte neutrofile ulegają marginalizacji, toczeniu po śródbłonku, ich własne
integryny asocjują z ligandami glikoproteinowymi śródbłonka (kolagen, fibronektyna, laminina, ICAM-1), aż
wreszcie przenikają przez ścianę naczynia i zwalczają zakażenie.

Aktywacja neutrofili zachodzi pod wpływem pobudzenia przez bakterie, czynniki chemotaktyczne oraz

kompleksy antygen-przeciwciało. Powoduje to poprzez szlak polifosfoinozytolowy wzrost poziomu
wewnątrzkomórkowego Ca

2+

i następnie asocjacja mikrotubul (egzocytoza zawartości ziarnistości) oraz

pobudzenie układu aktyna – miozyna (ruchliwość pozwala na odszukanie źródła zakażenia). Kontakt ze źródłem
czynnika aktywującego powoduje jego fagocytozę, dlatego neutrofile nazywamy mikrofagami (w odróżnieniu
od makrofagów – fagocytujących agranulocytów). Zabijanie bakterii poprzedzone jest eksplozją tlenową, tj.
szybkim zużyciem tlenu celem wytworzenia ROS. Aktywacja pobudza dwa peptydy cytozolowe do
przeniesienia się na błonę, gdzie w połączeniu z cytochromem b

558

tworzą NADPH-oksydazę. Ta katalizuje z

kolei reakcję powstawania anionorodników ponadtlenkowych (2 O

2

+ NADPH → 2 O

2

-*

+ NADP

+

), które

wydalane są do fagolizosomów, gdzie spontanicznie dają nadtlenek wodoru (2 O

2

-*

+ 2 H

+

→ H

2

O

2

+ O

2

), ten z

kolei daje rodnik hydroksylowy (2 H

2

O

2

→ 2 OH

*

). Dodatkowo mieloperoksydaza wytwarza kwasy

podhalogenowe (H

2

O

2

+ H

+

+ X

-

→ HOX + H

2

O, gdzie X = Cl, Br, I, SCN), dysocjujące na aniony

podhalogenowe (OX

-

). Ogólnie powstające w fagolizosomach warunki (↑ pH, O

2

-*

, H

2

O

2

, OH

*

, OX

-

) w

połączeniu z proteazami prowadzą do unieszkodliwienia drobnoustrojów. Mutacje genów kodujących składniki
NADPH-oksydazy dają przewlekłą chorobę ziarniczą.

Neutrofile uśmiercane w walce z zakażeniem tworzą ropę, która ze względu na zawartość

mieloperoksydazy może przybierać barwę zieloną. Powstawanie ropy w obrębie narządu może prowadzić do
nacieku, ropnia lub sepsy – uogólnionego zakażenia organizmu.

Oprócz ataku ROS przez neutrofile, organizm posiada również mechanizmy odporności nieswoistej.

Lizozym niszczy ścianę komórkową bakterii przez hydrolizę wiązań peptydoglikanu – między kwasem N-Ac-
muraminowym a D-Glc-N-Ac. Defenzyny to tlenoniezależne 30-aa zasadowe peptydy antybiotykowe, również
uszkadzające ścianę komórkową. Laktoferryna wiąże żelazo, przez co może hamować wzrost niektórych
bakterii. Proteazy (elastaza, kolagenaza, żelatynaza, katepsyna G, aktywator plazminogenu = PA) zabijają
zarówno komórki obce, jak i własne, dlatego organizm musi bronić się przez aktywność antyproteazową. Do
antyproteaz należą: α

1

-antytrypsyna = α

1

-antyproteaza, α

1

-antychymotrypsyna, α

2

-makroglobulina, wydzielniczy

inhibitor leukoproteaz, inhibitor-1 aktywatora plazminogenu (PAI-1), tkankowy inhibitor metaloproteaz.
Destrukcyjne skutki palenia tytoniu opierają się m. in. na utlenianiu grup sulfhydrylowych i w konsekwencji
obniżaniu aktywności antyproteaz, co daje przewagę proteazom.

- -

127

d)

budowa i metabolizm trombocytów

Tromocyty, zwane również płytkami krwi, są obłonionymi fragmentami cytoplazmy megakariocytów

szpikowych. Nie posiadają jądra, a jedynie centralne zagęszczenie cytoplazmy zwane granulomerem, oddzielne
od błony bardziej przejrzystym hialomerem. W trombocytach występuje system kanalikowy otwarty i
zamknięty, służące odpowiednio do transportu oraz wydzielania. Ziarnistości płytek dzielimy na α, gęste i
lizosomalne. Fizjologicznie trombocyty krążą swobodnie w osoczu.

Trombocyty pod wpływem określonych czynników (kolagen śródbłonka, trombina osocza, TXA

2

i ADP

innych płytek, PAF wydzielany przez neutrofile) ulegają aktywacji. Aktywne płytki wykazują adhezję do
uszkodzonej ściany naczyniowej, uwalniają zawartość swych ziarnistości oraz agregują w zespoły. Adhezja
trombocytów do kolagenu naczynia krwionośnego zachodzi przez receptorowy kompleks glikoproteinowy
GP Ia-IIa (integryna α

2

β

1

). Wiązanie do warstwy podśródbłonkowej ułatwia czynnik von Willebranda (vWF),

stanowiący ligand dla GP Ib-V-IX. Trombina działając na swój receptor pobudza szlak polifosfoinozytolowy,
prowadząc przez DAG do fosforylacji plekstryny i w konsekwencji uwolnienia zawartości ziarnistości.
Uwalniany z ziaren gęstych ADP pobudza agregację innych płytek. Kontakt z kolagenem pobudza PLA

2

do

odszczepiania z fosfolipidów błonowych arachidonianu, stanowiącego substrat dla COX produkującej TXA

2

–

działa on synergistycznie z trombiną, pobudzając PLC-β. Równocześnie uwolnienie IP

3

powoduje napływ Ca

2+

z

RER. Ca

2+

współdziała z kalmoduliną i kinazą lekkich łańcuchów miozyny – fosforylacja tych ostatnich

prowadzi do współpracy z aktyną, przesunięcia i zmiany kształtu trombocytów, powodują ich rozpłaszczenie na
uszkodzonej powierzchni.

Na aktywnych trombocytach dochodzi do ekspresji na zewnętrznej powierzchni błony kompleksu GP IIb-

IIIa (integryna α

IIb

β

3

), umożliwiającego łączenie z fibrynogenem i agregację oraz fosfolipidów występujących

spoczynkowo po cytozolowej stronie błony (PS, PI), a niezbędnych do aktywacji czynników krzepnięcia X i II.

Synergistycznie z substancjami pobudzającymi agregację działa adrenalina (poprzez receptor α

2

),

serotonina (5-HT

2A

) i wazopresyna (V

1

).

Komórki śródbłonka naczyń produkują PGI

2

, która, działając na trombocyty poprzez swój receptor,

pobudza AC do produkcji cAMP, co obniża poziom Ca

2+

, a przez to aktywność PLA

2

i produkcję TXA

2

.

Śródbłonek rozkłada ponadto ADP i produkuje NO, siarczan heparanu, trombomodulinę i tkankowy aktywator
plaminogenu (tPA). Wszystkie te mechanizmy mają na celu działanie antykoagulacyjne.

e)

hemostaza osoczowa

Hemostaza jest procesem zatrzymywania krwawienia, następującym po uszkodzeniu ściany naczynia

krwionośnego. W zjawisku tym obserwujemy współdziałanie ściany naczyniowej, trombocytów i osoczowych
czynników krzepnięcia. Reakcja naczyniowa (hemostaza naczyniowa) polega wpierw na obkurczeniu naczynia
w miejscu uszkodzenia, a następnie na obkurczeniu naczyń w odcinku proksymalnym oraz zwolnieniu akcji
serca. Hemostaza płytkowa obejmuje również obkurczenie naczynia oraz agregację i adhezję płytek do miejsca
uszkodzenia, prowadzące do wytworzenia czopu płytkowego. Hemostaza osoczowa polega na powstaniu sieci
fibryny gromadzącej czop płytkowy (skrzep biały) i/lub erytrocyty (skrzep czerwony).

Wyróżnia się 13 czynników krzepnięcia, które dzielimy na: zymogeny proteaz serynowych (II, IX, X, XI,

XII, VII), kofaktory (III, V, VIII), włóknik = fibrynogen (I) i transglutaminazy (XIII). Dodatkowo w hemostazie
biorą udział: Ca

2+

(IV), białko C, białko S, trombomodulina, kalikreina, wysokocząsteczkowy kininogen oraz

płytkowe czynniki krzepnięcia w postaci fosfolipidów błonowych.

- -

128

Powstanie sieci fibrynowej może zostać zapoczątkowane na dwa sposoby. Uszkodzenie naczynia

odsłaniające włókna kolagenowe, tworzące tzw. aktywną powierzchnię, lecz nie połączone z uszkodzeniem
okolicznych tkanek, aktywuje tzw. szlak wewnątrzpochodny. Z kolei uszkodzenie tkanek i kontakt z nimi krwi
włącza szlak zewnątrzpochodny. W pewnym momencie oba szlaki zbiegają się, aby utworzyć wspólną drogę
końcową.

Szlak wewnątrzpochodny rozpoczyna się ekspozycją ujemnie naładowanych fragmentów kolagenu.

Wówczas kalikreina aktywuje czynnik XII (czynnik kontaktu, czynnik Hagemana) do XIIa. Ten ostatni
wykazuje aktywność proteazy serynowej – działa na prekalikreinę, uwalniając kolejne cząsteczki kalikreiny,
odszczepia bradykininę z wielkocząsteczkowego kininogenu oraz aktywuje czynnik XI (prekursor lub czynnik
poprzedzający tromboplastynę osoczową = PTA, czynnik przeciwhemofilowy C) do XIa. Ten jest również
proteazą serynową i w obecności Ca

2+

aktywuje czynnik IX (czynnik Christmasa, składnik tromboplstyny

osoczowej = PCT, czynnik przeciwhemofilowy B) do IXa – zawiera on Gla i również jest proteazą serynową.

Niewielkie ilości trombiny aktywują czynnik VIII (czynnik przeciwhemofilowy A, globulina

antyhemofilowa = AHG) do VIIIa, który jest kofaktorem służącym jako receptor dla czynników IXa i X na
powierzchni trombocytu.

Na zewnętrznej powierzchni błony aktywowanych płytek powstaje kompleks aktywny złożony z

czynników VIIIa, IXa, Ca

2+

oraz X (czynnik Stewarta – Prowera). Wówczas IXa rozkłada wiązanie Arg-Ile w

cząsteczce X, tworząc dwułańcuchową proteazę serynową Xa (czynna troboplastyna osoczowa; zawiera Gla).

Szlak zewnątrzpochodny uaktywniany jest przez ekspresję czynnika III (czynnik tkankowy = TF,

nieczynna tromboplastyna tkankowa) na komórkach naczynia. Niewielka ilość trombiny lub Xa przekształca VII
(prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny = SPCA, kotromboplastyna) do VIIa (konwertyna, proteaza
serynowa; zawiera Gla), który w obecności Ca

2+

i kofaktora III katalizuje aktywację X do Xa. Dodatkowo

kompleks VIIa-III aktywuje IX do IXa, zatem szlak zewnątrzpochodny może aktywować wewnątrzpochodny.

Xa stanowi punkt zbiegnięcia się obu szlaków krzepnięcia. Ulega on inhibicji przez inhibitor szlaku

czynnika tkankowego (TFPI), będący głównym fizjologicznym inhibitorem krzepnięcia. Niewielka ilość
trombiny katalizuje przejście czynnika V (proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator globuliny) do Va = VI
(akceleryna).

Na powierzchni aktywowanych płytek wytwarza się kolejny kompleks, gdzie Xa w obecności Ca

2+

i

kofaktora Va hydrolizuje 2 wiązania w obrębie czynnika II (protrombina; zawiera Gla), dając IIa (trombina,
proteaza serynowa). IIa działa na wiele pozostałych czynników: I, VII, VIII, XI, XIII. Dodatkowo przez
tworzenie kompleksu z trombomoduliną nabiera zdolności aktywacji białka C, które wówczas po połączeniu z
białkiem S tworzy kofaktor ACP, rozkładający Va i IIa-Va, ograniczając krzepliwość. Aktywacja II hamowana
jest przez naturalne inhibitory – antytrombinę III, α

2

-makroglobulinę, kofaktor heparyny III i α

1

-antytrypsynę =

α

1

-antyproteazę. Efekt inhibicji można nasilić kwaśnymi proteoglikanami (heparyna, siarczan heparanu) lub

znieść zasadowymi polipeptydami (protamina).

Fibrynogen (czynnik I) składa się z 3 par łańcuchów – (AαBβγ)

2

. Bβ i γ zawierają łańcuchy sacharydowe

przyłączone przez Asn. Regiony N utrzymywane są blisko siebie, podczas gdy C leżą po przeciwnych stronach.
Do α i β przyłączone są fibrynopeptydy A i B (FPA i FPB), zawierające Asp, Glu i O-siarczan Tyr, które
zwiększają rozpuszczalność i zapobiegają niepożądanej agregacji.

IIa w obecności Ca

2+

hydrolizuje 4 wiązania Arg-Gly pomiędzy α i A oraz β i B. Powoduje to odsłonięcie

miejsc wiążących monomerów fibryny (αβγ)

2

, które spontanicznie agregują w fibrynę labilną (czynnik Ia),

zatrzymującą elementy morfotyczne krwi i prowadzącą do powstania skrzepu. IIa przekształca również XIII
(czynnik stabilizujący fibrynę = FSF, fibrynoligaza) do XIIIa (tiolowo-zależna transglutamylaza). Czynnik ten
łączy kowalencyjnie cząsteczki fibryny przez utworzenie wiązań peptydowych między grupą amidową Gln a ε-
aminową Lys z eliminacją NH

4

+

. Powstaje w ten sposób ostateczna fibryna stabilna (czynnik Ib).

Powstały pełnowartościowy skrzep ulega retrakcji, czyli obkurczeniu połączonemu z wyciskaniem

surowicy. Ostatecznie zaś musi zostać rozpuszczony, za co odpowiedzialna jest plazmina (fibrynolizyna,
proteaza serynowa), dając produkty degradacji fibryny i fibrynogenu (odpowiednio – fdp i FDP). Plazmina
powstaje z osoczowego plazminogenu pod wpływem działania różnych fibrynolizynokinaz, dezaktywowana zaś
jest przez α

2

-antyplazminę. Fibrynolizynokinazy rozszczepiają wiązanie Arg-Val plazminogenu. Do tej grupy

związków należą: streptokinaza (SK) produkowana przez paciorkowce (łac. Streptococci), tkankowy aktywator
plazminogenu (tPA), hamowany przez inhibitor aktywatora plazminogenu oraz urokinaza, powstająca z
prourokinazy przez działanie kalikreiny (z tego powodu podejrzewa się, iż szlak wewnątrzpochodny bierze
udział bardziej w procesie fibrynolizy niż hemostazy).

W skład produktów degradacji fibryny stabilnej wchodzą D-dimery (DD) – wspomniane wyżej

połączenia Gln z Lys, które z powodu obecności wiązań kowalencyjnych tworzonych przez XIIIa wykazują
oporność na trawienie przez plazminę. Poziom D-dimerów koreluje z aktywnością fibrynolizy, zależną od
obecności skrzepów, dlatego jest istotnym parametrem diagnostycznym, pomocnym w ocenie takich patologii
jak: zakrzepica żż. głębokich, zatorowość płucna czy zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego
(DIC).

- -

129

5.

Biochemia wątroby

a)

rola tkanki wątrobowej

Wątroba pełni w organizmie wiele istotnych funkcji, bez których niemożliwe byłoby życie. Przyjmuje

ona rozgałęzienia ż. wrotnej, prowadzącej krew z jelit i śledziony – stanowi przez to filtr dla związków
potencjalnie niebezpiecznych, które rozpoznaje, wiąże i wydala różnymi drogami. Buforuje ponadto stężenia
składników odżywczych krwi, magazynując ich nadmiar bezpośrednio po posiłku, a uwalniając je stopniowo w
miarę potrzeby; w przypadku deficytu przekształca substancje średnio istotne na te najważniejsze. Wątroba
degraduje jednocześnie własne cząsteczki organizmu, krążące we krwi zbyt długi czas. Z drugiej strony
syntetyzuje wiele związków czynnych biologicznie, w tym funkcjonalne enzymy osocza oraz białka osocza
(poza γ-globulinami). Większość znanych szlaków metabolicznych zachodzi w wątrobie, z czego wyłącznie w
tym narządzie. Wątroba spełnia zatem funkcję integrującą biologiczne przemiany głównych składników
chemicznych organizmu. Dochodzi tu również do produkcji żółci, pełniącej zarówno funkcje trawienne, jak i
wydalnicze. Ponadto wątroba stanowi magazyn pewnej ilości krwi, skład żelaza oraz zapas witamin
rozpuszczalnych w tłuszczach. Szybki metabolizm podnosi temperaturę wątroby o ok. 2

o

, jest więc narządem

termogenezy.

b)

przemiana węglowodanowa, lipidowa i azotowa w wątrobie

Wątroba posiada bardzo bogaty zestaw enzymów, niespotykany w żadnym innym narządzie, co

umożliwia funkcjonowanie w niej większości szlaków metabolicznych. Jak już wspomniano, jest miejscem
integracji gospodarki węglowodanowej, lipidowej i azotowej.

Dostarczenie dużej ilości składników odżywczych po spożyciu pokarmu powoduje ich napływ do

wątroby, gdzie ulegają pierwszym przekształceniom. Nadmiar glukozy zostaje zmagazynowany jako glikogen
(glikogenogeneza), aby w czasie między posiłkami być stopniowi uwalniany (glikogenoliza), utrzymując poziom
glukozy w osoczu na niemal niezmienionym poziomie. Glukoza i glikogen mogą być ponadto regenerowane z
produktów metabolizmu tkanek pozawątrobowych – tj. z pirogronianu, mleczanu, alaniny, glicerolu i
propionianu (glukoneogeneza). Tkanka wątrobowa jest miejscem izomeryzacji do glukozy innych cukrów
prostych – fruktozy i galaktozy. Zachodzi również szlak pentozofosforanowy (PPP), dostarczając
równoważników redukujących do procesów detoksykacji oraz syntez redukcyjnych (lipogeneza,
steroidogeneza). Funkcjonuje tu szlak kwasu uronowego, produkujący glukuronian, zużywany w II fazie
detoksykacji oraz do syntezy proteoglikanów. Do tych ostatnich należy siarczan heparanu – naturalny
antykoagulant wydzielany przez granulocyty łącznotkankowego zrębu wątroby do krwi.

Równie donośna jest rola wątroby w przemianie lipidów. Produkuje ona apolipoproteiny, będące

nośnikami dla hydrofobowych tłuszczy. Jednocześnie zaś posiada receptory dla lipoprotein, wychwytując lipidy
i włączając je w reakcje. Zachodzi tu również synteza kwasów tłuszczowych (lipogeneza), jak i ich utlenianie w
szlaku β-oksydacji. Napływające z adipocytów trójglicerydy są rozkładane, dają kwasy tłuszczowe oraz glicerol,
które mogą posłużyć jako źródła energii lub zostać przebudowane w inne cząsteczki. Syntetyzowane są również
fosfolipidy – istotne składniki błon biologicznych, pełniące zarówno funkcje strukturalne, jak i biorące udział w
hemostazie, apoptozie, syntezie eikozanoidów i transdukcji sygnałów hormonalnych. Nadmierne nasilenie β-
oksydacji prowadzi do powstania ciał ketonowych (ketogeneza), które mogą być wykorzystane jako substrat
energetyczny przez tkanki pozawątrobowe lub wydalane z wydychanym powietrzem (aceton w cukrzycy).
Tkanka wątroby to również miejsce zbierania cholesterolu z reszty organizmu oraz syntezy go de novo.
Cholesterol może zostać przekształcony w kwasu żółciowe i wydalony do światła jelita lub wysłany przez krew
do tkanek przekształcających go w hormony sterydowe (kora nadnerczy i gonady). Wątroba jest wreszcie
miejscem 25-hydroksylacji prowitaminy D

3

– etapu powstawania kalcytriolu, będącego regulatorem gospodarki

wapniowo – fosforanowej.

Podobnie przedstawia się integracja przemiany azotowej. Do wątroby trafiają aminokwasy pochodzenia

pokarmowego oraz glikoproteiny krwi pozbawione reszt kwasu sialowego (asialoglikoproteiny), które narząd ten
wychwytuje za pomocą receptora i hydrolizuje do aa. Dodatkowo zachodzi tu synteza aa endogennych z ich
związków prekursorowych. Aa wątroby zużywane są przez nią do syntezy białek osocza (z wyjątkiem γ-globulin
produkowanych przez plazmocyty) oraz enzymów funkcjonalnych osocza. W przeciwieństwie do cukrów i
tłuszczy nadmiar aa nie może być nie może być zmagazynowany, lecz podlega transaminacji i dezaminacji.
Powstałe szkielety węglowe mogą być utleniane bądź przekształcane w inne związki, zaś amoniak, łącznie z
pulą powstającą w wyniku dezaminacji jelitowej, przenoszony jest na CO

2

; następnie jako mocznik przenoszony

jest z krwią do nerek, gdzie podlega filtracji kłębuszkowej i usuwany jest z moczem. Wątroba unieszkodliwia
również produkty dezaminacji i dekarboksylacji jelitowej – indol, skatol i ptomainy (kadaweryna, putrescyna,
agametyna). W wątrobie dochodzi ponadto do syntezy i rozkładu zasad azotowych. Pirymidyny rozkładane są do
produktów rozpuszczalnych w wodzie (CO

2

, NH

3

, octan, β-hydroksymaślan), puryny zaś do nierozpuszczalnego

- -

130

kwasu moczowego, który podobnie jak mocznik ulega wydaleniu z moczem. Wraz ze śledzioną wątroba stanowi
miejsce rozpadu hemoglobiny i hemu, a powstała bilirubina sprzęgana jest z glukoronianem i poprzez żółć trafia
do mas kałowych. Narząd ten jest również miejscem ostatniej reakcji w szlaku syntezy kreatyny – mięśniowego
przenośnika energii.

c)

wątroba jako gruczoł zewnątrzwydzielniczy

Wątroba jest miejscem produkcji żółci, która przechodząc kolejnymi przewodami zbiera się w

pęcherzyku żółciowym, aby opuścić go podczas trawienia. Skurcze pęcherzyka powodują wtłaczanie żółci do
dwunastnicy, zaraz zaś przed nią dochodzi do zmieszania z sokiem trzustkowym. śółć wątrobowa jest lekko
zasadowa (pH 7,1 – 7,3) i składa się z wody (97%) i rozpuszczonych w niej składników stałych: kwasów
żółciowych (37%), soli nieorganicznych (33%), mucyn i barwników żółciowych (21%), kwasów tłuszczowych
(7%) oraz cholesterolu (2%). W pęcherzyku żółć ulega 4 – 5 x zagęszczeniu, tak iż woda stanowi 86%, a pH
może wahać się w dość szerokich granicach (6,9 – 7,7). Sole kwasów żółciowych przez zmniejszanie napięcia
powierzchniowego ułatwiają jelitową emulgację tłuszczy i rozpuszczanie kwasów tłuszczowych, przez co
wspomagają trawienie i wchłanianie zarówno samych lipidów, jak i rozpuszczalnych w nich witamin. Pośrednio
wpływa to na trawienie wszystkich składników pokarmowych. Ponadto lekko zasadowa żółć neutralizuje
kwaśną treść pokarmową, przygotowując ją do trawienia enzymami jelitowymi. Przez żółć organizm pozbywa
się również cholesterolu, kwasów żółciowych, metabolitów leków i toksyn oraz metali ciężkich (Cu, Zn, Hg).

d)

procesy biotransformacji i detoksykacji

Ksenobiotykami nazywamy wszelkie substancje obce dla organizmu – leki, kosmetyki, środki czystości i

zanieczyszczenia środowiska . Po dostaniu się do organizmu bardzo rzadko opuszczają go w formie
niezmienionej – najczęściej ulegają różnorodnym przemianom, nierzadko z udziałem wielu enzymów.

