Przygotowanie bakterii kompetentnych E. coli przy zastosowaniu chlorku wapnia

1. Niewielką objętość (5 - 20 ml) bulionu LB inokulować bakteriami z pojedynczej kolonii
wybranego szczepu E. coli (np. DH10B). Hodowlę prowadzić przez noc w temp. 37°C z
intensywnym wytrząsaniem.

2. 200 - 300 ml bulionu LB inokulować 1 ml całonocnej hodowli (p. wyżej). Hodować do
osiągnięcia przez kulturę OD = 0,3 - 0,5 (maks. 0,7).

3. Rozporcjować hodowlę do probówek wirowniczych, zbalansować wypełnione probówki.

4. Wychłodzić probówki z hodowlą w lodzie przez 20 min.

5. Zwirować hodowlę przy 6000 rpm przez 10 min. w temp. 0 - 2°C.

6. Po wirowaniu nadsącz odrzucić a osad komórek zawiesić w 1/2 obj. r-ru chlorku wapnia.

7. Zbalansować wypełnione probówki wirownicze, po czym zwirować jak wyżej.

8. Nadsącz odrzucić a osad komórek zawiesić w 1/15 obj. r-ru chlorek wapnia + glicerol.

9. Zawiesinę komórek rozporcjować po 100 μl do umieszczonych w lodzie probówek o poj. 1,5
ml.

10. Probówki z bakteriami zamrozić w suchym ludzie lub ciekłym azocie i przechowywać w
temp. - 80°C.


Roztwory

chlorek wapnia – 50 mM CaCl

2

chlorek wapnia + glicerol – 50 mM CaCl

2

, 10 % glicerol

Transformacja chemicznie kompetentnych bakterii E. coli plazmidowym DNA

1. Przygotować szalki z agarem LB i amplicyliną w stężeniu 100 μg/ml.

2. Wyjąć bakterie kompetentne z zamrażarki na - 80°C i umieścić w lodzie.

3. Po rozmrożeniu zawiesiny bakterii (100 μl) dodać do niej 1 μl plazmidowego DNA (1 - 50
ng/μl), całość delikatnie zamieszać poprzez stukanie palcem w probówkę.

4. Bakterie z dodanym pDNA inkubować przez 20 min. w lodzie, co kilka minut mieszając j.w.

5. Probówki z bakteriami i pDNA zanurzyć na 1 min. w łaźni wodnej o temp. 42°C.

6. Probówki przełożyć do lodu na 2 min., po czym do każdej dodać 1 ml bulionu LB.

7. Probówki inkubować przez 1 h w 37°C zapewniając przy tym mieszanie zawiesiny bakterii.

8. 100 μl zawiesiny bakterii wysiać na szalkę z agarem LB i ampicyliną.

9. Szalki inkubować przez noc w temp. 37°C. Po pojawieniu się kolonii bakterii szalki przełożyć
do lodówki.


Pożywki i roztwory


bulion LB (1 litr) – Bacto-tryptone 10 g, ekstrakt drożdżowy 5 g, NaCl 10 g

agar LB – bulion LB z dodatkiem 1,5 % agaru

ampicylina – 50 mg/ml