TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

KOMÓRKI KOMPETENTNE

1. projektowanie starterów, na co zwrócić uwagę, czego unikać

2. potrzebna będzie mapa wektora pGEX-2T z pierwszych zajęć!!!

3. wiedzieć co to jest ORF + przyda się mała powtórka translacji, tj, START/STOP

4. sposoby ukompetentniania komóre i wprowadzania DNA do komórek (można znaleźć z Stryerze, lub w Gene cloning...)

5. co to OD, dlaczego 600 i po co czekamy na określoną wartość OD

6. dlaczego będziemy stosować tetracyklinę

7. Porównać składy roztworów A, B i C i zastanowić się dlaczego akurat takie są

8. Analiza genotypu szczepu, z którym pracujemy znaczenie poszczególnych markerów

9. na e-portalu każda z grup ma możliwość pobrania dokumentu z analizą densytometryczną wektora (gr. 4 ze środy znajdzie swoje pasmo pod numerem 7 na żelu z grupy piątkowej), spróbujcie wykoncypować jak na podstawie posiadanych danych można oszacować stężenie Waszych próbek, oprócz wspomnianego pliku przydadzą się Wam dokładne dane na temat markera z jakim pracowaliśmy (w tym użytej jego objętości) a także znajomość objętości próbki DNA niesionej na żel) - bez paniki jeśli ktoś sobie nie poradzi, zrobimy to wspólnie podczas najbliższych zajęć (dlatego miejcie ze sobą wydruk oraz dane o markerze)

Transkrypcja:

Promotor prokariotyczny:

Start: kaseta TATAAT (Pribnowa) rejon -10, rejon -35

Stop: spinka bogata w G-C i ciąg poliU

Translacja:

Prokarioty: sekwencja Shine-Dalgarno w mRNA na końcu 5’ rozpoznawana przez podjednostkę 16S rybosomu (16S rRNA-sekwencja anty Shine-Dalgarno) - mRNA policistronowe

Eukarioty: - kap na końcu 5’, sekwencja Kozak - mRNA monocistronowe

Start:AUG

Stop:UAA, UAG, UGA

Kompetencja może być indukowana przez:

- warunki wpływające hamująco na wzrost, np. wysokie stężenie cAMP

- gęstość populacji bakteryjnej

- transbłonowy transport wapnia

- warunki żywieniowe

Inkubujemy do odpowiedniego OD (ok. 0,4), bo w inoculum było dużo martwych i starych komórek, a my chcemy mieć hodowlę w fazie wzrostu logarytmicznego. Hodowlę nadal prowadzimy w podłożu z tetracykliną, bo chcemy, żeby komórki potomne też dostawały plazmid z genem oporności. Mierzymy przy długości 600nm-rozproszenie światła przez komórki w zawiesinie.

Ukompetentnianie:

Kationy dwuwartościowe opłaszczają komórkę zmieniając ładunek na błonie na dodatni (oddziałują z ujemnym ładunkiem fosfolipidów). Przechowywanie w -80 C sprawia, że błona staje się bardziej przepuszczalna. Po dodaniu DNA adsorbuje się na powierzchni komórki (oddziaływania elektrostatyczne). Po zwiększeniu temperatury do 37 C DNA zostaje wchłonięte do komórki.

ELEKTROPORACJA-metoda fizyczna

Ile dodać tetracykliny?

Przy Rx20 możemy zaniedbać x w V2.