Przemiany te możne podzielić na reakcje I i II fazy. W fazie I zachodzi najczęściej hydroksylacja przez

monooksygenazy, ale również: dezaminacja, dehalogenacja, desulfuracja, peroksydacja, redukcja czy hydroliza.
W fazie II dochodzi do sprzęgania produktów fazy I ze związkami endogennymi: glukuronianem, siarczanem,
octanem, glutationem (GSH), aa lub resztą metylową. Celem obu faz jest zwiększenie polarności i
rozpuszczalności w wodzie, a przez to zapobieganie akumulacji w lipidach i umożliwienie wydalenia.
Najczęściej efekt ten zostaje osiągnięty, czasem jednak reakcje te prowadzą do powstania produktu bardziej
toksycznego niż pierwotny.

Główną reakcją I fazy jest hydroksylacja przez monooksygenazy, tj. enzymy grupy cytochromu P450

(CYP, zawierającej ogółem 35 – 60 enzymów): RH + O

2

+ cyt-H

2

→ R-OH + H

2

O + cyt. Poza ksenobiotykami

substrat mogą stanowić lipofilne steroidy, eikozanoidy, kwasy tłuszczowe i retinoidy. Jest to najbardziej
uniwersalny ze znanych biokatalizatorów (przetwarza ok. 50% leków). Stanowi oksydazę o mieszanej funkcji,
gdyż jeden atom tlenu wchodzi w skład cząsteczki wody, a drugi do grupy hydroksylowej produktu. W
reakcjach uczestniczy NADPH oraz reduktaza NADPH : CYP; przeniesienie elektronu indukuje redukcyjną
aktywację tlenu cząsteczkowego, donorem elektronów zaś może być mikrosomalny cytochrom b

5

. W skład

układu CYP wchodzi główny fosfolipid ER – fosfatydylocholina; układ zawiera również hem. Występuje
głównie w jelicie cienkim, w wątrobie (gdzie stanowi do 20% frakcji mikrosomalnej), w nadnerczach (również
w mitochondriach, gdzie posiada adrenodoksynę i reduktazę adrenodoksynową), w mózgu i w płucach. Synteza
układu wzmaga się pod wpływem określonych związków, np. fenobarbitalu, głównie przez oddziaływanie na
wzrost transkrypcji mRNA. Ma to znaczenie w zjawisku interakcji leków, np. dikumarol-fenobarbital-CYP2C9,
etanol-rozpuszczalniki-CYP2E1. Niektóre (CYP1A1) biorą udział w metabolizmie wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych (PAH), dlatego nazywa się je hydroksylazą węglowodorów aromatycznych
(AHH); może ona przekształcać prokarcynogeny, np. dymu tytoniowego. Zjawisko polimorfizmu genów
cytochromów jest przyczyną osobniczego zróżnicowania reakcji organizmu na daną substancję.

Reakcje II fazy przekształcają substrat w formę, w jakiej jest on wydalany z organizmu (z moczem, żółcią

lub inną drogą). Należą tu następujące procesy sprzęgania:

typ reakcji

endogenny donor grupy

enzym(y)

przykłady ksenobiotyków

glukuronidacja

UDPGlcUA

transferaza glukuronylowa

2-acetyloaminofluoren,

anilina, benzoesan,

meprobenat, fenol, steroidy

sulfatacja

3’-{P}-adenozno-5’-{P}-

siarczan = PAPS

transferaza siarczanowa

alkohole, aminy

aromatyczne, fenole

sprzęganie z GSH

(→ merkapturan –

zaw. grupę Ac-Cys)

GSH, AcCoA

S-transferaza glutationowa,

GGTP, dipeptydaza Cys-

Gly, transacetylaza

elektrofilowe ksenobiotyki,

np. pewne karcynogeny

- -

131

acetylacja

AcCoA

transacetylaza

metylacja

S-adenozylo-Met (SAM)

transmetylaza

Efekty działania ksenobiotyków:

•

cytotoksyczny – w wyniku połączenia się reaktywnych metabolitów z witalnymi makrocząsteczkami,

•

immunologiczny – w wyniku połączenia haptenu z białkami komórkowymi może powstać antygen,
przeciwko któremu skierowana zostanie odpowiedź immunologiczna (nadwrażliwość, alergia),

•

karcynogeneza chemiczna – efekt mutagenny w wyniku połączenia karcynogenów z DNA.

6.

Biochemia nerek

a)

funkcje i regulacja

Nerki pełnią wiele funkcji niezbędnych do życia organizmu: usuwają końcowe metabolity i toksyny,

utrzymują równowagę wodno – mineralną i kwasowo – zasadową oraz stanowią organ wydzielniczy.

Najistotniejszą rolą nerek jest oczyszczanie ustroju ze szkodliwych produktów metabolizmu, m. in.

gospodarki azotowej, a także K

+

i H

2

O. W ciałku nerkowym dochodzi do filtracji osocza – po zatrzymaniu

elementów morfotycznych i makrocząsteczkowych (> 60-70 kDa) woda i rozpuszczone w niej związki
przechodzą do kanalika nerkowego, tworząc mocz pierwotny. Ponieważ ten ostatni posiada bardzo dużą objętość
(ok. 200 l/dobę) i zawiera wiele cennych składników, toteż w kanaliku bliższym (proksymalnym) dochodzi do
resorpcji wody, jonów, glukozy, aa, witamin i polipeptydów. Tu również wydalane są do kanalików: kreatynina,
leki i substancje diagnostyczne (np. kwas para-aminohipurowy = PAH). Pętle nefronu dzięki zróżnicowanej
przepuszczalności i pompom jonowym wytwarza gradient osmotyczny w tkance śródmiąższowej (tzw.
wzmacniacz przeciwprądowy). W obrębie kanalika dalszego (dystalnego) aktywnie wchłaniany jest Na

+

(zależnie od aldosteronu) – zachodzi jego wymiana z K

+

, H

+

i NH

4

+

oraz bierny transport Cl

-

. Wreszcie w

cewkach zbiorczych komórki główne wymieniają Na

+

na K

+

(zależnie od aldosteronu i ADH), zaś komórki

wstawkowe – K

+

na H

+

. Dzięki wytworzonemu przez pętle i naczynia proste gradientowi osmolalnemu dochodzi

tu również do ostatecznego zagęszczania moczu, tak iż staje się on hipertoniczny względem krwi i w takiej
formie jest wydalany. Wymiana wodno – elektrolitowa zachodząca między pętlami a naczyniami prostymi
określana jest jako wymiennik przeciwprądowy.

Nerka jest również narządem wydzielniczym. Sama tkanka śródmiąższowa jest źródłem związków

regulujących ciśnienie krwi – PGA

2

i PGE

2

. Na biegunie naczyniowym kłębuszka znajduje się aparat

przykłębuszkowy, złożony z trzech elementów. Komórki mioidalne są zmodyfikowaną mięśniówką tętniczki do-
i odprowadzającej; pełnią one funkcje pressoreceptorów i wydzielają reninę, która przez angiotensynę II i
aldosteron podnosi ciśnienie krwi (układ RAA). Plamka gęsta składa się z komórek fragmentu ściany kanalika
dystalnego, przylegającego do bieguna naczyniowego; jest to osmochemoreceptor czuły na zmiany poziomu Na

+

i mający możliwość wpływu na czynność komórek mioidalnych. Wreszcie mezangium pozakłębuszkowe
występuje między powyższymi elementami i w razie spadku pO

2

wydziela nerkowy czynnik erytropoetyczny

(renal erythropoetic factor = REF), przekształcający prekursorową globulinę osocza w erytropoetynę, regulującą
proces tworzenia krwinek czerwonych w szpiku kostnym.

Pod względem biochemicznym nerka jest narządem o dużej aktywności metabolicznej – zużywa 20x

więcej energii niż przeciętna tkanka. Posiada zestaw enzymatyczny zbliżony do wątrobowego. Pobiera z krwi
mleczan, FFA i glicerol – część z nich zaspokaja jej własne potrzeby energetyczne, reszta zaś wchodzi w szlak
glukoneogenezy. Powstała glukoza, wraz z ilością odzyskaną z moczu przez przenośnik SGLT-1, powraca do
krwi dzięki obecności dwukierunkowego transportera GLUT-2. Resorpcja aa z moczu zachodzi poprzez cykl γ-
glutamylowy z udziałem glutationu:

GGT (γ-glutamylotransferaza = γ-glutamylotranspreptydaza = GGTP) oprócz błony komórek kanalików

nerkowych występuje na ER hepatocytów. Nerka jest miejscem produkcji NH

4

+

z mocznika i glutaminy, przez

co może kompensować kwasicę bez mobilizacji istotnych dla organizmu zasad. Zachodzi tu również reakcja
wymiany: Arg + Gly → Orn + glikocyjamina = guanidynooctan, której produktem jest półprodukt do syntezy

- -

132

kreatyny – mięśniowego przenośnika energii. W wyniku nieenzymatycznej reakcji cyklizacji kreatyny powstaje
kreatynina, wydzielana do moczu w kanaliku bliższym; pomiar jej stężenia jest wskaźnikiem filtracji
kłębuszkowej. Podobnie wydzielany jest hipuran – produkt sprzęgania Gly z benzoesanem, pochodzącym z
konserwantów pokarmowych lub z metabolizmu ksenobiotyków aromatycznych. Mitochondria komórek
kanalika proksymalnego zawierają 1α- oraz 24-hydroksylazę, przeprowadzając ostatni etap syntezy kalcytriolu.

b)

skład i właściwości moczu w normie i w patologii

Dorosły człowiek produkuje fizjologicznie w ciągu doby ok. 1500 ml moczu (600 – 3000 ml; < 500 ml to

oliguria (skąpomocz), < 100 ml to anuria (bezmocz), > 2500 ml to poliuria (wielomocz)). Barwa zależy od
urochromu i zazwyczaj jest słomkowożółta (czerwona ← krew, HGB, leki, moczony; brązowa ← bilirubina;
brązowienie na powietrzu ← alkoptoniuria). Swoisty zapach może ulec zmianie w gnilny (← zapalenie),
fermentujących jabłek (← ciała ketonowe) lub drażniący (← fenyloketonuria). Gęstość waha się prawidłowo w
granicach 1,018 – 1,022, choć może wynosić 1,002 – 1,035. pH jest lekko kwaśne (ok. 6), lecz zależy wyraźnie
od diety (bogatobiałkowa → do 4,6, jarzynowo – mleczna → do 8).

Mocz jest wodnym roztworem wielu związków organicznych i mineralnych – znajdujemy w nim

(stężenie molowe / stężenie objętościowe): mocznik (410 / 24,6), kwas moczowy (5 / 0,85), kreatyninę (11,9 /
1,35), hipuran, glukuroniany, mleczan, octan, szczawian, witaminy, hormony i ich metabolity (aldosteron,
katecholaminy, kortyzol, metanefryna, kwas wanilinomigdałowy = VMA, 11,17-hydroksykortykosteroidy, 17-
ketosteroidy), enzymy (m. in. AspAT i AlAT), barwniki i ich metabolity (kwas δ-aminolewulinowy = ALA,
porfobilinogen = PBG, urobilinogen) oraz jony Na

+

(148 / 3,4), K

+

(100 / 3,9), Ca

2+

(4 / 0,16), Mg

2+

(11 / 0,27),

NH

4

+

, Cl

-

(150 / 5,3), {P} (37 / 3,5), SO

4

2-

(25 / 1,2).

Fizjologicznie mocz nie zawiera białek (co najwyżej wydalanych jest 50 – 100 mg / dobę). Proteinuria

(albuminuria) może świadczyć o uszkodzeniu układu filtrującego. Podobnie glukozy nie powinno być więcej niż
0,1 – 1 mM / 1,8 – 18 mg%. Glikozuria może być następstwem hiperglikemii, występującej w cukrzycy, ciąży,
pod wpływem stresu, w zaburzeniach hormonalnych (akromegalia, choroba Cushinga). Prawidłowo nie
pojawiają się w moczu ciała ketonowe, a ketonuria bywa następstwem głodzenia, cukrzycy, wymiotów lub
wysiłku fizycznego. Podobnie nie powinna występować bilirubina, a bilirubinuria świadczy o żółtaczce za- lub
wątrobowej albo nowotworach. Urobilinogen występuje fizjologicznie w niewielkiej ilości, a może wzrastać
przy niedrożności dróg żółciowych i antybiotykoterapii hamującej florę jelitową. Uszkodzenie miąższu może
dawać hematurię (krwiomocz). Obecność kwasów żółciowych to choluria, cystyny – cystynuria, ksantyny –
ksantynuria. Przy mukopolisacharydozach pojawiają się siarczany dermatanu i heparanu, a przy mukolipidozach
– fragmenty glikoprotein.

7.

Biochemia mięśni

a)

budowa i charakterystyka białek mięśni

Aktyna G jest białkiem globularnym stanowiącym ¼ wszystkich białek mięśnia. W fizjologicznej sile

jonowej i obecności Mg

2+

dochodzi do kowalencyjnej polimeryzacji, w wyniku czego powstaje fibrylarna aktyna

F. Tropomiozyna jest heterodimerem αβ o budowie fibrylarnej, przyłącza się do aktyny F w rowku między
łańcuchami. Troponina jest heterotrimerem: podjednostka T łączy elementy filamentu w całość, I – hamuje
interakcję aktyny F i miozyny, zaś C jest analogiem kalmoduliny wiążącym 4 Ca

2+

.

Miozyny stanowią rodzinę kilkunastu białek. Miozyna I jest monomerem łączącym mikrofilamenty z

błonami. Mięśniowa miozyna II stanowi ponad ½ masy białek mięśnia. Jest heksamerem, składa się w dwóch
skręconych helis, z których każda zakończona jest globularną główką. Posiada 2 łańcuchy ciężkie H i 4 lekkie L
(po dwa podstawowe i dwa regulatorowe). Rozkład trypsyną ujawnia meromiozyny: lekka LMM stanowi
fragment skręconych α-helis trzonu, nie wiąże aktyny F i nie jest ATP-azą; ciężka HMM posiada część
globularną S1 i nitkowatą S2, które można rozdzielić papainą. HMM-S1 wiąże łańcuchy lekkie L oraz aktynę (w
nieobecności ATP), jest ATP-azą, a aktywność ta wzrasta 100-200x po związaniu z aktyną F. HMM-S2 posiada
strukturę podobną do LMM.

Inne białka filamentu to:

tytyna – sięga od linii Z do M i pełni rolę w rozkurczu mięśnia,

nebulina – rozciąga się od linii Z wzdłuż nitek aktyny, regulując ich tworzenie i długość,

α-aktynina – stabilizuje aktynę, zakotwiczając ją w liniach Z,

desmina – układ się wzdłuż aktyny i łączy się z plazmalemmą,

dystrofina – również połączona z plazmalemmą, jej defekt jest przyczyną dystrofi mięśni,

kalcyneuryna – wykazuje aktywność fosfatazy regulowanej przez kalmodulinę,

białko C wiążące miozynę ułożone jest poprzecznie w prążkach A, integruje ono strukturę
sarkomeru przez wiązanie tytyny i miozyny.

- -

133

b)

mechanizm skurczu mięśnia

Główki miozyny S1 hydrolizują ATP, nie pozwalając jednocześnie produktom na odłączenie się;

kompleks miozyna-ADP-{P} jest w stanie wysokoenergetycznym. Pobudzenie miocytu zwiększa
powinowactwo aktyny do miozyny, główki odnajdują i wiążą się z odpowiednimi miejscami na aktynie.
Oddzielenie ADP i {P} indukuje zmiany konformacyjne główek względem trzonu i przesunięcie nitek
względem siebie. Do kompleksu w stanie niskoenergetycznym przyłącza się ATP, zmniejszając powinowactwo
aktyny do miozyny i powodując rozpad kompleksu.

Regulacja skurczu odbywa się z udziałem Ca

2+

. Mechanizm oparty na aktynie występuje w mięśniu

szkieletowym i sercowym, zaś oparty na miozynie – w mięśniu gładkim. Inhibitorem skurczu jest troponina
związana z tropomiozyną. TpI zapobiega łączeniu aktyny z miozyną przez przesunięcie tropomiozyny na
miejsce wiązania główek miozynowych, wobec czego mięsień pozostaje w rozkurczu. Spoczynkowe
sarkoplazmatyczne [Ca

2+

] wynosi 10-100 nM i jest utrzymywane przez Ca

2+

-ATP-azę pompującą wapń do ER,

gdzie przejściowo łączy się z kalsekwestryną. Sarkomery i ER stykają się z pobudliwymi błonami w postaci w
postaci ścian kanalików porzecznych (T). Powstanie potencjału czynnościowego na sarkolemmie powoduje
aktywację powolnych napięciowo-zależnych kanałów wapniowych (DHPR = receptor dihydropirydynowy), a
przez to ATP-Ca

2+

-zależnych kanałów uwalniających Ca

2+

z ER (RYR1 = receptor rianodynowy 1; 2 – w sercu,

3 – w UN). Gwałtowny wzrost sarkoplazmatycznego [Ca

2+

] do 10 µM powoduje łączenie Ca

2+

z TpC, wpływ na

TpT i TpI i usunięcie tropomiozyny z dotychczasowych miejsc. Podczas rozkurczu ↓ [Ca

2+

], wapń uchodzi z

TpC, tropomiozyna wraca na pierwotne miejsce i w obecności ATP kompleks aktyna-miozyna ulega rozpadowi.
Brak ATP powoduje utrzymanie wysokiego [Ca

2+

] oraz utrudnia dysocjację aktyny i miozyny – w konsekwencji

mięsień pozostaje w skurczu, co może prowadzić do stężenia.

Złośliwa hipertermia spowodowana jest mutacją podjednostki α RYR1 z następowym utrzymującym się

wysokim [Ca

2+

]. Obserwuje się nadwrażliwość na anestetyki (halotan) i/lub leki zwiotczające (sukcynylocholina

= suksametonium). Leczenie obejmuje m. in. dantralen (poch. hydantoniny).

W mięśniu sercowym miocyty tworzą syncytium. Obecny jest własny automatyzm dzięki powolnej

spoczynkowej depolaryzacji komórek P przedsionków. Obserwuje się silniejszy rozwój kanalików T, zaś słabszy
ER, co uzależnia skurcz od zewnątrzkomórkowych zasobów wapnia. Wymiana Ca

2+

pomiędzy kardiomiocytem

a płynem pozakomórkowym zachodzi przez kanały wapniowe L i T (układ CIRC), wymiennik 3Na

+

/Ca

2+

oraz

Ca

2+

-ATP-azę, Miocyty sercowe posiadają receptory błonowe dla hormonów i wykazują wrażliwość na cAMP,

czym tłumaczy się dodatnie inotropowe działanie agonistów β-adrenergicznych.

W mięśniu gładkim nie dostrzegamy uporządkowania odpowiedzialnego za poprzeczne prążkowanie.

Brak również układu troponiny. Istotny jest wapń zewnątrzkomórkowy, a pompy Ca

2+

działają wolno. Lekkie

łańcuchy miozyny zbudowane są inaczej, ponadto występuje miozynowy mechanizm regulacji skurczu. Miozyna
nie wykazuje aktywności ATP-azy oraz to lekki łańcuch p zapobiega łączeniu się aktyny F z miozyną; oba te
efekty znoszone są przez fosforylację łańcucha lekkiego p. Wzrost [Ca

2+

] powoduje łączenie się go z

kalmoduliną, następnie wiązanie z kinazą miozynową i fosforylację przez nią łańcucha lekkiego p, ostatecznie
dochodzi do interakcji aktyny z miozyną. Powrót do stanu wyjściowego zapewnia fosfataza. Sam skurcz jest
długi i powolny, z małym zużyciem ATP; może być zapoczątkowany zarówno przez stymulację nerwową, jak i
hormonalną. cAMP aktywuje odpowiednią kinazę, która fosforyluje kinazę łańcucha lekkiego – wówczas u tej
spada powinowactwo do kompleksu Ca

2+

-kalmodulina; w ten sposób pod wpływem β-adrenergicznym dochodzi

do zahamowania skurczu. W mięśniu gładkim występuje kaldesmon, który wiążąc się z aktyną i tropomiozyną
zapobiega skurczowi. Wzrost [Ca

2+

] i wiązanie z kalmoduliną poprzedza wiązanie z kaldesmonem i

umożliwienie skurczu; podobnie działa fosforylacja.

Źródła energii dla skurczu mięśnia (ATP):

•

glikogen – fosforylaza aktywowana przez Ca

2+

, A i AMP;

•

glukoza i TAG z osocza

•

kreatyna (Cr) – fosforylowana przez kinazę (CK)

•

ADP

- -

134

8.

Biochemia tkanki łącznej

a)

składniki tkanki łącznej, ich budowa i funkcja

Każda tkanka organizmu składa się z komórek, pomiędzy którymi występuje zmienna ilość substancji

międzykomórkowej. Ta ostatnia ma największy udział w strukturze tkanki łącznej. Substancja
międzykomórkowa składa się z włókien oraz istoty (substancji) podstawowej. Włókna dzielimy na kolagenowe,
siateczkowe (zbudowane z kolagenu III) oraz sprężyste (złożone z elastyny oraz mikrofibryli, zbudowanych z
fibryliny). W skład istoty podstawowej wchodzą mukopolisacharydy (glikozoaminoglikany = GAG: kwas
hialuronowy (HA), siarczan chondroityny A i C (CSA+C), siarczan dermatanu (DS), siarczan keratanu (KS) oraz
siarczan heparanu (HS)), jak również białka niekolagenowe: fibronektyna, laminina i inne.

Elastyna odpowiada za sprężystość tkanek. Występuje w znacznych ilościach w płucach, dużych

tętnicach i niektórych więzadłach sprężystych, mniej zaś jej zawiera skóra i małżowina uszna. Syntetyzowana
jest jako monomeryczna proelastyna, której określone Pro ulegają hydroksylacji do Hyp. W przeciwieństwie do
kolagenu nie występują peptydy ekstensyjne, łańcuchy cukrowe, Hyl, powtarzalne sekwencje ani mnogość
odmian. Po wydaleniu z komórki niektóre Lys ulegają oksydacyjnej dezaminacji do aldehydów, po czym
kondensacja takich trzech z niezmienioną Lys daje desmozynę; zapewnia one nierozpuszczalność, stabilność,
sprężystość i długi okres półtrwania. Mutacje genu elastyny (7q11-23) prowadzą do zespołu Williamsa, który
objawia się zwężeniem aorty, zaburzeniami tkanki łącznej i OUN, gromadzeniem się elastyny (twardzina) lub jej
niedoborem (rozedma płuc, nadmierna rozciągliwość i starzenie się skóry).

Fibrylina to glikoproteina, która po opuszczeniu komórki ulega wbudowaniu do mikrofibryl,

stanowiących rusztowanie dla odkładanej elastyny. Mutacje genu fibryliny (chromosom 15) prowadzą do
zespołu Marfana. Jej występowanie we włóknach soczewki, w okostnej i we włóknach sprężystych dużych tętnic
tłumaczy objawy zespołu: ektopię (przesunięcie) soczewki, wysoki wzrost, arachnodaktylię i anomalie sercowo
– naczyniowe, np. tętniak aorty wstępującej.

