M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

1

FIZJOLOGIA

DROŻDŻY

Aby określić rodzaj lub gatunek drożdży występujących w badanym środowisku,

należy przeprowadzić obserwacje makroskopowe i mikroskopowe kultury, a także zbadać

pewne cechy biochemiczne, które mogą stanowić podstawę klasyfikacji.

Badania makroskopowe

Badania te obejmują obserwacje badanych kultur na podłożu płynnym i stałym.

Na podłożu płynnym należy zwrócić uwagę na:

- występowanie osadu na dnie pożywki,

- gazowanie (obecność pęcherzyków gazu stwierdzamy przez ostrożne wstrząsanie płynu),

- tworzenie się kożuszka, błonki lub pierścienia na powierzchni płynu.

Na podłożu stałym po 1-2 miesiącach hodowli w temp. 20°C określa się:

- rodzaj wzrostu (jednolity nalot lub pojedyncze kolonie),

- powierzchnię wzrostu (matowa, błyszcząca) i strukturę kolonii (zwarta, mazista),

- zabarwienie i kształt kolonii.

Badania mikroskopowe

Badania te dotyczą obserwacji kształtu, wielkości, sposobu ułożenia oraz rozmnażania

komórek. Prowadzi się je wykonując preparaty przyżyciowe z jednodobowych kultur

hodowanych na podłożu płynnym, brzeczkowym, w temp. 30°C. Zastosowanie odpowiednich

metod barwienia pozwala określić żywotność kultury oraz obecność substancji zapasowych w

komórkach drożdży.

Test na żywotność

Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę błękitu

metylenowego, do niego dodajemy zawiesinę drożdży,

przykrywamy szkiełkiem nakrywkowym i oglądamy pod

ś

rednim powiększeniem. Komórki żywe nie wpuszczają

barwnika do wnętrza (trucizna). Komórki martwe łatwo

wpuszczają barwnik do wnętrza i barwią się na

niebiesko. Policzyć % martwych komórek (podać

wartość średnią z 3-5 pól widzenia).

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

2

Test na odżywienie

Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę płynu Lugola, przenosimy drożdże, nakrywamy

szkiełkiem nakrywkowym i oglądamy pod średnim powiększeniem. Glikogen będący

materiałem zapasowym tworzy z płynem Lugola kompleks, co przejawia się brunatnym

zabarwieniem komórek dobrze odżywionych. Komórki słabo odżywione są prawie

przezroczyste (jasnożółte). Policzyć % komórek dobrze odżywionych (podać wartość średnią

z 3-5 pól widzenia).

Inne testy

badanie zdolności fermentacji cukrów

-

badają zdolność

drożdży w warunkach beztlenowych do wykorzystywania

różnych cukrów (glukoza, galaktoza, sacharoza, maltoza,

laktoza,

rafinoza)

poprzez

fermentację.

Wynikiem

pozytywnym jest powstanie CO

2

, który zbiera się w rurce

Durhama,

testy asymilacyjne

– badają zdolność drożdży w warunkach

tlenowych do wykorzystywania różnych źródeł węgla i

azotu. Wynikiem pozytywnym jest zmętnienie roztworu lub

pojawienie się kożuszka na jego powierzchni, co świadczy o

rozwoju mikroorganizmów,

badanie zarodnikowania

– drożdże dzielimy na zarodnikujące i niezarodnikujące, do

pobudzenia wytwarzania zarodników przez komórki drożdżowe używa się podłoży

sporulacyjnych o specyficznym składzie (agar octanowy, agar Gorodkowa), uzyskane w

ten sposób worki z zarodnikami barwi się metodą Schaeffera-Fultona, kształty

zarodników: kuliste, elipsoidalne, nerkowate, półkuliste, kapeluszowate, soczewkowate,

w kształcie Saturna, maczugowate, igiełkowate,

badanie obecności tłuszczu

–

z roztworem Sudanu III, krople tłuszczu barwią się na

czerwono, cytoplazma pozostaje bezbarwna,

badanie rozmnażania wegetatywnego

–

w hodowlach kropelkowych, w komorze

Lindnera co 15 minut przez kilka godzin obserwuje się komórki pod mikroskopem

(termostatowanym) oceniając sposób rozmnażania i typ pączkowania,

inne badania

– zdolność wzrostu w podwyższonej temperaturze, przy braku witamin,

przy wysokiej zawartości cukrów, zdolność do syntezy związków skrobiopodobnych,

zdolność do syntezy kwasu octowego, wytwarzania estrów, wytwarzania barwników itp.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