Fibronektyna to główna glikoproteina substancji pozakomórkowej, występująca również w osoczu. Jest

homodimerem, zawiera 3 typy motywów tworzące ≥ 7 czynnościowych fragmentów cząsteczki – ich rolą jest
wiązanie heparyny, fibrynogenu, kolagenu, DNA i powierzchni komórek. Poprzez sekwencję RDG łączy się z
receptorową integryną przezbłonową, a ta z kolei łączy się poprzez adhezyny (talina, winkulina, α-aktynina,
białko czapeczkowe) z aktyną cytozolową. Fibronektyna bierze udział w adhezji i migracji komórek.

Laminina to heterotrimer o budowie AB

1

B

2

, tworzący cząsteczkę o kształcie krzyża. Wiąże ona kolagen

IV, heparynę oraz integryny powierzchniowe komórek, odpowiada za spójność nabłonka z błoną podstawną.
Wiąże się z entaktyną pełniącą podobne funkcje. Ujemne ładunki na powierzchni cząsteczki lamininy
wytwarzane przez siarczan heparanu i kwaśne glikoproteiny spełniają istotne funkcje w błonie filtracyjnej
kłębuszków nerkowych, odpychając ujemnie naładowane białka osocza i zapobiegając ich przechodzeniu do
moczu pierwotnego.

b)

synteza kolagenu – reakcje i regulacja procesu

Kolagen stanowi główny składnik większości tkanek łącznych oraz jest najbardziej rozpowszechnionym

białkiem zwierzęcym (stanowi 25% wszystkich białek ssaków). U człowieka występuje 19 typów kolagenu,
zbudowanych z 30 różnych łańcuchów polipeptydowych. Wyróżniamy typy tworzące włókna (I, II, III, V, XI),
tworzące sieci (IV, VIII, X), FACIT (IX, XII, XIV, XVI, XIX), koralikowe (VI), kotwiczące (VII),
przezbłonowe (XIII, XVII) i inne (XV, XVIII). Niektóre odmiany cechują się dobrą rozciągliwością (ścięgna,
skóra), twardością (kości, zęby) lub przejrzystością (rogówka).

Produktem translacji mRNA jest preprokolagen, który dzięki sekwencji sygnałowej wędruje do ER. Tam

peptyd sygnalny jest odszczepiany, dając prokolagen, który podlega hydroksylacji i glikozylacji. Na obu
końcach prokolagenu występują peptydy ekstensyjne, zawierające reszty Cys, tworzące wewnątrz- (N+C) oraz

- -

135

międzyłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, ułatwiające tworzenie superhelisy. Łańcuch polipeptydowy α jest
lewoskrętną helisą (n ≈ 3), zaś 3 łańcuchy α skręcone są w prawoskrętną superhelisę. Co 3 aa stanowi Gly, gdyż
jest ona na tyle mała, aby zmieścić się w ograniczonej przestrzeni w środkowej części rdzenia superhelisy.
Struktura wygląda zatem jak (Gly-X-Y)

n

, gdzie 3n ≈ 1000. Helisa podlega hydroksylacji Pro i Lys oraz

glikozylacji powstałego Hyl.

Pro —— hydroksylaza Pro, askorbinian, α-ketoglutaran —→ Hyp

Lys —— hydroksylaza Lys, askorbinian, α-ketoglutaran —→ Hyl —— O-glikozylacja —→ + Gal, + Gal-Glc

Pro i Hyp, obie występujące w ilości ok. po 100, zapewniają cząsteczce odpowiednią sztywność, a

poprzez wzajemne odpychanie wymuszają postać wydłużonej lewoskrętnej helisy. Aparat Golgiego pomaga w
wydaleniu takiej formy prokolagenu poza komórkę, gdzie aminoproteinaza i karboksypeptydaza prokolagenowa
usuwają peptydy ekstensyjne. Umożliwia to spontaniczną agregację nowo powstałych cząsteczek kolagenu do
włókien kolagenowych – typy włókniste układają się superhelisami bok do boku przy przesunięciu ¼, co
tłumaczy prążkowanie włókien tkanki łącznej. Ostatnim etapem jest stabilizacja włókien przez tworzenie wiązań
poprzecznych z udziałem oksydazy lizynowej; utlenia ona grupy ε-aminowe Lys i Hyl, a powstałe reszty
aldehydowe ulegają kondensacji aldolowej między sobą lub tworzą zasadę Schiffa z nieutlenionymi grupami ε-
aminowymi. Po niewielkich przekształceniach struktura ulega wzmocnieniu i nabiera ostatecznego kształtu.

Choroby:

•

Zespół Ehlersa – Danlosa charakteryzuje się nadmierną rozciągliwością skóry i zwiększoną
ruchomością stawów. Wyróżniono 11 typów, z czego w IV obserwuje się samoistne pękanie ścian jelit i
naczyń, w VI – pęknięcia gałki ocznej, w VII C – miękką skórę i nadmierną ruchomość stawów.

•

Zespół Alporta związany jest z defektem kolagenu VI budującego błony podstawne. Objawia się
krwiomoczem i niewydolnością nerek.

•

Epidermoliza pęcherzykowa to defekt włókien kotwiczących, zbudowanych z kolagenu VII, co
powoduje pękanie skóry i urazowe tworzenie pęcherzy.

•

Szkorbut polega na deficycie witaminy C, co upośledza strukturę kolagenu. Pojawia się krwawienie z
dziąseł, wybroczyny podskórne i upośledzone gojenie ran.

c)

biochemia kości

W skład tkanki kostnej wchodzą substancje organiczne i mineralne. 95% tych pierwszych stanowi

kolagen I, reszta to kolagen V oraz białka niekolagenowe: osocza, proteoglikany CD-PG I – III, osteonektyna,
osteokalcyna, osteopontyna, sialoproteina kostna, BMP. Składniki nieorganiczne to głównie hydroksyapatyt
Ca

10

(PO

4

)

6

(OH)

2

, a także Na

+

, Mg

2+

, K

+

, Cl

-

, F

-

, węglany i cytryniany.

Osteoklasty odpowiadają za trawienie tkanki kostnej. Na błonie apikalnej występuje rąbek

szczoteczkowy, gdzie ATP-aza pompuje protony do przestrzeni resorpcyjnej, obniżając pH do ok. 4. Ułatwia to
rozpuszczanie hydroksyapatytu i demineralizację, zaś kwaśne proteazy lizosomalne rozkładają białka kostne.
Aktywatorami osteoklastów są: PTH, 1,25(OH)

2

D

3

, IL-1, IL-6, TNF, TGF-α, zaś inhibitorami: kalcytonina,

estrogeny (przez IL-6), TGF-β, IFN-α, PGE

2

.

Osteoblasty wytwarzają białka, czynniki wzrostu i cytokiny; kontrolują mineralizację przez migrację Ca +

{P} przez ich błony zawierające fosfatazę alkaliczną, która pozyskuje {P} z fosforanów organicznych.
Aktywacja zachodzi pod wpływem: PTH, 1,25(OH)

2

D

3

, T

3/4

, hGH, IGF-I, PGE

2

, TGF-β, estrogenów, zaś

hamowanie przez glikokortykoidy.

Choroby:

•

karłowatość – genetyczna (achondroplazja), hormonalna (przysadkowa – GH, tarczycowa – T

3/4

),

•

krzywica i osteomalacja – hipowitaminoza D

3

,

•

choroba zwyrodnieniowa stawów – mutacje kolagenu I i II,

•

osteoporoza – zmniejszenie gęstości kości ułatwia ich złamania; związek z estrogenami (niedobór po
menopauzie), IL-6, IL-6

•

osteopetroza = marmurowatość kości – defekt procesu resorpcji powoduje wzrost gęstości kości;
przyczyną jest mutacja genu anhydrazy węglanowej II (CA-II, 8q22); występuje również kwasica
nerkowa i zwapnienia mózgowia

•

przedwczesne zarastanie szwów czaszkowych:
zespół Pfeiffera – mutacja FGFR-1
zespół Jacksona – Weissa – mutacja FGFR-2
zespół Crouzona – mutacja FGFR-2

•

achondroplazja / dysplazja tanatoferyczna – mutacja FGFR-3

- -

136

•

Wrodzona łamliwość kości (łac. osteogenesis imperfecta; inna nazwa – zespół błękitnych białkówek)
spowodowana jest mutacjami w obrębie genu kolagenu I, np. zamianą Gly na większy aa. Obecność
jednego nieprawidłowego łańcucha prowadzi do proteolizy całej cząsteczki, co znane jest jako
samobójstwo prokolagenu. Najgroźniejsza jest wrodzona zaawansowana postać u noworodków, które
mogą wówczas rodzić się z wieloma złamaniami i umierać. Dodatkowo twardówki oczu są
patologicznie cienkie i przejrzyste, tak iż prześwitują przezeń żyły naczyniówki, nadając barwę lekko
niebieską, stąd inne określenie – zespół błękitnych białkówek.

9.

Biochemia zmysłu wzroku

a)

rola i przemiany karotenoidów w organizmie człowieka

W jarzynach występuje β-karoten (prowitamina A) – żółty barwnik złożony z dwóch cząsteczek retinalu i

wykazujący 1/6 jego aktywności. W jelicie ulega on dioksygenazie β-karotenowej i przy współudziale kwasów
żółciowych oraz tlenu cząsteczkowego daje 2 cząsteczki retinalu (witamina A

1

). Retinal w reakcji katalizowanej

przez NADPH-zależną reduktazę retinalową daje odwracalnie retinol (witamina A), zaś utleniony przechodzi
nieodwracalnie w kwas retinolowy. Estry retinolu rozpuszczalne w tłuszczach pokarmowych ulegają emulgacji
w kroplach żółci, hydrolizie w świetle jelita oraz wchłonięciu przez nabłonek. Retinol jest estryfikowany i
wbudowywany do chylomikronów, których remnanty wychwytywane są przez hepatocyty. Następnie retinol
magazynowany jest w lipocytach pod postacią lipoglikoprotein lub transportowany przez RBP (retinol binding
protein) do tkanek pozawątrobowych, gdzie wiąże go CRBP. Retinol wolny, występujący we krwi po
przekroczeniu pojemności białek transportowych, jest toksyczny i teratogenny. Kwas retinolowy transportowany
jest przez albuminy.

Retinol i kwas retinolowy ulegają wiązaniu przez białka jądrowe, działając niczym hormony sterydowe

na regulację ekspresji genów. Kwas retinolowy reguluje syntezę surfaktantu fosfolipidowego pęcherzyków
płucnych, wpływa na układ reprodukcyjny, nasila procesy wzrostu i różnicowania komórek przez wspomaganie
syntezy glikoprotein (fosforan retinoilowy jest błonowym przenośnikiem oligosacharydów). 5,6-epoksyretinolan
pełni funkcje antyoksydacyjne.

11-cis-retinal jest istotnym składnikiem rodopsyny, pełniącej funkcje barwnika wzrokowego. Cząsteczka

retinolu połączona jest przez zasadę Schiffa z Lys296 opsyny.

b)

reakcje zachodzące w procesie fotorecepcji

Do funkcjonowania rodopsyny wymagana jest duża płynność błony, co zapewnia obecność kwasu

dekozaheksaenowego (DHA) w fosfolipidach siatkówki. Absorpcja kwantu światła przez rodopsynę powoduje
izomeryzację 11-cis–retinalu do formy all-trans, co z kolei destabilizuje połączenie typu zasady Schiffa.
Rodopsyna przechodzi przez kilka stadiów, rozpadając się na zaktywowaną opsynę i all-trans retinal. Ten ostatni
ulega izomerazie retinalowej, przechodząc z powrotem w formę 11-cis, która może łączyć się z opsyną w
rodopsynę. Zanim jednak do tego dojdzie zaktywowana opsyna oddziałuje z białkiem G

T

trasnsducyną,

powodując wymianę w nim GDP na GTP. Powoduje to oddzielenie podjednostki α od zakotwiczonego w błonie
kompleksu βγ. Łączy się ona z podjednostką γ PDE cGMP, odsłaniając aktywny katalitycznie kompleks αβ.
Aktywność PDE prowadzi do znacznego spadku [cGMP] w komórce światłoczułej i zamknięcie cGMP-
zależnych kanałów kationowych (dla Na

+

i Ca

2+

). Przy niezakłóconej pracy innych mechanizmów wymiany

jonów prowadzi to do zwiększenia ujemnego ładunku wnętrza komórki, czyli jej hiperpolaryzacji, która po
przekroczeniu odpowiedniego progu wzbudza potencjał czynnościowy. Informacja o odebraniu bodźca wędruje
przez kolejne warstwy siatkówki do nerwu wzrokowego, po czym drogą wzrokową do korowego ośrodka
wzroku. 10 x spadek poziomu wewnątrzkomórkowego Ca

2+

aktywuje GC do produkcji cGMP, co otwiera kanały

kationowe i niweluje hiperpolaryzację. Podjednostka α trasnducyny rozkłada GTP i ustaje aktywność GTPazy.
Kinaza rodopsynowa fosforyluje, a arestyna wiąże barwnik wzrokowy. W ten sposób układ zdolny jest do
odebrania następnego bodźca.

- -

137

ROZDZIAŁ VIII – KWASY NUKLEINOWE

I BIOSYNTEZA BIAŁEK

1.

Budowa i właściwości kwasów nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny

a)

elementy składowe kwasów nukleinowych – zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy

Cząsteczki nazywane kwasami nukleinowymi biorą swoją nazwę od głównego miejsca występowania w

komórce – jądra (łac. nucleus). Wyróżnia się dwa rodzaje kwasów nukleinowych – kwas rybonukleinowy (ang.
ribonucleic acid – RNA) oraz dezoksyrybonukleinowy (ang. desoxiribonucleic acid – DNA). W budowie
obydwu z nich dostrzec można tak podobieństwa, jak i różnice. Różnią się one ponadto funkcją i lokalizacją
komórkową: DNA występuje w jądrze i stanowi magazyn informacji genetycznej, zaś RNA obecny jest w jądrze
i w cytoplazmie, a jego podstawową rolą jest udział w biosyntezie białek. Wszystkie kwasy nukleinowe są
polimerami mniejszych cząsteczek, zwanych nukleotydami. Nukleotyd składa się z nukleozydu, do którego
przyłączona jest reszta fosforanowa (PO

4

3-

). Nukleozyd z kolei stanowi połączenie zasady azotowej oraz cukru

pięciowęglowego (pentozy).

•

zasady azotowe

Zasady azotowe wchodzące w skład kwasów nukleinowych to pochodne puryny (zasady purynowe) lub

pirymidyny (zasady pirymidynowe). Zasady purynowe to adenina (A; 6-aminopuryna) i guanina (G; 2-amino-6-
hydrokypuryna), zaś pirymidynowe – cytozyna (C; 2-hydroksy-4-aminopirymidyna), uracyl (U; 2,4-
dihydroksypirymidyna) i tymina (T; 5-metylouracyl). Metabolizm tych związków opisany jest w punkcie V-4.
Adenina, guanina i cytozyna występują w obu rodzajach kwasów nukleinowych, natomiast tymina tylko w
DNA, a uracyl – tylko w RNA. Ponadto w kwasach nukleinowych zwierząt, roślin i drobnoustrojów występują
w niewielkich ilościach pochodne powyższych zasad, np.: hipoksantyna (H; 6-hydroksypuryna), N

6

-

metyloadenina, N

6,6

-dimetyloadenina, N

1

-metyloguanina, 5-metylocytozyna czy 5-hydroksymetylocytozyna.

Zasady azotowe mogą występować w dwóch formach tautomerycznych – puryny w ketonowej i enolowej, zaś
pirymidyny w aminowej i iminowej. W kwasach nukleinowych dominują te pierwsze – ketonowa w purynach, a
aminowa w pirymidynach – co ma istotne znaczenie w tworzeniu wiązań wodorowych (por. dalej). Obecność
układu wiązań nienasyconych powoduje, że omawiane związki silnie pochłaniają promieniowanie z zakresu
ultrafioletu (UV), z maksimum absorpcji w okolicach λ ≈ 260 nm. Ma to dwojakiego rodzaju konsekwencje – z
jednej strony czyni promienie UV wyjątkowo silnym czynnikiem mutagennym (zastosowanie w lampach
bakteriobójczych), z drugiej zaś umożliwia ich wykorzystanie do identyfikacji kwasów nukleinowych
(zawierająca je próbka świeci w świetle UV na pomarańczowo).

•

pentozy, nukleozydy

Drugim składnikiem nukleozydu jest cukier C

5

– pentoza. Nazwy kwasów nukleinowych wzięły się

właśnie od wchodzących w ich skład cukrów – kwas rybonukleinowy zawiera D-rybozę, zaś
dezoksyrybonukleinowy – 2-dezoksy-D-rybozę. Obie pentozy występują w kwasach nukleinowych w postaciach
pierścieniowych (β-furanozowych). Atomy węgla wchodzące w skład pierścienia pentozy numeruje się, dodając
znaczek ‘ (prim), dla odróżnienia od numeracji atomów zasad azotowych. Nukleozydy są N-glikozydami pentoz
zasad azotowych, przy czym wiązanie glikozydowe łączy atom C1’ pierścienia cukrowego z atomem N1 zasady
pirymidynowej lub N9 zasady purynowej. Ze względu na położenie zasady i pentozy względem tego wiązania
wyróżnia się konfiguracje syn i anty nukleozydów, przy czym fizjologicznie dominuje ta druga. Nazwy
nukleozydów tworzone są od występujących w nich zasad. W nukleozydach purynowych końcówkę zasady –ina
zamienia się na –ozyna: nukleozyd adeniny (9-N-β-D-rybofuranozyloadenina) to adenozyna, a guaniny (9-N-β-
D-rybofuranozyloguanina) – guanozyna. Nazwy nukleozydów pirymidyn tworzy się w inny sposób: nukleozyd
uracylu (1-N-β-D-rybofuranozylouracyl) to urydyna, cytozyny (1-N-β-D-rybofuranozylocytozyna) – cytydyna,
zaś tyminy (1-N-2’-dezoksy-β-D-rybofuranozylotymina) – tymidyna (występuje tylko w DNA i zawsze zawiera
dezoksyrybozę). Inne niż tymidyna nukleozydy zawierające dezoksyrybozę przybierają dodatkowo przedrostek
dezoksy-: dezoksyadenozyna (9-N-2’-dezoksy-β-D-rybofuranozyloadenina), dezoksyguanozyna (9-N-2’-
dezoksy-β-D-rybofuranozyloguanina) oraz dezoksycytydyna (1-N-2’-dezoksy-β-D-rybofuranozylocytozyna).
Nukleozydy zawierające rybozę określa się jak rybozydy, a dezoksyrybozę – dezoksyrybozydy. Jednoliterowe
skróty nazw zasad (A, G, C, T, U) stosuje się również jako skróty nazw ich nukleozydów, czyli np. G oznacza
zarówno guaninę, jak i guanozynę, zależnie od kontekstu. Wyjątkowo w kwasach nukleinowych mogą

- -

138

występować nukleozydy zawierające inne niż wyżej opisane rodzaje wiązań – np. w pseudourydynie (5-
rybozylouracyl, ψ-urydyna lub po prostu ψ) ryboza związana jest z atomem C5, a nie C1 uracylu; związek ten
występuje w pewnych rodzajach RNA (tRNA, por. dalej).

•

nukleotydy

Nukleotydy są estrami fosforowymi (dokładnie – ortofosforowymi (V)) nukleozydów. Reszta

fosforanowa związana jest z jedną z grup hydroksylowych pentozy: w rybozydach – przy C2’, C3’ lub C5’, a
dezoksyrybozydach – przy C3’ lub C5’. Nazwy nukleotydów tworzy się od nazw ich nukleozydów, dodając
numer atomu węgla, z którym związana jest zestryfikowana grupa hydroksylowa – i tak kwas 5’-adenylowy to
adenozyno-5’-fosforan (ang. adenosine 5’-monophosphate – 5’-AMP), kwas 5’-guanylowy – guanozyno-5’-
monofosforan (GMP), kwas 5’-urydylowy – urydyno-5’-monofosforan (UMP), kwas 5’-cytydylowy – cytydyno-
5’-monofosforan (CMP); określa się je łącznie mianem rybotydów. Przez analogię dezoksyrybotydy to: kwas
tymidylowy – tymidyno-5’-monofosforan (TMP), kwas dezoksyadenylowy (dAMP), dezoksyguanylowy
(gGMP) oraz dezoksycytydylowy (dCMP). W niewielkich ilościach występują w kwasach nukleinowych
nietypowe nukleotydy, jak np. kwas 5’-inozynowy – inozyno-5’-monofosforan (IMP), w którym zasadą jest
hipoksantyna. Wszystkie nukleozydy mogą być również fosforylowane przy C3’, a rybozydy – także przy C2’.
Istnieją też cykliczne nukleotydy, w których reszta fosforanowa estryfikuje dwie kolejne grupy hydroksylowe (tj.
przy C2’ i C3’ lub C3’ i C5’); aby zaznaczyć ich cykliczny charakter, dodaje się do skrótu literę c, np. cykliczny
3’,5’-guanozynomonofosforan to 3’,5’-cGMP. Monofosforany nukleozydów mogą być dalej fosforylowane –
powstają wówczas dwu- (ADP, GDP, CDP, TDP, UDP) i trójfosforany nukleozydów (ATP, GDP, CDP, TTP,
UTP). Substratami do biosyntezy kwasów nukleinowych są właśnie te ostatnie (por. dalej). Ponadto
trójfosforany nukleozydów używane są jako cząsteczki aktywujące inne związki, pozwalając im na pełnienie
funkcji substratów w wielu reakcjach – por. UDP i synteza glikogenu (patrz punkt III-5-a), metabolizm
galaktozy (III-6-c) czy aminocukrów (III-7-a), CTP i synteza fosfolipidów, ATP i synteza białek (VIII-4-b).

•

polinukleotydy

Kwasy nukleinowe – zarówno DNA, jak i RNA – są polinukleotydami, tj. liniowymi polimerami

odpowiednich nukleotydów, połączonych ze sobą wiązaniami fosfodwuestrowymi (reszta fosforanowa łączy
atom C3’ jednej pentozy z C5’ kolejnej). W ten sposób powstaje polarna nić, w której wyróżnić można koniec 5’
oraz 3’; na 5’-końcu obecna jest zazwyczaj wolna grupa hydroksylowa (rzadko ufosforylowana), a na 3’-końcu –
ufosforylowana (rzadko wolna). Sekwencję nukleotydów w cząsteczce kwasu nukleinowego, czyli jego strukturę
I-rzędową, podaje się zawsze w kolejności 5’→3’, chyba że zaznaczone jest inaczej.

W odpowiednich warunkach reszty fosforanowe dysocjują, co nadaje polinukleotydom ładunek

elektryczny. To z kolei umożliwia im wędrówkę w stałym polu elektrostatycznym, a przez to – rozdział metodą
elektroforezy (patrz punkt I-1-g).

b)

budowa przestrzenna i właściwości DNA

Badacze J. D. Watson i F. C. K. Crick wykazali, że DNA posiada strukturę II-rzędową w postaci

podwójnej prawoskrętnej helisy. Dwie nici polinukleotydowe występują jako wzajemnie splecione helisy,
oplatające linią śrubową wspólną oś długą.

•

W zależności od warunków środowiska, dwupasmowe DNA może występować w co najmniej 6
formach: A, B, C, D, E i Z, przy czym w warunkach fizjologicznych (niskie stężenia soli, wysoki
poziom uwodnienia) dominuje forma B.

W formie B szerokość helisy (odległość między atomami C1 danej zasady i zasady komplementarnej)
wynosi ok. 1,1 nm, skok p = 3,4 nm, ilość par zasad na skok n = 10, zatem odległość między
sąsiadującymi zasadami wynosi 3,4 : 10 = 0,34 nm, a ich wzajemne skręcenie: 360

o

: 10 = 36

o

.

Płaszczyzny pierścieni sąsiadujących ze sobą zasad są równoległe i występują między nimi tzw.
oddziaływania warstwowe. Pomiędzy warstwy te mogą wnikać różne inne cząsteczki, zaburzając
funkcjonowanie DNA, co pozwoliło na ich zastosowanie jako środki dezynfekcyjne (barwniki
akrydynowe, np. etakrydyna – Riwanol) lub leki cytostatyczne (p/nowotworowe). Obie helisy
rozdzielone są przez 2 różnej wielkości rowki – większy i mniejszy – stanowiące miejsca interakcji z
białkami, które mogą dzięki temu rozpoznawać i wiązać się ze swoistymi sekwencjami
nukleotydowymi bez potrzeby rozdzielania par zasad komplementarnych (por. punkt VIII-1-j).

Forma Z powstaje w warunkach zmniejszonego uwodnienia (hydratacji). Cechuje się rozsunięciem obu
nici i obecnością wolnej przestrzeni wewnątrz cząsteczki.

W formie E zaasdy nie występują w układzie osiowym, lecz niejako rozsuniętym.

- -

139

•

Ponieważ oba łańcuchy są prawoskrętne i polarne, muszą być przeciwbieżne, tzn. sekwencje atomów i
grup układają się w każdym z nich w kierunku przeciwnym. Pasmo biegnące w kierunku 5’→3’ określa
się jako kodujące, ponieważ koduje przekazywaną informację genetyczną (przekłada się na sekwencję
aa w kodowanym białku), drugie natomiast (3’→5’) – jako matrycowe, gdyż stanowi matrycę do
syntezy mRNA.

•

Grupy cukrowe i fosforanowe stanowią zewnętrzny szkielet, wijący się helikalnie, natomiast zasady
schowane są we wnętrzu cząsteczki, co chroni informację genetyczną i umożliwia oddziaływania
między zasadami. Każda zasada jednego łańcucha jest bowiem połączona kilkoma wiązaniami
wodorowymi z naprzeciw leżącą zasadą drugiego łańcucha. Ponieważ odległość między nićmi jest
stała, a wymiary zasad purynowych i pirymidynowych – różne, toteż wnioskować można, że wiązania
tworzą się między zasadą purynową jednego łańcucha a pirymidynową drugiego. Jednak skład pary
puryna – pirymidyna tworzącej wiązania nie jest dowolny, ograniczają go bowiem możliwości rotacji
wokół wiązań fosfodwuestrowych, preferencja konfiguracji anty wiązania N-glikozydowego oraz
dominacja określonych form tautomerycznych zasad azotowych (keto » enolo, amino » imino). Analiza
tych ograniczeń uzasadnia obserwację, że wiązania wodorowe tworzą się tylko między parami A i T
oraz G i C – z tego powodu zasady każdej z par określa się jako komplementarne (uzupełniające się). W
parze A-T jedno wiązanie powstaje między atomem N1 A a atomem wodoru przy N5 T, drugie zaś
między grupą aminową przy C6 A a grupą ketonową przy C4 T; obecne są więc dwa wiązania,
wzajemnie do siebie równoległe. Natomiast w parze G-C tworzą się 3 wiązania: jedno między atomem
wodoru przy N1 G a atomem N5 C, drugie między grupą ketonową przy C6 G a grupą aminową przy
C4 C oraz trzecie między grupą aminową przy C2 G a grupą ketonową przy C6 C. Obecność
dodatkowego wiązania wodorowego powoduje, ze siły utrzymujące parę G≡C są mocniejsze niż w
przypadku A=T. Następstwem komplementarności jest równa ilość uzupełniających się zasad w
cząsteczce DNA (A = T, a G = C), przez co w konsekwencji ilość puryn (A + G) jest taka sama jak
ilość pirymidyn (C + T). Natomiast stosunek A+T : G+C jest zmienny gatunkowo. Długość odcinka
DNA lub sparowanego RNA wyraża się podając ilość wchodzących w jego skład par zasad (ang. base
pairs – bp). Cały genom ludzki składa się z ok. 3 Gbp.

•

Denaturacja (topnienie) DNA polega na rozpleceniu podwójnej helisy i zmianie płaszczyzn
wzajemnego położenia zasad przy zachowaniu struktury I-rzędowej (sekwencji nukleotydów). Do
zmian w środowisku powodujących denaturację zaliczamy wysoką temperaturę i obniżenie stężenia
soli. Ponieważ różnie regiony DNA cechują się zróżnicowaną wrażliwością na czynniki denaturujące,
przez temperaturę topnienia (T

m

) DNA rozumie się średnią temperatur rozpoczęcia i zakończenia

rozplatywania DNA. Zależy ona od składu zasad DNA (ilość wiązań komplementarnych i
oddziaływania warstwowe decydują o tym, że regiony DNA o dużej zawartości par G≡C są bardziej
odporne na denaturację niż bogate w pary A=T), stężenia soli w roztworze oraz od obecności innych
substancji, np. formamid destabilizuje wiązania wodorowe i ułatwia denaturację. Denaturacji
towarzyszy spadek lepkości roztworu oraz tzw. efekt hiperchromiczny, polegający na zwiększeniu
absorpcji promieniowania UV przez zasady azotowe. Po powrocie do fizjologicznej temperatury i siły
jonowej następuje powrót do postaci natywej – renaturacja, czyli ponowne połączenie (reasocjacja)
rozdzielonych pasm komplementarnych lub tworzenie hybryd z cDNA lub mRNA, co wykorzystuje się
w analityce odpowiednio w metodach Southern- i Northern-blotting. Denaturację cieplną wykorzystuje
się również w technice PCR.

W niektórych niższych organizmach (bakterie, wirusy) DNA ma formę kolistą, co niweluje wolne końce

5’ i 3’. Taka cząsteczka może występować w postaci rozluźnionej albo silnie skręconej (gdy zajdzie skręcenie
wokół własnej osi bądź skręcenie linijnej cząsteczki o zakotwiczonych końcach). Proces dodatkowego skręcania
wymaga dostarczenia energii w ilości proporcjonalnej do stopnia skręcenia. Oznacza to, że cząsteczka
zawierająca dodatkowe skręty posiada zmagazynowaną w ten sposób energię, przez co łatwiej poddaje się
reakcjom endoergicznym (np. rozdzielaniu pasm niezbędnemu do replikacji i transkrypcji) i dzięki temu jest
preferowaną postacią w układach biologicznych. Zmiany stopnia skręcenia, tj. topologiczne zmiany DNA,
katalizowane są przez enzymy topoizomerazy – ich przykładem jest bakteryjna gyraza DNA, czerpiąca energię z
ATP w celu wprowadzania dodatkowych skrętów. Zablokowanie aktywności topoizomeraz uniemożliwia
podziały komórkowe, stąd zastosowanie ich inhibitorów jako chemioterapeutyki (chinolony) i cytostatyki
(kamptotecyna i jej pochodne).

- -

140

c)

budowa, właściwości i klasyfikacja RNA

W przeciwieństwie do DNA, kwas rybonukleinowy składa się z pojedynczego łańcucha

polinukleotydowego; istnieje tu tylko jeden wyjątek w postaci sekwencji palindromowych, zawierających ciągi
komplementarnych zasad o odwróconej polarności, które mogą ulegać parowaniu. Konsekwencją jednonicowej
budowy RNA jest nierówna ilość A i U oraz G i C (równość może zdarzyć się przypadkowo). Ponadto w RNA
tymina (T) zastąpiona jest przez uracyl (U), a pentozą jest ryboza – obecność grupy hydroksylowej przy atomie
C2’ cukru warunkuje wrażliwość RNA na hydrolizę zasadową, w wyniku której powstają cykliczne 2’,3’-
dwuestry nukleozydów. RNA powstaje w wyniku transkrypcji DNA – jest więc komplementarny do
matrycowego pasma źródłowego DNA i może z nim hybrydyzować (Northern-blotting). W komórce istnieje 5
klas RNA (mRNA, tRNA, rRNA, hnRNA i snRNA), różniących się wielkością, stabilnością i szczegółową rolą,
ale ogólną funkcją wszystkich z nich jest udział w biosyntezie białek.

Informacja z DNA przepisywana jest w procesie transkrypcji na informacyjny RNA (ang. messager RNA

– mRNA). W komórce może więc występować tyle rodzajów mRNA, ile genów posiada jej materiał genetyczny,
a więc u człowieka aż 30 tys. mRNA posiada stałą sedymentacji w granicach 18 – 30S i stanowi niewielką część
(5%) ogólnej puli RNA komórki. U Eucariota DNA jest wpierw przepisywane na heterogenny jądrowy RNA
(ang. heterogenous nuclear RNA – hnRNA), który następnie przechodzi proces składania, dając ostatecznie
dojrzałe mRNA. W składaniu RNA uczestniczy pomocniczo małocząsteczkowy jądrowy RNA (snRNA; ok. 10
rodzajów cząsteczek). Informacja z gotowego mRNA jest następnie przepisywana na sekwencję aa w
kodowanym białku w procesie translacji. To tego ostatniego niezbędne są dwa kolejne rodzaje RNA, tj.
rybosomalny (rRNA) oraz transportujący (tRNA). Istnieją tylko 4 rodzaje rRNA, jednak stanowią one aż 80%
komórkowego RNA. Wraz z odpowiednimi białkami współtworzą podjednostki rybosomalne (większą i
mniejszą), które złożone w całość dają kompletny rybosom. tRNA pełni funkcję pośredniczącą pomiędzy
sekwencją nukleotydów a sekwencją aa – ma budowę niejako dwubiegunową i może przyłączać oba te
elementy. Istnieje ok. 50 rodzajów tRNA, ta klasa ma jednak znikomy udział ilościowy w RNA komórki.

Pewne rodzaje RNA (rRNA, snRNA) wykazują wewnętrzną aktywność katalityczną (działają jak

enzymy), dlatego określa się je mianem rybozymów („rybonukleinowych enzymów”). Stanowi to fenomen
biochemiczny, ponieważ aktywność katalityczna jest cechą przypisywaną wyłącznie cząsteczkom białek.
snRNA pełni funkcje rybozymu w reakcjach endorybonukleolizy i transestryfikacji w procesie składania mRNA
(por. punkt VIII-3-c), zaś rRNA – w reakcji hydrolizy estru aminoacylowego w elongacji translacji (por. punkt
VIII-4-d).

d)

budowa chromatyny

W organizmach eukariotycznych niemal całość materiału genetycznego (DNA) znajduje się na terenie

jądra komórkowego, gdzie występuje w formie związanej z białkami jako chromatyna. Są to głównie białka
zasadowe – histony, resztę stanowią kwaśne i większe białka niehistonowe. W skład chromatyny wchodzi
również niewielka ilość RNA.

Histony to mała grupa blisko spokrewnionych ze sobą białek. Oznacza się je symbolami: H1, H2A, H2B,

H3 i H4. 2/3 cząsteczki począwszy od C końca zawiera zwykły skład aa, natomiast w 1/3 N-końcowej części
dominują aa zasadowe – w H2A i H2B jest to głównie Lys, a w H3 i H4 – Arg. Histon H1 jest najsłabiej
związany z chromatyną i daje się z niej łatwo usunąć roztworem soli, co pozwala na rozpuszczenie chromatyny.
Pozostałe rodzaje histonów wchodzą w skład rdzenia nukleosomów: H3 i H4 agregują w tetramer (H3/H4)

2

, a

H2A i H2B łączą się w dimer H2A/H2B, który może polimeryzować do form (H2A/H2B)

n

– fizjologicznie n=2,

czyli powstaje drugi tetramer. Oba tetramery asocjują, tworząc oktamer histonowy, który spontanicznie łączy się
z DNA, w wyniku czego powstaje nukleosom. Tworzenie struktury nukleosomu uwarunkowane jest obecnością
H3 i H4, zaś H2A i H2B stabilizują pierwotną cząsteczkę i wiążą 2 dodatkowe półskoki spirali DNA. Nić
polinukleotydowa owinięta jest wokół oktameru 1,75 x, co odpowiada odcinkowi 146 bp, natomiast
poszczególne nukleosomy oddzielone są od siebie odcinkami o długości ok. 30 bp. Dalsze upakowanie materiału
genetycznego zależy od interakcji histonów H1 z przyległymi nukleosomami. Większość komórkowego DNA
występuje właśnie w postaci nukleosomów, a cały genom ludzki zawiera ich ok. 17 mln. Preferencja
nukleosomów do pewnych regionów na szczególnych cząsteczkach DNA określana jest jako fazowanie.

Histony nukleosomów mogą podlegać 5 rodzajom modyfikacji kowalencyjnych, których znaczenie nie

zostało do końca poznane; są to:

•

acetylacja – w przypadku H3 i H4 jest to mechanizm regulacji transkrypcji genów,

•

fosforylacja – dodanie reszty {P} do H1 towarzyszy kondensacji chromosomów w czasie cyklu
replikacyjnego,

•

ADP-rybozylacja – związana jest z naprawą DNA,

•

kowalencyjne związanie z ubikwityną – tylko w przypadku H2A,

•

metylacja.

- -

141

Nukleoplazmina jest pentamerem kwaśnego białka, które nie wiąże się ani z DNA ani z chromatyną, lecz

ma zdolność odwracalnego oddziaływania z oktamerem histonowym, dzięki czemu zasadowe (kationowe)
histony nie przylegają nieswoiście do kwaśnych (anionowych) powierzchni takich jak DNA. Białko to utrzymuje
w jądrze komórkowym środowisko jonowe powodujące swoiste oddziaływania DNA z histonami i tworzenie
struktur nukleosomów. Po utworzeniu nukleosomów nukleoplazmina uwalnia się od histonów.

Strukturami wyższego rzędu od nukleosomów są nici chromatydowe 10 nm oraz 25-30 nm. Nić 10 nm

(stopień upakowania 1-10 x) składa się z nukleosomów ułożonych w taki sposób, że ich brzegi stykają się, a ich
płaskie powierzchnie leżą równolegle do długiej osi nici. Nić 10 nm jest dodatkowo skręcona, tworząc nić 30 nm
(upakowanie 40-60 x), zawierającą 6 – 7 nukleosomów na 1 skok. Zwoje tej spirali są dosyć płaskie, a płaskie
powierzchnie nukleosomów kolejnych skrętów są niemal równoległe. Nić 30 nm jest prawdopodobnie
stabilizowana przez histony H1.

Nici chromatyny mogą ulegać dalszemu zwinięciu w pętle (domeny), zakotwiczone w strukturze

szkieletowej (macierzy podporowej) jądra. Jedna domena obejmuje odcinek DNA o długości 30 – 100 kbp. W
ich obrębie określone sekwencje DNA mogą posiadać nieprzypadkowe ułożenie.

e)

chromatyna aktywna i nieaktywna

Pomimo faktu, iż każda komórka ludzkiego ustroju zawiera te same cząsteczki DNA, to poszczególne

komórki wykazują bardzo zróżnicowaną ekspresję genów. Jest to wynikiem różnic w aktywności
poszczególnych sekwencji DNA, okazuje się bowiem, że chromatyna zawiera fragmenty transkrypcyjnie
aktywne oraz nieaktywne.

Chromatyna aktywna – euchromatyna – występuje w postaci rozluźnionej, tzn. ma zmienioną lub

całkowicie zniesioną strukturę nukleosomalną. Zawiera duże (ok. 100 kbp) regiony wrażliwe na trawienie
nukleazą (np. DNAazą I), w obrębie których istnieją krótkie (100-300 bp) odcinki o wybitnie zwiększonej
(nawet 20x) wrażliwości, często położone bezpośrednio przed aktywnym genem. W powstawaniu miejsc
nadwrażliwych biorą udział białka uczestniczące w transkrypcji oraz zaangażowane w utrzymywanie dostępu do
pasma matrycowego.

Chromatyna nieaktywna – heterochromatyna – jest natomiast gęsto upakowana. Dzieli się ona na dwa

rodzaje. Heterochromatyna konstytutywna jest zawsze nieaktywna (upakowana), występuje w regionach w
pobliżu centromeru i w telomerach. Natomiast heterochromatyna fakultatywna może być przejściowo aktywna i
ulegać transkrypcji, przez resztę czasu będąc skondensowaną i nieaktywną. Jej przykładem jest drugi
chromosom X u kobiet, który kondensuje w tzw. ciałko Barra, ale ulega dekondensacji w okresie gametogenezy
i jest aktywny we wczesnej embriogenezie.

Chromatyna wykazuje największy stopień upakowania w stadium metafazy – wówczas występuje w

postaci chromosomów (u człowieka w licznie 2n = 46). Pętle chromosomów metafazowych posiadają
współczynnik upakowania ok. 8000x. Każdy chromosom składa się z dwóch identycznych (siostrzanych)
połówek, zwanych chromatydami – każda z nich stanowi pojedynczą cząsteczkę dwupasmowego DNA.
Chromatydy połączone są w centromerze – nazwanym tak, gdyż położony jest mniej więcej w połowie długości
chromosomów. Centromer ma długość ok. 130 bp i zawiera region bogaty w pary A=T, a wraz z licznymi
białkami tworzy kompleks zwany kinetochorą, do którego przyłącza się wrzeciono kariokinetyczne. Na końcach
każdego chromosomu obecne są telomery, złożone z wielokrotnie powtórzonej pojedynczej sekwencji bogatej w
T i G (u człowieka: 5’-TTAGGG-3’). Telomery ulegają skracaniu wraz z każdym podziałem komórki, co
warunkuje ich żywotność. W niektórych komórkach istnieje odtwarzający je enzym – telomeraza; obecność
telomerazy w komórkach nowotworowych warunkuje ich nieśmiertelność.

f)

sekwencje powtarzające; mutacje dynamiczne; konwersja genu

Duża część ludzkiego (i innych ssaków) genomu występuje w nadmiarze – większość posiadanego przez

nas DNA nie niesie informacji i nie ulega ekspresji. Całość DNA można zatem podzielić na sekwencje
unikatowe (nie powtarzające się, złożone z pojedynczych kopii genów kodujących białka) oraz sekwencje
powtarzające (2 – 10 mln kopii w każdej komórce), stanowiące 20 – 30 % genomu. Te ostatnie dzielą się na
sekwencje umiarkowanie oraz często powtarzające.

•

Sekwencje często powtarzające składają się z odcinków długości 5 – 500 bp, powtarzanych
wielokrotnie w postaci tandemu. Są one zgrupowane w centromerach i telomerach, występują w liczbie
1 – 10 mln kopii, są nieaktywne transkrypyjnie i mogą pełnić funkcje strukturalne.

•

Sekwencje umiarkowanie powtarzające występują w mniejszej liczbie (< 1 mln kopii) i nie są
zgrupowane, lecz rozproszone wśród sekwencji unikatowych. Mogą ulegać transkrypcji przez
polimerazę RNA II i posiadać czapeczki metylacyjne. Dzielą się na długie (LINEs – 6-7 kbp, 20-50 tys.
kopii) oraz krótkie (SINEs 70-300 bp, ≥ 100 tys. kopii). Prawdopodobnie są one retropozonami, tj.
sekwencjami powstałymi wskutek transpozycji oraz utworzonymi za pośrednictwem RNA i odwrotnej

- -

142

transkryptazy. Przykładem SINE jest rodzina sekwencji Alu, występująca w liczbie ½ mln kopii, a
której przedstawiciele wykazują zdolność poruszania się w obrębie genomu.

Sekwencje powtarzające istnieją w formie rozproszonej lub zgrupowanych tandemów sekwencji

mikrosatelitarnych – długości 2-5 bp, ok. 50 powtórzeń, najczęściej AC na jednym paśmie i TG na drugim,
zlokalizowane w ok. 50 – 100 tys. miejsc w genomie. Heterozygotyczność pod względem liczby kopii
poszczególnych sekwencji mikrosatelitarnych, czyli inaczej mówiąc – istnienie różnej ilości powtórzeń na
dwóch chromosomach homologicznych, jest cechą dziedziczną. Mnogość i łatwość wykrywania tych sekwencji
metodą PCR czyli z nich użyteczne narządzie diagnostyczne – większość genów towarzyszy bowiem co
najmniej jednemu markerowi satelitarnemu, przez co można oznaczyć ich położenie (mapy sprzężeń), a ponadto
można badać polimorfizm mikrosatelitarny u dużej liczby spokrewnionych osób. Mutacje dynamiczne, głównie
zwiększenie liczby powtórzeń sekwencji trójnukleotydowych, czyli niestabilność sekwencji mikrosatelitarnych,
jest przyczyną wielu chorób, m. in. zespołu łamliwego chromosomu X (powtórzenia CGG), choroby
Huntingtona (CAG), dystrofii miotonicznej (CTG), atrofii mięśniowej rdzeniowo – opuszkowej (CAG) czy
choroby Kennedy’ego (CAG).

Konwersja genu to ujednolicenie sekwencji składowych rodzin powtarzającego DNA w wyniku

przypadkowego utrwalenia jednego z ich wariantów. Sytuacja taka ma miejsce, gdy podobne sekwencje na
chromosomach homologicznych nieprzypadkowo wytwarzają między sobą sparowane struktury dwupasmowe i
eliminują wszystkie sekwencje niesparowane.

g)

rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych

Materiał genetyczny może ulegać rearanżacji, m. in. drogą rekombinacji chromosomalnej, czyli równej i

wzajemnej wymiany fragmentów chromosomów homologicznych (ang. crossing-over – dosłownie:
przechodzenie na drugą stronę). Zjawisko to zachodzi w stadium pachytenu profazy I mejozy. Jeżeli osobnik jest
heterozygotą względem genu położonego w odcinku podlegającym rekombinacji, wówczas mogą pojawić się
zauważalne i dziedziczne różnice w sprzężeni genów. Z kolei przy niedokładnym ułożeniu chromosomów może
dochodzić do nierównej wymiany materiału – tzw. nierównego crossing-over. Oddziałuje to na tandemową
organizację powtarzających sekwencji DNA i może zmienić liczbę kopii rodziny takich sekwencji.

Wymiana chromatyd siostrzanych to proces rekombinacji, zachodzący między identycznymi

chromatydami w tetraploidalnych komórkach, które zakończyły fazę S cyklu komórkowego. Są one identyczne,
ponieważ są produktami semikonserwatywnej replikacji wspólnej macierzystej cząsteczki DNA. Wymiana
chromatyd siostrzanych nie niesie ze sobą żadnych konsekwencji genetycznych tak długo, jak nie dochodzi do
nierównego crossing-over.

h)

gen i jego ekspresja; genom

Gen jest podstawową jednostką informacji genetycznej. Dokładna definicja genu ulegała wielokrotnej

modyfikacji. Pierwotnie, zanim poznano budowę i rolę DNA, przez gen rozumiano czynnik determinujący
występowanie u organizmu określonej cechy. Później, gdy odkryto że DNA niesie informacje o strukturze
białek, genem nazywano odcinek DNA kodujący strukturę pojedynczego białka. Ponieważ jednak wykazano
istnienie białek złożonych z kilku podjednostek, kodowanych przez odmienne geny, toteż współcześnie przez
gen rozumie się fragment DNA kodujący jeden łańcuch polipeptydowy.