3

M

ETODY BEZPOŚREDNIE OZNACZANIA ILOŚCIOWEGO KOMÓREK

(

METODY

MIKROSKOPOWE

)

•

liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór

Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem mają postać szklanych płytek z

wyciętym wgłębieniem podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni.

Używane są komory Thoma (hemocytometr), Howarda, Bürkera, Fuch Rosenthala

i inne. Różnią się one wymiarami powierzchni, na których liczy się drobnoustroje. Dane

dotyczące powierzchni i głębokości podane są na komorach.

W komorach można zasadniczo liczyć tylko większe komórki drobnoustrojów, takie

jak drożdże, zarodniki i strzępki grzybów. Ograniczenia te wynikają po pierwsze stąd, że

grubość i głębokość komory nie pozwalają na użycie obiektywów o dużej sile powiększenia,

a więc tym samym o małej odległości roboczej i po drugie przy dużej głębokości komory

(100 mikrometrów = 0,1 mm) małe drobnoustroje, np. bakterie o średnicy 5 mikrometrów

(µm), mogą układać się w wielu płaszczyznach i przy użyciu silniejszych obiektywów o małej

głębi ostrości część komórek położona nad i pod płaszczyzną pola widzenia będzie

niewidoczna.

Komorę Thoma przedstawia rysunek poniżej. Jest to grube szkiełko przedmiotowe z

wyciętymi wgłębieniami o głębokości 0,1 mm (100 µm). Wgłębienia te widoczne są gołym

okiem po obydwu stronach środkowego kanalika jako równoramienne krzyże, powstałe

z przecięcia linii wyznaczających regularne, kwadratowe i prostokątne powierzchnie. Bok

małego kwadratu wynosi 1/20 mm (50 µm). Powierzchnia małego kwadracika wynosi więc

1/400 mm

2

(0,0025 mm

2

= 2500 µm

2

). W każdej siatce znajduje się 256 małych

kwadracików.

Po przykryciu komory szkiełkiem przykrywkowym nad każdym kwadracikiem powstaje

prostopadłościan o objętości 1/400 mm

2

x 0,1mm = 1/4000 mm

3

(2500 µm

2

x 100 µm =

250 000 µm

3

). Co piąty kwadrat w obu kierunkach podzielony jest na pół dodatkową linią, w

wyniku czego część kwadratów ma powierzchnię o połowę mniejszą, a cała komora

podzielona jest w ten sposób na 16 dużych kwadratów, z których każdy składa się z 16

małych kwadracików. Na przecięciu dodatkowych linii powstają maleńkie kwadraciki o

czterokrotnie mniejszej powierzchni równej 1/1600 mm

2

. Na powierzchni tej komory

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

4

wyżłobione są trzy kanaliki tworzące literę H, dwa poprzeczne i jeden środkowy, łączący je.

Mają one za zadanie zatrzymywać nadmiar płynu naniesionego na komorę.

Komora Thoma: a – widok z góry, b –

widok z boku, c– wgłębienie z naciętymi

kwadratami, c' – siatka kwadratów w

powiększeniu

Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu komory Thoma wykonuje się

następująco. Zawiesinę komórek drożdży mających tendencję do zlepiania się rozcieńcza się,

biorąc 5 objętości zawiesiny i 1 objętość kwasu siarkowego rozcieńczonego wodą w stosunku

1:10, wytrząsa się kilka minut, przenosi szybko do komory Thoma, przykrywa szkiełkiem

przykrywkowym i przystępuje do liczenia. Po ustawieniu oświetlenia, należy znaleźć siatkę

komory najpierw przy obiektywie 10x, a następnie przy obiektywie 40x. Jeśli stwierdzi się

zbyt duże zagęszczenie drobnoustrojów, to należy próbę rozcieńczyć ilościowo, np. 10-

krotnie i powtórzyć oznaczenie. Oblicza się średnią liczbę drobnoustrojów z ok. 40 małych

kwadracików (o pow. 1/400 mm

2

). W sumie należy policzyć ok. 700 komórek, by błąd nie

przekroczył 10%. Komórki rozmieszczone są nierównomiernie, w jednych kwadracikach

może być ich kilka, a w innych - kilkanaście.