Ekspresja (dosłownie: wyrażanie) genu to proces tłumaczenia zawartej w nim (w postaci sekwencji

nukleotydów) informacji na strukturę I-rzędową nowo biosyntetyzanego białka (czyli sekwencji występujących
w tym białku aa). Ekspresja genu jest bardzo złożona pod względem biochemicznym, można ją podzielić na 2
etapy. W pierwszym, zwanym transkrypcją, sekwencja dezoksyrybotydów DNA przepisywana jest na sekwencję
rybotydów RNA – zazwyczaj mRNA. Innymi słowy na matrycy w postaci jednego z pasm DNA (z tego właśnie
powodu określanego jako matrycowe) syntetyzowana jest nowa cząsteczka RNA. Produkt transkrypcji (RNA)
stanowi jednocześnie substrat dla drugiego etapu – translacji, w którym z kolei sekwencja rybotydów RNA
przekładana jest na sekwencję aa w powstającym białku. Przez analogię do powyższego – na matrycy RNA
(również nazywanego matrycowym – stąd mRNA) biosyntetyzowane jest nowe białko. Cząsteczki mRNA
stanowią zatem w tym łańcuchu pośrednie ogniwo. Ekspresja genów podlega złożonej regulacji.

Genomem nazywamy całość materiału genetycznego, jaki posiada każda komórka organizmu. U niższych

organizmów genom stanowi pojedyncza, zamknięta cząsteczka DNA, u wyższych natomiast DNA podzielone
jest na duże odcinki, z których każda ulega upakowaniu w jeden chromosom. Można więc powiedzieć, że genom
to inaczej pojedynczy (haploidalny) zestaw chromosomów (przykładowo u człowieka liczący n = 23
chromosomy). Genom ludzki zawiera ok. 30 tys. genów, tzn. znajduje się w nim informacja o budowie takiej
liczby łańcuchów polipeptydowych. Genom to jednak więcej niż zbiór wszystkich genów, występuje w nim
bowiem jeszcze duża ilość tzw. materiału międzygenowego – nie ulegającego tłumaczeniu na strukturę białek,
lecz pełniącemu funkcje strukturalne i regulacyjne.

- -

143

i)

transpozony; geny przekształcone

W komórkach eukariotycznych istnieją małe elementy DNA – tzw. „skaczące DNA” – zdolne do

transpozycji, czyli zmiany swojego położenia w obrębie genomu bez zaburzania funkcji sąsiednich sekwencji
DNA. Dowodem na ich istnienie jest obecność genów przekształconych, tj. złożonych z sekwencji DNA
identycznych lub bardzo podobnych do mRNA kodującego produkt odpowiedniego genu. W genach tych
nietranskrybowany region 5’-końcowy, fragment kodujący pozbawiony intronu oraz 3’-końcowa sekwencja
poliadenylowa ułożone są w sposób ciągły. Jedynym wyjaśnieniem tego zjawiska jest wsteczna transkrypcja
mRNA do DNA na zasadzie transpozycji. Znane są geny przekształcone m. in. dla cząsteczek immunoglobulin,
α-globuliny i innych. Pseudogeny to geny przekształcone, które w przebiegu ewolucji zostały tak zmienione, że
zawierają kodony nonsensowne (por. punkt VIII-4-d – termiacja translacji), uniemożliwiające ich ekspresję.

j)

motywy funkcjonalne białek wiążących się z DNA

Wiele białek, m. in. regulatorów transkrypcji, musi wiązać się do określonych sekwencji DNA z wysokim

powinowactwem, wykazując jednocześnie niewielkie do innych. Umożliwiają im to trzy unikatowe motywy
funkcjonalne: helisa-skręt-helisa, palec cynkowy i zamek leucynowy. W bezpośredni kontakt z DNA wchodzą
jedynie niewielkie regiony tych białek, zawierające powyższe motywy, pozostałe części cząsteczek odpowiadają
za dimeryzację i stabilizację. Białka te wiążą się kooperatywnie do kilku miejsc w obrębie DNA, a kontakt
białko-DNA utrzymywany jest dzięki wiązaniom niekowalencyjnym – wodorowym i van der Waalsa.

Motyw helisa-skręt-helisa (ang. helix-turn-helix) występuje u ssaków w białkach homeobox (por. geny

homeotyczne) i pou, jak również u organizmów prymitywnych, np. w represorze Cro bakteriofaga λ. Monomer
białka Cro składa się z trzech przeciwrównoległych płaszczyzn β (1 – 3) oraz trzech α-helis (1 – 3). Elementem
bezpośrednio rozpoznającym i wiążącym się do powierzchni DNA jest helisa α

3

. Średnia szerokość α-helisy

wynosi 120 nm, co odpowiada mniej więcej szerokości większego rowka DNA w formie B. Motyw helisa-skręt-
helisa powstaje w ten sposób, że helisy α

2

i α

3

są utrzymywane pod kątem 90

o

przez skręt 4 aa. Dwa monomery

białka Cro asocjują przez zwinięcie antyrówoległych płaszczyzn β

3

w dimer o podwójnej osi symetrii. Reszta

cząsteczki odpowiada głównie za jej stabilizację. Domena rozpoznająca DNA każdego monomeru oddziałuje z
nim na odcinku 5 bp. Cały odcinek DNA przyłączający białko zawiera sekwencje palindromowe i ma długość
340 nm – odpowiada to długości jednego kompletnego zwoju podwójnej helisy DNA, przez co umożliwia
dopasowanie kolejnych półskrętów w rowku większym na tej samej powierzchni.

Motyw palca cynkowego (ang. zinc finger) występuje u ssaków m. in. w rodzinie receptorów steroidowo

– tarczycowych oraz w białku Sp1. Palce cynkowe stanowią serię powtórzonych domen (2 – 9 x), z których
każda osadza się na atomie cynku w postaci tetraedralnej konformacji. Atom ten związany jest przez 2 kolejne
reszty Cys, następnie obecna jest sekwencja 12 – 13 aa, po czym znów występują 2 reszty Cys (np. w THIIIA)
lub 2 reszty His (np. w rodzinie receptorów steroidowo – tarczycowych) – atom cynku jest więc umocowany do
białka czterema wiązaniami. Białka zawierające taki motyw wiążą się do jednej płaszczyzny helisy DNA, a
kolejne palce ułożone są naprzemiennie w obrębie dużego skrętu w dużym rowku, oddziałując na odcinku 5 bp.
Mutacja pojedynczego aa w jednym z dwóch palców cynkowych receptora dla 1,25(OH)

2

D

3

powoduje krzywicę

typu II.

Motyw zamka leucynowego (ang. leucine zipper) występuje w wielu ssaczych białkach regulatorowych –

C/EBP, Fos, Jun/Ap1, c-myc, n-myc, l-myc. Występuje w postaci 30-aa sekwencji α-helikalnej, w której reszty
Leu powtarzają się w stałej odległości 7 aa, przez co znajdują się po jednej stronie helisy w ułożeniu liniowym.
Organizacja taka obejmuje 8 helikalnych skrętów i 4 powtarzające się reszty Leu. Prawdopodobnie struktura ta
pozwala na połączenie monomerów białkowych w homo- (np. Jun*Jun) lub heterodimery (Jun*Fos), podobnie
jak zamek błyskawiczny. Zamek leucynowy, w przeciwieństwie do dwóch poprzednich motywów, bierze więc
udział w interakcjach typu białko-białko, które wzmacniają oddziaływania poszczególnych pojedynczych domen
z docelowymi sekwencjami DNA. Tak struktura wydaje się niezbędna do utrzymania domen wiążących DNA
każdego monomeru w odpowiedniej konformacji, umożliwiającej właściwe wiązanie.

2.

Replikacja i naprawa DNA; cykl komórkowy i jego regulacja

Replikacja (duplikacja, kopiowanie) DNA jest procesem syntezy nowej cząsteczki DNA, identycznej z

już istniejącą. W jej wyniku ilość materiału genetycznego komórki ulega podwojeniu. Do replikacji dochodzi w
fazie S interfazy, czyli okresu poprzedzającego podział komórki (por. dalej). Skopiowanie materiału
genetycznego jest bowiem niezbędne, jeżeli każda z dwóch komórek potomnych ma zawierać identyczny i
kompletny genom.

Replikacja zachodzi wg modelu semikonserwatynego (dosłownie: pół-konserwatywnego; autorzy:

Messelson i Stahl). Substratem jest macierzysta cząsteczka dwupasmowego DNA (ang. double-stranded DNA –
dsDNA), a każde jej pasmo służy do syntezy nowego. W rezultacie powstają dwie identyczne cząsteczki DNA, z

- -

144

których każda zawiera jedną nić macierzystą („starą”) oraz jedną nowo zsyntetyzowaną („nową”) – stąd nazwa
modelu.

Replikacja jest procesem złożonym, przebiegającym w trzech etapach – inicjacji (rozpoczęcia), elongacji

(wydłużania) oraz terminacji (zakończenia). Bierze w nim udział szereg enzymów: polimerazy, helikazy,
topoizomerazy, białka SSB, primaza i ligaza, z czego najważniejsza jest polimeraza DNA, wykazująca liczne
aktywności katalityczne. Chociaż replikowana jest cząsteczka dwuniciowa, to pojedyncza polimeraza DNA
kopiuje jednocześnie tylko jedno pasmo, wymaga zatem do pracy DNA jednoniciowego (ang. single-stranded
DNA – ssDNA).

a)

inicjacja

Inicjacja replikacji rozpoczyna się odnalezieniem w obrębie DNA miejsca, od którego ma się ona zacząć,

określanego jako ori (od ang. origin – początek). Organizmy prokariotyczne posiadają tylko jedną, kolistą
cząsteczkę DNA i w związku z tym jeden punkt początku replikacji. U bakterii E. coli jest to ori C, natomiast u
bakteriofaga λ – ori λ. U ssaków natomiast istnieje wiele miejsc rozpoczęcia replikacji, zgrupowanych po ok.
100. Proces przebiega w obu kierunkach wzdłuż chromosomu i oba pasma replikowane są jednocześnie. W
wyniku tego powstają tzw. bańki replikacyjne. Zgrupowania przyległych miejsc rozpoczynają replikację w
sposób zsynchronizowany, co przemawia za obecnością mechanizmów regulacji czasowo – przestrzennej – być
może funkcjonalne domeny chromatyny replikują się jako pełne jednostki.

Bakteryjny ori C ma długość 145 bp i zawiera kilka charakterystycznych konserwatywnych sekwencji. Po

pierwsze zawiera 4 sekwencje powtarzalne o odwrotnej orientacji (←→←→), długości 9 nukleotydów i
składzie: 5’-TTATNCANA-3’, gdzie N oznacza dowolny nukleotyd, po drugie – 3 sekwencje powtarzalne o
jednakowej orientacji (→→→), długości 13 nukleotydów i składzie: 5’-GATCTNTTNTTTT-3’. Duża
zawartość par A=T w tych odcinkach ułatwia rozdzielenie pasm (por. dalej). Do sekwencji typu powtarzalnego
wprost (ang. direct repeats) asocjują swoiste białka wiążące: u E. coli 4 cząsteczki białka dna A przyłączają się
do 4 sekwencji 9-nukleotydowych, zaś u faga λ 4 cząsteczki białka O łączą się z analogicznymi odpowiednimi
sekwencjami w obrębie ori λ. Do białek tych dołączają się kolejne, tak iż powstaje kompleks DNA długości 150
– 200 bp oraz multimerów białkowych w liczbie ok. 40. Do takiego kompleksu, określanego na tym etapie jako
zamknięty, dołączają się bakteryjne czynniki HU, FIS i IHC. Dla porównania: u drożdży obecne są
autonomiczne sekwencje replikujące (ARS), zawierające odcinki zwane elementami początku replikacji (ORE) o
długości 11 bp, zlokalizowane w regionie przyległym do sekwencji bogatej w pary A=T o długości 80 bp – ten
ostatni to tzw. rozplatający element DNA (DUE); do ORE przyłączają się białka analogiczne do dna A, tworząc
kompleks początku replikacji (ORC). Niezależnie od organizmu (wirus – fag, bakteria – E. coli, grzyb –
drożdże) powyższe zabiegi mają na celu rozdzielenie pasm podwójnej helisy DNA, bowiem tylko pojedyncza
nić stanowi substrat replikacji.

Następnym etapem jest rozdzielnie na krótkim odcinku struktury podwójnej helisy z wyodrębnieniem

pojedynczego pasma (ssDNA). Dzięki interakcjom między samymi białkami oraz między białkami i DNA, ten
ostatni owija się wokół kompleksu białkowego, aż komplementarne wiązania stabilizujące zaczynają pękać,
począwszy od sekwencji 13-nukleotydowej. Miejscowa denaturacja DNA umożliwia powstanie kompleksu
otwartego, oczka i widełek replikacyjnych. Do kompleksu otwartego przyłącza się helikaza DNA – u E. coli jest
to białko dna B, transportowane przez białko dna C. Heksamer proteinowy (dna B)

6

.

(dna C)

6

wprowadzony

zostaje do widełek replikacyjnych, po czym ulega rozpadowi – białko dna C odchodzi, zabierając ze sobą
niepotrzebne już białko dna A. Aby nie doszło do przedwczesnej renaturacji DNA do formy dwupasmowej, do
każdej z nici przyłącza się stabilizujące ją białko wiążące jednopasmowy DNA (ang. single-staranded DNA
binding protein – SSB). Ponieważ obie nici są nie tylko wzajemnie połączone, ale i skręcone w przestrzeni,
zatem dsDNA musi ulec rozkręceniu – potrzebne jest do tego wykształcenie struktury obrotowych widełek,
katalizowane przez topoizomerazy DNA (np. bakteryjna gyraza DNA – nazwa od łac. gyrus – zwój, zakręt).
Enzymy te wprowadzają tymczasowe przerwy w jednym pasmie, umożliwiając obrót widełek i likwidację
naprężeń, po czym przerwy są spajane. W nacinanym miejscu tworzy się wiązanie wysokoenergetyczne między
enzymem a resztą 5’-fosforanową wolnego końca DNA, dzięki czemu reakcja spajania nie wymaga nakładu
energii (w przeciwieństwie do spajania DNA przez ligazy). Topoizomerazy mają również zdolność rozkręcania
struktur wyższego rzędu kolistych cząsteczek DNA, np. skręconych wokół własnego środka (tzw. superzwinięt
DNA). W medycynie stosuje się inhibitory topoizomeraz – por. punkt VIII-1-b.

U E. coli zakażonej fagiem λ białko P faga wiąże białka dna B, po czym kompleks P/dna B oddziałuje z

białkiem O i wiąże się do ori λ. Następnie 3 białka szoku cieplnego (dna K, dna J i Grp E) zabierają dna B z
kompleksu P/dna B/O i aktywują je, co pozwala na rozplecenie DNA. W ten sposób w zakażonej komórce
bakteryjnej replikacji ulega materiał genetyczny faga, a nie bakterii.

- -

145

b)

elongacja

Przygotowane w powyższy sposób oczko replikacyjne jest gotowe do elongacji, polegającej na właściwej

biosyntezie pasm komplementarnych. Ze względu na fakt, że polimeraza DNA ma zdolność jedynie przyłączania
nukleotydów do już istniejącego pasma, a nie rozpoczynania synezy de novo, enzym primaza (u E. coli – białko
dna G) syntetyzuje krótkie (10 – 200 nukleotydów) starterowe sekwencje komplementarnego RNA – primery –
posiadające wolną grupę 3’.

Polimeraza DNA syntetyzuje nowe siostrzane pasmo, komplementarne do macierzystego, używając jako

substratów trójfosforanów odpowiednich dezoksyrybotydów (dNTP). Reakcja przebiega w ten sposób, że
nukleofilowa grupa 3’OH primera atakuje grupę α-fosforanową pierwszego NTP z odszczepieniem
pirofosforanu (PP

i

). Następnie grupa 3’OH ostatnio przyłączonego monofosforanu dezoksyrybotydu (dNMP)

atakuje następny dNTP, odszczepiając PP

i

itd. Wybór odpowiedniego dNTP, tj. tego, którego grupa α-

fosforanowa zostanie zaatakowana, zależy od odpowiedniego parowania z siostrzanym pasmem DNA, zgodnie z
zasadami komplementarności. W ten sposób stale rosnące pasmo stale ulega wydłużeniu.

Replikacja obydwu rozdzielonych pasm zachodzi jednocześnie, choć asymetrycznie, bowiem nici są

antyrównoległe (przeciwbieżne), a polimeraza DNA katalizuje wydłużanie nici jedynie w kierunku 5’→3’.
Wobec tego jedno z pasm (tzw. wiodące, prowadzące, liderowe) replikowane jest normalnie w sposób ciągły w
kierunku 5’→3’, drugie zaś (tzw. opóźnione, wsteczne) – również w stronę 5’→3’, lecz skokowo („po
kawałku”), tak że za każdym razem dobudowywany jest komplementarny odcinek o długości 1 – 5 tys.
nukleotydów, zwany fragmentem Okazaki. Helikaza, działając na nici opóźnionej, rozwija dsDNA w stronę
5’→3’, a towarzysząca jej primaza syntetyzuje primery na paśmie opóźnionym; taki ruchliwy kompleks primazy
i helikazy nosi nazwę primosomu. Po ukończeniu syntezy fragmentu Okazaki polimeraza odłącza się, a primaza
wstawia nowy primer, po czym ta sama cząsteczka polimerazy syntetyzuje kolejny fragment Okazaki itd.
Synteza przebiega wówczas w kierunku tylnego końca poprzedzającego primera RNA, a nie w kierunku
niezreplikowanej części cząsteczki. Określa się to połowiczną nieciągłą biosyntezą DNA. Gdy powstanie
odpowiednia ilość fragmentów Okazaki, kompleks replikacyjny usuwa primery RNA, uzupełnia powstałe po
nich ubytki odpowiednimi dezoksyrybotydami oraz łączy ze sobą nowo zsyntetyzowane fragmenty – to ostatnie
katalizują ligazy DNA. Podczas gdy w jądrach ssaków większość primerów jest usuwana, w mitochondriach
małe odcinki RNA pozostają jako integralna część zamkniętych kolistych struktur DNA.

U Eucariota chromosomy nie jest koliste, lecz liniowe, w związku z czym posiada wolne końce –

telomery. Ponieważ polimeraza funkcjonuje tylko w jednym kierunku, sekwencja związana z primerem
najbliższym telomerowi nie ulega replikacji – jest to tzw. problem replikacji końca. W efekcie każdemu
podziałowi komórki towarzyszy pewne skrócenie chromosomu, co jest przyczyną starzenia się komórki i
ogranicza jej żywotność. Ma to swoje pozytywne aspekty, gdyż zmniejsza ryzyko rozwoju procesu
nowotworowego, polegającego na ciągłych i niekontrolowanych podziałach komórek (proliferacji). Komórki
intensywnie dzielące się (embrionalne i komórki pnia) posiadają natomiast telomerazę, enzym
rybonukleoproteinowy (RNP) dobudowujący brakujące końce nici opóźnionej. Jej integralna cząsteczka RNA
zawiera sekwencję bogatą w C, która funkcjonuje jako matryca dla nici wiodącej, do której dobudowywane są
sekwencje telomerowe. Następnie primaza syntetyzuje primer na nici opóźnionej, polimeraza DNA odtwarza
odpowiedni fragment, po czym primer jest wycinany. W efekcie powstaje nowy ubytek, jednak w obrębie
telomeru, a nie obszaru strukturalnego (zawierającego geny). Aktywność telomerazy zmniejsza się wraz z
wiekiem. W większości komórek somatycznych jest ona zablokowana, reaktywuje się natomiast w komórkach
nowotworowych (85 – 95 % nowotworów ludzkich), które mogą cechować się nawet jej podwyższoną
aktywnością, co ma znaczenie diagnostyczne.

Zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych występuje kilka typów polimeraz,

pełniących trojakiego rodzaju funkcje. Po pierwsze – wydłużają pasmo, czego miarą jest szybkość wstawiania
komplementarnych nukleotydów [nukleotydy/s]. Po drugie – reprodukują sekwencję, co odpowiada liczbie
nukleotydów dodanych do nici przed odejściem polimerazy od matrycy [Mb/cykl]. Po trzecie – identyfikują i
korygują błędy (tylko u Procariota – por. dalej). U E. coli największe znaczenie i najwyższe parametry replikacji
posiada dekameryczna (10 podjednostek, > 1 MDa) polimeraza DNA III (replikaza; białko dna E). Jej
holoenzym wiąże się z DNA jako część wielobiałkowego kompleksu, w skład którego wchodzą różne czynniki
pomocnicze: β, γ, δ, δ’ i τ. Dwie identyczne podjednostki otaczają matrycę, pozwalając polimerazie na stabilny
ruch. Polimeraza DNA II zajmuje się głównie identyfikacją i naprawą błędów replikacji, a polimeraza DNA I
uzupełnia przestrzenie między fragmentami Okazaki. W organizmach eukariotycznych polimeraza DNA α
(odpowiednik I) wypełnia przerwy i syntetyzuje pasmo opóźnione, δ (odpowiednik III) – reprodukuje oraz
syntetyzuje pasmo prowadzące (wiodące), zaś polimerazy β, ε i γ (odpowiadają II) identyfikują błędy (ε),
naprawiają DNA (β i ε) oraz syntetyzują mitDNA (γ). W komórkach ssaków polimeraza działa ok. 10 x wolniej
(wstawia kilkaset nukleotydów/s) niż u Procariota (kilkanaście tysięcy nukleotydów/s), co może wynikać z
nawinięcia DNA na histony, czyli obecności nukleosomów. Jednak obecność wielu miejsc inicjacji powoduje, że
ogólna sprawność procesu jest wyższa u Eucariota.

- -

146

c)

terminacja

W kolistym genomie E. coli miejsce terminacji położone jest naprzeciwko ori C i ma długość ok. 600 bp.

Występują tam 4 sekwencje terminalne ter, do których przyłączają się białka ter A – D. Jeżeli polimerazy
przesuwają się w oczku replikacyjnym zgodnie z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, to przechodzą przez
punkty A i D, a zatrzymują się w B i C, jeżeli zaś przeciwnie do ruchu wskazówek, to odwrotnie. Dzięki temu
zatrzymanie polimeraz odbywa się w odpowiednim miejscu. Rozplecione pasma schodzą się, a dwie potomne
cząsteczki DNA – rozdzielają. U Eukariota następuje odtwarzanie struktury chromatyny: nowo zreplikowany
DNA jest szybko organizowany w nukleosomy, a oktamery histonów rozmieszczają się na każdy ramieniu
widełek replikacyjnych.

d)

regulacja replikacji i cykl komórkowy

Replikacja zachodzi w fazie S (tzw. okres syntezy) cyklu komórkowego. Znacznie wzrasta wówczas ilość

polimerazy DNA oraz enzymów syntetyzujących substraty replikacji, tj. trójfosforany nukleotydów. Faza
syntezy (S) oddzielona jest od fazy podziału (M) przez okresy przerw (ang. gap) – G

1

i G

2

. Komórka nie

dopuszcza do biosyntezy DNA poza okresem, kiedy przygotowuje się do podziału. Przejście komórki z jednej
fazy do drugiej uwarunkowane jest obecnością odpowiednich białek, zwanych cyklinami – nazywanych tak,
ponieważ ich poziom koreluje z fazami cyklu i podlega cyklicznym zmianom. Cykliny aktywują z kolei kolejną
grupę białek – kinazy zależne od cyklin (ang. cyclin-dependent kinases – CDK), które z kolei fosforulują
substraty odpowiedzialne za przebieg cyklu. Główne cykliny to A, B, D

1-3

i E (istnieją również F, K, H, L i T,

ale mają mniejsze znaczenie); CDK oznacza się numerami 1 – 11.

•

Poziom cykliny D wzrasta pod koniec fazy G1, przez co komórka przekracza punkt startowy (drożdże)
lub restrykcyjny (ssaki), wkraczając nieodwracalnie w fazę S. Cykliny D aktywują CDK 4 i 6,
występując z nimi we wspólnym kompleksie, który wykazuje aktywność kinazy Ser/Thr. Jednym z jego
substratów jest białko Rb (nazwa pochodzi od pewnego nowotworu siatkówki – retinoblastoma), które
wiąże i inaktywuje czynnik transkrypcyjny E2F, niezbędny do przejścia G

1

→S. Fosforylacja Rb przez

CDK4/6 uwalnia czynnik E2F od Rb, umożliwiając progresję cyklu.

•

Cyklina E i CDK 2 tworzą kompleks w późnej fazie G

1

. Cyklina E ulega degradacji, zaś uwolniona

CDK 2 wiąże się z cykliną A. Taka sekwencja zdarzeń jest krytyczna dla rozpoczęca syntezy DNA w
fazie S.

•

Cyklina B i CDK 1 regulują przejście fazowe G

2

→M, czyli wejście komórki w fazę podziału.

Wydzielanie cyklin w nieodpowiedniej ilości lub czasie może zaburzać cykl komórkowy. Przykładowo

onkogen bcl, związany z chłoniakiem typu B, koduje cyklinę D

1

.

e)

naprawa DNA

Źródłami uszkodzeń materiału genetycznego są błędy procesu replikacji oraz działanie czynników

zewnętrznych – fizycznych i chemicznych.

Warunkiem poprawności i dokładności replikacji DNA jest swoiste parowanie nukleotydów, zależne od

obecności preferowanych postaci tautomerycznych zasad azotowych. Faworyzowanie odpowiednich zasad
zapewnione jest przez system dwukrotnego monitorowania ich parowania – pierwszy raz w trakcie włączania
trifosforanów dezksyrybotydów oraz drugi raz przy ponownej kontroli (i ewentualnie naprawie). Dzięki temu
pomyłki spowodowane błędnie wstawioną zasadą zdarzają się nie częściej niż 1 : 10

8–10

.

U organizmów prokariotycznych, jak E. coli, elementem monitorującym jest aktywność egzonukleazy

3’→5’, jaką wykazuje sama polimeraza DNA II. U ssaków funkcje te zostały przejęte przez inne systemy
enzymatyczne. Mechanizmy naprawy DNA są skuteczne w przypadku uszkodzenia tylko jednego pasma
dsDNA.

Umowna klasyfikacja uszkodzeń DNA:

•

zamiana 1. zasady: depuryncja, deaminacja C→U lub A→H, alkilacja zasady, insercja lub delecja
nukleotydu, inkorporacja (włączenie) analogu zasady,

•

zamiana 2. zasad: dimery tymidynowe (indukowane UV), wiązania poprzeczna dwufunkcyjnym
czynnikiem alkilującym,

•

pęknięcie łańcucha: pod wpływem promieniowania jonizującego, rozpad wiązań fosfodwuestrowych
pod wpływem radioaktywności,

•

wiązania poprzeczne: między zasadami tego samego pasma lub pasm przeciwległych, między DNA a
białkami (np. histonami).

- -

147

Wyróżnia się 4 mechanizmy naprawy DNA: przez naprawę niesparowanych zasad, przez wycięcie

zasady, przez wycięcie nukleotydu oraz naprawę pęknięć dwupasmowych.

•

Naprawa niesparowanych zasad (ang. mismatch repair – MMR) – koryguje błędy replikacji, powstałe
np. w wyniku poślizgu lub zacięcia polimerazy, w postaci nadmiarowego wstawienia pojedynczej
zasady lub obecności pętli z kilku (2-5) niesparowanych nukleotydów. Nowo zsyntetyzowany odcinek
DNA jest przeszukiwany od kątem błędów; punkt orientacyjny stanowi zmetylowana adenina w
sekwencji GATC. Jeżeli znaleziona zostanie niesparowana zasada lub mała pętla nukleotydowa,
wówczas endonukleaza GATC przecina w odpowiednim miejscu pasmo zawierające mutację, następnie
egzonukleaza trawi pasmo i usuwa zmutowaną sekwencję, a ostatecznie ubytek wypełniany jest
komplementarymi zasadami dzięki aktywnościom polimerazy, SSB i ligazy. U E. coli do rozpoznania i
przecięcia potrzeba 3 białek (Mut S, C i H), u ssaków zaś aż 6. Zaburzenie tego mechanizmu ma udział
w patogenezie dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego (HNPCC). Zaburzenia dotyczą tu
genów hMSH2 (na chromosomie 6, odpowiednik bakteryjnego Mut S) oraz hMLH1 (odpowiednik Mut
L); w ich wyniku powstają dysfunkcje enzymów naprawczych, co powoduje wydłużenie sekwencji
mikrosatelitarnych, co z kolei zaburza funkcje białek krytycznych dla nadzoru cyklu komórkowego w
nabłonku jelita grubego.

•

Naprawa przez wycięcie zasady odwraca m. in. skutki depurynacji. Wiązanie N-glikozydowe, łączące
reszty cukrowe i zasad azotowych, jest wrażliwe na działanie temperatury (termolabilne). W komórkach
dochodzi więc stale do jego rozbijania i pozbawiania nukleotydów zasad purynowych, co jest
jednoznaczne z utratą niesionej przez nie informacji. Depurynacja w temperaturze 37

oC

zachodzi w

tempie 5 – 10 tys. w każdej komórce w ciągu doby. Miejsca depurynacji są rozpoznawane przez
swoiste N-glikozylazy, co jednocześnie stanowi sygnał dla endonukleazy apurynowej lub
apirymidynowej, które usuwają resztę cukrową pozbawioną zasady. Następnie naprawcza polimeraza
DNA β uzupełnia nukleotyd, a ligaza łączy go z sąsiednimi. W podobny sposób przebiega naprawa
deaminacji, alkilacji lub substytucji zasad przez ich analogi.

•

Naprawa przez wycięcie nukleotydu używana jest do usuwania i zastępowania większych (długości ok.
30 nukleotydów) regionów DNA, bierze w niej również udział większa liczba białek. Takie
uszkodzenia mogą powstawać w wyniku: działania promieni UV (→ dimery cyklobutanowe między
dwoma pirymidynami), dymu tytoniowego (→ addukcja beznzo[a]pirenu do guaniny), promieniowania
jonizującego i leków cytostatycznych (→ modyfikacje zasad, pękanie pasm, sieciowanie DNA-DNA
lub DNA-białka). W opisywanym mechanizmie hydrolizie ulegają dwa wiązania fosfodwuestrowe w
uszkodzonym paśmie, co katalizuje egzonukleaza złożona z wielu podjednostek (u E. coli – 3, u
człowieka – 17). Usunięty odcinek jest uzupełniany (u człowieka przez polimerazę δ/ε) oraz łączony
przez ligazę DNA. Zaburzenie tego typu naprawy związane jest z patogenezą typów A i C choroby
xeroderma pigmentosum (XP).

•

Naprawa pęknięć dwupasmowych, poza funkcjonowaniem jako mechanizm naprawy DNA, jest częścią
fizjologicznego procesu rearanżacji genów immunoglobulin. W niehomologicznym łączeniu złamań
dwupasmowych bierze udział białko Ku, które wiąże się do wolnych końców DNA i wykazuje latentną
aktywność helikazy zależnej od ATP. Następnie aktywacji ulega zależna od DNA kinaza białkowa
(DNA-PK), która wiąże wolne końce i zbliża je do siebie. W powstałym kompleksie kinaza ulega
aktywacji, fosforylując białko Ku i inną cząsteczkę DNA-PK, położoną na przeciwległym paśmie w
pozycji trans. Kinaza dysocjuje wówczas z kompleksu, a aktywacji ulega helikaza białka Ku, która
rozplata oba końce. Rozpleciona i zbliżone końce ulegają parowaniu, a dodatkowe ogony nukleotydowe
– usunięciu przez egzonukleazę. Przerwy między nukleotydami są ostatecznie scalane przez ligazę
DNA.

•

Zaburzenia mechanizmów naprawy są ponadto przyczyną chorób: ataxia teleangiectasia (AT),
cechującą się zwiększoną wrażliwością na promieniowanie X oraz anemia Fanconiego, gdzie defekt
dotyczy naprawy uszkodzeń wywołanych wiązaniami poprzecznymi w DNA.

3.

Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje

Transkrypcja (dosłownie: przepisywanie) jest procesem, w którym informacja zawarta w DNA

przenoszona jest na RNA (najczęściej mRNA). Innymi słowy na podstawie budowy DNA, a dokładniej
sekwencji nukleotydów w jego paśmie matrycowym, syntetyzowana jest nowo cząsteczka RNA. Ta ostatnia jest
więc komplementarna do pasma matrycowego swojego genu, a dokładnie identyczna z jego pasmem kodującym
(oczywiście T zamienione są na U). W dwupasmowym DNA pasmo matrycowe jednego genu nie musi być tym
samym dla drugiego w helisie DNA – każde z dwóch pasm dsDNA pełni rolę pasma matrycowego dla jednych,
a kodującego dla drugich genów. Transkrypcja jest procesem polarnym: informacja z pasma matrycowego
czytana jest w kierunku 3’→5’, zaś nowo powstająca cząsteczka RNA syntetyzowana jest w kierunku 5’→3’;
ma to istotne konsekwencja m. in. w sprzężeniu transkrypcji z translacją u Procariota (por. dalej).

- -

148

Istnieją pewne podobieństwa pomiędzy replikacją a transkrypcją. Oba procesy podzielone są na 3 etapy

(inicjacja, elongacja, terminacja), w obu biorą udział duże białkowe kompleksy inicjacyjne, w obu wreszcie
kolejne nukleotydy nowo syntetyzowanego kwasu nukleinowego wstawiane są na zasadzie komplementarności z
nukleotydami już istniejącej nici. Jednak, w przeciwieństwie do replikacji, w transkrypcji substratem są
trifosforany rybotydów (NTP), zamiast T wstawiany jest U, nie występują primery, a produkt nie jest
sprawdzany pod kątem poprawności wstawionych zasad. Ponadto w procesie replikacji kopiowany jest cały
komórkowy DNA, transkrypcji natomiast podlega tylko pewna niewielka jego część. Fragment DNA
podlegający transkrypcji to tzw. jednostka transkrypcyjna. Jest ona poprzedzona przez obszar zwany
promotorem, za nią zaś obecny jest terminator. Promotor i terminator wyznaczają miejsca początku (inicjacji) i
końca (terminacji) transkrypcji, czyli wyznaczają granice jednostki transkrypcyjnej. Pierwszy nukleotyd
jednostki transkrypcyjnej oznaczany jest +1 (jest to puryna – G lub rzadziej A), a dalsze – kolejnymi liczbami
naturalnymi; nukleotydy promotora oznaczane są kolejnymi liczbami ujemnymi (w kierunku 3’→5’).

a)

transkrypcja u Procariota

Inicjacja transkrypcji polega na odnalezieniu przez polimerazę RNA (RNAP) promotora genu na paśmie

matrycowym i związaniu się z nim. Niezwykle ważny jest wybór odpowiedniego promotora – genom E. coli
(4 Mbp) zawiera ich bowiem ok. 2 tys., zaś ludzki (3 Gbp) – ok. 100 tys. RNAP przeszukuje więc genom z
prędkością ok. 1 kbp/s w poszukiwaniu miejsca, do którego wykazuje wysokie powinowactwo.

•

budowa promotora

Promotory bakteryjne mają długość ok. 40 bp (4 zwoje podwójnej helisy), tak iż mogą być w danym

momencie całkowicie pokryte przez pojedynczą cząsteczkę RNAP (kompleks RNAP pokrywa 30 – 75 bp
zależnie od konformacji). Promotor zawiera 2 konserwatywne sekwencje: w pozycji -35 bp znajduje się 8-
nukleotydowa sekwencja 5’-TGTTGACA-3’, z którą wiąże się RNAP, tworząc kompleks zamknięty, zaś w
pozycji -10 bp występuje 6-nukleotydowa sekwencja 5’-TATAAT-3’ (tzw. ramka TATA – ang. TATA box;
inaczej ramka Pribnowa). Ta ostatnia, ze względu na zawartość samych wiązań podwójnych, łatwo ulega
denaturacji, pozwalając na dysocjację pasma kodującego i matrycowego i jego odczyt tego przez RNAP
(kompleks otwarty). Inne bakterie posiadają inaczej zbudowane promotory, ale zazwyczaj zawierają one również
2 charakterystyczne sekwencje (ramki).

•

budowa polimerazy RNA

U E. coli DNA-zależna polimeraza RNA (RNAP) składa się z tetramerycznego rdzenia, do którego

odwracalnie przyłącza się podjednostka σ; razem tworzą one holoenzym. Rdzeń polimerazy składa się z 2
podjednostek identycznych (α; 36,5 kDa; funkcja: montaż rdzenia) oraz z 2 podobnych, choć nieidentycznych: β
(151 kDa; wiąże rybotydy) i β’ (155 kDa; wiąże DNA); zawiera również 2 atomy cynku. Czynnik białkowy σ
odpowiada za rozpoznanie promotora i związanie z nim rdzenia RNAP, po czym przestaje być potrzebny i
odłącza się od rdzenia, mogąc przyłączyć się do innego. Dzięki temu transkrypcja może zachodzić z taką samą
szybkością nawet gdy czynników σ jest mniej niż rdzeni. Czynniki σ działają ponadto jako białka regulatorowe
transkrypcji – pojawiają się w komórce w odpowiedzi na szkodliwe czynniki zewnętrzne (np. bakteriofagi,
wstrząs cieplny; sporulacja), przyłączają się do odpowiednich rdzeni i modyfikują swoistość rozpoznawania
promotorów przez RNAP, przez co stymulują ekspresję określonych genów i w konsekwencji uruchamiają
mechanizmy obronne. Różne bakterie posiadają różne swoiste gatunkowo czynniki σ, np. u E. coli jest to σ

70

.

•

inicjacja

Podjednostka σ rozpoznaje w promotorze sekwencję -35 bp, co umożliwia związanie z nim RNAP i

utworzenie kompleksu zamkniętego; czynnik σ ulega wówczas odłączeniu. Gdy polimeraza rozpoznaje
sekwencję -10 bp, zmienia swoją konformację i zaczyna przesuwać się po nici. Dostęp do nukleotydów pasma
matrycowego wymaga rozdzielenia pasm i rozkręcenia podwójnej helisy. Topnienie DNA następuje na stałym
odcinku ok. 17 bp na cząsteczkę polimerazy i nie zależy od sekwencji DNA, co sugeruje, że RNAP wykazuje
aktywność rozwijającą. Zaraz za polimerazą postępuje topoizomeraza, zapobiegająca tworzeniu kompleksów
helisy wyższego stopnia. Udostępnienie pasma pozwala na utworzenie kompleksu otwartego i bąbla
transkrypcyjnego. Etap ten jest krytyczny dla powodzenia całego procesu – albo dochodzi do inicjacji poronnej
(zsyntetyzowanych jest tylko kilka nukleotydów, które odrywają się od kompleksu) albo RNAP osiąga punkt +1
i niemal z pewnością ukończy transkrypcję genu.

- -

149

•

elongacja

Elongacja transkrypcji jest bardzo podobna do elongacji replikacji. Gdy RNAP dojdzie do miejsca +1,

wstawia pierwszy (5’-końcowy) rybotyd, przy czym substratem jest jego trójfosforan (NTP), wiążący się do
podjednostki β. W wyniku odłączenia pirofosforanu (PP

i

) pozostaje NMP. Następnie RNAP przemieszcza się

(ulega translokacji) do kolejnej zasady na matrycy, wiąże i wstawia kolejny rybotyd, który tworzy z poprzednim
wiązanie 3’,5’-fosfodwuestrowe, czemu towarzyszu uwolnienie PP

i

. Cykl ten powtarza się wielokrotnie, zależnie

od długości jednostki transkrypcyjnej. Elongacja biegnie antyrównolegle – pasmo matrycowe czytane jest w
kierunku 3’→5’, a nowe RNA wydłuża się w stronę 5’→3’. Nowo syntetyzowany RNA związany jest z
podjednostką β RNAP. W tym samym czasie jedno pasmo matrycowe genu może być przepisywane przez
więcej niż jedną cząsteczkę RNAP, jednak jest to proces tak zsynchonizowany, że w danej chwili przepisywaniu
ulegają odmienne sekwencje DNA. Bakteryjny RNA jest policistronowy, gdyż kilka pobliskich genów może
znajdować się pod kontrolą wspólnego promotora i ulegać jednoczesnej transkrypcji. U Eucariota natomiast
każdy gen posiada własny promotor i ulega niezależnej ekspresji, stąd RNA jest monocistronowy.

•

terminacja

Terminacja transkrypcji może być dwojakiego rodzaju: tzw. ρ-zależna lub ρ-niezależna.
Terminacja ρ-zależna wyznaczona jest przez odpowiednią sekwencję na paśmie matrycowym, którą

rozpoznaje i z którą wiąże się heksameryczne (3 dimery) białko terminacji – czynnik ρ. Wykazuje on aktywność
RNA-DNA helikazy zależnej od ATP, dzięki czemu rozrywa kompleks DNA i RNA. Rdzeń polimerazy odłącza
się od DNA, czekając na pojawienie się kolejnego czynnika σ, aby znów rozpoznać promotor i zainicjować
transkrypcję.

Terminacja ρ-niezależna, zwana również spontaniczną, wyznaczana jest przez sekwencję terminatora. Ma

on długość ok. 40 bp i zawiera sekwencję palindromową (przerwana odwrócona sekwencja powtórzona –
orientacja: →...←), po której występuje wiele reszt A. Gdy polimeraza przejdzie przez sekwencję
palindromową, powstały odcinek RNA wykazuje komplementarność z samym sobą, dochodzi więc do
parowania zasad, w wyniku czego powstaje struktura II-rz. o kształcie szpilki lub spinki do włosów (są to
synonimy). Struktura ta oddziałuje z kompleksem transkrypcyjnym, tak że RNAP zatrzymuje się i odłącza. Za
sekwencją palindromową reszty A matrycy ulegają przepisaniu na U w RNA – dzięki temu kompleks DNA-
RNA jest za strukturą szpilki utrzymywany przez słabe pary A=U, łatwo więc ulega destabilizacji i transkrypt
odłącza się od matrycy. W czasie terminacji ρ-niezależnej struktura szpilki pojawia się zawsze, natomiast w
czasie ρ-zależnej zazwyczaj nie, choć może wystąpić dodatkowo.

b)

różnice w transkrypcji u Eucariota

•

promotory eukarotyczne

Generalnie promotory eukariotyczne są bardziej złożone. Przed jednostką transkrypcyjną występują 2 lub

3 typy sekwencji sygnalnych – jedna określa miejsce przyłączenia polimerazy, druga – podstawową częstość
transkrypcji, zaś trzecia determinuje dodatkową częstość transkrypcji, stanowiącą główny mechanizm
regulacyjny.

Większość genów ssaków zawiera mniej więcej w pozycji -15 bp sekwencję TATA (gł. TATAAT, choć
układ A i T może się różnić) – jest to tzw. ramka Haggesa. Przyłącza się do niej odpowiednie białko
wiążące (ang. TATA binding protein – TBP), do którego z kolei przyłączają się białkowe czynniki
asocjujące (ang. TBP associated facors – TAF). Powstanie kompleksu TBP i TAF (dawniej określanego
jako TFIID – por. dalej) jest pierwszym etapem tworzenia kompleksu transkrypcyjnego na promotorze.

Pewne geny nie posiadają sekwencji TATA – wówczas polimeraza kieruje się sekwencją inicjacyjną
(Inr), obejmującą punkt startu (-3 – +5) i o budowie: Py

2

A*NT/APy

2

, gdzie A* to nukleoyd +1, a Py –

pirymidyna. Promotory mogą zawierać zarówno sekwencję TATA, jak i Inr – są wówczas silniejsze od
zawierających tylko jedną z nich.

Sekwencje położone jeszcze wcześniej przed promotorem (ok. -80 bp) określają podstawową częstość
transkrypcji danego genu. Są to tzw. kasety GC oraz CAAT, wiążące odpowiednio białka: Sp1 oraz
CTF, C/EBP, NF1, NFY i inne. Są to elementy cis mogące funkcjonować w położeniu o odwróconej
polarności (→ lub ←), choć lepszy efekt wywierają gdy są zorientowane zgodnym z genem (→).

Istnieje również 3. klasa sekwencji sygnalnych, regulujących inicjację transkrypcji genów
eukariotycznych – są to tzw. wzmacniacze (ang. enhancers) lub wyciszacze (silencers). Mogą one
występować po obu stronach punktu +1, funkcjonują niezależnie od polarności i nawet będąc w dużej
(rzędu setek – tysięcy bp) odległości od jednostek transkrypcyjnych. Mogą wiązać jedno lub więcej
białek, które z kolei mogą się wiązać z jednym lub większą liczbą takich elementów. Elementy

- -

150

odpowiedzi hormonalnej (HRE; patrz punkt VII-1-a) działają albo jako takie właśnie sekwencje albo są
z nimi sprzężone. Inne czynniki wpływające na ekspresję genów (wstrząs cieplny, metale – Zn, Cd,
dioksyny) działają przez swoiste elementy regulatorowe. Podobnie swoista tkankowo ekspresja genów
zachodzi przez swoiste sekwencja DNA.

•

polimerazy eukariotyczne

W przeciwieństwie do Procariota, komórki ssaków zawierają kilka DNA-zależnych polimeraz RNA: I

(A), II (B) i III (C). Wszystkie mają podobną masę (500 – 600 kDa) i zbudowane są podobnie jak bakteryjna
RNAP (2 duże podjednostki + kilka mniejszych). Różnią się natomiast rodzajem przepisywanych genów oraz
wrażliwością na α-amanitynę. Polimeraza I, II i III przepisuje odpowiednio geny klasy I (rRNA), II (mRNA lub
hnRNA) i III (tRNA i 5S rRNA). α-amanityna jest toksyną grzyba Amanita phalloides, działającą jako swoisty
inhibitor eurakriotycznej nukleoplazmatycznej DNA-zależnej polimerazy RNA II, blokującym jej translokację.
Polimeraza I jest niewrażliwa na α-amanitynę, II – bardzo wrażliwa (wrażliwa na małe stężenia), a III – słabo
wrażliwa (wrażliwa na duże stężenia).

•

kompleks transkrypcyjny; regulacja transkrypcji

U Eucariota kompleks transkrypcyjny złożony jest z ok. 50 białek. Polimerazy nie rozpoznają same

promotorów, lecz są nań nakierowywane przez inne białka. Dla genów klasy II funkcje prokariotycznego
czynnika σ przejmują inne białka, tak iż podstawowa transkrypcja, oprócz polimerazy RNA II, wymaga
obecności czynników A, B, D, E, F, H i J. Określa się je symbolami TFIIX – czynnik transkrypcyjny (ang.
transcription factor) X dla genu klasy II, gdzie X to jedna z powyższych liter. Spośród nich jedynie TFIID (czyli
TBP i 8 – 10 TAF, por. wyżej) ma zdolność wiązania się ze swoistymi sekwencjami DNA – tu z sekwencją
TATA. TBP wiąże się z TATA w rowku mniejszym DNA (inaczej niż większość czynników transkrypcyjnych –
por. punkt VIII-1-j) powodując zgięcie lub złamanie helisy o kat 100

o

, co ułatwia integrację TAF i innych

składników kompleksu inicjacyjnego, a prawdopodobnie również czynników wiążących się z sekwencjami cis.
TBP jest także składnikiem kompleksów inicjacyjnych transkrypcji genów klas I i III, choć ich promotory nie
zawierają sekwencji TATA – nie wiadomo zatem gdzie dokładnie przyłącza się TBP. Związanie TBP z
promotorem genu oznacza go jako gotowy do transkrypcji – jest to jedyny etap całkowicie zależny od interakcji
typu białko-DNA. Następnie do kompleksu TBP-promotor dołącza się TFIIB – powstały trójskładnikowy
kompleks dokładniej umieszcza się na promotorze i wiąże do niego kompleks polimerazy II i TFIIF (podobny do
σ – niezbędny do połączenia polimerazy z promotorem). Dołączenie TFIIA stabilizuje kompleks TBP z
promotorem oraz umożliwia mu odpowiedź na aktywatory. Dodanie do kompleksu polimeraza II – TFIIF
czynników TFIIE i H finalizuje formowanie kompleksu preinicjacyjnego (ang. preinitiation complex – PIC).
Każde z opisanych zdarzeń powiększa rozmiar kompleksu, który ostatecznie pokrywa obszar ok. 60 bp (30 bp
po każdej stronie punktu +1) i jest gotowy do rozpoczęcia podstawowej transkrypcji. W genach zawierających
zamiast sekwencji TATA sekwencję Inr niezbędne są te same składniki.