a

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

5

Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu zawiesiny

drobnoustrojów (n), zawartość komórek (L) w 1 cm

3

wynosi:

L = 4 • 10

6

• a • n

•

liczenie drobnoustrojów metodą Breeda w preparacie barwionym

Polega na wykonaniu równomiernego rozmazu określonej, niewielkiej ilości hodowli,

pobranej tzw. pipetą Breeda (0,01 cm

3

), na znanej powierzchni (A) szkiełka podstawowego,

wcześniej dokładnie odtłuszczonego. Po wykonaniu rozmazu, wysuszeniu i utrwaleniu,

preparat wybarwia się odpowiednim barwnikiem, a następnie liczy pod mikroskopem

średnią liczbę komórek z trzech preparatów.

•

metoda DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)

Polega na liczeniu pod mikroskopem drobnoustrojów osadzonych na filtrze

membranowym, o porach 0,45 µm, po uprzednim ich wybarwieniu fluorochromami. Badane

próbki mogą być wstępnie poddane obróbce enzymatycznej, następnie wybarwiane

najczęściej oranżem akrydyny i liczone w mikroskopie fluorescencyjnym. Komórki żywe

fluoryzują na pomarańczowo lub żółto, natomiast martwe na zielono.

M

ETODY POMIARU WIELKOŚCI KOMÓREK

•

metoda pomiaru prostego komórek

Metoda polega na dokładnym narysowaniu komórki na papierze milimetrowym, w takiej

wielkości, w jakiej ją widzimy przy danym powiększeniu. W omawianej metodzie należy

zwrócić szczególną uwagę na zgodność wielkości obrazu oglądanego pod mikroskopem z

rysunkiem. Z rysunku odczytujemy wymiary w milimetrach, a wielkość rzeczywistą w

mikrometrach obliczamy ze wzoru:

b

a

a

rzeczywist

wielkosc

1000

×

=

gdzie:

a – wielkość komórki (mm),

b – powiększenie mikroskopu.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

6

•

pomiar wielkości komórek przy użyciu okularu mikrometrycznego

Do wykonania pomiaru potrzebne są dwa mikrometry: okularowy i przedmiotowy. Na

mikrometrze przedmiotowym wyryta jest skala o długości 1 mm, podzielona na 100 równych

części, stąd odległość między kreskami podziałki jest równa 0,01 mm, tj. 10 µm.

Mikrometr okularowy zaopatrzony jest w skalę o długości 5 mm, której działki oddalone są

od siebie o 0,1 mm, tj. 100 µm. Przed przystąpieniem do pomiaru należy wyznaczyć wartość

mikrometryczną mikroskopu dla danego układu optycznego: okular, obiektyw. Po

umieszczeniu mikrometru okularowego w okularze, a mikrometru przedmiotowego na stoliku

i znalezieniu obrazu, ustawia się obie skale mikrometrów w taki sposób, aby ich punkty

zerowe pokryły się.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ć

wiczenie 7

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

7

Następnie oblicza się, ile kresek (działek) mikrometru okularowego przypada na określoną

liczbę kresek mikrometru przedmiotowego.

Wartość mikrometryczną oblicza się ze wzoru:

b

a

czna

mikrometry

wartosc

10

×

=

gdzie:

a – liczba odczytanych jednostek mikrometru przedmiotowego,

b – liczba jednostek mikrometru okularowego.

Po wyznaczeniu wartości mikrometrycznej mikrometr przedmiotowy zastępujemy

preparatem. Pomiar przeprowadzamy przy użyciu mikrometru okularowego, odczytując

liczbę kresek przypadających na mierzoną komórkę. Wartość rzeczywistą obliczamy mnożąc

odczytaną wielkość przez wyznaczoną wartość mikrometryczną.

•

pomiar wielkości komórek przy użyciu programu komputerowego