Eukariotyczna polimeraza RNA II składa się z 14 podjednostek, z czego 2 największe (ok. 200 kDa) są

homologiczne do bakteryjnych β i β’. Na C-końcu największej podjednostki obecne są 7-aa powtórzenia (Tyr-
Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) – tzw. powtarzająca domena końca karboksylowego (ang. carboxyl termical repeat
domain – CTD), u ssaków w licznie 52. CTD stanowią substrat dla wielu kinaz, w tym THIIF oraz miejsca
wiązania białek mediatorowych Srb (supresory polimerazy RNA B), ponadto biorą udział w obróbce RNA i
poliadenylacji 3’-końca. TFIIE zwiększa aktywność kinazową TFIIH. Fosforylacja reszt Ser i Thr w obrębie
CDT aktywuje polimerazę II; polimeraza nie może funkcjonować bez sprawnych CDT.

TFIID (nie sam TBP) podtrzymuje zarówno transkrypcję podstawową (jak TBP), jak i nasiloną

działaniem innych czynników – aktywatorów. Te ostatnie przyłączają się do odpowiednich sekwencji: CAAT
(C/EBP, NF-Y), GC (Sp1, MyoD, NF1), oktamer Ig (Oct-1, 2, 4, 6), AP1 (Jun, Fos, ATF), SRF (← surowica),
HSF (← szok cieplny). TAF są niezbędne w tym drugim przypadku, tj. do aktywności aktywatorów, dlatego
określa się je jako koaktywatory. Istnieją więc 3 klasy czynników transkrypcyjnych, biorących udział w regulacji
genów klasy II: podstawowe (TBP i czynniki TFIIX), koaktywatory (TAF) oraz powyższe aktywatory.

Kolejność organizacji PIC wyjaśniają 2 modele: stopniowego montowania PIC (składniki kompleksu

przyłączają się kolejno, a aktywatory stymulują formowanie lub funkcje PIC) oraz hipoteza rekrutacji
(koaktywatory i aktywatory doprowadzają wcześniej preformowany PIC do promotora). Hormony i inne
cząsteczki sygnałowe modulują ekspresję genów przez wpływ na gromadzenie i aktywność aktywatorów i
koaktywatorów oraz następowe formowanie się PIC na promotorze danego genu.

•

Terminacja transkrypcji u Eucariota jest słabo poznana, jednak przypuszczalnie sygnały terminacji
znajdują się z znacznej odległości za (np. 1 – 2 kbp w stronę 3’) jednostkami transkrypcyjnymi.

- -

151

c)

geny podzielone; snRNA; składanie mRNA

U Procariota pierwotne transkrypty genów klasy II stanowią gotowe matryce do translacji, nawet jeszcze

przed ukończeniem transkrypcji. Transkrypcja i translacja są ze sobą sprzężone, co jest związane m. in. z
brakiem jądra komórkowego. Prokariotyczne mRNA nie ulega więc praktycznie żadnym modyfikacjom od
chwili powstania do chwili podjęcia funkcji matrycy dla syntezy białek. rRNA i tRNA są przepisywane w
formach dłuższych niż ostateczna, a liczne jednostki transkrypcji tRNA zawierają więcej niż jedną cząsteczkę –
wymagają one więc przekształcenia do form dojrzałych.

U Eucariota natomiast transkrypcja i translacja są rozdzielone przestrzennie (jądro / cytoplazma) i w

konsekwencji czasowo. Pomiędzy czasem syntezy a rozpoczęcia pełnienia funkcji wszystkie typy
eukariotycznego RNA przechodzą szereg przekształceń (ang. processing). Jest to konsekwencją występowania
większości genów eukariotycznych w formie genów podzielonych – oznacza to, że sekwencje kodujące aa w
produktach białkowych (tzw. eksony) są w nich porozdzielane długimi sekwencjami niekodującymi (tzw.
intronami – sekwencjami wtrąconymi), tj. niosącymi informacje odrzucane w procesie obróbki RNA. Introny
mogą być nawet dłuższe od eksonów; ciągłość pojedynczego gen jest zazwyczaj przerwana przez co najmniej 1
intron, a czasami może ich być nawet 50. Dokładna znaczenie intronów nie jest poznane, jednak przypuszczalnie
ich obecność przyspiesza reanarżacje genetyczne przez rekombinację, co przekłada się na przyspieszenie
ewolucji funkcji biologicznych. Eukariotyczne transkrypty pierwotne mają postać hnRNA, zawierającego
odcinki komplementarne do intronów, natomiast transkrypty ostateczne (mRNA), bezpośrednio podlegające
translacji, są ich pozbawione. Produkty transkrypcji ulegają więc jeszcze przed opuszczeniem jądra
komórkowego obróbce nukleolitycznej, określanej jako składanie (ang. splicing) RNA, a polegającej na
usunięciu intronów i spojeniu eksonów. W wyniku składania duża część (½ – ¾) syntetyzowanego w jądrze
RNA nie opuszcza tego organellum i nie dostaje się do cytoplazmy, lecz ulega wycięciu i strawieniu. Ogólnie
istnieją 4 mechanizmy reakcji składania RNA, ale u Eucariota występuje głównie jeden. Sekwencje intronów,
choć generalnie bardzo heterogenne, zawierają konserwatywne sekwencje w miejscach spojenia z eksonami oraz
w miejscach rozgałęzienia, zlokalizowanego 20 – 30 nukleotydów od miejsca spojenia 3’ (granicy intron /
ekson).

W procesie składania RNA bierze udział małocząsteczkowe jądrowe RNA (snRNA). Ta klasa RNA

występuje głównie w połączeniach z białkami jako kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP), zlokalizowane
zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie. Jego funkcją jest wspomaganie przekształceń mRNA oraz regulacja
ekspresji genów. snRNA U1-2 i 4-6 biorą udział w procesie składania RNA, U4 i 6 – dodatkowo w obróbce
ogona poli(A), a U7 – w tworzeniu prawidłowego końca 3’ histonowego mRNA (brak ogona poliadenylowego).

Składanie RNA zachodzi w strukturze zwanej spliceosomem. Składa się ona z pierwotnego transkryptu, 5

rodzajów snRNA (U1, 2, 5, 4/6) oraz ponad 50 białek – całość tworzy kompleks zwany małym kompleksem
nukleoproteinowym (snRNP, snURP), który ustawia hnRNA w taki sposób, aby mogło zajść spajanie eksonów.
Cząsteczki snRNA i białek pomagają w tworzeniu półproduktów i pełnią funkcje katalityczne (rybozymy).

Wpierw U1 wiąże się z 5’-końcem granicy ekson / intron (dawca, strona lewa) i nacina to miejsce.

Następnie U2 wiąże się do miejsca rozgałęzienia, zlokalizowanego nieco przed końcem 3’ tego intronu i
zawierającego sekwencję: PyNPyPyPuAPy (Py to pirymidyny, a Pu – puryny), eksponując występującą w tej
sekwencji nukleofilową resztę A. Jest ona zwykle położona 28 – 37 nukleotydów w górę od 3’ końca danego
intronu. Dalej przyłącza się kompleks U5/4/6, po czym następuje zależne od ATP rozplecenie i dysocjacja U4/6
– U4 uwalnia się, a U6 wchodzi w interakcję z U2 i U1, zbliżając je do siebie. Reaktywna reszta adenylylowa,
zbliżając się do 5’-końca, przeprowadza nań nukleofilowy atak, w wyniku czego tworzy się pętla (struktura
lassa), zawierająca wyjątkowe wiązanie 5’,2’-fosfodwuestrowe; reakcję tą wzmacnia U5. Następnie dochodzi do
drugiego nacięcia, tym razem na 3’-końcu granicy intron / ekson (biorca lub strona prawa). W tej drugiej reakcji
transestryfikacji grupa 3’OH poprzedniego eksonu atakuje resztę 5’{P} na granicy ekson / intron. Struktura lassa
zostaje wówczas odrzucona i ulega rozkładowi. Wolne końce najbliższych eksonów utrzymywane są przez
kompleks U2/6, a ostatecznie ulegają ligacji (spojeniu), dając ciągłe pasmo.

W genach zawierających liczne introny powyższy ciąg reakcji ulega powtórzeniu, przy czym introny nie

muszą być wycinane kolejno w kierunku 5’→3’.

W procesie składania pierwotnego transkryptu genu podzielonego mogą powstawać różne cząsteczki

mRNA. Zjawisko o określa się jak alternatywne składanie (alternatywny splicing) i jest związane ze swoistością
tkankową i rozwojową ekspresji genów. Złożoność procesu składania sprzyja zaburzeniom hierarchicznego
porządku relacji ekson – intron i powstawaniu różnych form mRNA z tego samego transkryptu. Dochodzą do
tego alternatywne punkty donorowe (5’) i akceptorowe (3’), możliwości selektywnego wyboru eksonów, miejsca
terminacji, przecinania i poliadenylacji, powiększające heterogenność mRNA.

Tkankowo-swoista regulacja ekspresji genów może być osiągnięta przez sekwencje kontrolne w

promotorach albo przez użyciu alternatywnych promotorów. Przykładowo geny glukokinazy (GK) w wątrobie i
w komórkach β trzustki różnią się składem produktów i lokalizacją promotorów: promotor genu GK komórek β i

- -

152

ekson 1B są położone ok. 30 kbp w górę (przed) od promotora wątrobowego i eksonu 1L. Każdy z promotorów
ma odmienną strukturę i podlega odmiennej regulacji. Pozostałe eksony (2 – 10) w obu genach są identyczne.

Zaburzenia składania RNA są przyczyną co najmniej jednej postaci β-talasemii – choroby, w której gen

β-globiny jest silnie wytłumiony i podlega zbyt małej ekspresji.

d)

modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA

Wiele typów RNA ulega modyfikacjom potranskrypcyjnym. W przypadku mRNA jest to dodawanie

czapeczki metylacyjnej na koniec 5’ i ogona poli(A) na 3’ oraz wtórne metylacje zasad.

Na 5’-końcu nowo syntetyzowanego mRNA obowiązkowo tworzona jest czapeczka (ang. cap)

metylacyjna w postaci 7-metylo-GTP połączonego przez 3 reszty {P} ze zmetylowanym nukleotydem
purynowym. Proces ten zachodzi w obrębie jądra przed transportem do cytozolu. Czapeczka pełni potrójną
funkcję: chroni przed atakiem 5’-egzonukleaz, umożliwia wytworzenie kompleksu RNP w procesie składania
hnRNA oraz bierze udział w rozpoznawaniu transkryptu przez układ translacji (por. punkt VIII-4-d i e). Być
może ma również udział w transporcie RNA.

Dodawanie ogona poliadenylowego do 3’-końca jest fakultatywne (nieobowiązkowe) i może zachodzić

albo w jądrze albo w cytoplazmie. Gdy polimeraza RNA II przekroczy region kodujący koniec 3’, endonukleaza
RNA przecina pierwotny transkrypt w miejscu ok. 15-20 nukleotydów w kierunku 3’ od sekwencji AAUAAA,
która wydaje się być sygnałem dla przecięcia transkryptów eukariotycznych. Następnie na tak powstały 3’-
koniec działa polimeraza poli(A), dodając krótki ogon, który następnie może być wydłużany do nawet 200 – 250
reszt A. Funkcja ogona obejmuje m. in. ochronę przed atakiem 3’-egzonukleaz, co nie ma wpływu na transport
do cytoplazmy. W cytoplazmie długość ogona może być skracana lub wydłużana, co nie ma jednak wpływu na
stabilność mRNA.

Wtórne metylacje zasad, głównie grupy 2’-OH lub atomu azotu N

6

adeniny, zachodzą w cytoplazmie.

Informacja niesiona przez DNA może być zmieniona na poziomie mRNA w procesie jego korekty – tzw.

redagowania (ang. editing) – wówczas kodująca sekwencja mRNA różni się od odpowiadającej sekwencji DNA.
Przykładem jest synteza apoB – w wątrobie gen podlega transkrypcji i translacji do białka apoB

100

(nazwa z

powodu masy ok. 100 kDa), natomiast w jelicie deaminaza C katalizuje konwersję C→U, co zmienia kodon
CAA (Glu) na UAA (sygnał terminacji translacji – stop). W wyniku tego powstaje o wiele krótsze białko apoB

48

(48 kDa). Podobnie zachodzi zamiana Gln → Arg w receptorze Glu.

e)

transkrypcja genów tRNA i rRNA

DNA-zależna polimeraza RNA III przepisuje geny klasy III, tj. tRNA i 5S rRNA. Rozpoznaje ona

promotor wewnątrz genu podlegającego transkrypcji, a nie przed nim. U Eucariota obecne są 2 oddzielne
wewnętrzne bloki sekwencji (A i B), funkcjonujące jako promotor wewnątrzgenowy. Sekwencje te w dojrzałej
cząsteczce tRNA znajdują się w obszarach konserwatywnych – pętli DHU i TψC. Punkt startu transkrypcji
znajduje się 10 – 16 bp przed blokiem A, zaś optymalna dla funkcji promotora odległość A-B wynosi 30 – 40
bp. Dla genu 5S rRNA istnieje swoisty białkowy czynnik transkrypcyjny, umożliwiający dopasowanie miejsca
katalitycznego polimerazy III do miejsca startu transkrypcji na DNA.

Zarówno u Procariota jak i Eucariota cząsteczki tRNA transkrybowane są jako duże cząsteczki

prekursorowe, które następnie poddawane są obróbce nukleolitycznej. Ponadto tRNA musi być precyzyjnie
złożone z powodu obecności pojedynczego intronu w pobliżu fragmentu docelowo tworzącego ramię
antykodonowe. Nukleazy przekształcające prekursory tRNA kierują się prawdopodobnie jego strukturą III-rz., a
nie I-rz., dlatego przekształcane są jedynie cząsteczki zdolne do odpowiedniego sfałdowania.

Modyfikacje potranskrypcyjne tRNA obejmują modyfikacje (alkilację) nukleotydów oraz dołączenie

końcówki CCA do 3’-końca przez transferazę nukleotydylową.

Rybosomalny RNA (rRNA) stanowi niebiałkowy składnik rybosomów, odpowiedzialny za formowanie

ich struktury, wiązanie mRNA oraz udział w translacji. Znane są 4 rodzaje rRNA: 5S, 5,8S, 18S oraz 28S, z
czego wszystkie poza 5S powstają w wyniku obróbki pojedynczej dużej cząsteczki prekursorowej 45 S. Geny
rRNA zlokalizowane są w jąderku, w liczbie setek kopii w każdym z nich – tak duża liczba jest niezbędna do
syntezy RNA dla ok. 10 mln rybosomów, potrzebnych do pojedynczego podziału komórkowego. O ile bowiem
na pojedynczej cząsteczce mRNA może postać 100 tys. cząsteczek kodowanego białka, to rRNA jest produktem
końcowym.

Pierwotny transkrypt 45S jest silnie zmetylowany – zawiera 65 grup metylowych na rybozach oraz 5 na

zasadach (dla prekursora 28S); metylacji ulegają tylko te jego fragmenty, które mogą stać się stabilnym rRNA.
Następnie, wciąż w obrębie jąderka, ulega on hydrolizie (nukleolizie) w serii reakcji katalizowanych przez endo-
i egzonukleazy, w wyniku czego degradowana jest niemal połowa transkryptu. Rybonukleazy specyficzne dla
rRNA odcinają z 5’-końca prekursora 45S fragment, dając prekursor 32S; następnie w jego obrębie rozcinany

- -

153

jest odcinek łączący materiał dla 18S oraz 5,8S, po czym eliminowane są jego pozostałości. Ostatecznie
rozdzielane są sekwencje 5,8S oraz 28S. W czasie przekształcania rRNA zachodzi dalsza metylacja, 28S oraz
5,8S łączą się na terenie jąderka z białkami rybosomalnymi, tworząc dużą (60S) podjednostkę rybosomalną, zaś
18S, po połączeniu z białkami, wchodzą w skład podjednostki małej (40S).

Rybosom ssaków (4,3 MDa, 80S) składa się z dwóch podjednostek. Większa z nich (2,8 MDa, 60S)

zawiera cząsteczki rRNA: 5 S, 5,8 S i 28 S, a także ok. 50 łańcuchów polipeptydowych, zaś mniejsza (1,4 MDa,
40S) – rRNA 18 S i ok. 30 łańcuchów białkowych.

Rybosom bakteryjny jest mniejszy od eukariotycznego (70S), ale również składa się z podjednostki

mniejszej (30S) i większej (50S). Różni się również pod względem regulacji (por. punkt VIII-4-e ).

4.

Translacja – biosynteza białek

Translacja jest procesem syntezy białka w oparciu o informacje zawarte w mRNA. Podczas translacji

sekwencja nukleotydów w mRNA tłumaczona jest na sekwencję aa w syntetyzowanym białku; sposób w jaki
odbywa się to tłumaczenie określa się kodem genetycznym. Ponieważ w procesie tym matryca i aa nie mają ze
sobą bezpośredniego kontaktu, musi istnieć cząsteczka pośrednicząca, kontaktująca się z jednej strony z
nukleotydami, a z drugiej z aa – cząsteczką tą jest tRNA.

a)

kod genetyczny

mRNA zawiera 4 rodzaje nukleotydów (A, U, G, C). Za pomocą pojedynczego nukleotydu można więc

zakodować informację o 4 cząsteczkach, za pomocą dwu (dublet) – o 4

2

= 16, trzech (tryplet) – 4

3

= 64 itd.

Ponieważ kodowanych jest 20 aa białkowych, toteż informacja o każdym z nich musi być zapisana przez 3
nukleotydy. Tryplet nukleotydowy kodujący pojedynczy aa określa się jako kodon. System przełożenia kodonu
na aa określany jest kodem genetycznym; posiada on kilka istotnych cech:

•

jednoznaczność, determinacja – oznacza, że dany kodon koduje tylko jeden określony aa; cecha ta jest
konsekwencją przyłączania pojedynczej cząsteczki aa do tRNA (por. dalej)

•

nadmiarowość, degradacja, niejednoznaczność – oznacza, że powyższa reguła jednoznaczności nie
działa w drugą stronę, tzn. różne kodony mogą kodować ten sam aa, np. Ser jest kodowana przez aż 6
różnych kodonów; główną przyczyną degradacji kodu jest niewielkie znaczenie ostatniego (3.)
nukleotydu w determinacji kodowanego aa (por. dalej)

•

brak nakładania się – skrajne nukleotydy sąsiadujących kodonów stykają się ze sobą, lecz nigdy nie
pokrywają; innymi słowy ostatni nukleotyd kodonu poprzedniego nie może być jednocześnie
pierwszym nukleotydem kodonu następnego; zasada ta jest złamana jedynie u pewnych wirusów

•

bezprzecinkowość – pomiędzy kodonami nie występują przerwy, inaczej mówiąc: każdy nukleotyd
wchodzi w skład jakiegoś kodonu, nie wystepują fragmenty niekodujące

•

trójkowość – ponieważ jeden aa kodowany jest przez 3 nukleotydy

•

kolinearność – kodujące nukleotydy są ułożone liniowo, a cząsteczka mRNA nie zawiera rozgałęzień

•

pośredni charakter – kodujące nukleotydy nigdy nie kontaktują się z odpowiadającymi im aa

•

uniwersalność – wszystkie żywe komórki tłumaczą kodony w ten sam sposób; zasada ta nie jest ścisła,
gdyż istnieją pewne różnice między kodem cytoplazmatycznym a mitochondrialnym, nawet tej samej
komórki, jak również między kodami poszczególnych gatunków – por. tabela:

kodon

AUA, AUU

UGA

AGA, AGG

cytoplazma

Ile

stop

Arg

mitochondrium

ssaki

stop

drożdże

Met

bakterie

*

Ile

Trp

Arg

* – Neurospora spp. i Aspergillus spp.

Tabela kodu genetycznego (1, 2, 3 – kolejne zasady kodonu):

1.

U

C

A

G

2.

U

C

A

G

U

C

A

G

U

C

A

G

U

C

A

G

U

Phe

Ser

Tyr

Cys

Leu

Pro

His

Arg

Ile

Thr

Asn

Ser

Val

Ala

Asp

Gly

C

Phe

Ser

Tyr

Cys

Leu

Pro

His

Arg

Ile

Thr

Asn

Ser

Val

Ala

Asp

Gly

A

Leu

Ser

stop

stop

Leu

Pro

Gln

Arg

Ile

Thr

Lys

Arg

Val

Ala

Glu

Gly

3.

G

Leu

Ser

stop

Trp

Leu

Pro

Gln

Arg

Met*

Thr

Lys

Arg

Val

Ala

Glu

Gly

* – kodon startowy (por. dalej)

- -

154

b)

budowa tRNA i aktywacja aa

RNA transportujący (tRNA) wyróżnia się wśród wszystkich RNA najmniejszą cząsteczką – ok. 75

nukleotydów. Podobnie jak mRNA ulega on obróbce na terenie jądra. tRNA pełni funkcje adaptacyjne –
odczytuje informację zawartą w sekwencji nukleotydów mRNA i tłumaczy ją na sekwencję aa syntetyzowanego
białka. Zdolność ta jest konsekwencją niejako dwubiegunowej budowy tRNA – z jednej strony posiada on
sekwencję komplementarną do kodonu mRNA (antykodon), z drugiej zaś wiąże odpowiedni aa. Ponieważ do
pojedynczego tRNA może przyłączyć się tylko jeden określony aa, toteż w komórce musi istnieć co najmniej
jeden rodzaj tRNA dla każdego aa, czyli łącznie dla wszystkich aa – co najmniej 20 rodzajów tRNA. Struktura I-
rzędowa tRNA warunkuje fałdowanie cząsteczki – wewnętrzna komplementarność zasad umożliwia im
parowanie i tworzenie II-rzędowej struktury liścia koniczyny, w obrębie której można wskazać 4 główne
ramiona. Każde z ramion posiada szypułę z kilku sparowanych zasad oraz zakończone jest pętlą. Przyciąganie
się skrajnych ramion powoduje zgięcie całej cząsteczki, tak iż przestrzennie przypomina ona odwróconą literę L
(struktura III-rz.).

Ramię akceptorowe (szypuła 7 bp) zakończone jest sekwencją CCA, do której końcowego nukleotydu
przyłącza się swoją grupą karboksylową swoista reszta aa.

Ramię DHU (szypuła 3-4 bp) zawiera zmodyfikowany nukleozyd – dihydrourydynę (stąd nazwa). Jest
istotne dla właściwego rozpoznania danego rodzaju tRNA przez odpowiednią syntetazę aa-tRNA, gdyż
zawiera sekwencję rozpoznawalną przez tą ostatnią.

Ramię antykodonowe (szypuła 5 bp) zawiera sekwencję 7 nukleotydów: 3’-N-Pu*XYZPyPy-5’ (N –
dowolny nukleotyd, Pu* – zmodyfikowana puryna, Py – pirymidyna), z których 3 środkowe (XYZ)
stanowią antykodon, tj. sekwencję komplementarną do kodonu na mRNA. Odpowiada ona za swoistość
mRNA. Kodon i antykodon są antyrównoległe pod względem komplementarności. Degeneracja kodu
genetycznego związana jest gł. z ostatnim nukleotydem kodonu, co sugeruje jego mniej precyzyjne
połączenie z komplementarnym nukleotydem antykodonu. Wyjaśnia to tzw. hipoteza tolerancji,
zgodnie z którą w tym miejscu kodon i antykodon są w stanie rozchwiania, tak iż kilka kodonów
kodujących ten sam aa może się wiązać z tym samym antykodonem, nawet pomimo braku między nimi
komplementarności. Translacja kodonu jest więc mało wrażliwa na zmiany w pozycji 3.

Ramię TψC (szypuła 5 bp) zawiera tyminę, niespotykaną normalnie w RNA oraz pseudourydynę,
różniącą się od urydyny wiązaniem N-glikozydowym pomiędzy atomem C5, a nie C1, uracylu. Bierze
ono udział w wiązaniu aa-tRNA do powierzchni rybosomu.

Ramię dodatkowe jest najbardziej heterogennym fragmentem całej cząsteczki, a jego długość stanowi
kryterium klasyfikacji tRNA na dwie kwasy: klasa 1 (75% tRNA) zawiera krótką (3-5 bp) pętlę
dodatkową, zaś klasa 2 – długą pętlę (13-21 bp) oraz strukturę pętla – szypuła.

Reakcje przenoszenia aa na odpowiedni tRNA katalizowane są przez 20 różnych enzymów, zwanych

wspólnie syntetazami aminoacylo-tRNA (aa-tRNA). Reakcja rozpoznawania i dołączania aa jest dwuetapowa:
wpierw powstaje aktywny kompleks pośredni aminoacylo-tRNA-enzym, który następnie rozpoznaje swoisty
tRNA i przenosi resztę aa na jego grupę 3’OH:

aa + ATP + enzym → enzym-AMP-aa + PP

i

enzym-AMP-aa + tRNA → enzym + AMP + aa-tRNA

Powstałe wiązanie estrowe utrzymuje się aż do czasu wprowadzenia reszty aa w sekwencję syntetyzowanego na
rybosomie polipeptydu.

c)

budowa i funkcje rybosomów (patrz również punkt VIII-3-e)

Organellum komórkowym, w którym odbywa się translacja, jest rybosom. Spotykają się tu różne

cząsteczki, aby ostatecznie dać produkt w postaci nowo zsyntetyzowanego białka. Pojedyncza cząsteczka
mRNA może być jednocześnie używana przez wiele rybosomów – zespoły takie określa się jako polirybosomy
(polisomy). Poszczególne rybosomy wiążą się do mRNA w odległościach nie mniejszych niż 80 nukleotydów.
Wielkość polisomów, tj. liczba rybsomów związanych z mRNA, zależy bezpośrednio od długości tego
ostatniego. Polisomy przyłączone do błon tworzą szorstką siateczkę śródplazmatyczną (ang. rough
endoplasmatic reticulum – RER), służącą do syntezy integralnych białek błonowych oraz białek eksportowanych
poza komórkę lub magazynowanych jako zymogeny w aparacie Golgiego, czekając na eksport. Rybsomy wolne,
tj. obecne w cytoplazmie i niezwiązane z błonami, używane są do syntezy własnych białek cytoplazmatycznych
komórki.

- -

155

d)

etapy translacji

Proces translacji składa się z inicjacji, elongacji i terminacji. Informacja genetyczna odczytywana jest w

kierunku 5’→3’, a polipeptyd syntetyzowany od N do C-końca. Polarność procesu translacji umożliwia
organizmom prokariotycznym na rozpoczęcie translacji jeszcze przed ukończeniem transkrypcji – do powstałego
fragmentu 5’ mRNA szybko przyłączają się rybosomy i rozpoczynają syntezę polipeptydu.

•

inicjacja i regulacja translacji

Inicjacja translacji obejmuje złożenie aparatu translacyjnego, w skład którego wchodzą: mRNA, tRNA,

rRNA i białka rybosomalne oraz czynniki inicjujące. Podczas translacji zużywane są: ATP, GTP i aa.

U Procariota istnieją 3 czynniki inicjujące (ang. initiation factors – IF): IF1, IF2 i IF3. W pierwszym

etapie inicjacji czynniki te przyłączają się do mniejszej podjednostki rybosomu (30S), przy czym IF2 związany
jest z GTP. Czynniki 1 i 3 uniemożliwiają przyłączenie podjednostki większej (50S), zaś 2 (+ GTP) odpowiada
za przyłączenie formylo-Met-tRNA. Następnie IF3 i Mg

2+

ułatwiają przyłączenie mRNA. Do kodonu startowego

(AUG, GUG, UUG – wszystkie 3 kodują formylometioninę) przyłącza się formylo-Met-tRNA, po czym czynnik
IF3 oddysocjowuje, co pozwala na przyłączenie się podjednostki większej i powstanie kompletnego rysobomu
(70S). Tak przygotowany aparat jest gotowy do elongacji.

U Eucariota natomiast występuje co najmniej 10 eukariotycznych czynników inicjacji (ang. eucariotic IF

– eIF), złożonych z licznych podjednostek. Proces inicjacji składa się tu z 4 faz.

W pierwszej fazie rybosom (80S) dysocjuje na dwie podjednostki (40S i 60S). Do mniejszej (40S)
wiążą się eIF3 i eIF1A, co sprzyja dysocjacji oraz zapobiega reasocjacji. Podobny efekt wywiera
związanie eIF3A z większą (60S).

W drugiej fazie tworzy się kompleks preinicjacyjny (PIC). eIF2 wiąże GTP – powstały kompleks
startowy inicjacji wiąże Met-tRNA S

i

, który z kolei łączy się z kodonem startowym AUG (kodującym

Met). Symbol S

i

(start inicjacji) oznacza startowy tRNA dla Met, który różni się od tRNA dla Met

wprowadzanej do polipeptydu podczas elongacji. Potrójny kompleks łączy się z podjednostką mniejszą
(40S), tworząc PIC 43S, stabilizowany przez eIF3 i eIF1A.
eIF2 bierze udział w regulacji syntezy białka – jego podjednostka α jest fosforylowana (reszta Ser51)
przez różne kinazy białkowe (HRC, PKP, GCN2) aktywowane pod wpływem stresu komórki, kiedy
przeciwwskazany jest wydatek energetyczny na biosyntezę białek. Do czynników stresowych komórki
należą: brak aa lub glukozy, infekcja wirusowa, brak surowicy, hiperosmolalność, szok cieplny).
Ufosforylowana podjednostka α wiąże β, nie pozwalając na wymianę GTP / GDP i utworzenie PIC.

W fazie trzeciej powstaje właściwy kompleks inicjacyjny. Czapeczka metylacyjna na końcu 5’ mRNA
ułatwia jego wiązanie do PIC 43S. Do niej bezpośrednio przyłącza się kompleks eIF4F, złożony z
eIF4E (miejsce wiązania), 4G i 4A. Następnie eIF4A i 4B redukują strukturę II-rzędową kompleksu na
5’ końcu mRNA dzięki swojej aktywności ATPazy i helikazy zależnej od ATP. Kompleks przeszukuje
mRNA w poszukiwaniu kodonu inicjacyjnego – AUG (dokładniej: sekwencja Kozaka o składzie
GCCA/GCC-AUG-G). eIF3 wiąże się do eIF4G i łączy cały kompleks z podjednostką 40S w
kompletny kompleks inicjacyjny 48S.

Ostatecznie w czwartej fazie eIF5 hydrolizuje GTP związaną eIF2, co uwalnia czynniki inicjacyjne
związane z kompleksem inicjacyjnym (podlegają one recyrkulacji) i prowadzi do spontanicznej
asocjacji podjednostek rybosomalnych 40S i 60S w 80S. Met-tRNA znajduje się w miejscu P rybosomu
i jest gotowy do rozpoczęcie cyklu elongacji.

Szczególne znaczenie w regulacji inicjacji (i całości transkrypcji) ma kompleks eIF4F, a właściwie jego

dwa składniki – 4E i 4G.

eIF4E rozpoznaje i wiąże się z czapeczką metylacyjną, co ogranicza tempo translacji. Proces ten jest

podwójnie regulowany. Po pierwsze grupa białek wiążących ten czynnik 4E-BP1 (PHAS1), BP2 i BP3
uniemożliwia mu połączenie się z 4G i utworzenie kompleksu 4F (regulacja negatywna). Po drugie liczne
mitogeny (insulina, IGF-1, PGDF, IL-2, angiotensyna II) aktywują kinazy zwiększające aktywność eIF4E
(regulacja pozytywna): z jednej strony aktywują komponentę szlaku MAPK, która fosforyluje sam 4E (Ser209
lub Thr210), tak iż ma większe powinowactwo do czapeczki 5’, a z drugiej aktywują serynową kinazę białkową
aktywną w szlaku mTOR, która fosforyluje 4E-BP w 5 unikatowych miejscach, przez odłącza się ono od 4E i
nie przyłącza ponownie aż do całkowitej defosforylacji.

eIF4G wiąże się natomiast do eIF3, który łączy kompleks do 40S oraz do 4A i 4B, czyli kompleksu

ATPaza – ATP-zależna helikaza, uniemożliwiając rozplecenie mRNA (regulacja negatywna).

- -

156

•

elongacja

U Procariota występują 3 czynniki elonacyjne: EF-Tu, EF-Ts oraz EF-G. Na początku elongacji

pojawiają się one kolejno, przy czym pierwszy związany jest z GTP i wiąże aa-tRNA, a funkcją drugiego jest
regeneracja pierwszego. W kompleksie translacyjnym wyróżnia się miejsce P (peptydowe), w którym
początkowo obecny jest formylo-Met-tRNA oraz A (akceptrowe), do którego przyłącza się na zasadzie
komplementarności odpowiedni aa-tRNA. Następnie EF-Tu związany z GDP zostaje wyparty z kompleksu przez
EF-Ts, tak że może wymienić GDP na GTP i powrócić. Aktywność peptydylotransferazy przenosi 1. aa –
formylo-Met na 2., wytwarzając między nimi wiązanie peptydowe. Powstały dwupeptyd związany jest z tRNA
w miejscu A, zaś wolny tRNA z miejsca P usuwa się z kompleksu. Translokaza (EF-G) przesuwa wówczas
tRNA z przyłączonym dwupeptydem w miejsce P, a do miejsca A wchodzi następny odpowiedni aa-tRNA. Cykl
ten powtarza się tyle razy, ile kodonów zawiera mRNA.

U Eucariota elongacja przebiega analogicznie jak u Procariota, z tym że katalizowana jest przez

eukarotyczne czynniki elongacji (eEF) – eEF1α, eEF1βγ oraz eEF2. Rybosom eukariotyczny również posiada
miejsce P, zajęte początkowo przez Met-tRNA S

i

oraz A, początkowo wolne. eEF1α, tworząc kompleks z GTP,

umożliwia wejście odpowiedniego aa-tRNA w wolne miejsce A. Jednocześnie od GTP odłącza się fosforan,
pozostawiając eEF1α-GDP, który odłącza się, ale wraca po wymianie GDP na GTP. Gdy w miejscach A i P
rybosomu znajdują się aa-tRNA, tworzone jest wiązanie peptydowe: grupa α-aminowa nowego aa-tRNA
przeprowadza nukleofilowy atak na estryfikowaną grupę α-karboksylową peptydylo-tRNA. Reakcja ta
katalizowana jest przez komponent białkowy podjednostki 60S – peptydylotransferazę albo przez składnik RNA
(być może 23S – rybozym). Rosnący łańcuch peptydowy zostaje przeniesiony na tRNA w miejscu A. W miejscu
P znajduje się wówczas cząsteczka tRNA pozbawiona reszty aa, która szybko stamtąd oddysocjowuje. eEF2 i
GTP odpowiadają za translokację nowo utworzonego peptydylo-tRNA z miejsca A do zwolnionego P, co wiąże
się z hydrolizą GTP → GDP + {P}. Jednocześnie miejsce A zostaje zwolnione i może się z nim związać kolejny
aa-tRNA. Translokacji towarzyszy przesunięcie rybosomu względem mRNA o 3 nukleotydy, tak iż w miejscu A
znajduje się kolejny kodon. Elongacja prowadzona jest z prędkością 6 aa/s u Eucariota i 3 x szybciej u
Procariota.

Bilans energetyczny jednego cyklu elongacji:

związanie reszty aa z tRNA: ATP → AMP = 2 ATP → 2 ADP

wejście aa-tRNA w miejsce A:

GTP → GDP

translokacja:

GTP → GDP

Zatem synteza jednego wiązania peptydowego zużywa łącznie 4 wiązania wysokoenergetyczne.

•

terminacja

Terminacja translacji zachodzi, gdy w miejscu A znajdzie się jeden z kodonów nonsensownych (stop:

UAG – amber, UGA – opal lub UAA – orche). Dla takich kodonów nie istnieją żadne swoiste tRNA, sygnał ten
jest natomiast rozpoznawany przez czynniki uwalniające (ang. releasing factors – RF). U bakterii są to: RF1 (dla
UAA lub UAG), RF2 (dla UAA lub UGA) oraz RF3, aktywujący oba poprzednie, u Eucariota zaś –
eukariotyczne czynniki uwalniające (ang. eucariotic RF – eRF). Wchodzą one w miejsce A i, wraz z GTP i
peptydylotransferazą, przenoszą na peptydylo-tRNA w miejscu P cząsteczkę wody, przez co powodują hydrolizę
wiązania pomiędzy peptydem a tRNA, które ulegają uwolnieniu. Ostatecznie czynniki uwalniające i translokaza
powodują rozpad kompleksu na elementy składowe – podjednostki rybosomalne, mRNA i tRNA, które mogą
ponownie wchodzić do cyklu.

e)

regulacja i inhibitory translacji

Układ translacyjny gospodarza wykorzystywany jest przez wirusy do syntezy własnych białek. Czasem

wirusowe mRNA ulega bardziej wydajnej translacji niż gospodarza (np. mengovirus), a czasem powstaje w
nadmiernych ilościach, konkurując z mRNA gospodarza o dostęp do aparatu translacyjnego (np. HSV1,
reowirusy). Niektóre wreszcie hamują syntezę białek komórkowych przez blokadę połączenia mRNA i 40S.
Pikornawirusy (piko-RNA-wirusy – czyli bardzo małe wirusy RNA; np. wirus polio) zaburzają funkcje
kompleksu 4F, a ich mRNA nie posiada czapeczki 5’, lecz miejsce IRES (ang. initial ribosomal entry site),
wymagające 4G zamiast 4E. Proteaza wirusowa atakuje 4G i 4E, dlatego nie powstaje kompleks 4F i 40S nie
łączy się z komórkowymi mRNA (z czapeczką). 4G łączy się za to z miejscem IRES wirusowego mRNA,
którego translacja jest w tej sytuacji promowana. Ponadto wirusy te pobudzają defosforylację BP1, dodatkowo
zmniejszając translację komórkowego mRNA.

Egzotoksyna maczugowca błonicy (Corynebacterium diphtheriae) katalizuje ADP-rybozylację eEF2,

wykorzystując jako donor NAD

+

, przez co blokuje translację.

- -

157

Rycyna (toksyna nasion rącznika) inaktywuje eukariotyczny 28S rRNA albo przez rozcięcie wiązania N-

glikozylowego albo przez odłączenie reszty A.

Różnica między rybosomami bakteryjnymi (70S) a eukariotycznymi (80S) umożliwiła opracowanie i

syntezę kilku klas antybiotyków bakteriostatycznych, hamujących syntezę białek bakteryjnych i
uniemożliwiających ich rozwój. Hamowanie podjednostki mniejszej (30S) to zasada działania aminoglikozydów
i tetracyklin, zaś większej (50S) – makrolidów i ketolidów, linkozamidów, streptogramin, oksazolidynonów i
chloramfenikolu. Związkami blokującymi podjednostki rybosomalne, które pozbawione są znaczenia
klinicznego, są puromycyna i cykloheksamid. Puromycyna jest analogiem Tyr-tRNA – powoduje przedwczesne
uwolnienie syntetyzowanego peptydu, hamując translację zarówno na rybosomach prokariotycznych, jak i
eukariotycznych. Cykloheksamid natomiast blokuje syntezę białek tylko u Eucariota przez hamowanie
aktywności peptydylotransferazy w podjednostce 60S.

Translacja może być mechanizmem obronnym organizmu. Przykładowo obecność żelaza uwalnia białko

cytozolowe, które wiąże się z sekwencją nie tłumaczącą blisko końca 5’ mRNA ferrytyny, stymulując jego
translację. Konsekwentny wzrost ferrytyny wiąże jony żelaza, nie dopuszczając do osiągnięcie przezeń poziomu
toksycznego (por. punkty III-7 – RFT oraz VII-3 – gospodarka żelazem).

f)

potranslacyjne modyfikacje białek

Wiele białek powstałych w wyniku translacji odpowiednich mRNA stanowi dopiero nieaktywne

cząsteczki prekursorowe, wymagające do aktywacji obróbki potranslacyjnej. Modyfikacje potranslacyjne można
podzielić na strukturalne i regulacyjne, w zależności od zmienianych właściwości białek. Do pierwszej grupy
należą m. in.: glikozylacja (patrz punkt IV-7-b), hydroksylacja (por. VII-8-b) i acylacja, do drugiej zaś – obróbka
proteolityczna i fosforylacja (por. II-4-b), acetylacja, metylacja i ADP-rybozylacja (por. punkt VIII-1-d). Do
białek mogą być również dołączane atomy metali (por. II-2-f) czy grupy barwnikowe (por. I-3-e).

5.

Mitochondrialne DNA (mtDNA)

Niemal cały materiał genetyczny komórki znajduje się na terenie jej jądra. Istnieją jednak organella

posiadające własny DNA – są to mitochondria, zawierające mtDNA, a u roślin również chloroplasty (chlDNA).
Obecność własnego materiału pozwala im na niezależne podziały, dlatego określa się je mianem organelli
autonomicznych. Teoria endosymbiozy głosi, że powstały one w wyniku wniknięcia probakterii do komórek
prokariotycznych. Cząsteczki mtRNA w różnych mitochondriach tej samej komórki, a nawet w tym samym
mitochondrium, mogą się od siebie różnić, co określa się jako heteroplazmia. U ssaków mtDNA dziedziczony
jest niemal wyłącznie w linii żeńskiej (dziedziczenie matczyne), a mitochondria plemnika są niszczone we
wczesnych fazach rozwoju zygoty. Podczas podziału komórki mitochondria są losowo rozdzielanie do komórek
potomnych (tzw. przypadkowa segregacja mitotyczna).

Pozajądrowy DNA występuje jako dwuniciowe cząsteczki koliste, czyli genofory. Pojedyncze ludzkie

mitochondrium zawiera 4 – 10 kolistych cząsteczek DNA. Każda z nich ma długość 16569 bp i zawiera 37
genów, z czego 13 koduje enzymy łańcucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej (podjednostki syntazy
ATP, dehydrogenazy NADH oraz oksydazy cytochromu c; por. punkty III-5 i 6), 22 – tRNA, a 2 – rRNA. Jest to
o wiele za mało, aby pozwolić na w pełni samodzielne funkcjonowanie – większość białek w obecnych w
mitochondriach kodowanych jest przez genom jądrowy, syntetyzowanych w cytoplazmie i importowanych do
miejsc docelowych. Z tego względu poprawniejsze byłoby określenie mirochondriów jako organella
półautonomiczne. Z dwu pasm mtDNA jedno określa się jako ciężkie (H), drugie zaś lekkie (L). Na obydwu z
nich zlokalizowane są geny, przy czym na nici L transkrypcja rozpoczyna się z jednego promotora, a na H z
dwóch. Geny mitochondrialne nie są podzielone, tj. nie zawierają intronów, a powstały na nich RNA nie musi
być składany. Mitochondrialny kod genetyczny różni się nieco od jądrowego (patrz punkt VIII-4-a).

mtDNA ma znacznie wyższe tempo mutacji niż DNA jądrowy. Przyjmuje się, że wynika to z braku

systemów naprawy mitchondrialnego DNA, z braku histonów oraz z obecności dużej ilości wolnych rodników
(RFT – por. punkt III-8). Mutacje pojawiające się w mitochondrialnym DNA komórek linii płciowej mogą
powodować choroby występujące w rodzinie, zaś mutacje pojawiające się w komórkach somatycznych mogą
być związane ze spadającą z wiekiem wydolnością układu fosforylacji oksydacyjnej. W tym pierwszym
przypadku są to choroby genetyczne dziedziczone w linii matczynej, uderzające głównie w tkanki rzadko
dzielące się, a o wysokim zapotrzebowaniu energetycznym – gł. mięśniową i nerwową. Mutacje często nie są
jedyną przyczyną chorób, a na ich efekty wpływają inne, nieznane jeszcze czynniki, najprawdopodobniej
sekwencja samego mtDNA, proporcje i dystrybucja do różnych tkanek zmutowanych cząsteczek DNA oraz
genotyp jądrowy. Niektóre choroby mitochondrialne mogą być spowodowane właśnie mutacjami genomu
jądrowego – genów kodujących białka strukturalne mitochondriów bądź regulujące ich pracę. Objawy chorób
obejmują najczęściej: paraliż, miopatię, utratę siły mięśniowej, sztywność mięśni, neuropatię, encefalopatię,

- -

158

degenerację jąder podstawnych, w niektórych chorobach również cukrzycę, głuchotę i ślepotę. Diagnostyka jest
trudna, a postępowanie i leczenie wyłącznie objawowe. Przykłady:

LHON (dziedziczna neuropatia n. wzrokowego, z. Lebera),

NARP (neuropatia obwodowa, ataksja i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki),

MERRF (padaczka miokloniczna z poszarpanymi – tzw. szmatowanymi – włóknami mm.),

MELAS (encefalopatia mitochondrialna, kwasica mleczanowa, napady udaropodobne),

CPEO (przewlekły postępujący paraliż mm. oka),

KSS (z. Kearsa – Sayre’a),

z. Paersona (szpikowo – trzustkowy),

z. Leigha.

mtDNA wykorzystuje się w antropologii, genetyce populacyjnej i medycynie sądowej. Umożliwia to

obecność tzw. nadzmiennych (hiperzmiennych) obszarów mtDNA, czyli fragmentów niekodujących, różniących
się u poszczególnych ososbników. Wyróżnia się 2 regiony hiperzmienne – pierwszy (HVR1) obejmuje
sekwencję 16024-16365, a drugi (HVR2) – 73-340. W antropologii mtDNA służy analizie rozprzestrzeniania się
gatunku ludzkiego ze swej pierwotnej kolebki – Afryki Środkowej – na pozostałe kontynenty. Ponadto badanie
mtDNA pochodzących od ludzi w różnych grup etnicznych pozwoliło na obliczenie, że kobieta, od której
pochodzi genom mitochondrialny wszystkich żyjących obecnie ludzi (tzw. mitochondrialna Ewa) żyła ok. 200
tys. lat temu. Podstawą badań nt. neandertalczyka są również próbki mtDNA. W medycynie sądowej służy ono
natomiast identyfikacji osób (również nieznanych zwłok) i ustalaniu między nimi pokrewieństwa.